Nghiên cứu giới hạn phát hiện (LOD) biến đổi gen trong đậu tương và các sản phẩm chế biến từ đậu tương phục vụ công tác kiểm nghiệm

Tuy nhiên, ít hay nhiều, sinh vật biến đổi gen đem lại sự hoài nghi về tính an toàn trong quá trình sử dụng đối với con người và vật nuôi, thậm chí một số quan diểm cho rằng GMO có thể ả

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lưu Minh Cúc và PGS.TS Bùi Văn Thắng, những người đã tận tình hướng dẫn

em trong suốt quá trình thực tập và viết khóa luận tốt nghiệp

Em xin trân trọng cảm ơn quý Thầy, Cô trong Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã truyền đạt kiến thức trong những năm em học tập Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quý báu để em bước vào dời một cách vững chắc và tự tin

Em chân thành cảm ơn các anh, chị tại Phòng Giám định Sinh vật và Sản phẩm biết đổi gen – Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình em thực tập tại đây

Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp nghề giáp cao quý Đồng kích chúc cô và các anh, chị trong Phòng Giám định Sinh vật và Sản phẩm biến đổi gen – Viện Di truyền Nông nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt dược nhiều thành công trong công việc

n i n th n nă Sinh viên th c hi n

Nguyễn Phúc Hưng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 T NG QU N T I IỆU 3

1.1 Cây trồng biến đổi gen 3

1.1.1 Khái niệm về Cây trồng biến đổi gen 3

1.1.2 Tình hình sản xuất và thương mại hóa cây trồng biến đổi gen 3

1.1.3 Những vấn đề bàn luận xung quanh sản phẩm của cây trồng biến đổi gen

5

1.1.4 Một số sự kiện liên quan đến cay trồng biến đổi gen 7

1.1.5 Vấn đề dán nhãn sản phẩm biến đổi gen 8

1.2 Khái quát về quy trình thí nghiệm và phương pháp xác định giới hạn LOD sản phẩm biến đổi gen 9

1.2.1 Quy trình thí nghiệm 9

1.2.2 Tổng quan về phương pháp tách chiết DNA dựa trên CTAB 10

1.2.3 Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA 11

1.2.4 Khái quát về giới hạn phát liện LOD (Limit of Detection) 12

1.2.5 Các phương pháp điện di 13

1.2.6 Các phương pháp PCR 13

CHƯƠNG 2.MỤC TI U, V T IỆU V PHƯƠNG PH P NGHI N CỨU 18

2.1 Mục tiêu 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Vật liệu 18

2.4 Phương pháp tách chiết DNA 18

2.4.1 Phương pháp dựa trên CTAB 18

2.5 Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA trên máy NanoDrop2000 21

2.6 Định lượng DN đã tách chiết bằng phương pháp điện di trên gel agarose21

2.6.1 Hóa chất 21

2.6.2 Cách tiến hành 21

2.7 Realtime PCR 22

2.7.1 Thành phần phản ứng 22

2.7.2 Biểu thị kết quả 24

2.8 Xác định giới hạn phát hiện LOD 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.1 Kết quả tách chiết DNA bằng phương pháp CT B 26

3.2 Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8% 27

3.3 Kết quả Realtime PCR và xác định giá trị LOD 28

3.3.1 Kết quả Realtime PCR xác định giá trị OD đối với nền mẫu đậu tương hạt 28

KẾT LU N V ĐỀ NGHỊ 41

1 KẾT LU N 41

2 ĐỀ NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO １

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

DNA Deoxyribonucleic Acid

RNA Ribonucleic Acid

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

GM Genetically Modified (Biến đổi gen)

GMCs Genetically Modified Crops (Cây trồng biến đổi gen) GMOs Genetically Modified Organism(Sinh vật biến đổi gen) ISAAA Cơ quan dịch vụ quốc tế và khuyến khích ứng dụng

công nghệ sinh học nông nghiệp

PCR Polymerase Chain Reaction

PVP Polyvinyl-pyrrovylidon

TBE Tris-Boric acid-EDTA

TCVN Tiêu chuẩn Quốc gia

SDS Sodium decyl sulfate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các tính trạng chuyển gen được thương mại hóa 5

Bảng 2.1 : Trình tự mồi và mẫu dò sử dụng 22

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng Realtime PCR 23

Bảng 2.3: Chương trình thời gian nhiệt độ Realtime PCR 24

Bảng 3.1 : Kết quả đo nồng độ DNA trên máy NanoDrop2000 26

Bảng 3.2: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng độ 0,01%

28

Bảng 3.3: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng độ 0,01%

29

Bảng 3.4: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng độ 0,01%

29

Bảng 3.5: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 tại điểm nồng độ 0.02% 30

Bảng 3.6: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 tại điểm nồng độ 0.02% 32

Bảng 3.7: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 33

Bảng 3.8: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 tại điểm nồng độ 0,04% 35

Bảng 3.9: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 tại điểm nồng độ 0,04% 36

