Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp GP5 m của virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực tập, hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp, tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam em đã nhận

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập, hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp, tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ tận tình của các giáo viên hướng dẫn,cùng các thầy cô và cán bộ nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Viện, với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Hà, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới NCS.ThS Nguyễn Thị Minh Hằng, PGS.TS Phạm Bích Ngọc đã giúp đỡ, giảng dạy, đem đến cho em những kiến thức quý báu về Công nghệ sinh học, người đã tạo cho em những cơ hội quý báu

để thực hiện niềm say mê nghiên cứu khoa học và cũng là giáo viên hướng dẫn

em trong quá trình thực tập tốt nghiệp Nội dung của đề tài khóa luận này cũng nằm trong đề tài nghiên cứu sinh của NCS.ThS Nguyễn Thị Minh Hằng

Em xin chân thành cảm ơn ThS Hồ Thị Thương, ThS Nguyễn Thu Giang cùng toàn thể cán bộ, học viên, sinh viên Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt để lại cho

em những kiến thức, kinh nghiệm làm việc quý báu và cần thiết cho bản thân sau này

Trong quá trình học,thực tập, hoàn thiện, hoàn thành chương trình học và khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học tại Trường Đại học Lâm nghiệp Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu và giảng dạy em những kiến thức nền tảng làm phong phú thêm nguồn kiến thức của bản thân em cũng như là tiền đề trong công việc ở tương lai sau khi em bước ra khỏi cánh cổng đại học

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, góp ý cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 05 tháng 4 năm 2018

Sinh viên

Trần Thị Ngọc

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN v

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 12

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh lợn tai xanh 4

1.1.3 Tình hình dịch bệnh lợn tai xanh 7

1.1.4 Sản xuất vacxin phòng dịch bệnh lợn tai xanh 11

1.2 Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật 13

1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp tạm thời bằng phương pháp agroinfiltration 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 17

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 17

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2 Vật liệu nghiên cứu 17

2.2.1 Chủng vi khuẩn 17

2.2.2 Các vector và vật liệu thực vật 17

2.2.3 Các cặp mồi sử dụng 18

2.3 Hóa chất, thiết bị 18

2.3.1 Hoá chất 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp khuếch đại gen bằng phản ứng PCR 19

2.4.2 Phản ứng nối ghép gen (ligation) 20

2.4.3 Biến nạp plasmid vào tế bào E coli và A tumefaciens 21

2.4.4 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 22

2.4.5 Tách chiết và tinh sạch plasmid 22

2.4.6 Cắt plasmid kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn 24

2.4.7 Phương pháp trong biểu hiện tạm thời 24

2.4.8 Tách chiết protein tổng số 25

2.4.9 Phương pháp điện di SDS-Page và lai miễn dịch Western blot 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Thiết kế vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide 27

3.1.1 Kết quả khuếch đại đoạn gen gp5-m bằng kỹ thuật PCR 27

3.1.2 Tạo vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide 27

3.1.3 Thiết kế vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide 30

3.1.4 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector pCB301-gp5-m-100xELP tái tổ hợp 32

3.2 Kết quả biểu hiện gen gp5-m ở cây thuốc lá N benthamiana 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

Kết luận 36

Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

polymerase

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.2 Thành phần tham gia phản ứng PCR 19

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép gen 20

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn 24

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái cơ bản của virus PRRS 6

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc và các khung đọc mở trên hệ gen virus PRRS 7

Hình 1.3 Cây N benthamiana 13

Hình 2.1 Xâm nhiễm cây bằng phương pháp hút chân không 34

Hình 3.1 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen gp5-m bằng phản ứng PCR 27

Hình 3.2 Colony-PCR chọn dòng tế bào E.coli mang plasmid pRTRA-gp5-m-ELP 28

Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm cắt vector pRTRA-gp5-m-ELP tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn HindIII 29

Hình 3.4 Bản đồ cấu trúc vector tách dòng pTRA35S-gp5-m –ELP 30

Hình 3.5 Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301-gp5-m-ELP tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn HindIII 31

Hình 3.6 Bản đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301-gp5-m-100xELP 32

Hình 3.7 Colony-PCR 33 Hình 3.8 Xác định sự biểu hiện của kháng nguyên GP5-M bằng Western blot 35

ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh Đặc trưng của bệnh là hiện tượng sẩy thai

ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đường hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa

Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987 Sau đó xuất hiện ở nhiều nước chăn nuôi lợn theo phương thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)… Từ năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nước khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới

