Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan kim tuyến (anoectochilus blume)

Ở Việt Nam mà cụ thể là ở thành phố Hồ Chí Minh, theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn trong năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan đạt 200-300 tỷ VNĐ nhưng đến 2005 con

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong muôn ngàn loài hoa đua hương khoe sắc mà thiên nhiên đã ban tặng cho con người, hoa lan được người Châu Á liệt vào hàng “vương giả chi hoa”- vua của các loài cây cỏ có hoa - bởi vẻ đẹp đặc sắc muôn màu muôn vẻ, hương thơm nhẹ nhàng nhưng cũng vô cùng quyến rũ Nó tượng trưng cho tình yêu và vẻ đẹp, có

ý nghĩa thanh cao mà quý phái, tất cả thuộc về phái yếu, duyên dáng và thanh lịch

Bên cạnh, giá trị đem lại về mặt tinh thần thì hoa lan còn là nguồn nguyên liệu cho một số ngành sản xuất Cụ thể như: nguồn hương liệu cho sản xuất nước hoa, chất làm tăng hương vị thực phẩm, nguyên liệu để điều chế keo, chất nhũ tương, chất thuộc da… Một số loài lan còn được biết đến như nguồn dược liệu có giá trị và nhiều tiềm năng

Đặc biệt, trong điều kiện hiện nay khi mức sống người dân ngày một tăng lên thì nhu cầu sử dụng nguồn dược liệu nói chung, lan dược liệu nói riêng vào công tác y- dược để tăng cường sức khoẻ con người càng được chú trọng Vì vậy, việc nhân giống tạo ra một số lượng lớn nguồn dược liệu quý hiếm này là một việc làm cần thiết để bảo vệ số lượng loài trong tự nhiên và hứa hẹn mang lại hiệu quả kinh tế cao.Thực tế đã ghi nhận hiệu quả kinh tế to lớn mà việc trồng và kinh doanh phong lan đem lại Số liệu năm 2000, kim ngạch xuất khẩu hoa lan thế giới đạt 150 triệu USD Ở Việt Nam mà cụ thể là ở thành phố Hồ Chí Minh, theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn trong năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan đạt 200-300 tỷ VNĐ nhưng đến 2005 con số này là 600-700 tỷ VNĐ và đến đầu năm 2006 đã đạt 400 tỷ VNĐ.[21]

Trước kia, khi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật ở nước ta chưa phát triển thì việc nhân giống một loài lan gặp rất nhiều khó khăn do phương pháp nhân giống sinh dưỡng truyền thống có nhiều hạn chế như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ Hơn nữa, hạt lan lại quá nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên là rất thấp

Ngày nay cùng sự phát triển của khoa học- công nghệ, kỹ thuật nhân giống

in vitro được áp dụng phổ biến và thành công ở nhiều đối tượng thì việc nhân nhanh

2

các loài hoa lan đã trở nên thuận lợi Bằng phương pháp này, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không ngừng tăng lên của thị trường

Nói đến chi lan Kim tuyến Anoectochilus với 12 loài, thì loài lan Kim tuyến

Anoectochilus setaceus Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm

cảnh do lá và hoa đẹp mà còn vì giá trị làm thuốc của nó Theo các tài liệu y học thế giới, lan Kim tuyến là loài cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này

Như vậy, lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume là loại thảo dược có

giá trị và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm thuốc (500.000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Kim tuyến được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007

Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về

kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố Do vậy, có thể

nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume

bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn

Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Giống& Công nghệ sinh học- khoa Lâm Học- trường Đại học Lâm Nghiệp trong thời gian

thực tập tốt nghiệp, tôi đã tiến hành đề tài “Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật nhân

giống in vitro loài lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) ” nhằm góp

phần nhân giống và bảo tồn loài lan quý hiếm này của Việt Nam Từng bước đưa chúng thoát khỏi tình trạng bị đe doạ

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO

1.1.1 Khái niệm:

Nhân giống in vitro là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận

thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có những chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hoocmon sinh trưởng và đường

1.1.2 Sơ lược lịch sử phát triển:

Nhân giống in vitro được khởi xướng vào cuối thế kỷ 19, cho đến nay đã trải

qua trên 100 năm phát triển Quá trình phát triển dó có thể khái quát qua 4 giai đoạn sau:

