Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch và cụm chồi từ chồi măng cây song mật (calamus platyacanthus warb exbecc) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Để duy trì và phát triển nguồn tài nguyên có giá trị này việc tạo cây con bằng phương pháp in vitro để đáp ứng nhu cầu phát triển sản xuất đang là hướng ưu tiên và được nhiều người quan

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

KHOA LÂM HỌC

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO MẪU SẠCH VÀ CỤM CHỒI TỪ

CHỒI MĂNG CÂY SONG MẬT (Calamus platyacanthus Warb Ex

Becc) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO

NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ : 307

Giáo viên hướng dẫn : ThS Hồ Văn Giảng

ThS Vũ Thị Huệ Sinh viên thực hiện : Nguyễn Quang Đàm Khoá học : 2005 - 2009

Hà Nội, 2009

MỞ ĐẦU

Nước ta là một nước đi lên từ nền nông nghiệp nhưng ngày nay vào thời kỳ công nghiệp hoá hiện đại hoá đất nước, nền nông nghiệp đang dần được thay thế bằng nền công nghiệp hiện đại Vì vậy ruộng đất của nông dân ngày càng bị thu hẹp, nông dân còn ít ruộng để sản xuất Để giải quyết công

ăn việc làm cho bà con nông dân khi còn ít ruộng đất, cũng như khi nông nhàn thì các nghề phụ như nghề mây tre đan, làm gốm, làm nón là một giải pháp rất tốt Các làng nghề không chỉ giúp bà con giải quyết công ăn việc làm, tăng thu nhập mà còn góp phần tích cực vào sự phát triển kinh tế xã hội chung của đất nước

Một trong những nghề phụ hiện đang được phát triển mạnh mẽ là nghề chế biến kinh doanh các mặt hàng thủ công mỹ nghệ Các mặt hàng này được dùng trong nước và xuất khẩu Một trong những nguồn nguyên liệu để sản xuất mặt hàng này là thân cây Song mật Ngày nay nhu cầu phát triển các mặt hàng thủ công mỹ nghệ với nguyên liệu lấy từ thân cây Song mật ngày càng nhiều Từ đó đòi hỏi một nguồn nguyên liệu lớn Song mật phục vụ cho sản xuất

Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex beec) là loài cây có giá trị

kinh tế cao vì thân cây nhẹ, bền, dễ kết hợp với các vật liệu khác để sản xuất hàng thủ công mỹ nghệ Tuy nhiên do thân của song mật có giá trị kinh tế cao nên thường bị khai thác trước khi cây ra hoa kết quả Mặt khác, hạt Song mật nhanh mất sức nảy mầm do có độ ẩm cao nên thường rất khó bảo quản Trong thực tế thì việc nhân giống bằng cách gieo hạt thì hệ số nhân không đủ để cung cấp cho sản xuất Kết quả là nguồn nguyên liệu Song mật phục vụ sản xuất ngày một cạn kiệt dần Trong khi đó đại bộ phận nguồn nguyên liệu có được hiện tại chủ yếu do cây được mọc lên từ tự nhiên hoặc do thu hái từ tất

cả các nguồn khác nhau mà chưa qua khảo nghiệm đã được đem gieo trồng Chính vì vậy nguồn giống không đảm bảo chất lượng nên việc tạo nguồn giống Song mật với sản lượng và chất lượng cao đang là nhu cầu cấp bách [8]

Để duy trì và phát triển nguồn tài nguyên có giá trị này việc tạo cây con

bằng phương pháp in vitro để đáp ứng nhu cầu phát triển sản xuất đang là

hướng ưu tiên và được nhiều người quan tâm hơn cả vì nó có khả năng tạo ra

số lượng mẫu lớn, sạch bệnh… đáp ứng được các yêu cầu của nguyên liệu Song mật cho sản xuất [5]

Chính vì vậy tôi đã chọn nghiên cứu cho khoá luận tốt nghiệp của mình là:”Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch và cụm chồi từ chồi măng cây Song

mật (Calamus platyacanthus Warb Ex beec) bằng phương pháp nuôi cấy mô

- tế bào”

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử về nuôi cấy mô - tế bào thực vật

1.1.1 Khái niệm về nuôi cấy mô - tế bào thực vật

Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là phương pháp nhân giống cây con từ các bộ phận của cây mẹ, bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng có môi trường thích hợp và được kiểm soát [1]

Bộ phận đem nuôi cấy (mẫu) thường rất nhỏ so với nhân giống truyền thống và được tiến hành trong không gian rất nhỏ (bình, phòng…) nên hình thức này còn gọi là vi nhân giống (micro propogation) Vì được thực hiện trong điều kiện vô trùng trong ống nghiệm với môi trường dinh dưỡng phù hợp và được kiểm soát gọi là nhân giống trong ống nghiệm (in vitro) [1]

