Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây trẩu ba hạt (vernicia montana lour ) qua phôi soma

- Theo Sharp và các cộng sự 1980 sự tạo phôi soma có thể được khởi đầu theo 2 con đường: + Trong một số nuôi cấy, phôi phát sinh trực tiếp không qua giai đoạn tạo mô sẹo, phôi được hình

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Hồng Gấm đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn về sự giúp đỡ nhiệt tình, tận tụy của Ban Giám đốc và toàn thể cán bộ - viên chức của Trung tâm Giống & Công nghệ sinh học, đặc biệt là ThS Hồ Văn Giảng, đã tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho bản khóa luận của tôi được hoàn thiện nhất Cuối cùng tôi xin được cảm ơn bạn bè và người thân trong gia đình đã động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu khoa học

và hoàn thiện bản khóa luận này

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Vũ Ngọc Anh

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rừng là một trong những tài sản quốc gia vô cùng quý giá, bởi rừng không chỉ mang lại cho chúng ta nguồn giá trị lớn về mặt kinh tế mà nó còn góp phần quan trọng trong việc ổn định hệ sinh thái, bảo vệ môi trường sống trong sạch cho con người Tuy nhiên, hiện nay nguồn tài nguyên rừng ngày càng trở nên cạn kiệt và suy thoái nghiêm trọng do tình trạng sử dụng một cách bừa bãi và không có ý thức, không có hiểu biết của con người Vấn đề cấp bách đặt ra là cần phải khôi phục lại nguồn tài nguyên rừng bằng các biện pháp bảo vệ và trồng mới Nhiệm vụ quan trọng hàng đầu phục vụ cho công tác trồng rừng là tạo ra được những giống cây rừng vừa đem lại giá trị kinh tế

cao, vừa thích ứng được với điều kiện lập địa nơi gây trồng

Khi khoa học kỹ thuật chưa phát triển, con người chỉ biết sử dụng các biện pháp chọn tạo và nhân giống truyền thống như: lai hữu tính, đột biến thực nghiệm, sản xuất cây con từ hạt, giâm hom, ghép cây, chiết cành Bước vào thế kỷ 21, với những ứng dụng rộng rãi và siêu việt, công nghệ sinh học

được coi là “Cuộc cách mạng xanh lần thứ 2”, nhờ đó năng suất cây trồng

được tăng cao cùng với việc giảm thiểu tác hại tới môi trường sinh thái Công nghệ sinh học thực vật đang được áp dụng rất rộng rãi và hiệu quả trong chọn tạo và nhân giống cây trồng Tuy nhiên, tại Việt Nam mới chỉ có số ít cây rừng được nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào, như: Bạch đàn, Keo, Hông, Dó trầm, Cùng với dự án trồng mới 5 triệu ha rừng trên phạm vi

cả nước, nhu cầu về số lượng cây con có chất lượng di truyền cao phục vụ cho trồng rừng là rất lớn Bởi vậy có thể nói công tác nghiên cứu nhằm chọn tạo

và nhân rộng các giống mới ở các loài cây trồng rừng phổ biến đang được

Nhà nước, Ngành hết sức quan tâm Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) là

loài cây có tên trong danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo 9 vùng sinh thái Lâm nghiệp (Theo quyết định số 16/2005/QĐ – BNN ban hành ngày 15/03/2005) Đây là loài cây bản địa có nhiều giá trị sử dụng, được trồng ở Việt Nam từ lâu đời Ở nước ta, cây Trẩu được phân bố khá

rộng từ các tỉnh miền Trung đến các tỉnh biên giới phía Bắc Việc gây trồng Trẩu ba hạt ở Việt Nam đã được tiến hành từ những năm đầu của thập niên 80 thế kỷ trước, song mục tiêu chủ yếu chỉ để thu quả và hạt dùng làm nguyên liệu lấy dầu Vì thế, mọi nghiên cứu về cải thiện giống và kỹ thuật gây trồng đều tập trung vào việc nâng cao sản lượng quả - hạt Tuy nhiên, hiện nay cây Trẩu đang được quan tâm gây trồng với mục tiêu lấy gỗ bởi Trẩu là loài cây bản địa mọc nhanh, thích nghi với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau Gỗ Trẩu màu trắng, mềm, không phân biệt giác lõi, có tỷ lệ cellulose cao, dễ chế biến, ít mối mọt, có thể sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người Chính vì thế mà vấn đề áp dụng các kỹ thuật của Công nghệ sinh học để chọn tạo và nhân giống đối với Trẩu đang bắt đầu được các nhà chuyên môn chú ý

Một trong những kỹ thuật không thể thiếu cho hàng loạt các nghiên cứu

về chọn tạo và nhân giống cây trồng theo phương pháp tiên tiến là xây dựng

hệ thống tái sinh cây Nó chính là cơ sở cho phương pháp gây tạo giống mới bằng kỹ thuật chuyển gen, lai sinh dưỡng, chọn biến dị dòng soma, cũng như cho phương pháp nhân giống thực hiện qua giai đoạn mô sẹo hay tế bào trần

Vì thế, khâu đầu tiên của bất kỳ nghiên cứu nào về các phương pháp chọn tạo

và nhân giống trên đều phải là nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây Với lý do trên, trong khuôn khổ thời gian thực tập tốt nghiệp, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) qua phôi soma” nhằm góp phần nhỏ vào việc xây dựng quy

trình chọn tạo và nhân giống Trẩu ba hạt theo các phương pháp tiên tiến

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về cây Trẩu ba hạt

1.1.1 Vị trí phân loại, nguồn gốc

Tên khoa học của loài Trẩu ba hạt là Vernicia montana Lour

Tên tiếng Anh của loài này là : Mu oil tree hay Chinese wood oil [20]

Ở Trung Quốc, một quốc gia mà loài Trẩu được trồng rất nhiều thì Trẩu

ba hạt còn được biết đến với tên gọi: Mu-yu (Webster, 1967), Shan t’ung [20]

Tại Việt Nam, cây Trẩu ba hạt còn có tên là Trẩu nhăn, Trẩu Bắc bộ, Trẩu lá xẻ và Trẩu ta [2,3,7,10]