*Giai đoạn 1: Giai đoạn khởi sướng ( 1898-1930)

Gottlieb Haberlandt (1902), nhà thực vật học người Đức, đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời” Đây là một trong những nền tảng lí thuyết căn bản của nuôi cấy mô- tế bào sau này Tuy nhiên, những thí nghiệm của Haberlandt khi đó với các tế bào mô mềm, biểu bì đã bị thất bại do chúng không thể phân chia được Nhưng sau đó Garrison (1904-1907) đã nuôi thành công tế bào thần kinh của ếch trong huyết tương.Trên cơ sở đó, các nhà khoa học thực vật cũng tiến nuôi tế bào trên môi trường dinh dưỡng tự nhiên chiết

từ thực vật nhưng không thành công Sau đó trong một thời gian dài các nhà nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu môi trường nuôi cấy tự nhiên và tổng hợp

Năm 1922, Kotte là học trò của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ cây ngô Hai tác giả đã nuôi được trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên môi trường lỏng có chứa đường glucose và muối khoáng thu được hệ rễ nhỏ Từ đó đầu rễ được nuôi và hoàn thiện môi trường nuôi cấy

*Giai đoạn 2: Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950)

Giai đoạn này được đánh dấu bằng sự thành công của White (1934) đã duy trì được sinh trưởng của của đầu rễ cà chua trong thời gian khá dài trên môi trường

4

lỏng có chứa đường, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men Theo hướng khác, Gautherets đã thành công trong nuôi cấy mô tượng tầng các cây gỗ và đã tìm ra môi trường thích hợp

Cũng trong giai đoạn này, vai trò thúc đẩy sinh trưởng trong nuôi cấy của hàng loạt vitamin nhóm B cũng được phát hiện như: thiamin (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), nicotinic (vitamin B3)…Nuôi cấy mô- thực vật có nhiều thuận lợi hơn khi Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên, sau

đó xác định là axit indole axetic (IAA) và được Kogl tách chiết thành công

Trong thời gian 1941-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin được nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit napthalen axetic (NAA),

axit 2.4 D- dichlorophenoxy axetic (2.4 D)…

Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trưởng rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá Một năm sau, chất đó được tổng hợp thành công và được Skoog gọi là Kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào

Việc phát hiện ra NAA, 2.4 D, Kinetin cùng với các loại vitamin và nước dừa là những bước tiến có ý nghĩa trong giai đoạn thứ 2 của nuôi cấy mô- tế bào thực vật

*Giai đoạn 3: Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1957-1960)

Skoog và Miller (1957) đã chứng minh sự biệt hoá của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tuỷ thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tương đối của auxin/cytokinin

và từ đó đưa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô- tế bào thực vật

Trong khoảng thời gian từ 1954 -1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển và hoàn thiện dần Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dưỡng định kỳ Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo được cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp

*Giai đoạn 4: Giai đoạn nghiên cứu di truyền (từ 1960 đến nay)

Là giai đoạn ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật vào công tác giống và nghiên cứu di truyền Các thành tựu nổi bật trong giai đoạn này gồm:

5

Năm 1960, nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Morel đã tạo ra được các protocorm từ địa lan Khi để trong điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển thành cây lan con sạch bệnh Cũng trong năm đó, Coocking ở trường Đại học Tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần (protoplast) nhờ xử lý với enzyme cellulase

Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây

cà độc dược Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành công với cây thuốc lá Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn

và hạt phấn đã đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống

Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả người Nhật là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được cellulose Melchers và cộng

sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây,

mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử

từ bên ngoài, do đó chúng là những đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật

Ngày nay, nuôi cấy mô - tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen vào cây trồng

1.1.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô- tế bào thực vật:

Kỹ thuật kỹ thuật nhân giống in vitro đã được phát triển trên những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật

1.1.3.1 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào:

Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời" Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, các nhà khoa học đã

6

chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

1.1.3.2 Sự phân hoá và phản phân hoá:

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào thành các mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình

Trong những điều kiện môi trường thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào hợp tử ban đầu cho ra các tế bào mới và có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Quá trình đó được gọi là sự phản phân hoá tế bào

Hai quá trình trên được biểu thị bằng sơ đồ sau:

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình điều hoà hoạt hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được

mã hoá trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào

Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối

mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào, quá trình hoạt hoá

sẽ được xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó

Tế bào giãn

Phân hoá tế bào

Phản phân hoá tế bào

Tế bào

phôi sinh

Tế bào chuyên hoá

7

1.1.3.3 Sự trẻ hoá :

Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu Trong nuôi

cấy in vitro, các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi

cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn

1.1.4 Các điều kiện nuôi cấy in vitro

1.1.4.1 Điều kiện vô trùng:

Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của quá trình nuôi cấy mô-tế bào Nếu không mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn sẽ thối và chết

 Vô trùng dụng cụ và môi trường:

Trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật, các thao tác mẫu cấy được tiến hành trong tủ cấy vô trùng Để vô trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy, có thể sử dụng một trong các phương pháp sau:

- Khử trùng khô: phương pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt Thiết bị dùng khử trùng khô là lò sấy

- Khử trùng ướt: là phương pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô trùng môi trường và các dụng cụ nuôi cấy Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thường dùng ở 1210C

- Màng lọc: dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thước 0.025-10µm khỏi môi trường nuôi cấy Đây là phương pháp phù hợp với các môi trường mà thành phần của nó bị phân huỷ ở nhiệt độ cao

 Vô trùng mẫu cấy:

Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu cấy nhưng ở các vị trí khác nhau thì phương pháp khử trùng mẫu cấy là khác nhau

Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất

có khả năng tiêu diệt vi sinh vật

Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hoá chất khử trùng Một hoá chất được lựa chọn để vô trùng phải đảm bảo 2 thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu thực vật Các hoá chất hay được sử dụng đó là: hypoclorit canxi (nồng độ 5-15% w/v), hypoclorit natri (nồng độ 10- 20% v/v), oxy già (nồng độ 10-12% v/v), thuỷ ngân clorua (nồng

8

độ 0,1-1% w/v), chất kháng sinh (50-100 mg/l) Để tăng tính linh động của hoá chất diệt khuẩn,người ta thường sử dụng thêm các chất làm tăng sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol hoặc có thể phối hợp xử lý với cồn 700

Một số trường hợp rất khó vô trùng mẫu cấy do đó xử lý vô trùng bề mặt sẽ không đạt hiệu quả hoàn toàn Trong trường hợp này các nhà nghiên cứu đã thêm các chất diệt khuẩn, nấm vào môi trường nuôi cấy

1.1.4.2 Ánh sáng và nhiệt độ

Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những phòng nuôi ổn định về ánh sáng và nhiệt độ Tất cả các trường hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình nhân giống của chúng cũng cần có ánh sáng Nhiệt độ của các phòng nuôi cây thường được duy trì từ 25-28 0C nhờ các máy điều hoà nhiệt độ

1.1.5 Môi trường nuôi cấy in vitro

1.1.5.1 Thành phần hóa học của môi trường

Thành phần môi trường nuôi cấy mô- tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy khác nhau thì môi trường nuôi cấy khác nhau cũng khá cơ bản Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy

Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhưng môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:

 Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lượng và vi lượng) được

bổ sung vào môi trường nuôi cấy

- Trong muối khoáng đa lượng các nguyên tố cần phải cung cấp là nitơ, photpho, kali

+ Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng nitrat (NO3-) và amon (NH4+) Đa số các môi trường có chứa dạng nitrat nhiều hơn dạng amon Trong môi trường MS, amon được cung cấp ở dạng NH4NO3, còn môi trường B5 có amon dạng muối (NH4)2SO4

+ Photpho thường được đưa vào môi trường ở dạng muối photphat, hai loại hợp chất hay được dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4 Hàm lượng photpho trong môi trong môi trường nuôi cấy từ 0,15-0,40 mM

9

+ Kali được cung cấp cho môi trường nuôi cấy dưới dạng KNO3, KCl và

KH2PO4 Nồng độ sử dụng từ 2- 25 mM

- Yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy khá phức tạp và

ít được nghiên cứu Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy Đây là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ < 30 ppm Các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu, Zn, Bo, Co, Iot Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme

+ Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia

+ Bo: thiếu Bo trong môi trường nuôi cấy thường gây lên biểu hiện thừa Auxin Mô nuôi cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hoá mạnh nhưng thường là mô xốp, mọng nước, kém tái sinh

 Thành phần hữu cơ:

- Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol:

+ Vitamin: các vitamin hay được sử dụng là các vitamin nhóm B (B1, B3, B6), ngoài ra môi trường nuôi cấy còn sử dụng một số vitamin khác như vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E với các nồng độ khác nhau: Vitamin B1: 0,1- 5,0 mg/l

Vitamin B6: 0,1- 1,0 mg/l

Vitamin H: 0,01- 1,0 mg/l

+ Myo-inositol có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng và phát triển giống như các vitamin và trong nhiều trường hợp có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy Hàm lượng sử dụng là 100 mg/l môi trường

+ Các aminoaxit và amit:

Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường phải được bổ sung các aminoaxit, amit vì chúng có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái Theo Skoog & Milles (1957) tất cả các dạng tự nhiên của amino axit dạng L dễ đàng được mô nuôi cấy hấp thụ, L-arginin dùng cho nuôi cấy rễ, L- tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi, L- serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn Nồng độ sử dụng mỗi loại 10- 100 mg/l

- Thành phần hữu cơ phức hợp: được dùng trong môi trường nuôi cấy để cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất Chúng được sử dụng khi

+ Dịch chiết nấm men: chứa hàm lượng khá cao của nhiều vitamin nhóm B, nồng độ sử dụng 0,025 - 0,20 % w/v

+ Dịch chiết hoa quả, củ: nước ép cà chua, nước ép cam, nước ép chuối xanh nước dừa

 Các chất điều hoà sinh trưởng:

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu được trong môi

trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in vitro

Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy

- Nhóm Auxin:

Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở

tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính (Epstein&cs, 1989) Các loại auxin thường sử dụng cho nuôi cấy:

+ IAA (Indole acetic acid)

+ IBA (Indole butyric acid)

+ NOA (Naphthoxy acetic acid)

+ α- NAA (α- Naphthaleneacetic acid)

+ 2.4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid)

IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm lượng cao 1,0-30 mg/l (Dodds & Robert, 1999) Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,1-2,0 mg/l

- Nhóm Cytokinin: kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1962) Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh

trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Các loại cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô là:

+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine)

11

+ Kinetin (6-furfurylamino purine)

+ BAP (Bezylamino purine)

+ TDZ (Thidiazuzon)

Hàm lượng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l Ở những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Trong các loại cytokinin nói trên, Kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả

Đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tỷ lệ khác nhau

- Nhóm Gibberillin: Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô

người ta còn sử dụng thêm gibberillin để kích thích kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberillin được sử dụng thường xuyên nhất Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên phải lọc qua màng lọc trùng rồi mới đưa vào môi trường

 Nguồn cacbon:

Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp nhưng ở cường độ rất thấp Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/v) Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol, rất ít dùng Hàm lượng đường thấp được sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần, ngược lại hàm lượng đường cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi

 Các thành phần khác:

- Tác nhân tạo gel: quyết định trạnh thái vật lý của môi trường nuôi cấy Chất tạo gen được sử dụng phổ biến là agar (thạch) Nồng độ agar sử dụng từ 0,5-10 % (w/v) tuỳ theo chất lượng của chúng và môi trường sử dụng Khi môi trường nuôi cấy là môi trường lỏng hoặc bán lỏng thì không hoặc bổ sung rất ít agar

- Than hoạt tính: được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Mặt khác, khi bổ sung vào môi trường, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do môi trường trở nên sẫm vì vậy có thể kích thích quá trình tạo rễ, một số trường hợp còn có tác dụng thúc đẩy phát sinh

12

phôi vô tính và kích thích sinh trưởng phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ (Dodds & Roberts, 1999) [11] Nhưng than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng Nồng độ than hoạt tính thường sử dụng từ 0,2 - 0,3 % (w/v)