Ở Việt Nam, lần đầu tiên phát hiện được huyết thanh dương tính với PRRS trên đàn lợn nhập khẩu từ Hoa Kỳ năm 1997 (Tô Long Thành, 2007) Sau nhiều năm không có dịch, đến đầu tháng 3 năm 2007, lần đầu tiên dịch bệnh đã bùng phát dữ dội tại tỉnh Hải Dương, sau đó lan nhanh sang các tỉnh lân cận như Hải Phòng, Thái Bình, Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang và Quảng Ninh Cho đến nay, dịch bệnh đã bùng phát rộng khắp trên cả ba miền của cả nước, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cũng như các vấn đề an sinh xã hội cho các địa phương này

PRRS là một bệnh virus mới gần như đồng thời được tìm thấy ở Mỹ và châu Âu vào cuối những năm 1980 và đầu những năm 1990, tương ứng Cho đến nay, PRRS đã lan rộng ra toàn thế giới với các đặc điểm của dịch bệnh đặc hữu ở những nước nuôi lợn, gây thiệt hại kinh tế rất lớn mỗi năm Nghiên cứu phát triển vaccine PRRS hiệu quả đã đi đầu trong nghiên cứu lâm sàng trong những năm gần đây Mặc dù vắc-xin sống biến đổi (MLV) và vaccine bất hoạt hiện nay có sẵn trên thị trường và được sử dụng rộng rãi Đã không có một báo

cáo nào cho thấy virus sống có thể có khả năng trở lại độc lực và gây ra các triệu chứng giống như PRRS trong suốt thời gian tồn tại ở đàn lợn sau khi chủng ngừa Vaccine giết chết không thể luôn cung cấp khả năng miễn dịch bảo vệ vững chắc ở cấp độ đàn Có một yêu cầu cấp bách để phát triển văcxin hiệu quả hơn và thay đổi các chiến lược chống lại căn bệnh này Thiết kế virus tái tổ hợp

là một trong những phương pháp phổ biến và hữu ích

Vacine thực vật hay còn goị là vaccine ăn được (edible vacine) là một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại Thực chất vacine thực vật là vacine tiểu đơn vị được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn So với các hệ thống sản xuất vacine truyền thống, vacine thực vật có nhiều ưu điểm như: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng nên

dễ bảo quản và sử dụng; có thể dùng qua đường miệng như ăn tươi hoặc nấu chín an toàn; đặc biệt vacine ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vacine tiêm

Từ những cơ sở trên tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp GP5-M của virus PRRS gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

1.1.1 Giới thiệu chung

Bệnh có thể xâm nhiễm vào lợn ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ Hội chứng rối loạn hô

hấp và sinh sản ở lợn (PRRS viết tắt của: Porcine reproductive and respiratory syndrome) hay còn gọi là bệnh lợn tai xanh là một bệnh truyền nhiễm nguy

hiểm, lây lan nhanh và làm chết nhiều lợn, bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn trong nước nói riêng và trên thế giới nói chung

Bệnh có thể xâm nhiễm vào lợn ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ chết thay đổi theo từng nhóm lợn khác nhau từ 20-100% Thời gian ủ bệnh 2-5 tuần Tốc độ lây lan nhanh trong vòng 3-5 ngày từ một vài cá thể nhiễm bệnh có thể dẫn đến cả đàn

bị nhiễm bệnh Sự lây lan của bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa lợn bệnh và lợn khỏe mạnh

Virus gây bệnh có trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch (trong giai đoạn nhiễm trùng máu), phân, nước tiểu và phát tán ra môi trường Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm cho bào thai từ giai đoạn giữa thai kỳ trở đi, virus cũng được bài thải qua nước bọt và sữa Virus có thể phát tán thông qua các hình thức: vận chuyển lợn mang trùng, theo gió (có thể đi xa tới 3 km), bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và

có thể do một số loài chim hoang

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn lần đầu tiên được ghi nhận ở Hoa Kỳ vào năm 1987, vào thời điểm đó, có những mẫu bệnh phẩm lợn khi phân lập ra virus nhưng chủng không có độc tính và do chưa xác định được căn bệnh nên gọi là “bệnh bí hiểm” (MD: Mystery Swine) và sau đó có tên lần lượt như sau:

 Bệnh tai xanh ở lợn (MDS: Mystery Swine Disease)

 Bệnh dịch 89 ở lợn

 Hội chứng hô hấp và vô sinh ở lợn (SIRS: Swine Infertility and Respiratory Syndrome)

 Bệnh sốt cao-biến ăn-sảy thai ở lợn (HAAT: Hyperthermie Avortements des Truies)

 Bệnh tai xanh (Blue Ear Disease)