1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô

và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào Theo ông, mỗi tế bào của bất kì cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh Ông làm thí nghiệm với tế bào khí khổng và đã không thành công Thất bại này đã làm các nhà khoa học mất hết hy vọng xây dựng phương pháp nuôi cấy mô - tế bào trong một thời gian dài, nhưng sau đó Garrison (1904-1907) đã thực hiện được tư tuởng của Haberlandt Ông đã nuôi được tế bào thần kinh của ếch trong huyết tương [4]

Năm 1922, Robbins và học trò của Haberlandt là Kotte đã thành công trong việc nuôi cấy đầu rễ trong 12 ngày Từ đó đầu rễ được sử dụng để nuôi

và hoàn thiện trong môi trường nuôi cấy Từ những năm 30 của thế kỉ trước phương pháp nuôi cấy mô và tế bào đã mang những nét của nuôi cấy mô và tế bào hiện đại và không khác nhiều về mặt kĩ thuật Trong thời gian này Whtite nhà bác học người Mỹ và Gautheret (Pháp) đã có nhiều đóng góp trong việc

nghiên cứu các môi trường nuôi cấy Nhiều môi trường đến nay vẫn đang được sử dụng [4]

Từ 1931 phương pháp nuôi cấy mô - tế bào mới coi như được chính thức bắt đầu bằng công trình nghiên cứu của White với việc nuôi cấy đầu rễ cây cà chua và ông là người đầu tiên chỉ ra rằng mô phân sinh có thể sinh trưởng trong thời gian dài nếu được cấy chuyển lên môi trường dinh dưỡng mới Trong cùng thời gian Gautheret đã thành công trong nuôi cấy mô tượng tầng và tìm được môi trường dinh dưỡng thích hợp Sau đó Miller và Skoog trong khi nuôi cấy lõi cây thuốc lá đã xác định được vai trò của Kinetin trong

sự kích thích phát triển của mô [4]

Những thí nghiệm về môi trường dinh dưỡng đã chỉ ra rằng môi trường dinh dưỡng, tính chất vật lí, hóa học là những điều kiện quan trọng quyết định thành công trong môi trường nuôi cấy mô, cơ quan và tế bào Những thành phần bắt buộc của môi trường gồm chất khoáng từ các muối khác nhau của nguyên tố đa lượng và vi lượng, thành phần hidrocacbon trong dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng [4]

Cũng từ những năm 30 của thế kỉ trước nuôi cấy mô - tế bào đã phát triển thành một hướng như nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô và cơ quan tách rời[4]

Từ những năm 60 của thế kỉ trước cho đến nay ngoài các hướng kể trên thì nuôi cấy bào phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần (protoplast) được phát triển mạnh [4]

Từ những năm 70 của thế kỉ trước đến nay, các kĩ thuật lai xôma bằng dung hợp tế bào trần và các kĩ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể Đến nay nuôi cấy mô tế bào đã được phát triển mạnh mẽ và ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn giống và nhân giống cây trồng [4]

1.1.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.3.1 Tính toàn năng của tế bào

Cuối thế kỉ 19 đầu thế kỉ 20 nhà sinh lí thực vật học người Đức Haberlandt đã phát biểu tính toàn năng của tế bào thực vật:”tế bào bất kì của

cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN) cần thiết và đủ của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều

có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” [10]

1.1.3.2 Sự trẻ hóa tế bào

Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau Trong nuôi cấy mô tế bà thực vật các bộ phận non trẻ sẽ ra chồi, ra rễ tốt hơn các bộ phận trưởng thành [10]

1.1.3.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể

Sự phản phân hóa là sự chuyển hóa các tế bào chuyên hóa chức năng trở lại thành tế bào phôi sinh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp đặc biệt [10]

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào

1.2 Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật

1.2.1 Trên thế giới

Nghiên cứu mô - tế bào thực vật là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giông vô tính Kỹ thuận này cho phép tạo ra quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ khắc phục được những điều kiện bất lợi [1] Phương pháp này đặc biệt tỏ ra ưu việt với

các loài cây khó nhân giống bằng con đường hữu tính (Phong lan), các giống quý hiếm có số lượng ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh

Nghiên cứu mô - tế bào thực vật còn được ứng dụng để:

- Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống

- Làm sạch vius, phục tráng giống thoái hoá, bị bệnh

- Nhân nhanh và duy trì các giống có ý nghĩa khoa học, giá trị kinh tế cao

Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô - tế bào thực vật dễ nhận thấy nhất

là trong lĩnh vực nhân giống và phục tráng giống cây trồng Với phương pháp nghiên cứu đỉnh sinh trưởng, Morel đã mở ra một hướng lớn không chỉ là một cách mạng trong công nghệ lan mà còn áp dụng cho nhân giống nhiều loại cây trồng khác như: Đu đủ, Khoai tây, Dâu tây,…(Morel, 1960)