Bảng 3.10: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 tại điểm nồng độ 0,04% 37

Bảng 3.11: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 tại điểm nồng độ 0.1% 38

Bảng 3.12: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 tại điểm nồng độ 0.1% 39

Bảng 3.13: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở điểm nồng độ 0.1%

40

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 27 Hình 3.2 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng độ 0,01% 28 Hình 3.3 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng độ 0,01% 29 Hình 3.4 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng độ 0,01% 30 Hình 3.5 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng độ 0,02% 31 Hình 3.6 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng độ 0,02% 32 Hình 3.7 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng độ 0,02% 34 Hình 3.8 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng độ 0,04% 35 Hình 3.9 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng độ 0,04% 36 Hình 3.10 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng

độ 0,04% 37 Hình 3.11 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng

độ 0,1% 38 Hình 3.12 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng

độ 0,1% 39 Hình 3.13 Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng

độ 0,1% 40

MỞ

Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism – GMO) là những sinh vật mà vật liệu di truyền đã được thay đổi nhân tạo trong phòng thí nghiệm thông qua kỹ thuật di truyền (genetic engineering – GE)

Sinh vật biến đổi gen (GMO) được tạo ra với những mục đích sử dụng khác nhau, như tạo ta các giống cây trồng chuyển gen kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, v.v [6] Như vậy, một trong các mục đích và tiêu chí của công nghệ gen

là nhằm tạo ra những sinh vật biến đổi gen có thể đem lại những lợi ích to lớn cho loài người Tuy nhiên, ít hay nhiều, sinh vật biến đổi gen đem lại sự hoài nghi về tính an toàn trong quá trình sử dụng đối với con người và vật nuôi, thậm chí một số quan diểm cho rằng GMO có thể ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái vì quần thể GMCs (Genetically Modified Crops - GMCs) gây ra hiện tượng độc canh làm xáo trộn các sinh cảnh và hệ sinh thái, làm giảm đa dạng sinh học do các loài sinh vật khác không thể thích nghi nhanh với việc sử dụng ngay cây biến đổi gen làm thức ăn được [8]

Đến nay, đã có 495 sự kiện chuyển gen được phê chuẩn, tập trung chủ yếu vào một số cây trồng chính như ngô (231 sự kiện); bông (59 sự kiện); khoai tây (47 sự kiện); cải dầu (40 sự kiện); đậu tương (36 sự kiện) và các loại cây trồng khác Các nước sử dụng sản phẩm biến đổi gen làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi cũng tăng lên đến 40 nước, trong đó có cả Cộng đồng châu Âu (EU), tính là một nước [9] Việt Nam đã cấp phép 21 sự kiện ngô, đậu tương biến đổi gen sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Đây là một bước tiến quan trọng trong khâu quản lý để đảm bảo an ninh lương thực trong nước và quyền lợi người tiêu dùng khi các thông tin về sản phẩm trở nên minh bạch, công khai hơn Các quyết định của cơ quan quản lý về việc có cấp phép hay không đối với một

số hoạt động liên quan đến sinh vật biến đổi gen được dựa trên quy trình phân tích nguy cơ nghiêm ngặt, trong đó tập trung vào các bằng chứng khoa học và tư

chứng minh về tính an toàn của các sản phẩm được tạo ra từ các loại cây trồng biến đổi gen (ISAAA, 2016) Thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật và sản phẩm biến đổi gen trải qua nhiều thử nghiệm hơn bất cứ thực phẩm nào trong lịch sử

Đối với Việt Nam, việc phát hiện biến đổi gen trong các sản phẩm thực phẩm và thực hiện dán nhãn không liên quan đến an toàn thực phẩm mà chính là

để đảm bảo quyền lựa chọn của người tiêu dùng Trong quá trình xây dựng phương pháp định tính, định lượng biến đổi gen trong các sản phẩm nông sản, thực phẩm, việc xác định giới hạn phát hiện (Limit of detection - LOD), giới hạn định lượng (Limit of quantification - OQ) là bước quan trọng nhất để khẳng định năng lực của phòng thử nghiệm

Chính vì vậy, để phần nào phục vụ tốt hơn cho công tác giám định cây

trồng và sản phẩm biến đổi gen; tôi đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu giới hạn phát hiện (LOD) biến đổi gen trong đậu tương và các sản phẩm chế biến từ đậu tương phục vụ công tác kiểm nghiệm”, qua đó khẳng định độ tin cậy, chính xác về mặt kỹ thuật của các phòng thí nghiệm hoạt động theo tiêu chuẩn

quốc tế ISO/IEC 17025 theo tiêu chí toàn cầu hóa “M t tiêu chuẩn - m t lần thử

nghi m - được chấp nhận ở mọi nơi”