 Hội chứng dịch sảy thai ở lợn tại Châu Âu (PEARS: Porcine Epidemic Abortion Syndrome)

 Năm 1992, hội nghị quốc tế về sức khỏe gia súc đã đƣợc tổ chức thú y thế giới nhất trí và công nhận bệnh bí hiểm này là Hội chứng rối loạn sinh sản và

hô hấp ở lợn (PRRS)

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh lợn tai xanh

Nguyên nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn do một loại

virus thuộc họ Arteriviridae Họ Arteriviridae chỉ có một giống Aterivirus bao gồm hai loại là: Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sẩy thai và viêm phổi ngựa non và Porcine Respirstory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV) gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Các virus PRRS có khả năng phát triển, nhân lên bên trong tế bào đại thực bào và tiêu diệt đại thực bào Virus PRRS có thể tiêu diệt tới 40% đại thực bào, làm phá huỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể khiến cho các vi khuẩn, virus khác

có cơ hội phát triển và gây bệnh

Virus tương đối mẫn cảm và dễ dàng bị tiêu huỷ bởi các yếu tố vật lý, hóa học Cụ thể, virus bị tiêu huỷ nhanh chóng khi môi trường có pH<5,5 hoặc pH>6,5 và tính gây bệnh cũng giảm đi đến 90% ở những môi trường như vậy; đối với tác động của nhiệt độ vi rút có thể tồn tại 1 năm trong nhiệt độ lạnh

từ -200C đến -700C; trong điều kiện 40C vi rút có thể sống 1 tháng; với nhiệt

độ cao, cũng như các virus khác, PRRSV đề kháng kém: ở 370C chịu được 48 giờ, 560C bị giết sau 1 giờ Với các hoá chất sát trùng thông thường như Chloroform hoặc Ether và môi trường có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt Ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng (https://vi.wikipedia.org/wiki/Hội_chứng_rối_loạn_sinh_sản_và_hô_hấp_ở_lợn).Cấu trúc virus PRRS:

Virus PRRS là dạng đa hình thái Virion có dạng hình cầu hoặc tròn với kích thước giao động từ 50-65 nm, nhân rỗng chia lớp, đường kính 40 nm và bề mặt bên ngoài nhẵn với nhiều protein được gắn vào

Gen được bao bọc xung quanh bởi nucleocapsid cấu thành bởi một chuỗi phân lớp kép các protein homodomer được bó trong một hình cầu rỗng Nhân nucleocapsid được bao quanh bởi một màng lipid, lớp vỏ bao quanh các protein cấu trúc được gắn chặt Các protein chính hợp thành lớp vở lipid là GP5 và M, cùng nhau vây quanh ít nhất một nửa tổng số protein virus GP5 và M hình thành nên một cầu nối 2 sulfur thông qua các phần còn lại trong cả hai protein Các protein cấu trúc chính GP2, GP3, GP4 hình thành nên phức hợp chặt ch trong lớp vỏ lipid và ít nhất với virus PRRS týp 1 thì protein E cũng là một phần của phức hợp này Protein ORF5a được khám phá gần đây được tin là protein cấu trúc thứ 8 của virus PRRS, nhưng sự định hướng của nó trong virion và sự tương tác với các protein cấu trúc khác vẫn cần được làm rõ

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái cơ bản của virus PRRS

(https://www.prrs.com/vi/prrs/virus/)

Đa dạng di truyền của virus PRRS:

Từ những nghiên cứu ban đầu 2 bộ gen khác nhau của virus PRRSv đã được định danh, bao gồm genotype 1 (chủng Châu Âu); genotype 2 (chủng Bắc Mỹ) Mặc dù cấu trúc và hình thái của genotype 1 và genotype 2 là tương tự nhau, và xuất hiện gần như đồng thời ở cả 2 châu lục, nhưng chúng bộc lộ sự khác nhau về phân tử và đặc tính kháng nguyên rõ rệt Những chủng virus đầu tiên (VR2332 và Lelystad(LV)) đóng góp khoảng 60% nucleotide đồng nhất ở cấp độ gen Mỗi kiểu gen phân lập được có sự biến thiên tới 20 % trong chuỗi nucleotide là do kết quả của sự đột biến ngẫu nhiên (RNA không ổn định) và sự tái tổ hợp gen Tỷ lệ đột biến với chủng virus PRRS kiểu gen 1 được tính toán là giữa 1.4x10-2 base thay thế cho một vị trí một năm (s/s/y) và 7.7 2.1x10-2 s/s/y Tỷ lệ đột biến này khá giống với các virus khác có bản chất RNA Sự biến thiên được phân bố một cách không đổi