Năm 1985 theo Roca có 55 loài cây trồng được áp dụng để nhân giống sạch bệnh qua nuôi cấy mô gồm 11 cây ăn quả, 8 loài cây lấy củ, 7 loài cây công nghiệp và 23 loài cây cảnh

Năm 1965, Morel và Martin đã dùng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh tạo được Khoai tây không chứa virus mang lại ý nghĩa lớn cho ngành sản xuất Khoai tây thế giới

Năm 1970, Storrisky đã rất thành công khi nuôi cấy vẩy củ hoa Lay ơn trên môi trường dinh dưỡng có 5mg/l BAP và cây Dạ lan hương với nồng độ 8ppm IAA [16]

1.2.2 Ở Việt Nam

Nuôi cấy mô - tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975) Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô - tế bào đầu tiên được xây dựng tại viện sinh vật học, viện khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nuôi cấy cơ bản trong điều kiện Việt Nam như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy

mô sẹo và protoplast Các kết quả đầu tiên về nuôi cấy thành công bao phấn lúa và thuốc lá đã được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và cs 1978; Lê Thị Xuân và cs) Tiếp đó là thành công về nuôi cấy protoplast ở thuốc lá và

khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành 1978; Nguyễn Đức Thành và

Lê Thị Muội, 1980, 1981) Trong cùng thời gian tại phân viện khoa học Việt Nam ở Thành Phố Hồ Chí Minh và muộn hơn nữa là tại Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội và Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô - tế bào cũng được thành lập và tập trung chủ yếu vào vi nhân giống khoai tây Đến nay chúng ta đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các viện nghiên cứu (Viện Di truyền Nông Nghiệp, Viện rau quả Trung Ương) mà còn cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Cần Thơ,.) [4]

Từ những năm 80 của thế kỷ trước trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô - tế bào được phát triển mạnh Những kết quả khích lệ

đã đạt dược trong lĩnh vực khi nhân giống khoai tây (Viện công nghệ sinh học, Đại học Nông Nghiệp 1, Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam), dứa, chuối, mía (Viện công nghệ sinh học, Đại học Nông Nghiệp 1, Viện Di truyền Nông Nghiệp, Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam, Viện rau quả Trung Ương) Một số cây hoa như Phong lan (Phân viện công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm chướng (Viện công nghệ sinh học, Viện Di truyền Nông Nghiệp) và cây công nghiệp như Bạch đàn (Viện Di truyền Nông Nghiệp, Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam) Một số kết quả bước đầu đã dược ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thuỷ và cs, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và cs, 1994; Đinh Thị Phòng

và cs, 1994) Các kết quả dung hợp tạo tế bào chất và chuyển gen lục nạp cũng thu được những kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và cs, 1993, 1997) Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào

có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998) cũng đã và đang được phát triển (Phan Thị Bảy và cs,1995) [4]

1.3 Ý nghĩa của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác giống cây trồng

Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mang lại ý nghĩa

vô cùng to lớn Nó đã chứng minh được tính toàn năng của tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật góp phần giải quyết vấn đề lý luận và thực tiễn, đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái ở nhiều thực vật từ mức độ tế bào đến cấu trúc mô [10]

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là một trong những giải pháp công nghệ mới có ý nghĩa khoa học trong công nghệ sinh học Trên các môi trường nhân tạo, từ các mô hay tế bào thực vật sẽ phân chia, phân hóa và phát triển thành cây con hoàn chỉnh [10]

Đây là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một phương pháp nhân giống vô tính [1]

Những ưu việt của phương pháp nhân giống vô tính này là:

+ Mang đầy đủ ý nghĩa của hình thức nhân giống sinh dưỡng thông thường [1]

+ Tạo ra một quần thể cây con đồng đều giữ nguyên được phẩm chất di truyền như của cây mẹ đã được chọn lọc [1]

+ Bảo tồn được nguyên vẹn ưu thế lai của F1 khi dùng F1 để nhân giống tiếp [1]

+ Là quá trình nhân nhanh những cây quý hiếm phục vụ cho mục tiêu bảo tồn Vì bảo tồn theo hình thức này thì thế hệ sau là hiện thân nguyên vẹn của thế hệ trước [1]

+ Là phương thức nhân giống bổ sung cho các loài cây khó thu hạt hoặc khó bảo quản hạt như: Sao đen hạt giống nảy mầm ngay sau vài ngày thu hái hạt hay như cây họ Dầu rất khó bảo quản hạt vì nhanh mất khả năng nảy mầm, hay các loài Lát hoa, nghiến khó thu hái hạt vì hạt nhỏ lại có cánh [1]