1.1.2 Đặc điểm sinh học

Cây Trẩu là cây gỗ nhỡ có chiều cao khoảng 10 - 15 m, đường kính 25 – 40 cm, thân đơn trục thẳng Vỏ cây nhẵn màu nâu nhạt, lớp vỏ trong màu hồng, nhựa ở dạng nước trong [2]

Lá đơn mọc cách, có lá kèm sớm rụng Lá Trẩu tương đối đa dạng, có hình trứng đầu nhọn dần, đuôi thường hình tim; ở cây tái sinh hoặc cành chồi

lá thường xẻ 4 - 5 thùy; ở cây trưởng thành lá nhỏ hơn, phiến lá nguyên hoặc

xẻ 3 thùy, nách thùy có tuyến Lá non màu nâu đỏ, phủ lông màu trắng mịn ở

cả 2 mặt Gân lá hình chân vịt Cuống lá dài 7 - 12 cm, ở gốc phiến lá, đầu cuống lá có hai đốm tía nổi rõ [2, 3]

Hoa đơn tính khác gốc hoặc cùng gốc, đôi khi tạp tính Thông thường chùm hoa đực và cái mọc riêng rẽ, rất hiếm khi hoa đực và hoa cái mọc trên cùng một chùm, nếu có thì hoa cái thường nằm giữa Chùm hoa thường xuất hiện ở ngọn của một nhánh, sau khi quả rụng ở cuối nhánh, một nhánh mới mọc ra dự trữ mầm hoa cho các năm sau Hoa tự đực hình xim - ngù ở đầu cành Cánh đài 5 màu xanh, rời, màu trắng hoặc phớt hồng Nhị 8 - 20, xếp thành 2 vòng thường hợp ở gốc Hoa tự cái thường hình chùm bông, thưa hoa; bầu 3 ô lúc non phủ lông màu gỉ sắt; vòi nhụy 3 [2, 3]

Quả Trẩu hình trứng, hơi nhọn đằng đuôi, tròn đằng cuống Quả lớn khoảng 5 x 5 cm Vỏ nhăn nheo, bề mặt có lông tơ, có nhiều rãnh ngang dọc Mỗi quả chia 3 múi, khi chín quả ngả từ màu xanh, xanh vàng sang màu vàng sẫm hoặc đỏ nâu Mỗi quả thường chứa 3 hạt Hạt Trẩu có vỏ màu nâu đen, sần sùi, cứng, kích thước 1,5 x 2 cm [2, 22]

Hình 1.1: Hoa và quả Trẩu ba hạt Theo Ngô Quang Đê và Lê Mộng Chân, Trẩu là loài có hệ rễ hỗn hợp Cây dưới 1 tuổi có hệ rễ cọc phát triển mạnh, khi lớn hệ rễ cọc có thể đạt độ sâu 1,5 m Từ 2 tuổi trở lên, rễ bên phát triển mạnh, phân nhánh nhiều rộng, phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt từ 0 – 50 cm và thường dài gấp 4 - 5 lần rễ cọc

Cây Trẩu có bộ rễ phát triển mạnh thuận lợi cho cây hút chất dinh dưỡng ở những nơi đất có tầng dầy, tuy nhiên khả năng xuyên thấu của rễ kém ở những nơi đất có nhiều đá lẫn; những nơi đất tầng mỏng bộ rễ không thể phát triển bình thường [3]

1.1.3 Đặc điểm sinh thái học

1.1.3.2 Đặc điểm sinh thái học

Phạm vi thích ứng với khí hậu của cây Trẩu này rất rộng Trẩu thích hợp với vùng tương đối ấm áp, đây là nhiệt độ thích hợp nhất để Trẩu sinh trưởng, Trẩu 3 hạt đạt sản lượng quả cao ở những nơi có nhiệt độ bình quân hàng năm trên 20ºC, ẩm độ không khí từ 85 - 90%, lượng mưa từ 1000 - 2000

mm và có độ cao 300 – 400 m so với mặt nước biển Trong mùa sinh trưởng

từ tháng 4 - 7 loài cây này cần lượng mưa tương đối nhiều, nếu mưa ít thì sản lượng quả thấp [3]

Trẩu ba hạt có yêu cầu khá khắt khe đối với đất Đất thích hợp với sự sinh trưởng và phát triển của Trẩu là đất tầng dày, tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước, nhưng đủ ẩm, hơi chua (độ pH 5 - 6,5) Những nơi đất chua, kiềm, đất

bị chặt, nhiều đá lẫn hoặc sỏi sạn thì Trẩu sinh trưởng không tốt Từ các việc nghiên cứu các đặc trưng phẫu diện kết hợp với tình hình ra hoa kết quả của cây, tác giả Đỗ Thanh Hoa đã kết luận đất feralit vàng nhạt trên phiến thạch mica, đất feralit vàng đỏ trên phiến thạch sét, đất poocfiarit vàng nâu trên là thích hợp để trồng Trẩu [3]

Trẩu ba hạt là cây ưa sáng mạnh, nên ở nơi có địa hình đồi gò, trồng thưa, tán cây xòe rộng thì Trẩu kết quả nhiều Nơi khe núi, chân núi do thiếu

ánh sáng nên Trẩu ra hoa kết quả kém mặc dù cây vẫn có thể mọc tốt Tuy nhiên Trẩu không chịu được gió nên không trồng ở những nơi nhiều bão [3]

Hoa Trẩu bắt đầu nở từ tháng 4 – 6 hàng năm Mùa quả bắt đầu ngay sau đó, từ tháng 6 – 10 cùng năm

1.1.4 Các nghiên cứu về phương thức trồng và nhân giống Trẩu ba hạt 1.1.4.1 Trên thế giới

Về lịch sử nghiên cứu cây Trẩu ba hạt, phải kể đến các tài liệu để lại từ thời Pháp thuộc và đặc biệt là các tài liệu từ Trung Quốc, một nước đã quan tâm và gây trồng loài cây này từ lâu đời