Hệ gene của PRRSV có kích thước khoảng 15 kb, với 9 khung đọc mở (ORF): 1a, 1b, 2a, 2b, 3-7 Glycoprotein 5 (GP5) được mã hóa bởi ORF 5, là một trong những thành phần chính của hạt virus với vùng ngoại bào 40 axit amin và vùng nội bào 50 đến 70 axit amin (Dea S.và Dtg 2000) GP5 có một đoạn tín hiệu peptide định hướng tại đầu cuối N của protein và bị glycosyl hóa sau dịch mã từ 2 đến 4 vị trí đó là N30, N33, N44 hoặc N51 (Zhou YJ va Đtg

2009) Vị trí được glycosyl hóa rất quan trọng cho quá trình hình thành cấu trúc

và duy trì hoạt tính của protein (Ansar và Đtg 2006) GP5 được biết như yếu tố kích thích việc sản sinh kháng thể trung hòa ở lợn và đây là một vấn đề then chốt của miễn dịch dịch thể Những chủng PRRSV mang đột biến loại vùng glycosyl hóa ở GP5 cho thấy khả năng kích thích sinh kháng thể trung hòa cao hơn chủng dại

Virus PRRS có tỷ lệ đột biến cao tương tự hoặc cao hơn các virus RNA khác Từ khi xuất hiện, sự đa dạng của nó ở Châu Âu ngày càng tăng lên Việc xuất nhập những lợn dương tính với PRRS ở các nước / các vùng địa lý khác nhau đã dẫn tới sự khác biệt ngày càng tăng của các chủng virus PRRS phân lập được tại Châu Âu

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc và các khung đọc mở trên hệ gen virus PRRS

(http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp)

1.1.3 Tình hình dịch bệnh lợn tai xanh

Lịch sử bệnh

 Năm 1987, PRRS lần đầu tiên được phát hiện tại Hoa Kỳ

 Năm 1988, bệnh này lây lan sang Canada (nằm kế Hoa Kỳ)

 Đến năm 1990, bệnh lan sang các nước Châu Âu: Đức (1990); các nước Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991); Pháp (1992)

 Từ năm 1996, PRRS được phát hiện tại châu Á: Trung Quốc (1996), Việt Nam (1997), Hàn Quốc (1998), Nhật Bản (1998)

 Cho đến nay, rất nhiều nước và lãnh thổ phát hiện PRRS

 Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Hoa

Kỳ

Trên thế giới

Theo thống kê của Tom F Duinhof (4/2014) ngành chăn nuôi lợn của Đan Mạch thiệt hại 15 triệu bảng mỗi năm do dịch bệnh lợn tai xanh, và con số này ở Mỹ là 560 triệu bảng Theo tiến sỹ Trevor Drew - Trưởng phòng Virus học, Cơ quan Thí nghiệm Thú y ở Weybridge, Anh, sự biến chủng của PRRS nhanh một cách bất thường và coi đây là một trong những virus tiến hóa nhanh nhất trong những virus mà ông đã nghiên cứu (www.roslin.ed.ac.uk/events/EuroPRRSnetAbstractBook.doc) Thông thường, virus lưu ở vật chủ và gây bệnh hiểm nghèo rồi giảm dần độc lực theo thời gian Với PRRS, virus hành xử theo cách ngược lại Đầu tiên, chủng không độc hại lưu hành trên vật chủ ở các trại lợn Bắc Mỹ Sau đó, chúng biến chủng và độc lực ngày càng mạnh ở nhiều nước khác nhau Về tính đa dạng di truyền, dựa vào kiểu gene (genotype), PRRSV được chia làm hai loại: kiểu gene châu Âu (type I), đại diện tương ứng là chủng Lelystad (LV) và kiểu gene Bắc Mỹ (type II), đại diện tương ứng là chủng VR2332 Tuy bố trí sắp xếp gene giống nhau, nhưng đặc tính của các gene, độ dài các gene và đặc tính sinh học (tính gây bệnh và kháng nguyên - miễn dịch) của các chủng thuộc 2 dòng PRRSV này có khác nhau Cụ thể, người ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả

2 type phân lập, được khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và amino acid của các khung đọc mở của LV và VR-2332 Trình tự amino acid của VR-

2332 so với LV là 76% (ORF 2), 72% (ORF3), 80% (ORF4 và 5), 91% (ORF6)

và 74% (ORF7), phân tích trình tự cho thấy các virus đang dần tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen (Murtaugh và đtg, 1995, Nelsen và đtg,