+ Tạo ra quần thể cây trồng đồng đều về sinh trưởng, phát triển và sinh sản cũng như sản phẩm thu hoạch nên rất thuận lợi cho việc gieo trồng, chăm sóc, khai thác, chế biến sản phẩm [1]

+ Phương pháp này được thực hiện một cách chủ động trong mọi điều kiện thời tiết và không chịu chi phối bởi hiện tượng bảo lưu cục bộ-hiện tượng mà cây trồng giữ nguyên tập tính của bộ phận sinh dưỡng như khi nó ở trên cây mẹ [1]

+ Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào có hệ số nhân giống cao: từ 36

-1012/năm, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất để sớm phát huy được hiệu quả kinh tế [10]

+ Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong 1m2nền có thể đạt tới 18000 cây [10]

+ Cây sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh [10]

+ Cây con được tạo ra bằng nuôi cấy mô được trẻ hóa, thậm chí không

có sự khác biệt đáng kể so với cây con mọc từ hạt [10]

+ Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi Các cây giống được giữ ở nhiệt độ 4oC trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống 95% [10]

Nhu cầu về cây giống mô tế bào ngày càng nhiều Mấy năm gần đây, hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng được yêu cầu thực tiễn sản xuất [10]

1.4 Các điều kiện cần thiết trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật

1.4.1 Môi trường nuôi cấy

1.4.1.1 Môi trường vật lý

- Ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng [4], [10] Thời gian chiếu sáng có vai trò trong quá trình phát sinh hình thái của

mô nuôi cấy, với đa số các loài cây thời gian chiếu sáng thích hợp từ 12-18

h/ngày Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, cường độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong khi cường độ ánh sáng thấp sẽ hình thành mô sẹo Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000 lux Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế sự vươn cao của mô nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo

- Nhiệt độ

Nhiệt độ phòng nuôi cấy mô - tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới

sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây Tuỳ thuộc vào xuất

xứ của mẫu mô nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Thường cây nhiệt đới đòi hỏi nhu cầu nhiệt độ cao hơn so với cây ôn đới [9]

1.4.1.2 Môi trường hoá học

Môi trường hoá học là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trưởng phân hoá mô trong suốt quá trình sinh hoá trong cây Cơ sở của việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cây Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm :

1.4.1.2.1 Các nguyên tố đa lượng và vi lượng

 Nguyên tố đa lượng

Sử dụng ở nồng độ > 30 ppm Những nguyên tố N, S, P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tượng [4], [10]

+ Nitơ: Dùng ở dạng NO3ˉ và NH4

+

riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau + Photpho: Là nguyên tố mà mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu rất cao và thường được đưa vào môi trường ở dạng đường Photpho

+ Lưu huỳnh ( S ): Được sử dụng ở dạng muối SO4

2-

nồng độ thấp còn dạng SO3

+ Na+ và Cl -: Cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng với muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường

 Các nguyên tố vi lượng

Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ < 30 ppm (< 30 mg/l) [10] Các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu, Zn, Bo, Co, Iot Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng

+ Fe : Thiếu Fe làm giảm ARN, Protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia [9]

+ Mn: Thiếu Mn làm cho ADN và các axit amin tự do tăng lên nhưng lượng mARN và sự sinh tổng hợp protein bị giảm nên làm giảm sự phân bào

+ Bo: Thiếu Bo trong môi trường nuôi cấy thường gây lên biểu hiện thừa Auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế Auxin oxydase trong tế bào phát triển Mô nuôi cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hoá mạnh nhưng thường là

mô xốp, mọng nước, kém tái sinh

 Nguồn Cacbon

Cây in vitro chủ yếu phát triển theo phương thức dị dưỡng (hoàn toàn

sử dụng các chất dinh dưỡng của môi trường) Để sử dụng được thì nhờ nguồn Cacbon từ môi trường đưa vào thông qua các loại đường khác nhau như: Saccharose, Mantose, Fructose Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy tuỳ thuộc vào mô nuôi cấy [6], [10]

 Vitamin

Nuôi cấy in vitro khi chồi tái sinh vẫn tổng hợp được vitamin nhưng

không đủ do vậy phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là vitamin B Tuỳ thuộc vào các loại mô nuôi cấy và giai đoạn nuôi cấy mà hàm lượng vitamin bổ sung vào khác nhau

 Các nhóm chất bổ sung

Một số loài cây đặc biệt thì cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy

để cung cấp các axit amin tự do, protein, vitamin Một số nhóm chất bổ sung

là: nước dừa, dịch chiết mầm lúa mỳ, dịch chiết nấm men, dịch thuỷ ngân, chất nền (thạch)

+ Nước dừa: Trong nước dừa có nhiều axit amin tự do, axit amin liên kết, axit hữu cơ, đường, ARN Nước dừa là chất bổ sung đặc biệt cho nuôi cấy phong lan

+ Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha): Chứa một số đường, vitamin, một

số chất có hoạt tính điều hoà sinh trưởng

+ Dịch chiết nấm men: Thành phần chủ yếu chứa đường, axit nucleic, axit amin, vitamin, auxin, muối khoáng

+ Dịch thuỷ phân Casein: Làm nguồn bổ sung axit amin

cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hoá tế bào cần thiết cho

sự phát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều hoà khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như: Indole acetic acid (IAA), α-Naphthalene acetic acid (α-NAA), 2,4D-dichlorophenoxy acetic acid (2,4D), Indole butyric acid (IBA)

 Cytokinin

Bao gồm các nhóm chất: Benzyl amino purin (BAP), Kinetin (Ki), Zeatin (Z), Thidiazuron (TDZ)

Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng tốc độ phân bào Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hoá rễ của mô cấy

Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này Cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt Auxin Trong một tỷ lệ giữa Cytokinin và Auxin thì có thể kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường Cytokynin cao hơn Auxin thì kích thích tạo chồi và ngược lại, Auxin cao hơn Cytokinin thì kích thích sự tạo rễ [9], [10]

 Gibberelin

Đây là chất có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt, thân, cành cây Ngoài ra, nó còn có tác dụng phá tính ngủ nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ Chất thường được sử dụng nhất trong nhóm này là GA3 (Gibberelin) [9]

Ngoài ba nhóm chất trên còn có các chất có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển khác như Etylen Chất này cũng gây ảnh hưởng khá rõ đến sự phát sinh hình thái của một số loài cây trồng trong nuôi cấy in vitro

1.4.2 Vật liệu nuôi cấy

Về nguyên tắc, trừ những mô đã hoá gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô nuôi cấy Tuy nhiên các mô đang phát triển mạnh (mô phân sinh đầu ngọn, đầu rễ, lá non, tượng tầng,…) có thể nuôi cấy dễ dàng hơn [10]

Các mô khác nhau trên cùng một cây tuy mang lượng thông tin di truyền như nhau nhưng khi nuôi cấy có thể cho mô sẹo hoàn toàn khác nhau, khả năng hình thành chồi, rễ khác nhau Vì vậy tốc độ nhân giống, chất lượng giống nhân, hiệu quả nhân giống phụ thuộc rất nhiều vào việc chọn mẫu Do

đó các mô trẻ sinh lý, chưa bị phân hoá sâu sắc và sinh trưởng tốt là nguồn mẫu nuôi cấy lý tưởng bởi có thể dễ tác động và điều khiển quá trình phát sinh hình thái và tái sinh cây hoàn chỉnh từ chúng

Các khả năng trên còn phụ thuộc vào mùa vụ lấy vật liệu trong năm, kích thước vật liệu nuôi cấy, tuổi cây mẹ, tuổi của quả, vị trí lấy mẫu trên cây mẹ,… [9]

1.4.3 Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện đầu tiên quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô-

tế bào Nếu điều kiện không đảm bảo thì môi trường sẽ bị nhiễm, cây mô sẽ bị chết Vì vậy, yêu cầu đặt ra là phải có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp kết hợp với các dụng cụ, thiết bị nuôi cấy, khử trùng hiện đại

 Chất khử trùng

+ Thủy ngân II Clorua

Tác dụng diệt trùng cao do làm kết tủa các dung dịch protein Dung dịch không bền, dễ bị phân hủy khi tiếp xúc với một số chất hữu cơ và vô

cơ Muốn tránh chất này bị phân hủy và làm tăng khả năng thấm sâu vào đối tượng khử trùng thì cho thêm HCl và NaCl Dung dịch thủy ngân II Clorua 0,1 - 0,2% trong nước dùng trong phòng thí nghiệm dùng ngâm các dụng cụ nhiễm trùng, khử trùng mẫu Tác dụng tiêu độc kém đối với các chất chứa kiềm và protein Tuy nhiên, do thủy ngân là chất độc có thể tích

tụ trong môi trường làm liều độc hình thành sau một thời gian sục clo và ôxy

+ Cồn: Là chất dễ cháy, dùng để khử trùng các vết thương sử dụng trong y tế, dùng trong phòng thí nghiệm dùng để khử trùng mẫu cấy, sát trùng tay (cồn 700), khử trùng các dụng cụ (cồn tuyệt đối)

1.5 Nghiên cứu về nhân giống Song mây

thành công của quá trình nhân giống vật liệu dùng để nuôi cấy rất đa dạng

như phôi hạt, vùng cổ chồi, đỉnh chồi, cây con đối với Song mây, tuỳ từng loài mà lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp nhưng nhìn chung phôi hạt và

vùng cổ rễ của cây non là vật liệu tốt nhất cho nhân giống in vitro [2], [7]