Trong lĩnh vực chọn giống, các tác giả Wang JF; Fang JX; Liu XW (1988), khi nghiên cứu chọn dòng Trẩu có năng suất cao và mở rộng gây trồng đã kết luận phương pháp thích hợp cho trồng Trẩu ở Trung Quốc là sử dụng cây nhân giống vô tính từ các dòng tốt nhất thay cho việc trồng từ hạt, 3 trong số 13 dòng đã được sàng lọc, tuyển chọn, gây trồng trên diện rộng hơn

3000 ha và thu được 1168 tấn dầu [3]

Viện Lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) nghiên cứu về bệnh của cây Trẩu đã đưa ra kết luận về bệnh chổi than và bệnh khô héo thường làm

năng suất quả giảm 40 – 80% Tuy nhiên ghép Trẩu V.fordii lên gốc ghép là Trẩu V.montana lại có khả năng kháng bệnh [10]

El Borel (1942) khi đề cập đến phương pháp gây giống và sự chọn lọc

đã cho rằng nhân giống bằng hạt bao giờ cũng dẫn đến những cây không có quả hoặc có rất ít quả Ngay cả khi trồng bằng hạt lấy từ những cây sai quả, cây trồng vẫn bị phân ly rất mạnh và số cây không có quả hoặc có rất ít quả vẫn chiếm nhiều hơn Do vậy nếu chọn được cây mẹ tốt thì có thể khai thác mắt ghép từ những cây này, áp dụng cách ghép và trồng bằng cây ghép sẽ đạt hiệu quả cao [3]

1.1.4.2 Tại Việt Nam

Ở nước ta cũng có một số công trình nghiên cứu đi vào các lĩnh vực phân loại, kỹ thuật ghép cây tạo dòng vô tính

Cao Ngọc trong “Kỹ thuật gây trồng và chế biến hạt Trẩu” (1984) đã

đề cập đến sự cần thiết phải chọn giống để lấy vật liệu ghép với các tiêu chuẩn: cây Trẩu phải ở độ tuổi từ 12 - 15 năm, năng suất hạt khô đạt 10 kg/năm, có dạng tán tròn, phát đều, phân cành thấp, sinh trưởng tốt và không

bị sâu bệnh Cây trồng phải tiến hành nhân giống bằng phương pháp ghép mắt Gốc ghép cũng gieo từ hạt lấy từ cây mẹ có năng suất quả cao sau đó thành lập vườn sản xuất mắt ghép để cung cấp cho sản xuất đại trà [3]

Đinh Văn Tẫn, Nguyễn Kim Thi (1986) khẳng định nhân giống bằng phương pháp ghép có thể tạo được các dòng vô tính giúp cho việc nâng cao

năng suất quả Theo tác giả này, loài Trẩu (V montana) trồng từ hạt có sự

phân ly tính đực cao, chỉ có tác dụng trồng cây bóng mát hoặc làm rừng đầu nguồn vì tỉ lệ cây có tính đực chiếm 82% Nếu trồng lấy quả nên tiến hành trồng bằng cây ghép [3, 10]

Nguyễn Minh Thảo (1990) nghiên cứu về Trẩu ở Phủ Quỳ, Nghệ Tĩnh cho rằng Trẩu trồng thực sinh tại nhiều địa phương ở đây có tỷ lệ hoa đực rất cao, 6 năm mới có quả, tỷ lệ cây cho quả chỉ từ 10 – 30%, năng suất quả - hạt rất thấp Do vậy để Trẩu cho quả sớm, năng suất cao phải có giống tốt đã được tuyển chọn nhiều năm Những rừng trồng từ cây ghép của 2 dòng tốt sau

3 năm cho 1 tấn hạt khô/ha và tác giả đề nghị 2 dòng này nên được nhân nhanh để phục vụ sản xuất [3]

Hiện nay, đa số rừng Trẩu được trồng ở các tỉnh Lai Châu, Hòa Bình, Quảng Nam và thành phố Đà Nẵng Thường trồng bằng cách gieo hạt thẳng

để lấy gỗ, ở một số nơi trồng bằng cây ghép để thu hái quả và hạt [3]

Có thể nói rằng, trên thế giới cũng như ở Việt Nam hiện số công trình nghiên cứu và tài liệu nghiên cứu về cây Trẩu ba hạt là không nhiều Chỉ có Trung Quốc là nước trồng và nghiên cứu về Trẩu khá rầm rộ Tuy nhiên cũng chưa có công trình nào được công bố về lĩnh vực nhân giống loài cây này bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.5 Giá trị sử dụng

Trẩu là một loài cây có nhiều giá trị sử dụng:

- Hạt Trẩu có hàm lượng dầu tương đối cao, chiếm khoảng 25 – 30% theo tỷ lệ hạt Dầu Trẩu là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị bởi nó có nhiều công dụng Dầu Trẩu mau khô, tỷ trọng nhẹ, không dẫn điện, có tính chống

ẩm và chống mục tốt,… nên được sử dụng rộng rãi như: chế tạo các loại sơn cao cấp dùng trong các ngành điện tử, sơn vỏ tàu, thuyền, dùng làm sơn lót vỏ

đồ hộp do có khả năng chống kiềm mặn cao, chống gỉ Ngoài ra dầu Trẩu còn được dùng trong việc chế tạo các vật liệu cách nhiệt, cách điện và vật liệu tạo màng bóng,… Trên thế giới người ta đã thống kê được khoảng 850 mặt hàng

có sử dụng dầu Trẩu, từ các loại chất dẻo, nylon, da nhân tạo đến các loại thuốc trong y dược [2, 3, 7, 10, 22]

- Trong khô dầu Trẩu có: 77,58% chất hữu cơ, 3,5% chất đạm, 0,97% lân, 0,5% kali, nên được dùng làm phân bón rất tốt Khô dầu Trẩu chứa 50% protein, nếu khử sạch độc tố thì có thể làm thức ăn cho gia súc Vỏ quả còn có thể dùng để chế than hoạt tính [3, 7]