CHƯƠNG 1

NG N TÀI LIỆU 1.1 Cây trồng biến đổi gen

1.1.1 Khái niệm về Cây trồng biến đổi gen

Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) là loại cây trồng được tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển một hoặc một số gene chọn lọc nhằm tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn

Đậu tương biến đổi gen được tạo bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại để chuyển một hoặc một số gen có giá trị để tạo ra giống đậu tương mang những tính trạng mong muôn như chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường, hay chống chịu sâu bệnh, cho năng suất cao

1.1.2 Tình hình sản xuất và thương mại hóa cây trồng biến đổi gen

Theo số liệu báo cáo của Trung tâm dịch vụ Quốc tế và tiếp thu các ứng dụng Công nghệ Sinh học trong Nông nghiệp (IS , 2015), đến nay các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi gen cho 24 loại cây trồng khác nhau với 364 sự kiện (Event) chuyển gen đã được tạo ra, bao gồm các nhóm cây lấy hạt, cây lấy dầu, cây lấy củ, cây lấy quả, cây lấy sợi và cây hoa

 Tình hình phát triển cây trồng biến đổi gen

Theo báo cáo hàng năm của IS , sau 19 năm phát triển (kể từ năm 1996), các loại cây trồng chuyển gen được thương mai hóa ngày càng tăng qua các năm Tính riêng năm 2014, cây trồng biến đổi gen được trồng rộng rãi tại 28 nước với tổng diện tích khoảng 181,5 triệu ha (số nước trồng cây biến đổi gen tăng 4 lần, diện tích tăng hơn 100 lần so với năm 1996), tỷ lệ tăng trưởng hằng năm khoảng 3 đến 4% Trong đó Hoa kỳ là quốc gia đứng đầu về diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới (73,1 triệu ha, chiếm 40%), tiếp đến là Barazil

triệu ha) Điều đáng chú ý là số các quốc gia đang phát triển đưa cây trồng biến đổi gen vào canh tác ngày càng tăng trong khi các nước phát triển (đặc biệt là các nước châu Âu) rất hạn chế mở rộng diện tích Khoảng 10 năm đầu, từ 1996-

2006, các nước đang phát triển sử dụng cây trồng biến đổi gen trong canh tác còn rất ít Tuy nhiên, khoảng cách đã dần thu hẹp ở các năm sau đó

Trong 3 năm gần đây, diện tích cây trồng biến đổi gen ở các nước đang phát triển luôn cao hơn các nước phát triển (khoảng 100 triệu ha năm 2016 so với 81 triệu ha năm 2014) Điều này cho thấy, cây trồng chuyển gen đang đóng góp tích cực cho phát triển nông nghiệp và tăng trưởng kinh tế đặc biệt là các nước đang phát triển do giảm được chi phí sản xuất, nâng cao năng suất Dựa vào kết quả của 147 nghiên cứu được thực hiện trong 20 năm cho thấy, việc trồng cây chuyển gen đã giảm 37% lượng phân bón hóa học, tăng 22% năng suất cây trồng, lợi nhuận của người nông dân tăng 68% Ngoài ra, việc trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu bệnh hại đã giảm đáng kể lượng thuốc trừ sâu sử dụng, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường, cân bằng sinh thái

Mặc dù rất nhiều gen được ứng dụng chuyển vào trong cây nhưng cho tới nay mới chỉ có 7 nhóm tính trạng được phép thương mại hóa (Bảng 1.1), bao gồm khả năng chống chịu các stress phi sinh học, năng suất hạt, kháng côn trùng, kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao chất lượng, kiểm soát sự thụ phấn Trong đó 3 nhóm cây trồng chuyển gen được canh tác chủ yếu gồm: kháng thuốc diệt cỏ (trên 100 triệu ha), đa tính trạng (khoảng 50 triệu ha), kháng côn trùng (khoảng

27 triệu ha) Đậu tương, bông, ngô và cây cải dầu là 4 cây trồng được canh tác rộng rãi nhất Trong tổng số 111 triệu ha đậu tương, giống chuyển gen chiếm 85% diện tích, bông chiếm 68% trong tổng số 37 triệu ha, ngô chiếm 30% trong tổng số 184 triệu ha, cải dầu chiếm 25% trong 36 triệu ha

Bảng 1.1: Các tính trạng chuyển gen được thương mại hóa

Chống chịu stress phi sinh

học

Ngô, mía đường

Tăng năng suất hạt Đậu tương

Kháng bệnh Đậu, đu đủ, mận, khoai tây, bí, ớt ngọt, cà chua Kháng thuốc diệt cỏ Alfalfa, cải dầu, cẩm chướng, bông, lanh, ngô,