Ở các nước như: Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan, Singapo, vật liệu

dùng trong nhân giống in vitro được sử dụng trước tiên là phôi hạt Từ nguồn

mẫu sạch được tạo từ phôi hạt tiến hành nghiên cứu thăm dò khả năng tái sinh, nhân và kích thích tăng trưởng chồi Trên cơ sở kết quả nghiên cứu thu được từ loại vật liệu nuôi cấy này, người ta mới tiến hành thử nghiệm nuôi cấy các bộ phận sinh dưỡng khác (chồi măng, chóp rễ, mảnh lá, cây con) [11], [14]

Năm 1985, Umali – Gacia đã lấy đỉnh chồi của 3 loài mây thuộc chi

calamus làm vật liệu nuôi cấy, đỉnh chồi được cấy vào môi trường cảm ứng

tạo mô sẹo, cho mô sẹo phát triển thành cụm chồi, sau đó tách chồi cấy vào môi trường thúc rễ để tạo cây con hoàn chỉnh Các tác giả trên cũng thành công trong việc nghiên cứu tạo đa chồi bằng cách dùng vùng cổ chồi cây con nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BAP hoặc Kinetin, sau đó tách chồi để cấy vào môi trường có hàm lượng Cytokinin thấp để tạo mô hoàn chỉnh và chuyển ra ngoài tự nhiên [13]

1.5.2 Ở Việt Nam

Ở nước ta, trong những năm gần đây việc ứng dụng công nghệ nhân

giống in vitro để thành công ở một số loài cây trồng rừng phổ biến như: bạch

đàn cao sản, keo lai, dó trầm, tếch ,hông … nhiều cơ sở nghiên cứu và sản xuất đã áp dụng công nghệ này để sản xuất cây giống ở quy mô công nghiệp, nhằm chủ động cung cấp nguồn cây giống chất lượng cao phục vụ trồng rừng sản xuất [3]

Tuy nhiên đối với những loài cây bản địa và cây đặc sản có giá trị kinh

tế cao nói chung, đặc biệt là cây Song mật nói riêng vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ mới chỉ đơợc tiến hành một cách đơn lẻ ở một số cơ sở nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm và mang tính chất thăm dò là chính [2], [7]

Kết quả nghiên cứu nhân giống sinh dưỡng của Nguyễn Ngọc Tân và Trần Hồ Quang, năm 1995 đã sử dụng lá non và phôi hạt làm nguyên liệu nuôi cấy Kết quả cho thấy có sự hình thành mô sẹo từ lá non, nhưng không tái sinh chồi và chết dần khi môi trường có nồng độ cytokinin cao Các tác giả

có thành công trong việc nhân giống từ phôi, các phôi được nuôi trên môi trường MS có bổ sung Cytokinin và Auxin để tạo cây hoàn chỉnh Tuy nhiên, nghiên cứu này còn hạn chế là có chu kỳ cấy chuyển dài (6 - 8 tuần), ngoài ra không thấy đề cập đến hệ số nhân chồi hữu hiệu, thời gian và tỷ lệ ra rễ của cây con, cũng nhờ biện pháp huấn luyện cây mô ở vườn ươm

1.6 Giới thiệu về Song mật

1.6.1 Đặc điểm hình thái của Song mật

Song mật có tên khoa học là: Calamus platyacanthus Warb Ex Becc Song mật thuộc họ cau dừa (Arecaseae), gồm cây thân ngầm và thân khí sinh

Thân ngầm là phần phình lên của thân khí sinh, có dạng giống như củ gừng và được bao bọc bởi nhiều bẹ lá màu trắng hay vàng nhạt Thân khí sinh mọc thành bụi, nhưng thường rất thưa và ít thân, đôi khi ta gặp bụi Song mật chỉ

có một thân khí sinh Ở cây con, thân được bao bọc bởi bẹ lá hình ống, màu xanh lá cây, trên mặt có nhiều gai màu vàng Khi già, bẹ ở gốc thân chuyển thành màu vàng, màu nâu rồi rụng đi để lộ thân khí sinh màu xanh rêu Thân rất dài, có thể đến 100m Thân non màu trắng ngà, sau chuyển sang màu xanh, thân chia lóng, lóng dài 8-25cm, đốt hơi nổi, đường kính trung bình đạt 2,3-2,8cm, cây to đạt 4-5cm Lá đơn, xẻ thuỳ dang lông chim gần giống lá dừa, bẹ lá rất dài, bao bọc kín thân, có gai dẹt, dài 8-10cm, lá gồm 20-38 lá nhỏ, mọc thành cụm 2-6 cái một, các cụm cách nhau 15-30cm, đỉnh lá mang 4-7 lá nhỏ, 2 lá nhỏ ở giữa dính nhau ở gốc Lá nhỏ hình bầu dục không cuống, dài 40cm, rộng 6-8 cm, gân hình cung Thường khi cây cao 2-3cm, từ

lá thứ 6-7 trở lên xuất hiện roi trên đỉnh cuống lá, roi dài 1,5cm hay hơn Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa hình bông mo, dài hơn 1m, mọc ở gần nách các

lá phía ngọn, mỗi thân thường mang 5-10 bông mo Mỗi bông mo mang nhiều bông nhỏ dài 2-2,5cm, với 14-17 hoa Hoa đực xếp sát nhau thành 2 dãy, lá