1.1.5.2 pH của môi trường:

pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 6,0 pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar

5,5-có thể rất cứng

Nếu trong môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc quá axit thì GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính (Van Braft & Pierk, 1971) [11]

1.1.5.3 Tính thẩm thấu của môi trường:

Hấp thụ nước của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy bị chi phối bởi thế năng của nước trong dịch bào và trong môi trường dinh dưỡng Các thành phần chính có ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường bao gồm: hàm lượng đường, hàm lượng agar, một số thành phần muối khoáng

Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy đồng thời còn tham gia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường Hàm lượng đường cao, mô nuôi cấy khó hút được nước Hàm lượng đường thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng thuỷ tinh hoá ở mẫu nuôi cấy, đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây ra đồng ruộng [3]

1.1.6 Các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống in vitro

1.1.6.1 Giai đoạn chuẩn bị

Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy Khâu đầu tiên của giai đoạn này có thể coi như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động nguồn mẫu trong công tác nhân giống Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật liệu giống Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô trùng Người ta thường sử dụng một số loại hoá chất như: HgCl2 0,1 %, cồn

700, H2O2, Ca(OCl)2 để khử trùng mẫu cấy [11] Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu nuôi cấy mà lựa chọn loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp

13

1.1.6.2 Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu vật đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường thích hợp Về nguyên tắc thì mô nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây lấy từ các phần non của cây (thân, rễ, lá,…) nhưng theo Bhatt thì mô nuôi cấy lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành khác Vì vậy, người ta

thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro Ngoài ra, khi lựa chọn mô

nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của cây mô, các mô ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh chồi tốt hơn (Anolesnon, 1980) [11]

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Giai đoạn này thường kéo dài trong 4-6 tuần lễ

1.1.6.3 Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với

các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao Vì vậy giai đoạn nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống

Giai đoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh nhiều chồi mầm cung cấp cho giai đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn 2 và cấy chúng lên môi trường mới theo định kỳ Phải xác định được môi trường dinh dưỡng

và môi trường vật lý phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất Trong giai đoạn này thì vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất phụ gia (nước dừa, chuối, khoai tây…) là cực kỳ quan trọng Tuỳ vào đối tượng nuôi cấy mà người ta có thể nhân nhanh theo hướng kích thích sự hình thành cụm chồi hoặc kích thích sự phát triển của chồi nách [11]

Mặt khác, cũng cần đảm bảo các nhân tố vật lý (nhiệt độ, ánh sáng …) phù hợp Trong giai đoạn này cần tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan trọng kích thích mô phân hoá mạnh Bảo đảm chế độ nhiệt 20-300C [3]

Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra hệ số cao nhất nhưng không ảnh hưởng đến sức sống và bản chất di truyền của cây

1.1.6.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

14

Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển từ môi trường ở công đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây hoàn chỉnh Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin để rễ phát triển (Pierik, 1987) Các chất α- NAA, IBA, IAA thường được sử dụng ở nồng độ 1-5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng [11]

1.1.6.5 Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần với môi trường tự nhiên Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp (chiều cao, số lá, rễ) thì mang trồng Giá thể phải đảm bảo tơi xốp và sạch bệnh Trong 2- 3 tuần đàu cần duy trì

độ ẩm trên 50%, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh nhiễm khuẩn và nấm gây hiện tượng thối nhũn Điều kiện môi trường trong giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng cáp và phòng bệnh cho cây Đây được xem là công đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất

1.1.7 Ý nghĩa của kỹ thuật nhân giống in vitro

Sự ra đời của kỹ thuật nhân giống in vitro đã mang lại ý nghĩa vô cùng to

lớn Nó đã chứng minh được tính toàn năng của tế bào thực vật Kỹ thuật nhân

giống in vitro góp phần giải quyết vấn đề lý luận và thực tiễn, đặc biệt là lĩnh vực

nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái ở nhiều thực vật từ mức độ tế bào đến cấu trúc mô

Nhân giống in vitro được xem là một trong những giải pháp công nghệ mới

có ý nghĩa khoa học trong công nghệ sinh học Trên các môi trường nhân tạo, từ các

mô hay tế bào thực vật sẽ phân chia, phân hoá và phát triển thành cây hoàn chỉnh Đây là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giống vô tính