rau diếp xoăn, khoai tây, đậu tương, thuốc lá, lúa, lúa mì, củ cải đường

Kháng côn trùng Alfalfa, cải dầu, cẩm chướng, bông, lanh, ngô,

rau diếp xoăn, khoai tây, đậu tương, thuốc lá, lúa, lúa mì, củ cải đường

Nâng cao chất lượng Alfalfa, táo, cải dầu, cẩm chướng, ngô, chanh,

petunia, khoai tây, hoa hồng, lúa, đậu tương, thuốc lá, cà chua

Kiểm soát thụ phấn Cải dầu, rau diếp xoăn, ngô

1.1.3. Những vấn đề bàn luận xung quanh sản phẩm của cây trồng biến đổi gen

 Những quan điểm ủng hộ sinh vật biến đổi gen

Hiện nay, những nười ủng hộ nhiệt tình việc sử dụng sinh vật biến đổi gen cho rằng: có thể sản xuất được hạt giống chống lại được những điều kiện khắc nghiệt của môi trường; tạo ra vật nuôi có năng suất hơn; tạo ra cây trồng cho năng suất cao ở đất nghèo dinh dưỡng; giảm được nhu cầu sử dụng hóa chất; có thể tạo ra vacxin hoặc dễ dàng hơn trong việc xác định những căn bệnh bằng cách sử dụng dấu hiệu của gen hoặc xác định sớm các gen dị tật [3]

Theo cuộc điều tra của Hội đồng Thông tin Thực phẩm Quốc tế (IFIC) năm 2012, 69% người tiêu dùng Hoa Kỳ tin tưởng vào sự an toàn của nguồn

Nghiên cứu công bố trên tạp chí Nature của các nhà nghiên cứu tại Học viện Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc cho rằng cây trồng biến đổi di truyền

có khả năng kháng sâu bệnh có thể cắt giảm việc sử dụng thuốc trừ sâu xuống một nửa từ năm 1997 đến năm 2012 [10]

Theo tạp trí Science xuất bản tháng 2 năm 2016, các nhà sinh học thực vât

(ASBP) ủng hộ việc sử dụng kỹ thuật như một công cụ hữu hiệu để thúc đẩy an ninh lương thực và giảm tác động tiêu cực đến môi trường của nông nghiệp SBP đã thu thập được hơn 1400 chữ ký từ cộng đồng của các nhà khoa học thực vật, các quan chức trong một số tổ chức chính phủ và khoa học trên toàn thế giới, cho thấy sự đồng thuận rõ rang về việc sử dụng công nghệ biến đổi gen cho cây trồng là an toàn và hiệu quả [11]

Các cuộc khảo sát trực tuyến năm 2016 đã thu được trên 2.000 phiếu trả lời, trong đó hai phần ba bày tỏ sự ủng hộ đối với thực phẩm biến đổi gen, miễn

là các sản phẩm này không gây hại cho sức khỏe cộng đồng và môi trường Hơn nữa, gần một nửa (44%) nói rằng về nguyên tắc họ chấp nhận các loại cây trồng, trong khi 10% tin rằng thực phẩm biến đổi gen là giải pháp duy nhất để nuôi sống số dân ngày càng tăng Có 27% số người được hỏi cho rằng họ không chấp nhận các phương pháp tham gia vào việc sản xuất thực phẩm biến đổi gen [17]

 Những quan điểm phản đối sinh vật biến đổi gen

Những ý kiến phản đối việc sử dụng lúa mì biến đổi gen cho rằng loài người đối mặt với nguy cơ thiếu lương thực là do việc khai thác không bền vững

hệ sinh thái, ngay cả việc sử dụng sinh vật biến đổi gen cũng không giải quyết được những vấn đề khác của loài người như bùng nổ dân số, sự can thiệp vào nông nghiệp quá mức, thiếu năng lượng Vì vậy, điều cần thiết không phải sinh vật biến đổi gen mà là những phương pháp nông nghiệp hiện đại Hơn nữa, sử dụng lúa mì biến đổi gen có thể đưa những thay đổi DN vào người mà chưa thể dự báo trước được [8]

Người dân ở một số nước lo lắng về việc chính phủ nhiều nước hoãn thu mua lúa mì biến đổi gen khi họ đã làm ra, trong khi họ hoàn toàn phụ thuộc vào

nhà cung cấp hạt giống cây biến đổi gen, vì lý do bản quyền, họ không còn khả năng tạo ra và giữ lại được giống từ chính cây họ trồng để dùng cho những năm tiếp theo [5]

Theo Michael Antoniou và cộng sự, một lượng lớn và ngày càng tăng của các bằng chứng khoa học có uy thế khác nhau cho thấy rằng những tuyên bố ủng

hộ cây trồng biến đổi gen có thể là không đúng Các bằng chứng được trình bày trong báo cáo chỉ ra rằng cây GM được làm trong phòng thí nghiệm, sử dụng công nghệ hoàn toàn khác so với phương pháp tự nhiên, không được điều chỉnh một cách hợp lý để đảm bảo an toàn, không tăng tiềm năng, không những không giảm việc sử dụng thuốc trừ sâu mà còn làm tăng việc sử dụng chúng, tạo ra những vấn đề nghiêm trọng đối với nông dân, bao gồm các loại cây trồng siêu sâu chịu thuốc diệt cỏ, chất lượng đất bị phá hoại, cây trồng bị mẫn cảm, làm ảnh hưởng đến chất lượng đất, phá vỡ hệ sinh thái và giảm đa dạng sinh học không thể giải quyết vấn đề đói nghèo trên thế giới mà còn làm phân tán sự chú