1999, Meng và đtg, 1995, Karpur và đtg, 1997) Hiện nay, PRRSV được xem như là một trong những tác nhân gây bệnh ở lợn nghiêm trọng nhất trên thế giới

Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục (từ châu Đại Dương) trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát hiện có bệnh Tai xanh lưu hành Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nước trên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la Ví dụ: hàng năm Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD Các nước trong khu vực có tỷ lệ bệnh tai xanh lưu hành rất cao, ví dụ: ở Trung Quốc là 80% Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là 97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% 73,1%

- Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia của Trung Quốc đã được phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006, đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt cao ở lợn"

do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virus PRRS và các loại mầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy Kết quả nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virus PRRS gây bệnh tại nước này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus (thiếu hụt 30 acid amin trong gen) Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hưởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan

Trước diễn biến phức tạp của dịch tai xanh, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đang thực hiện chương trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng chương trình nghiên cứu, sản xuất vác xin đã được cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân dân tệ tương đương với 36,5 triệu USD

- Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc

Mỹ cùng lưu hành, đặc biệt trong cùng một con lợn ở Hồng Kông đã xác định nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch tai xanh cũng được thông báo ở Thái Lan từ các năm 2000 - 2007 Thông báo cho biết các vi rút gây bệnh tai xanh được phán lập từ nhiều địa phương thuộc nước này gồm cả chủng dòng châu Âu và chủng

dòng Bắc Mỹ Trong đó, số vi rút thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%, còn các virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58% Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lưu hành virus gây bệnh Tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng virus cổ điển độc lực thấp

- Tháng 9/2007, Nga là nước thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh Tai xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây ra (Theo Tài liệu của Cục Thú y)

- Tại hàn Quốc (2005 -2006), khi xét nghiệm 692 mẫu có tỷ lệ dương tính PRRS là 69,10%, tỷ lệ này ở Philippin 59%

Tại Việt Nam

Mặc dù virus đã xuất hiện ở Việt Nam từ 15 năm trước đây nhưng các dịch bệnh nặng chỉ được thông báo vào đầu năm 2007 (Tô Long Thành, 2007) và lây lan khắp 17 tỉnh trên khắp cả nước và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi trong nước (Đậu Ngọc Hào và đtg., 2008), với tổng số hơn 60.000 heo mắc bệnh, số chết và phải tiêu huỷ là hơn 15.000 con, tỷ lệ chết thực do PRRSV lên đến 15% Do tình hình dịch bệnh và hệ thống chăn nuôi heo phức tạp ở Việt Nam, bệnh đã trở nên không kiểm soát và lây lan ngày càng rộng hơn Số địa phương có dịch ngày càng mở rộng, số lượng gia súc mắc bệnh tăng và thời gian kéo dài Nếu như năm 2007, toàn quốc có 324 xã, phường của 65 quận, huyện thuộc 18 tỉnh, thành phố có dịch với số lượng lợn mắc bệnh là 70.577 con thì đến năm 2008, dịch đã xảy ra ở 956 xã, phường thuộc 103 huyện của 28 tỉnh, thành phố; tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con Trong 6 tháng đầu năm 2010, dịch heo tai xanh đã lây lan trên diện rộng ở nhiều tỉnh trên khác cả nước, kéo dài một cách bất thường (Cục Thú y, Bộ Nông nghiệp và PTNT) Ngay cả trong khi không có dịch bệnh xuất hiện thì ở các trại nuôi lợn virus PRRSV vẫn âm thầm tồn tại Một số nghiên cứu về bệnh PRRS trên những trại nuôi lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với virus PRRS rất khác nhau (1,3% - 68,29%), vì thế việc quản lý kịp thời diễn biến bệnh

là vô cùng cần thiết PRRSV cũng không là ngoại lệ, mang đặc tính chung của

các bệnh gây ra do virus là tính biến đổi di truyền cao Ngày càng nhiều các bằng chứng cho thấy PRRSV đa dạng về các đặc tính sinh học, kháng nguyên cũng như độc học và chính điều này gây ra các biểu hiện lâm sàng phức tạp hơn Thêm vào đó, theo kết quả phân tích của đoàn chuyên gia Tổ chức Nông lương Liên hiệp quốc (FAO) cho thấy, PRRSV đang lưu hành tại Việt Nam là chủng virus có độc lực cao (http://fao.org.vn/) Điều này đồng nghĩa, tỷ lệ tử vong cao hơn và dịch bệnh lan càng nhanh (Chu Hoàng Hà và đtg, 2012-2014).