- Trước đây, cây Trẩu được trồng chủ yếu để lấy hạt Tuy nhiên, hiện nay gỗ Trẩu cũng đang được chú ý để khai thác bởi gỗ Trẩu có màu trắng, mềm, không phân biệt giác lõi, có tỷ lệ cellulose cao, dễ chế biến, ít mối mọt,

có thể sử dụng làm nhà, làm bao bì, làm nguyên liệu giấy và đóng các đồ mộc thông thường [2, 3, 7]

- Trong lĩnh vực y dược, vỏ Trẩu được dùng trong y học cổ truyền làm thuốc chữa đau, nhức răng Hạt có dầu còn được dùng làm thuốc giải độc, chống độc, thuốc chữa mụn nhọt [3, 22]

- Ngoài các giá trị trên, Trẩu còn được sử dụng như một cây trồng phòng hộ Do là loài cây gỗ nhỡ, mọc nhanh, dễ trồng, có tán dày, xanh về mùa hè nóng, nên Trẩu được sử dụng làm cây che bón cho các vườn Chè, Dứa, Cà phê Một số nơi trồng Trẩu như một cây phủ xanh bảo vệ đất, kết hợp cung cấp gỗ củi và các sản phẩm khác [2, 3]

1.2 Tổng quan về nhân giống vô tính in vitro qua giai đoạn tạo phôi soma 1.2.1 Cơ sở khoa học của nhân giống vô tính in vitro

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, nhà sinh lý thực vật học người Đức Gottlieb Haberlandt đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật khi ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của

cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu

ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Cho đến nay các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [16, 1, 14]

1.2.1.2 Sự biệt hóa và phản biệt hóa tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (hợp tử) Ở giai đoạn đầu, hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều

tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó từ các

tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự biệt hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau Tuy nhiên, khi tế bào biệt phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó được gọi là sự phản biệt hóa tế bào

Về bản chất thì sự biệt hoá và phản biệt hoá là kết quả của quá trình điều hoà hoạt hoá các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho

ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của các phân tử ADN ở mỗi tế bào

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào, quá trình hoạt hoá sẽ được xảy ra theo một chương trình nhất định có sẵn trong bộ gen đó [16, 1, 15, 14]

1.2.1.3 Sự trẻ hóa

Vào thế kỷ XVII, XVIII người ta cho rằng các dòng vô tính thoái hoá

đi theo tuổi và chỉ có thể trẻ hoá thông qua sinh sản bằng hạt Song thực tế cho thấy đời sống của dòng vô tính là vô hạn nếu như nó sống trong môi trường thích hợp và liên tục đổi mới bằng sinh sản sinh dưỡng Khả năng tái sinh là một dấu hiệu quan trọng xác định sự chuyển giai đoạn từ non trẻ sang trưởng thành Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau Nuôi cấy các bộ phận non trẻ sẽ ra chồi, ra rễ tốt hơn các bộ phận trưởng thành Vì vậy việc trẻ hoá là một biện pháp quan trọng trong nhân giống sinh dưỡng [1, 14]

1.2.2 Phương thức nhân giống vô tính in vitro qua phôi soma

1.2.2.1 Sự phát sinh phôi soma

Thực vật là đối tượng duy nhất mà các phôi vô tính có thể phát sinh từ các kiểu tế bào và mô ở nhiều thời điểm khác nhau của pha giao tử và bào tử

thể trong chu trình sống

Khả năng phát sinh phôi vô tính trong điều kiện in vitro lần đầu tiên

quan sát được trong nuôi cấy rễ cây Cà rốt của Steward và cộng sự (1958) Sự hình thành phôi vô tính là khá phổ biến ở thực vật bậc cao và phát sinh phôi thực nghiệm đã được thông báo trong nuôi cấy mô của hơn 30 họ thực vật [1]

- Theo Kohlenbach (1978) các phôi soma xuất hiện trong nuôi cấy in vitro từ

3 nguồn tế bào lưỡng bội nuôi cấy:

+ Tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành

+ Các mô tái sinh không phải hợp tử

+ Các lá mầm và trụ dưới lá mầm của phôi và cây con không có bất cứ

sự phát triển nào của mô sẹo [16, 15, 14]

- Theo Sharp và các cộng sự (1980) sự tạo phôi soma có thể được khởi đầu theo 2 con đường:

+ Trong một số nuôi cấy, phôi phát sinh trực tiếp không qua giai đoạn tạo mô sẹo, phôi được hình thành từ những tế bào được xác định là tế bào tiền phôi

+ Các phôi được tạo ra từ các tế bào phôi hóa cảm ứng trong mô sẹo Các phôi được khởi đầu trong mô sẹo từ các cụm tế bào ngoài liên kết với những tế bào không bào hoá mạnh [16, 15, 14]

Mỗi tế bào phôi soma đều phát triển qua các giai đoạn trước khi trưởng thành: hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hình cá đuối Có 2 sự kiện quyết định liên quan đến quá trình phát triển phôi là:

+ Cảm ứng biệt hóa tế bào của những tế bào tiền phôi

+ Biểu hiện trình tự phát triển ở các tế bào tiền phôi

Các tế bào tiền phôi có khả năng biệt hóa nhưng sự phát triển của chúng có thể bị ngăn cản do sự mất cân bằng của các chất trong môi trường nuôi cấy Sự hình thành các cụm phát triển phôi và sự kết dính phôi có thể xảy ra nếu môi trường có những nồng độ cao của Auxin sau khi tế bào phát triển phôi đã biệt hóa

Hai loại môi trường khác nhau có thể được sử dụng: một môi trường dùng cho tạo các tế bào có khả năng phát sinh phôi và một loại môi trường để cho những tế bào đó phát triển thành phôi Môi trường thứ nhất phải có auxin, môi trường thứ hai không có auxin hoặc có với nồng độ thấp

Ví dụ: Sự hình thành cấu trúc phôi trong tế bào cà rốt nuôi cấy trong

môi trường lỏng như sau: đầu tiên các tế bào phân chia mạnh để tạo thành các cụm tế bào Trong các cụm này, các phân tử của xylem được hình thành sau