ý đến các nguyên nhân thực sự gây đói nghèo[12]

1.1.4 Một số sự kiện liên quan đến cay trồng biến đổi gen

IITA (Viện Nông nghiệp nhiệt đới quốc tế) đưa ra giống đậu tương tốt hơn cho nông dân châu Phi.Ba giống đậu tương mới được phát triển bởi IIT đã được đưa ra tại Malawi và Nigeria Giống đậu tương TGx1740-2F được phát triển bởi IITA và Sở nghiên cứu nppng nghiệp Dịch vụ Malawi (DARS), trong khi các giống TGx1987-10F và TGx1987-62F được phát triển bởi IITA và Viện nghiên cứu ngũ cốc Quốc gia Nigeria (NCRI) Việc đưa ra giống đậu Malawi đã được sự chấp thuận của Ủy ban Khai báo Công nghệ nông nghiệp (ATCC) ngày 18/1/2011, và việc đưa ra 2 phiên bản khác đã được phê duyệt bởi Ủy ban công

bố giống của Nigeria ngày 02/12/2010 Nhà tạo giống đậu tương của IITA ông Hailu Tefera cho biết TGx1740-2F vượt quá sản lượng hạt giống được trồng rộng rãi là Magoye tại nhiều điểm thử nghiệm trong hai năm qua.“Tại Nigeria, giống sinh trưởng vừa là TGx1987-10F và TGx1987-62F đã chứng minh khả

năng rất cao trong việc chống bệnh rỉ sét, bạc lá vi khuẩn và đốm lá Cercospora”, ông Ranajit Bandyopadhyay, nhà nghiên cứu bênh học tại IITA cho biết

Tháng 7 năm 2016, hơn 100 học giả đoạt giải Nobel đã ủng hộ GMOs và việc đổi mới công nghệ sinh học trong nông nghiệp bằng cách ký một lá thư kêu gọi Tổ chức Hòa bình xanh chấm dứt hành động phản đối GMO, đặc biệt với Gạo vàng Họ cũng kêu gọi các chính phủ trên toàn thế giới từ chối chiến dịch của Tổ chức Hòa bình xanh chống lại Gạo vàng và các loại cây trồng, thực phẩm mới được tạo ra bằng công nghệ sinh học nói chung Bức thư được gửi đến các nhà lãnh đạo của Tổ chức Hòa bình xanh, Liên Hiệp Quốc và các chính phủ trên toàn thế giới Bức thư đã dẫn rằng các cơ quan khoa học và pháp lý trên toàn thế giới đã thống nhất và luôn khẳng định rằng các loại thực phẩm và cây trồng được cải tiến bằng phương pháp công nghệ sinh học là an toàn tương đương, thậm chí an toàn hơn những thực phẩm và cây trồng được phát triển bằng những phương pháp truyền thống khác Chưa có một trường hợp nào cho thấy các tác động tiêu cực lên sức khỏe con người hay động vật khi ăn các loại thực phẩm và cây trồng biến đổi gen á thư đã kêu gọi mạnh mẽ chính phủ các quốc gia trên toàn thế giới thực hiện mọi giải pháp có thể trong quyền hạn của mình để phản đối các hành động của Tổ chức Hòa bình xanh; và tạo điều kiện để nông dân có thể tiếp cận nhanh nhất với các công cụ sinh học hiện đại, đặc biệt là các giống cây trồng biến đổi gen

1.1.5 Vấn đề dán nhãn sản phẩm biến đổi gen

Trong cuộc tranh luận xung quanh thực phẩm biến đổi gen (GM), tranh cãi liên quan về việc liệu sản phẩm thực phẩm biến đổi gen phải được dán nhãn hay không Các tranh cãi này xảy ra trên các tập đoàn kinh tế và các nhà làm chính sách, chủ yếu là ở Mỹ và châu Âu [13]

Người tiêu dùng thực phẩm phải có đầy đủ thông tin về những gì họ tiêu thụ, các thuộc tính của sản phẩm và các tác động tức thì hay lâu dài liên quan đến việc tiêu thụ hang hóa hoặc dịch vụ Đối với sản phẩm biến đổi gen, thông qua việc ứng dụng các quy trình công nghệ sinh học trong nông nghiệp phức tạp,

rất khó để người tiêu dùng có thể hiểu biết các kỹ thuật khoa học đã được dùng trong sản xuất hàng hóa, tác dụng của việc tiêu dùng các sản phẩm đó lên sức khỏe trong ngắn hạn và dài hạn, hoặc ảnh hưởng của sản xuất và tiêu dùng đến các vấn đề rộng hơn như môi trường, đạo đức và tôn giáo Nếu thiếu đi các thông tin đầy đủ như trên, người tiêu dùng được cho là thiếu chủ quyền và không thể đưa ra quyết định tiêu dùng hợp lý [14]