1.1.4 Sản xuất vacxin phòng dịch bệnh lợn tai xanh

Vì sự nguy hiểm và những thiệt hại lớn về kinh tế mà PRRSV gây ra, việc kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh luôn được đòi hỏi Trong đó, biện pháp miễn dịch bằng tiêm phòng là cách đơn giản và an toàn nhất để hạn chế dịch bệnh Gần đây chỉ có một số lượng hạn chế các vacxin bất hoạt và nhược độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu (Botner và đtg, 1999; Diaz và đtg, 2006; Labarque và đtg, 2003; Van Woensel và đtg, 1998) Vacxin dạng này có một số nhược điểm như vacxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thường không cao (Nilubol và đtg, 2004), còn vacxin nhược độc tạo

ra mức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tương đồng, nhưng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại (Meng, 2000) Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng có hai loại vacxin chống PRRSV dạng này với giá thành khá cao 40.000 đồng/liều, nhưng hiệu quả chỉ đạt 40% và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với virus Cho đến nay, thế giới duy nhất có Trung Quốc sản xuất được vacxin chống virus PRRS độc lực cao, tuy nhiên họ chưa có giấy phép để xuất khẩu loại vacxin trên Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật

Cho đến nay, thế giới duy nhất có Trung Quốc sản xuất được vacxin chống virus PRRS độc lực cao, tuy nhiên họ chưa có giấy phép để xuất khẩu loại vacxin trên

Gần đây, một vài hướng mới đã được ứng dụng để phát triển các loại vacxin chống PRRSV khác nhau, bao gồm vacxin DNA (Hou và đtg, 2008; Jiang và đtg, 2006b) và virus vector pseudorabies biểu hiện GP5 (Qiu và đtg,

2005), adenovirus biểu hiện GP5/M (Jiang và đtg, 2006a), pseudotype baculovirus biểu hiện GP5/M (Wang và đtg, 2007), virus vaccinia biểu hiện GP5/M (Zheng và đtg, 2007) và cây thuốc lá biểu hiện GP5 (Chia và đtg, 2010) Đây là những cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo sản xuất kháng nguyên GP5-M tạo vacxin phòng bệnh lợn tai xanh

Vacxin đang sản xuất trong nước vacxin nội hiệu lực cao

Để giải quyết vấn đề này, dự án khoa học và công nghệ phát triển sản phẩm quốc gia “Công nghệ sản xuất vacine phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản cho lợn” được triển khai, với sự chủ trì của Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đây là dự án nằm trong chương trình Phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 - một trong các chương trình khoa học và công nghệ quốc gia đang được triển khai tại Bộ Khoa học và Công nghệ

Trong giai đoạn đầu (từ tháng 12/2014 đến tháng 1/2017), dự án đã tuyển chọn thành công 3 chủng virus cường độc (gồm KTY-PRRS-06, KTY-PRRS-

07, KTY-PRRS-08) với độ vô trùng, thuần khiết đạt 100% Vaccine cũng đạt được sự ổn định về đặc tính sinh học và sinh học phân tử sau 5 lần cấy truyền trên môi trường tế bào, tính độc trên động vật thí nghiệm và tính kháng nguyên Ngoài ra, dự án cũng xây dựng thành công quy trình tạo chủng giống gốc virus tai xanh cường độc, tạo thành công 3 chủng tai xanh nhược độc (KTY-PRRS-04, KTY-PRRS-09 và KTY-PRRS-05)

Đặc biệt, dự án cũng đã đăng ký 9 trình tự gene các chủng giống virus tại Ngân hàng gene thế giới và sản xuất được 209.000 liều vaccine có hiệu lực 80% (tức là ít nhất 80% số lợn được tiêm vaccine s chống lại được sự tấn công của virus) và thời gian thuốc có hiệu lực ít nhất là 4 tháng

“Từ các chủng giống được tạo và chủng giống virus nghiên cứu được, nhóm nghiên cứu có thể sản xuất ra các loại vaccine phòng bệnh tai xanh ở lợn

Ưu điểm của nghiên cứu này là tạo ra chủng giống gốc để sản xuất vaccine phân lập của Việt Nam, ổn định tất cả các mặt về đặc tính sinh học, đặc tính sinh học phân tử, đặc tính kháng nguyên So với vaccine phòng bệnh tai xanh ở lợn do

nước ngoài sản xuất, vaccine trong nước có tỷ lệ tương đồng kháng nguyên với virus gây bệnh cao hơn” - tiến sỹ Trịnh Đình Thâu - Trưởng khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, chủ nhiệm đề tài - cho biết