đài 3, cánh hoa 3, nhị 6 Hoa cái tập trung 14-32 hoa trong một bông nhỏ Thường chỉ 17-20 hoa cái phát triển thành quả Quả hình trứng dài 15-20mm, rộng 9-14mm, cống mập màu xanh vàng dài 6mm, đỉnh có mũi hình nón dài 4mm, vỏ quả mang 18 vảy dọc mỗi hàng 8 vảy, khi non quả màu xanh lá cây, khi già màu vàng nhạt hạt 1, hình trái xoan, khi non màu trắng ngà, khi già màu nâu đen, rất cứng [2], [15]

1.6.2 Đặc điểm sinh học và phân bố của Song mật

Đây là loài cây cận hữu của Việt Nam, gặp ở các tỉnh từ Đồng Nai (Nam Cát Tiên) trở ra, tập trung nhất ở các tỉnh: Lai Châu, Yên Bái, Lào Cai, Phú Thọ, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Hà Giang, Hà Tây (cũ), Hoà Bình, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam Cuối thế kỷ

20 đã được mang trồng thử nghiệm ở Hoà Bình (trạm thí nghiệm Bình Thanh), Hà Nội (Viện điều tra quy hoạch rừng- huyện Thanh Trì), Phú Thọ (Vườn Quốc Gia Xuân Sơn) trên quy mô nhỏ [15]

Song mật phân bố chủ yếu ở độ cao 100-1500m trên mặt biển, tập trung nhất ở độ cao 400-900m Cây ưu sáng và ẩm, mọc trên đất feralite vàng trên núi và các loại đất phân hoá trên phiến thạch, sa thạch, granit hoặc đá vôi Cây thường mọc ven thung lũng núi đất, chân và sườn núi đá, ven các khe ẩm, nơi độ dốc 30-35o cũng gặp song mật Cây mọc trong rừng lá rộng thường xanh nguyên sinh mới bị tác động, tầng trên là các cây gỗ lớn như: Trường, sâng, Trám, Chẹo tía, Côm…Tầng lâm hạ là cây thân cỏ và dương xỉ ưa ẩm như: Sa nhân, Sẹ, Câu tích,…Ngọn Song mật luôn vươn lên các tầng cao nhất của tán rừng Sau đó lại rủ xuống và vươn lên ngọn cây khác, tạo thành các cây Song dài 40-60m Cũng gặp Song mật trong rừng các thứ sinh với vối thuốc, bồ đề chiếm ưu thế hoặc rừng nứa lá to thuần loại, rừng vầu…ở độ cao trên 800m, như ở xã Trung Thành huyện Đà Bắc tỉnh Hòa Bình trong điều kiện đầy đủ ánh sáng, Song mật cho rất nhiều quả và hạt tái sinh tốt nhưng dưới tán rừng rậm hầu như không gặp cây con tái sinh Song mật chỉ tái sinh tốt ở tàn che 0,2-0,3 hay ở ven rừng, ven suối Cây 5-6 tuổi ra hoa nhưng

thường 8 tuổi mới cho quả Chồi hoa xuất hiện tháng 9-10, hoa nở tháng 4-5 năm sau Quả chín tháng 10-11 Quả song mật ăn rất ngon nên dễ bị các loài chim và thú nhỏ đến ăn ngay khi còn non Sau khi bị chặt bụi Song mật vẫn nảy chồi mới mà không bị chết Quả Song mật có vị ngọt, ăn ngon[15]

1.6.3 Giá trị kinh tế của Song mật

Song mật là loài cây có giá trị kinh tế cao, thân Song mật dài, rất dẻo, chịu uốn và bền nên được dùng làm bàn ghế, hàng mây tre đan và cốn bè, được nhân dân ưa dùng trong nước và xuất khẩu Hiện nay, Song mật là loại nguyên liệu quan trọng nhất trong các cơ sở chế biến Song mây của các tỉnh phía Bắc Giá Song mật đắt hơn các loài Song khác khoảng 2-3 lần [2], [15]