đó xảy ra quá trình tạo mầm mống rễ Khi chuyển sang môi trường nuôi tiếp thì quan sát thấy hình thành chồi và sau đó là cây hoàn chỉnh Reinert quan sát thấy sự phát triển phôi xảy ra với sự thay đổi các pha phát triển (tiền phôi, globula và torpedo) ở mô mạch của mô nuôi cấy hoặc mô sẹo [16, 15, 14]

1.2.2.2 Các bước tiến hành của phương thức nhân giống vô tính in vitro

qua giai đoạn tạo phôi soma

 Bước 1: Chọn vật liệu:

- Chọn cây mẹ: Cây mẹ là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy Thông thường, cây mẹ là những cây ưu việt, có những tính trạng tốt do gen kiểm soát, đạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những đối tượng đang có nguy

cơ tuyệt chủng Cây mẹ đã qua quá trình tuyển chọn, được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên của nó rồi trồng trong điều kiện thích hợp để tiện cho việc lấy mẫu, chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh

- Tùy theo mục tiêu nghiên cứu và tùy từng loại thực vật cần nhân giống mà chọn loại vật liệu trên cây mẹ (đỉnh sinh trưởng, lá, thân, rễ,…) phù hợp làm mẫu cấy Mẫu sau khi đã chọn sẽ được khử trùng sạch

 Bước 2: Khử trùng mẫu cấy

- Đây là một bước quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn gây bệnh (nấm, khuẩn, vi sinh vật) để vô trùng mẫu cấy

- Loại hóa chất sử dụng: Tùy từng loại vật liệu chọn làm mẫu cấy mà

sử dụng các hóa chất và chế độ khử trùng khác nhau Các hóa chất có

thể sử dụng như: Cồn 70%, HgCl2 , NaOCl, Ca(OCl)2, Tween 20, Tween 80,…

 Bước 3: Sau đó cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy một thời gian các mẫu mô và cơ quan nuôi cấy sẽ phát sinh phôi soma trực tiếp từ mẫu nuôi cấy hoặc tạo ra mô sẹo

 Bước 4: Nhân nhanh mô sẹo

Nếu tạo ra mô sẹo thì nhân nhanh để tạo ra khối lượng lớn mô sẹo bằng môi trường thích hợp

 Bước 5: Tái sinh mô sẹo tạo phôi

Dưới tác dụng của các chất điều hoà sinh trưởng và các yếu tố của môi trường nuôi cấy từ mô sẹo hình thành nên phôi soma

 Bước 6: Từ phôi soma có thể tiếp tục tiến hành:

- Nhân phôi soma tạo hệ số nhân lớn tùy thuộc vào loại mẫu cấy và tìm được môi trường thích hợp

- Tái sinh trực tiếp từ phôi và nhân nhanh chồi sau đó tạo cây hoàn chỉnh

- Sử dụng phôi soma tạo hạt nhân tạo Tạo hạt nhân tạo là một phương pháp tạo một dạng mô phỏng hạt tự nhiên, một phôi soma được bọc trong một lớp alginate có chứa chất dinh dưỡng (không đường), sau đó phôi này nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh Đây là cách để bảo quản hạt, là một cách để giữ giống [16, 14, 4]

1.2.2.3 Các nhân tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi soma

1.2.2.3.1 Các chất điều hòa sinh trưởng

Trong nuôi cấy phôi vô tính, loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đưa vào môi trường nuôi cấy theo từng giai đoạn:

- Auxin: Auxin dùng cho cảm ứng hình thành tế bào phát triển phôi, nó

có vai trò hoạt hóa gen khởi đầu và thúc đẩy tăng quần thể tế bào qua phân bào liên tiếp, đồng thời ngăn cản sinh trưởng và biệt hóa tế bào hình thành các phôi Loại auxin tổng hợp như 2,4D được dùng phổ biến trong những nuôi

cấy ban đầu Những auxin khác cũng được sử dụng bao gồm: IBA, NOA, picloram, các auxin yếu là NAA, IAA cũng được dùng trong một vài hệ thống nuôi cấy

- Cytokinin: Các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh phôi soma ở các loài thực vật hai lá mầm Loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy là BAP, nhưng các cytokinin khác như kinetin, zeatin và TDZ cũng cho kết quả tốt tùy thuộc vào loài thực vật

Trong nuôi cấy tạo phôi soma, nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng là rất quan trọng đối với phản ứng sinh trưởng tối ưu của mẫu cấy Khi nồng độ quá thấp sẽ không kích thích sinh trưởng, ngược lại nồng độ quá cao có thể gây độc cho mẫu

Ví dụ: Sự phát triển của phôi vô tính cà rốt trong nuôi cấy trải qua hai

giai đoạn, mỗi giai đoạn cần có môi trường nuôi cấy riêng rẽ Các mô sẹo được nuôi cấy khởi đầu và nhân sinh khối trên môi trường giàu auxin (thường dùng 2,4D, hàm lượng 0,5 – 1,0 mg/l), ở môi trường này sự phân hóa mô sẹo xảy ra tại các nhóm tế bào phân sinh được gọi là “các cụm tế bào tiền phôi” Khi cấy chuyển sang môi trường tăng sinh, các cụm tế bào tiền phôi tiếp tục lớn dần mà không tạo các phôi trưởng thành Nếu các cụm tế bào tiền phôi được chuyển sang môi trường có hàm lượng auxin rất thấp (0,01 – 0,1 mg/l) hoặc không có auxin, chúng sẽ phát triển thành phôi trưởng thành [16]

1.2.2.3.2 Nguồn nitơ

Các dạng nitơ dùng cho nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành phôi và mỗi loại thực vật thích hợp với những dạng nitơ khác nhau trong nuôi cấy phôi cũng như đến sự trưởng thành của phôi

- Trong nuôi cấy các mẫu có nguồn gốc từ cây cà rốt dại, sự phát triển của phôi chỉ xảy ra ở môi trường có nitơ dạng khử Nuôi cấy khởi đầu mô sẹo trên môi trường có chứa KNO3 làm nguồn nitơ duy nhất Sau đó bổ sung thêm một lượng nhỏ nitơ dạng amon (5mmol/l NH4Cl) vào môi trường có 55 mmol/l KNO3 đã thúc đẩy sự phát triển phôi