Vaccine trên cũng đã được thử nghiệm ở chuột và lợn Kết quả cho thấy, virus chọn ra được bảo đảm sự an toàn, thuần khiết và có tính suy yếu miễn dịch tốt, có khả năng bảo hộ tốt Đây là một trong những yếu tố quan trọng đối với việc sản xuất sản phẩm vaccine hiệu quả cao, đáp ứng được khả năng phòng, chống bệnh lợn tai xanh

Ưu điểm về hiệu quả kinh tế: Vaccine phòng bệnh tai xanh ở lợn do Việt Nam sản xuất có giá dao động từ 30.000-35.000 đồng/liều; trong khi đó, vaccine ngoại nhập có giá cao gấp 2-3 lần, từ 60.000-80.000 đồng/liều Điều có ý nghĩa hơn cả của nghiên cứu này là từ đây, Việt Nam có thể chủ động được nguồn vaccine phòng bệnh cho vật nuôi mà không phải phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu - vốn nhiều biến động.Tiến sỹ Thâu nói thêm: “Hiện vaccine phòng bệnh tai xanh đang trong giai đoạn sản xuất thử và chuẩn bị chuyển giao cho doanh nghiệp tự sản xuất Dự kiến năm 2018, sản phẩm s được đưa ra thị trường Sau nghiên cứu này, chúng tôi s ứng dụng các tiến bộ khoa học và công nghệ đã đạt được để sản xuất thêm các loại mới như vaccine tái tổng hợp” Theo các chuyên gia, việc sản xuất thành công vaccine phòng bệnh tai xanh ở lợn mang lại hiệu quả kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi và ngành nông nghiệp Việt Nam, góp phần chủ động được nguồn vaccine, giảm giá thành sản phẩm (Tạp chí chăn nuôi 22/9/2017)

1.2 Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật

Cho tới nay có hai phương pháp để biểu hiện protein tái tổ hợp trong thực vật: biểu hiện tạm thời và tạo cây chuyển gen (Mason và Arntzen, 1995)

Hệ thống biểu hiện tạm thời là một phương pháp rất hữu ích để phân tích khả năng biểu hiện của một protein đích trong thực vật vì phương pháp này nhanh, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá (Fischer và

đtg., 1999).Trong những năm gần đây biểu hiện tạm thời của protein trong thực vật trở nên một quy trình chiếm ưu thế hơn so với việc tạo ra những cây chuyển gen ổn định vì nó đạt được sự biểu hiện protein ở mức độ cao Hiện nay, có hai phương pháp cho phép tiến hành biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp trong thực vật: sử dụng virus thực vật làm vector và agroinfiltration

Đối lập với phương pháp biểu hiện tạm thời, hướng nghiên cứu biến nạp bền vững được định nghĩa bằng việc gắn gen đích vào hệ gen của tế bào thực vật Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để chuyển gen vào cây hai lá mầm như thuốc lá (Fischer và Emans, 2000), cây đậu (Prasad và đtg., 2004) Nhìn chung, gen đích được gắn vào vector nhị thể, vector này có khả năng sao chép được trong cả E coli và vi khuẩn Agrobacterium Các dòng cây chuyển gen được phân tích mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp Những cây mang một bản sao của gen đích và có mức độ biểu hiện cao nhất s được lựa chọn để tạo dòng thuần Dòng thuần mang tính trạng mong muốn s được trồng nhà kính, và protein tái tổ hợp được tinh sạch Thông thường để tạo ra cây chuyển gen thì phải mất khoảng 3-9 tháng thời gian này

phụ thuộc vào từng đối tượng thực vật sử dụng để chuyển gen

Hình 1.3 Cây N benthamiana

N benthamiana được sử dụng như một sinh vật mô hình để thực hiện các

nghiên về thực vật đặc biệt lĩnh vực virus học thực vật vì:

+ Khả năng phát triển đồng nhất và ổn định trên môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền với tốc độ nhân dòng nhanh

+ Đáp ứng tốt với quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium

+ Các tác nhân gây bệnh như nhiều loài: Virus, nấm, vi khuẩn, lớp nấm

trứng … đều có thể dễ dàng lây nhiễm cho N benthamiana

Hiện nay, N benthamiana đang nhanh chóng được phổ biến như một cây

mô hình trong nghiên cứu sinh học thực vật, đặc biệt là trong các nghiên cứu về protein thực vật, hệ thống biểu hiện protein và tinh chế protein từ thực vật Vì

vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng N benthamiana làm cây mục tiêu

và cây mô hình cho agroinfiltration, tạo nền tảng cho sản xuất công nghiệp protein tái tổ hợp

1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp tạm thời bằng phương pháp agroinfiltration