Hiện nay nguồn Song mật dùng cho chế biến, sử dụng vẫn chủ yếu vào khai thác từ rừng tự nhiên Nguồn tài nguyên Song mật đang cạn kiệt dần Song mật rất thích hợp phát triển trong các rừng của Việt Nam, vì vậy cần phải có kế hoạch bảo vệ, khai thác hợp lý, phát triển gieo trồng và sử dụng bền vững Hiện tại cần nhân giống tạo ra nguồn lớn cây con Song mật phục

vụ vào việc sản xuất và bảo tồn Một trong những cách nhân giống hiệu quả nhất hiện nay đã và đang được cả thế giới và Việt Nam áp dụng rộng rãi là

việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật

Chương 2 MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm được phương pháp khử trùng phù hợp với vật liệu nuôi cấy là chồi măng

- Tìm được thành phần môi trường hóa học và điều kiện nuôi cấy phù hợp cho mẫu cấy tái sinh chồi

-Tạo được nguồn mẫu sạch in vitro làm nguồn vật liệu cho các nghiên

cứu tiếp theo

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định phương pháp khử trùng phù hợp cho tạo mẫu sạch

- Xác định môi trường hóa học và điều kiện nuôi cấy phù hợp cho mẫu cấy tái sinh chồi

- Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi của mẫu cấy

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể

2.3.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.3.2.1.1 Xác định phương pháp khử trùng phù hợp cho tạo mẫu sạch

Chồi măng được lấy từ phần gốc của khóm Song mật, chồi có các bẹ lá bao bọc xung quanh thân, phần gốc khe giữa các bẹ lá là nơi chứa nhiều vi

khuẩn, nấm nên việc khử trùng gặp rất nhiều khó khăn

Để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn, nấm ra khỏi mẫu vật thường phải kết hợp nhiều phương pháp khử trùng khác nhau

Theo tài liệu Street, 1974 có thể sử dụng nhiều loại hoá chất để khử trùng (diệt nấm, khuẩn) nhưng ở đây đề tài sử dụng chất khử trùng là HgCl2

0,1% và Cồn 700 Các chất khử trùng được kết hợp với các thời gian khác nhau

- Phương pháp khử trùng chồi măng:

* Chia thành 2 phương pháp khử trùng: khử trùng kết hợp cồn 700 và 1 lần HgCl2 0,1% và khử trùng kết hợp cồn 700 và 2 lần HgCl2 0,1%

♦ Khử trùng kết hợp cồn 70 0

và 1 lần HgCl2 0,1%:

+ Khử trùng sơ bộ ( bên ngoài box cấy)

Tiêu chuẩn chồi măng lấy ngoài thực địa về khoẻ mạnh, không bị sâu bệnh, thối

Dùng dao, kéo loại hết phần bẹ già, mang nhiều gai bên ngoài và phần

rễ, sau đó đem rửa sạch dưới vòi nước chảy Dùng chổi lông mềm cọ sạch dưới vòi nước chảy nhiều lần Dùng nước xà phòng loãng ngâm mẫu trong thời gian khoảng 15 phút để cho nước xà phòng ngấm sâu vào trong các bẹ lá rồi lắc mạnh cho sạch, loại bỏ xà phòng và tráng sạch dưới vòi nước chảy

Cho mẫu vào bình có nút xoáy để lắc rửa mẫu bằng xà phòng loãng trong khoảng 10 phút rồi đưa mẫu xả sạch xà phòng dưới vòi nước chảy Mẫu

sau khi đã được rửa sạch dùng nước cất tráng lại 2-3 lần, sau đó đưa vào khử trùng bằng hoá chất

Chú ý: Khi các mẫu chồi măng có các kích thước không đồng đều nhau, trước khi khử trùng nên phân loại riêng các mẫu có các kích thước bằng nhau để khử trùng riêng, đặc biệt là giai đoạn khử trùng bằng hoá chất

để tránh trường hợp các mẫu quá nhỏ hoặc quá to khử trùng cùng nhau sẽ làm ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu nảy mầm

+ Khử trùng tuyệt đối (trong box cấy):

Mẫu đã qua khử trùng sơ bộ thì được chuyển vào box cấy vô trùng để khử trùng bằng hoá chất

● Khử trùng lần 1: Dùng cồn 700

để khử trùng mẫu với thời gian 1-2 phút Loại bỏ hết cồn và tráng mẫu bằng nước cất vô trùng (lắc 3-4 lần mỗi lần 2-3 phút) cho sạch cồn trong mẫu

● Khử trùng lần 2: Sử dụng HgCl2 0,1% lắc mẫu với thời gian: 5, 7, 10 phút cho mẫu sạch sau đó loại bỏ HgCl2 0,1% và tráng sạch mẫu bằng nước cất vô trùng (lắc 3-4 lần mỗi lần 2-3 phút) cho sạch HgCl2 0,1% trong mẫu Sau đó dùng giấy thấm vô trùng thấm khô mẫu và dùng panh, dao, đĩa đã vô trùng cắt bỏ 1 phần đầu chồi măng bị hóa chất ngấm vào và cấy mẫu vào môi trường đã chuẩn bị sẵn (MS + 40g/l đường Saccharose + 7g/l Agar)