Bắt đầu từ tháng 1 năm 2016, thực phẩm biến đổi gen (GM) tại Việt Nam phải được ghi nhãn theo quy định tại Thông tư liên tịch số 45/2015/TTLT-BNNPTNT-BKHCN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn và Bộ Khoa học và Công nghệ[1] Đối tượng áp dụng của Thông tư này là các sản phẩm thực phẩm có chứa ít nhất một thành phần GM chiếm trên 5% của tổng số các thành phần của sản phẩm Sản phẩm GM với tổng diện tích ghi nhãn nhỏ hơn 10cm2, nhà sản xuất phải ghi cụm từ “biến đổi gen” trên nhãn Thực phẩm chuyển gen

có nhãn không đúng quy cách sẽ không được phép sản xuất, kinh doanh bắt đầu

từ tháng 1 năm 2016 Nếu đến ngày đó, các loại thực phẩm đang lưu hành trên thị trường, chúng có thể tiếp tục được phép kinh doanh cho đến ngày hết hạn sử dụng Thực vật, động vật GM tươi và sống, thực phẩm GM không đóng gói, và những sản phẩm chỉ để xuất khẩu là một số mặt hàng không thuộc đối tượng quy định này

1.2 Khái quát về quy trình thí nghiệm và phương pháp xác định giới hạn LOD sản phẩm biến đổi gen

1.2.1 Quy trình thí nghiệm

Về cơ bản, các mẫu thử nghiệm của phòng thí nghiệm đề được xử lý theo quy trình sau:

Kết quả của phòng thí nghiệm sẽ dựa trên kết quả sàng lọc với promoter 35S và Terminator TNOS để kết luận là mẫu cho kết quả âm tính hay dương tính với loại gen được sàng lọc

1.2.2 Tổng quan về phương pháp tách chiết DNA dựa trên CTAB

Phương pháp này có thể dùng để chiết DNA từ thực vật và các loại chất nền có nguồn gốc thực vật, đặc biệt do có khả năng loại bỏ các hợp chất polisacarit và polyphenol vốn có ảnh hưởng đến chất lượng DN Phương pháp này có thể dùng cho các loại chất nền khác, thông dụng trong việc chuẩn bị DNA ở các phòng thí nghiệm

Qua bước phân giải bằng nhiệt với sự có mặt của CTAB, tiếp theo là các bước loại bỏ các tạp chất như polisacarit và các protein mà thu được sản phẩm là DNA tổng số tinh sạch[15]

Đối với một vài loại chất nền, cần tiến hành một số bước có sự tham gia của enzyme khác nhau Alpha-amylaza được cho vào dung dịch đệm phân giải

để thủy phân các tinh bột khi các chất nền có chứa nhiều tinh bột Việc xử lý

mẫu bằng proteinaza-K là cần thiết đối với nhiều loại chất nền khi việc kết tủa đồng thời RNA có thể làm nhiễu phép phân tích tiếp theo

Nồng độ muối trong suốt quá trình tách chiết là rất quan trọng trong việc loại bỏ các tạp chất, vì sự kết của của axit CTAB-nucleic sẽ xảy ra nếu nồng độ muối giảm xuống thấp khoảng 0,5 mol/l ở nhệt độ phòng và/hoặc nếu nhiệt độ giảm xuống dưới 160C Bằng cách tăng nồng độ muối, việc loại bỏ các protein

đã biến tính và polysacarit được tạo phức với CTAB sẽ được thực hiện, lúc đó axit nucleic sẽ được hòa tan Clorofom được dùng để tách tiếp các axit nucleic

ra khỏi CTAB và các hợp chất polysacarit/protein

Cuối cùng, các axit nucleic được tinh sạch bằng kết tủa isopropanol và rửa bằng ethanol

1.2.3 Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA

Để xác định độ tinh sạch và hàm lượng hỗn hợp DN , RN thu được sau khi tách chiết, người ta dùng phương pháp đo quang phổ và phương pháp điện di

Phương pháp đo quang phổdựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng có bước sóng khác nhau của các bazơ nitơ của các phân tử DNA mạch kép hoặc đơn Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (Optical Density – OD260) cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch

Một đơn vị OD ở bước song 260nm ký hiệu là A260nm

A260nm= 50 µg/ml cho dung dịch DNA mạch kép

A260nm= 33µg/ml cho dung dịch DNA mạch đơn

A260nm= 40µg/ml cho dung dịch RNA

Công thức xác định hàm lượng DNA trong dung dịch:

cDNA (µg/ml)= 50 x A260nm x hệ số pha loãng

Để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DN , người ta đo dung dịch tại bước sóng A280nm là mức hấp thụ cực đại của protein Nhưng protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm do đó làm sai lệch giá trị thật sự của nồng độ axit nucleic