Agroinfiltration là phương pháp đã được ứng dụng và biểu hiện thành công các protein tái tổ hợp trên nhiều loài thực vật Tuy nhiên phổ biến nhất

nhất là hai loài Nicotiana benthamiana và Nicotiana tabacum Để biểu hiện

protein mức độ cao, những cấu trúc này được điểu khiển dưới một promoter cơ bản, ví dụ như Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S (Kay R và đtg., 1987), hoặc protein quan tâm được đưa vào trong một hệ thống biểu hiện virus thực vật cải biến (Rybicki EP., 2010, Gleba và đtg., 2007) Nhiều nghiên cứu đã biểu hiện và sản xuất thành công kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 với hàm lượng cao như 200 mg HA/ kg lá tươi (Shoj vàđtg, 2009); 675 mg HA/kg (Mortimer vàđtg, 2012); 400 mg NA/kg (Mett vàđtg 2008)…

Bằng cách sử dụng hệ thống biểu hiện tạm thời này, Vaquero và đtg đã biểu hiện thành công scFv; chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể cũng như phân tử kháng thể đầy đủ kháng lại carcinoembryonic antigen Phân tử kháng thể đầy đủ có thể biểu hiện bằng cách tiêm đồng thời vào lá cây hai chủng vi khuẩn

Agrobacterium mang riêng biệt chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Thông thường phương

pháp biểu hiện tạm thời này phù hợp để kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật, đồng thời cũng để kiểm tra sự hoạt động của cấu trúc vector vừa thiết kế trước khi tiến hành tạo cây chuyển gen (Fischer và Emans, 2000)

Agroinfiltration được ứng dụng phổ biến nhất trên hai loài N benthamiana

và N tabacum Để biểu hiện protein mức độ cao, những cấu trúc này được điểu

khiển dưới một promoter cơ bản, ví dụ như Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S (Kay R và đtg., 1987), hoặc protein quan tâm được đưa vào trong một hệ thống biểu hiện virus thực vật cải biến (Rybicki EP., 2010, Gleba và đtg., 2007) Nhiều nghiên cứu biểu hiện và sản xuất thành công kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 với hàm lượng cao như 200 mg HA/kg lá tươi (Shoj và đtg., 2009); 675 mg HA/kg (Mortimer và đtg., 2012); 400 mg NA/kg (Mett và đtg., 2008)…

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp GP5-M bằng phương pháp

agroinfiltration trên cây thuốc lá N.benthamiana

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5-M

- Thiết kế vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5-M

- Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector

2.2.2 Các vector và vật liệu thực vật

- Trình tự 100xELP trong vector pRTRA được tổng hợp và mô tả bởi

Scheller và đồng tác giả (2004) Vector pRTRA-35S-H5-100xELP (Hoang, 2012) được thiết kế từ vector gốc pRTRA35S-TBAG-100xELP của Floss et al., (2010a) Vector chuyển gen pCB301-Kan (dựa vào pCB301 của Xiang và đồng

tác giả, 1999), plasmid mang gen gp5-m của virus PRRS chủng Việt Nam, ký hiệu pGEM-PRRS (VN07196) và cây thuốc lá N benthamiana do Phòng Công

nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Cây thuốc lá N benthamiana được cung cấp bởi Phòng Công nghệ tế bào

thực vật Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

2.2.3 Các cặp mồi sử dụng

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự (5’-3’)

I Mồi dùng trong khuếch đại gen gp5-m có gắn thêm các vị trí cắt của

enzyme giới hạn BamHI

Các loại enzyme hạn chế của Fermentas

Các hoá chất khác như: Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, nước khử ion; các loại kháng sinh kanamycin, rifamycine, spectinomycin và các hóa chất thông dụng khác của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech…

Kháng thể kháng cmyc được tổng hợp từ khuẩn bởi phòng thí nghiệm trọng điểm-Viện Công nghệ sinh học, kháng thể anti-mouse IgG cộng hợp HRP (Promega - USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl) có trình tự cmyc được tổng hợp bởi phòng thí nghiệm trọng điểm-Viện Công nghệ sinh học, hóa chất hiện

màu TMB (3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine), DAB (Diaminobenzidine) Kit hiện phim Super Signal West Pico Trial (Thermo Scientific)

2.3.2 Thiết bị

Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser, pipet man, tủ cấy vô trùng, máy đo pH cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp khuếch đại gen bằng phản ứng PCR

Đoạn gen gp5-m được khuếch đại bằng PCR sử dụng khuôn là plasmid

pGEM-PRRS (VN07196) với cặp mồi tương ứng (Bảng 1)