- Amon dùng trong môi trường nuôi cấy thường phối hợp với các acid hữu cơ, đặc biệt là các hợp chất của acid malic và xitric

- Các nitơ hữu cơ bao gồm các aminoacid, các amit, glutamin, asparagin có tác dụng kích thích phôi phát triển Những hỗn hợp hữu cơ không xác định như cazein thủy phân, nước dừa cũng có ảnh hưởng tốt đối với hình thành và phát triển phôi, do chúng chứa nhiều thành phần khoáng, các aminoacid,…[16]

1.2.2.3.3 Agar và các chất khác

- Đa số các hệ thống nuôi cấy phôi đều sử dụng agar và nồng độ trong môi trường dao động từ 0,5 – 1,5%, nồng độ cao hơn sẽ ức chế hình thành phôi do trao đổi nước kém

Ví dụ: Trong nuôi cấy phôi cây Dactylus glomerata, các tế bào phát

triển phôi đã hình thành trên môi trường đặc SH có 0,7% agar Các phôi vô

tính cũng thu được từ mô lá và đế hoa cây Cineraria nuôi trên môi trường đặc

MS với 0,8% agar [16]

Đối với các nuôi cấy bắt đầu từ huyền phù tế bào thì môi trường lỏng

cho kết quả tạo phôi tốt hơn Ví dụ: Các phôi của cây Ca cao (Thieobrroma

cácao) khi nuôi cấy trên môi trường lỏng có kích thước gấp đôi so với ở môi

trường bán rắn

- Nguồn cácbon cung cấp năng lượng chủ yếu trong nuôi cấy phôi vô tính ở nhiều loài thực vật là các loại đường, trong đó đường sacchrose được

sử dụng phổ biến

1.2.2.3.4 Điều kiện nuôi cấy

- Ánh sáng: Ánh sáng kích thích sự nảy mầm của phôi, do đó ở giai đoạn phôi còn non được nuôi cấy trong tối để cho phôi phát triển và khi cần tái sinh thì mới chuyển phôi ra nuôi ở nơi có ánh sáng Tuy nhiên có những phôi cần ánh sáng để hình thành và phát triển, nhu cầu về cường độ và thời gian chiếu sáng cũng không giống nhau cho sinh trưởng tối ưu

Ví dụ: Trong nuôi các hạt non cây Dương vàng (Liridendron tulipifera),

khi nuôi cấy trong tối sẽ hình thành các mô phát triển phôi sau khoảng một tháng nuôi cấy [16]

- Nhiệt độ: Mặc dù các loài thực vật trong tự nhiên có biên độ sinh thái khác nhau về nhiệt độ tối ưu, nhưng để thuận tiện thì nhiệt độ thường được duy trì ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy là 25˚C

Ví dụ: Ở Cà rốt và củ Cải vàng, khi nuôi cấy mô sẹo cho phát triển phôi

ở nhiệt độ 25 ± 2˚C đã tạo được phôi bình thường [16]

1.2.2.4 Ý nghĩa của nhân giống vô tính in vitro qua giai đoạn tạo phôi

soma

Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mang lại ý nghĩa

vô cùng to lớn, bởi nó góp phần giải quyết vấn đề lý luận và thực tiễn, đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái ở nhiều thực vật từ mức độ tế bào đến cấu trúc mô

Cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro được xem

là một trong những giải pháp tối ưu có ý nghĩa khoa học trong công nghệ sinh học ứng dụng để phục vụ cho đời sống con người

Đây là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giống vô tính bởi những ưu điểm

vượt trội Nhân giống vô tính in vitro qua phôi soma là một trong các kỹ thuật

nuôi cấy mô tế bào, do vậy nó mang đầy đủ các ý nghĩa của kỹ thuật hiện đại này, đó là:

 Tạo ra một quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên được đặc tính của cây mẹ

 Có hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất để sớm phát huy được hiệu quả kinh tế

 Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ

 Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh, vì vậy đảm bảo các giống sạch bệnh

 Cây được tạo ra có độ trẻ hóa cao, thậm chí không có sự khác biệt đáng

kể so với cây mọc từ hạt

 Khắc phục được hiện tượng bảo lưu cục bộ (hiện tượng các đặc điểm không di truyền được lưu lại) thường xuất hiện trong nhân giống sinh dưỡng truyền thống

 Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển Ngoài ra việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi

 Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống

 Làm sạch virus, phục tráng những giống thoái hóa, bị bệnh

 Nhân nhanh và duy trì các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có giá trị kinh tế cao [1, 14, 18, 19]

Ngoài các ưu điểm kể trên, kỹ thuật tái sinh cây qua phôi soma còn có các ưu điểm khác:

- Phôi soma có thể bảo quản lâu dài và con người có thể chủ động cho phôi nảy mầm vào thời vụ thích hợp Từ phôi soma có thể tạo hạt nhân tạo, đây là yếu tố thuận lợi cho cơ giới hóa và tự động hóa nhân giống công nghệ

- Phương thức nhân giống in vitro qua phôi soma có hệ số nhân rất lớn,

có thể thực hiện trên quy mô công nghiệp với việc sử dụng thiết bị nuôi cấy gọi là Bioreactor Vi nhân giống truyền thống đòi hỏi một lực lượng lao động lớn sẽ hạn chế khả năng ứng dụng và tính thương mại Trong khi đó, phôi soma dễ sử dụng do chúng có kích thước tương đối nhỏ và đồng đều về kích

cỡ, chúng không cần phải được cắt thành những mảnh nhỏ và tách rời khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh Ngoài ra, phôi soma có thể bảo quản trong thời gian dài ở nhiệt độ thấp hay sấy khô, thuận tiện cho vận chuyển và sản xuất với số lượng lớn [ 4, 8,16]