- Nếu tỉ lệ A260nm/A280nm > 2 nhiễm RNA, DNA bị biến tính hoặc phân hủy

- Nếu tỉ lệ A260nm/A280nm< 1.8 dung dịch lẫn tạp chất

1.2.4 Khái quát về giới hạn phát liện LOD (Limit of Detection)

Thông thường, từ “độ nhạy” được dùng để biểu thị khả năng của một phương pháp phân tích hoặc dụng cụ phân tích khi nói về khả năng phát hiện một lượng rất nhỏ hợp chất Ngày nay, độ nhạy là một thuật ngữ dùng để chỉ mức độ đáp ứng phát hiện liên quan đến hàm lượng của một thành phần trong mẫu một cách chính xác, “giới hạn phát hiện” hay “giới hạn định lượng” là một chỉ số của khả năng phát hiện

Định nghĩa: Giới hạn phát hiện ( OD) là lượng hoặc nồng độ thấp nhất của trình tự gen đích có thể phát hiện nhưng không nhất thiết định lượng được

OD được xác định trong cả phương pháp định tính, định lượng [2]

- OD tương đối (%): có thể phân tích một vật liệu dương tính (ví dụ 0.1%) trong tối thiểu 10 lần lặp, nếu cả 10 kết quả lặp là dương tính, điều đó có nghĩa là OD bằng hoặc thấp hơn giá trị được đo

- LOD tuyệt đối (số bản sao): để tính toán LOD của phương pháp ở mức tin cậy 95%, cần phân tích tối thiểu 10 kết quả lặp lại PCR, tính toán giá trị dương tính giả Nếu tỉ lệ dương tính giả <5%, tại đó, chính là giá trị LOD tuyệt đối

Tiêu chí đánh giá: Đối với sản phẩm biến đổi gen, ngưỡng dán nhãn của Việt Nam là 5% (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Khoa học và Công nghệ, 2015) Giá trị OD của phương pháp nên thấp hơn 20 lần nồng độ mục tiêu, liên quan đến ngưỡng kiểm soát theo luật định, thì OD nên < 0,25%

để đảm bảo độ chính xác của phương pháp

Giá trị LOD rất có ý nghĩa trong phương pháp định tính, được dùng để đánh giá chất lượng phòng thử nghiệm, bao gồm các tiêu chí: con người, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất theo tiêu chuẩn phòng thử nghiệm ISO/IEC 17025

1.2.5 Các phương pháp điện di

1.2.5.1 Điện di trên gel agarose

Agarose là một polymer trung tính tạo nên từ tính đông tụ của agar Cấu trúc của agarose không đồng nhất: vừa tích điện, vừa trung hòa Trong phân tử

có chứa nhóm sunfat, metoxyl, cacboxyl.Hàm lượng sunfat trong agarose được coi là chỉ số độ sạch của agarose.Chỉ số này càng thấp thì chất lượng càng cao

và ngược lại, thường trong agarose có 0.04% sunfat

Đây là phương pháp thông dụng để xác định nồng độ DNA trong các dung dịch Điện di gel agarose của DNA và nhuộm màu ethidium bromua (EtBr) đưa ra cách ước tính số lượng DNA và phân tích tại cùng một thời điểm trạng thái tự nhiên của chúng (ví dụ: độ phân hủy, sự có mặt của RN còn dư và một

số tạp chất) Phương pháp này có thể áp dụng để kiểm tra nếu DN chưa đủ sạch và có thể còn chứa các tạp chất hấp thụ tia UV[16] Điện di gel thường không được khuyến cáo để định lượng DN đã bị biến tính.Trong trường hợp này, có thể áp dụng các phương pháp khác

1.2.5.2 Điện di trên gel polyacrylamide

Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các đơn phân

tử acrylamide và N, N’- merthylene-bis-acrylamide Trong đó acrylamide là một đơn phân tử có cấu trúc CH2=CH-CO-NH2 và bis-acrylamide có cấu trúc

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

Phương pháp này dung trong phân tách các phân tử DN có kích thước nhỏ hơn 500 nucleotide Điện di trên gel polyacrylamide có thể tách riêng từng phân tử DNA khác biệt 1 nucleotide

1.2.6 Các phương pháp PCR

1.2.6.1.Tổng quan về phương pháp PCR

Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản để khuếch đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không cần sự có mặt của các tế bào.Kĩ thuật này được gọi là Polymerase Chain

bản) DNA trong phòng thí nghiệm Thành phần phản ứng PCR DNA sau khi được tách chiết sẽ được bổ sung vào eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR

 Thành phần phản ứng PCR

- DNA mẫu (DNA cần khuếch đại): không cần độ tinh sạch cao, DNA khuôn có thể là mạch đơn hoặc mạch đôi của mỗi đoạn DN hay RN , thường dài từ 300bp trở lên, được biết trước trình tự ở 2 đầu thiết kế mồi Thông thường, lượng DNA khuôn cho mỗi phản ứng nên sử dụng khoảng dưới 1µg đối với DNA hệ gen

- Các mồi (primer): gồm mồi xuôi và mồi ngược Là những đoạn oligonucleotide mạch đơn dài 6-100bp, có trình tự bazơ nitơ bổ trợ với bazơ nitơ của 2 đầu đoạn DN khuôn Nó được sử dụng để làm mồi cho sự khởi đầu quá trình tổng hợp DN Các đoạn mồi cần mang tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng

- Enzyme Taq DNA Polymerase chịu nhiệt Thông dụng nhất là Taq DNA polymerase Taq DNA polymaresa có trọng lượng phân tử 94kDa và hoạt động tốt nhất ở 70-80oC

- dNTP: các loại nucleotide triphosphate như: d TP, dTTP, dCTP, dGTP

- Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturing)

Phân tử DN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường

là ở 94-95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút

- Bước 2: Giai đoạn lai hay gắn denaturing mồi (Annealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn.Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 giây – 1 phút

- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay giai đoạn kéo dài (elongation)

Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC Thời gian phụ thuộc vào cả DN polymerase và chiều dài DN cần khuếch đại.Một chu kỳ bao gồm nhiều bước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Số lượng chu kỳ khoảng từ 35 đến 40

-1.2.6.2.Realtime PCR

Là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DN đích trong ống nghiệm, thành hàng tỷ bản sao, được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau đó để phát hiện sản phẩm nhân bản (điện di sản phẩm PRC trên gel agarose hoặc lai với các đoạn dò đặc hiệu trên màng, giếng, )

Real-time PCR là một cải tiến của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm

1991 Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen,…) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (F M, HEX,…)

Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang màu FAM (mẫu dò TaqMan) đặc hiệu cho đoạn gen được nhân bản, sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR Mẫu dò TaqMan bao gồm một đoạn DNA mạch đơn dài khoảng 30-40 nucleotide đặc hiệu cho vùng gen mục tiêu cùng với phân tử phát huỳnh quang (reporter) và phân tử thu hút huỳnh quang (quencher) được gắn cộng hóa trị ở hai đầu Khi mẫu dò còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút

mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’-3’ exonuclease của Taq DNA polymerase Lúc này phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCR được tạo ra

Biểu đồ nhân bản của Realtime PCR có các đặc tính

sau:

- ường nền (baseline): được định nghĩa là số chu kỳ PCR trong đó tín

hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị Theo mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15

và có thể thay đổi

- Ngưỡng (Threshold): là một giá trị huỳnh quang được xác lập một

cách tùy ý, dựa trên đường nền Một tín hiệu huỳnh quang phát hiện trên ngưỡng được xem là tín hiệu đặc hiệu, và sẽ được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng Ngưỡng được thiết lập theo từng thí nghiệm và nó thường cắt tất cả các đường tín hiệu đặc hiệu trong pha nhân bản cấp số mũ (exponential phase)

- Chu kỳ ngưỡng ( Threshold cycle – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ

PCR mà ở đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng Nói cách khác, đó

là số chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền Đây chính là nguyên lý cơ bản của real-time PCR và là yếu tố quyết định tính chính xác là lặp lại của kết quả Số trình tự mục tiêu trong mẫu ban đầu càng cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhỏ, nghĩa là giá trị Ct càng thấp

Hỗn hợp phản ứng PCR chứa một cặp mồi được thiết kế bắt cặp đặc hiệu vùng trình tự gen để nhân bản một trình tự gen mục tiêu có kích thước biết trước Sản phẩm nhân bản được phát hiện bởi tín hiệu huỳnh quang có được do sự phân cắt mẫu dò TaqMan đánh dấu màu F M đặc hiệu.Từ biểu đồ nhân bản, có thể xác định được sự vắng mặt hay có mặt của gen cần xác định

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu Đậu tương hạt, bột đậu tương, đậu

hũ, thức ăn chăn nuôi và sữa đậu nành

- Thực hiện và phân tích sản phẩm của phản ứng Realtime PCR với các mẫu DNA tổng số từ các mẫu Đậu tương hạt, bột đậu tương, đậu hũ, thức

ăn chăn nuôi và sữa đậu nành bổ sung thành phần sản phẩm biến đổi gen

+ Đậu tương MON87705: Đậu tương tăng cường hàm lượng axit oleic và chống chịu thuốc trừ cỏ Roundup gốc glyphosphate

+ Đậu tương MON87701: Đậu tương kháng sâu bộ cánh vảy

+ Đậu tương MON87708: Đậu tương chống chịu thuốc trừ cỏ Dicamba + Toàn bộ các chất chuẩn CRM và mẫu nền được phòng thử nghiệm cung cấp

2.4 hương pháp tách chiết DNA

2.4.1 Phương pháp dựa trên CTAB

a Hóa chất