- Tái sinh cây in vitro qua phôi soma là cơ sở quan trọng cho công tác

tạo giống cây trồng biến đổi gen, lai sinh dưỡng hay chọn biến dị dòng soma

1.2.2.5 Một số thành tựu của phương thức nhân giống qua giai đoạn tạo phôi soma tại Việt Nam

Cho đến nay, trên thế giới đã có khoảng 200 loài cây đã được nhân giống thành công bằng công nghệ phôi soma (phôi vô tính) Công nghệ tạo phôi soma hiện nay vẫn được coi là phương pháp nhân giống hiện đại nhất được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu

Tại Việt Nam, ngày nay đã có nhiều loại cây trồng được sử dụng phương thức nhân giống bằng việc tạo phôi soma và hạt nhân tạo như: Bông, Hồng môn, hoa Lily, hoa Địa lan, Cần tây, Đinh lăng, Quýt đường, Chuối, Khoai mì, Lát hoa, Trầm hương,…

Về đối tượng là cây lâm nghiệp đã có một số công trình nghiên cứu như sau:

* Nghiên cứu quy trình tái sinh cây Bông (Gossypium hirsutum L) từ

phôi soma của nhóm tác giả Trương Thu Thủy và cộng sự – Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam (2003) Nhóm tác giả đã nghiên cứu hệ thống tái sinh cây bông từ các bộ phận thân mầm và lá mầm thông qua giai đoạn mô sẹo, sau đó từ mô sẹo tạo phôi soma, từ phôi soma nảy mầm thành cây hoàn chỉnh Họ đã đưa ra một số kết luận như sau: đã tìm

ra được các tổ hợp chất điều khiển sinh trưởng thích hợp cho việc tạo mô sẹo

ở cây bông là: (0,1 – 0,4) mg/l 2,4D + (0,2 – 0,4 )mg/l Kinetin; 0,5 mg/l Kinetin + 2,5 mg/l NAA và (0,1 – 1) mg/l Zeatin + 0,05 mg/l NAA Chỉ mô sẹo tạo từ thân mầm mới phát triển thành phôi soma với tỷ lệ phôi trung bình tạo thành là 10% Phôi được nuôi cấy trên môi trường MS cho tỷ lệ cây sống sót cao nhất là 90% [12]

* Nghiên cứu tạo phôi vô tính ở cây Hồng môn (Anthurium

andreanum) của nhóm tác giả Đoàn Duy Thanh và cộng sự – Viện Di truyền

Nông nghiệp Họ sử dụng vật liệu nuôi cấy là mẫu lát cắt thân, lá và cuống lá

của cây Hồng môn in vitro, đưa các mẫu vào môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo

(callus), sau đó đến giai đoạn callus phôi hóa, đem nhân phôi trên môi trường lỏng, ở đây phôi phát triển theo các giai đoạn khác nhau và nảy mầm thành cây Môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l Kinetin + (1 – 5 mg/l) NAA cho tỷ

lệ tạo mô sẹo cao nhất (25%); môi trường nuôi cấy không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc có BAP (0,1 mg/l) thích hợp cho sự hình thành phôi soma; môi trường có 0,1 mg/l GA3 + 0,2mg/l BAP thích hợp cho phôi nảy mầm [13]

* Nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi soma trong công tác giống cây

Lát hoa (Chukrasia tabularis A Juss) của nhóm tác giả Bùi Thị Tường Thu,

Trần Văn Minh – Viện Sinh học Nhiệt đới - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam Vật liệu nuôi cấy là các bộ phận thân mầm, rễ mầm và lá mầm của

cây Lát hoa in vitro Đưa vào môi trường nuôi cấy để phát sinh tế bào soma

một cách trực tiếp, sau đó nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma trên môi trường agar và môi trường lỏng và bước cuối cùng là tái sinh phôi soma [11]

* Nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi soma trong công tác giống cây

Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) của nhóm tác giả Trần

Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu - Viện Sinh học Nhiệt đới - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam Ở nghiên cứu này, nhóm tác giả cũng này sử dụng vật liệu nuôi cấy là các bộ phận thân mầm, rễ mầm và lá mầm của cây Trầm

hương in vitro Đưa vào môi trường nuôi cấy để phát sinh tế bào soma một

cách trực tiếp, sau đó nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma trên môi trường agar và môi trường lỏng và bước cuối cùng là tái sinh phôi soma [15]

Chương 2 MỤC TIÊU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được loại vật liệu nuôi cấy, thành phần môi trường hóa học

và điều kiện nuôi cấy tốt nhất để tạo mô sẹo Trẩu ba hạt

- Xác định được thành phần môi trường hóa học và điều kiện nuôi cấy tốt nhất để tái sinh cây Trẩu ba hạt qua phôi soma

2.2 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng: Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.)

- Vật liệu dùng để nghiên cứu: Hạt Trẩu chín thu hoạch được thu hái từ những cây trội 10 tuổi

Hình 2.1: Hạt Trẩu ba hạt

2.3 Nội dung nghiên cứu

 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in

vitro từ phôi hạt

 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của phôi hạt

 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo

 Ảnh hưởng của loại vật liệu đến khả năng tạo mô sẹo

 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo phôi soma

từ mô sẹo

 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ phôi soma

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Giống & Công nghệ sinh học – Trường Đại học Lâm nghiệp

Các thí nghiệm được tiến hành trong môi trường với các điều kiện vật

lần, mỗi lần 1 – 1,5 phút Sau đó mẫu tiếp tục được khử trùng bằng các công thức khử trùng khác nhau

- Hạt được khử trùng trong box cấy bằng dung dịch Ethanol 70% (cồn 70%) trong thời gian 3 phút Loại bỏ cồn, rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 3 - 4 lần Sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 3 phút, 5 phút và 7 phút Rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5 lần Thí nghiệm khử trùng mẫu được trình bày bằng các công thức trong bảng 2.1:

Bảng 2.1: Công thức khử trùng mẫu hạt Trẩu

CTTN Hóa chất và thời gian sử dụng

trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro phôi hạt Trẩu

- Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu nảy mầm

- Thời gian thu thập: sau 03 ngày quan sát và ghi chép số liệu một lần

 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của phôi

hạt

Sử dụng chế độ khử trùng tối ưu (được xác định và cùng một nguồn hạt

đã được dùng trong thí nghiêm trên) để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của phôi hạt Trẩu Các công thức thí nhiệm được trình bày ở bảng 2.2:

- Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ mẫu nảy mầm, thời gian mẫu nảy mầm, chiều cao cây mầm hoàn chỉnh

- Thời gian thu thập: sau 05 ngày quan sát và ghi chép số liệu 1 lần

Bảng 2.2: Thành phần môi trường cấy mẫu phôi hạt Trẩu

CT1 1/2MS + 30 g/l đường sucrose + 7 g/l agar

CT2 MS + 30 g/l đường sucrose +7 g/l agar

CT3 MS + 1 g/l than hoạt tính + 30 g/l đường sucrose +7 g/l agar

CT4 MS + Vitamin* + 30 g/l đường sucrose +7 g/l agar

Ghi chú: Vitamin* của môi trường gồm có: Thiamin (Vitamin B 1 ): 0,4 mg/l, Acid nicotinic: 0,5 mg/l, Pyridoxin (Vitamin B 6 ): 0,5 mg/l

 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo

- Vật liệu tạo mô sẹo là thân mầm: Đoạn thân mầm được cắt thành các mảnh 0,5 cm

- Các mảnh mẫu thân mầm được cấy vào các môi trường cảm ứng tạo

mô sẹo Các môi trường nuôi cấy gồm có: MS + 30 g/l đường sucrose + 7 g/l agar và được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng với các hàm lượng khác nhau (theo bảng 2.3)

Bảng 2.3: Thành phần các chất ĐHST của môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo

BAP (mg/l) NAA (mg/l) Kinetin (mg/l) TDZ (mg/l)

- Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ tạo mô sẹo, đặc điểm của mô sẹo (hình dạng, kích thước, màu sắc) hình thành từ các loại vật liệu nuôi cấy

- Thời gian thu thập: 05 ngày quan sát và ghi chép số liệu một lần

 Ảnh hưởng của loại vật liệu nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo

- Môi trường nuôi cấy: Các môi trường cho kết quả tạo mô sẹo tốt đã được nghiên cứu ở nội dung trên

- Vật liệu dùng làm đối tượng nghiên cứu tạo mô sẹo: Các bộ phận của cây mầm: lá mầm, thân mầm và rễ mầm

- Cây con tái sinh được tách nhỏ theo các bộ phận với kích thước khác nhau:

+ Lá mầm được cắt thành các mảnh có kích thước 0,5 × 0,5 cm + Thân mầm được cắt thành các mảnh có kích thước 0,5 cm

+ Rễ mầm được cắt thành các mảnh có kích thước 0,5 cm

- Mẫu được cấy vào các môi trường cảm ứng tạo mô sẹo rồi nuôi trong điều kiện tối Khi mô sẹo đạt kích thước nhất định thì đem nuôi ở điều kiện nuôi sáng để kích thích mô sẹo tạo phôi soma

- Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ tạo mô sẹo, đặc điểm của mô sẹo (hình dạng, kích thước, màu sắc) hình thành từ các loại vật liệu nuôi cấy

- Thời gian thu thập: 05 ngày quan sát và ghi chép số liệu một lần

 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo phôi soma

từ mô sẹo

- Các khối mô sẹo tạo từ vật liệu tốt nhất được cấy chuyển sang môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở các hàm lượng khác nhau

để tạo phôi soma

- Các môi trường cảm ứng tạo phôi soma gồm có MS + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 7 g/l agar và được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng với các hàm lượng khác nhau (theo bảng 2.4)

- Chỉ tiêu thu thập: Số lượng phôi soma/cụm mô sẹo, đặc điểm của phôi soma (hình dạng, kích thước)

- Thời gian thu thập: 05 ngày quan sát và ghi chép số liệu một lần

Bảng 2.4: Thành phần các chất ĐHST của môi trường nuôi cấy tạo phôi soma CTTN

Chất điều hòa sinh trưởng

Đường sucrose (g/l) BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) NAA(mg/l)

Sau khi quan sát thấy số lượng các phôi soma hình thành đủ lớn, phôi

có dạng hình tim, hình thủy lôi hay hình cá đuối thì cấy chuyển các mẫu này sang môi trường có thành phần như bảng 2.5:

Bảng 2.5: Thành phần các chất ĐHST của môi trường nuôi cấy tái sinh chồi

CTTN Môi trường tái sinh chồi từ phôi soma

TSC1 ½ MS+ 30 g/l đường sucrose + 7 g/l agar

TSC2 MS+ 30 g/l đường sucrose+ 7 g/l agar

TSC3 MS + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 2,0 mg/l BAP +

0,5 mg/l Kinetin + 60 g/l đường sucrose + 7 g/l agar

TSC4 MS + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 2,0 mg/l BAP +

0,5 mg/l Kinetin + 0,5 mg/l NAA + 60 g/l đường sucrose + 7 g/l agar

- Chỉ tiêu thu thập: Số chồi tái sinh, đặc điểm của chồi (kích thước chồi, số lá/chồi, )

- Thời gian thu thập: 05 ngày quan sát và ghi chép số liệu một lần

Tất cả các môi trường đều được chuẩn độ đến pH = 5,7 – 5,8 và khử trùng ở điều kiện 1210C, áp suất 1,5 atm, thời gian 17 phút

2.4.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

- Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ mẫu sạch

Số mẫu sạch + Tỷ lệ mẫu sạch = x 100 %

Số mẫu cấy

Số mẫu nảy mầm + Tỷ lệ mẫu nảy mầm = x 100 %

Số mẫu sạch

Số mẫu tạo mô sẹo + Tỷ lệ tạo mô sẹo = x 100 % Tổng số mẫu cấy

+ Số lượng phôi/khối mô sẹo

Số chồi tạo thành + Tỷ lệ chồi tạo thành = x 100 %

Tổng số phôi soma

- Phương pháp xử lý số liệu:

Các số liệu được tính toán và xử lý theo phương pháp phân tích thống

kê bằng máy vi tính với ứng dụng Data Analysis của chương trình Excel 5.0