Những ưu việt của phương pháp này :

Tạo ra một quần thể cây con đồng nhất và giống như cây mẹ Phần này giống như ưu điểm của nhân giống vô tính Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn

15

chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có ưu điểm hơn nhân giống qua hạt

So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, giâm hom), nhân

giống bằng nhân giống in vitro có ưu điểm là có hệ số nhân giống rất cao: từ 36-1012/năm, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất Vì vậy có thể nhân nhanh giống cây trồng phục vụ cho sản xuất ở quy mô công nghiệp Hơn nữa, lại có thể tiết kiệm diện tích: trong 1m2 nền có thể để được tới 1800 cây

Có thể tạo ra cây con sạch bệnh thậm chí là bệnh virut nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh Đồng thời trong quá trình sản xuất không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh vì vậy có thể cung cấp nguồn giống quanh năm phục vụ sản xuất, kinh doanh Việc trao đổi giống được dễ dàng

Cây con được tạo ra bằng nuôi cấy mô có độ trẻ hoá cao độ, thậm chí không

có sự khác biệt đáng kể với cây mọc từ hạt Phương pháp này còn khắc phục được hiện tượng bảo lưu cục bộ gặp phải khi nhân giống bằng giâm hom

Hơn nữa, việc vận chuyển giống trở nên thuận tiện và làm hạ giá thành sản phẩm (một thùng cây khoảng 2000 cây chỉ nặng 15 kg) Việc bảo quản giống cũng thuận lợi Các cây giống được giữ ở nhiệt độ 40C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống cao đến 90%

Nhu cầu về cây giống in vitro ngày càng nhiều Mấy năm gần đây hàng năm

thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng được yêu cầu thực tiễn sản xuất

Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô-tế bào là một trong các hướng phát triển trọng điểm của công nghệ sinh học hiện đại Ở nước ta, hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật trong giai đoạn từ nay tới năm 2010 là: tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LAN

1.2.1 Đặc điểm chung họ lan:

Lan (Orchidaceae) là một loài hoa đông đảo, phong phú và phức tạp Hiện nay họ Lan (Orchidaceae) trên thế giới được chia làm 5 phân họ Apostasioideae,

16

Cypripedioideae, Neottioideae, Epidendroideae và Orchidoideae Họ Lan (Orchidaceae) bao gồm 750-800 chi, khoảng 19.500 loài,và 30,000 giống nguyên thủy và chừng độ một triệu đã được lai giống phân bố rộng khắp thế giới từ 680 vĩ

độ Bắc đến 560

vĩ độ Nam, tập trung chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á và nhiệt đới châu Mỹ [1] Ở khu vực nhiệt đới họ Lan phân bố chủ yếu ở độ cao dưới 2000m Loài lan được biết đầu tiên ở Phương Đông, từ đời Vua Thần Nông (2.800 năm TrCN.) được dùng làm thuốc chữa bệnh

Ở Việt Nam, nghiên cứu phân loại và mô tả đặc điểm thực vật học các loài thuộc họ Lan (Orchidaceae) có các tác giả Trần Hợp, Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến [2, 10] Họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp Loa kèn (Liliidae), Lớp Loa kèn (Liliopsida), Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Thực vật họ lan được chia làm 3 nhóm là Phong lan, Địa lan và Thạch lan

+ Epiphytes: Phong lan bám vào cành hay thân cây

+ Terestrials: Địa lan mọc dưới đất

+ Lithophytes: Thạch lan mọc ở các kẽ đá

Bao gồm các cây thân thảo, lâu năm, sống ở đất, vách đá, phụ sinh Những loài sống

ở đất thường có rễ củ giả, mập và xum xuê hoặc có thân bò dài hay ngắn Thân lan ngắn, kéo dài hay phân nhánh, thường mang lá Đa số các loài lan thân thường sinh trưởng hợp trục, nằm trong đất gọi là thân rễ Căn cứ vào đặc điểm của thân, họ lan chia ra 2 nhóm:

- Nhóm đơn thân (Monopodial) gồm các giống Vanda, Phalaenopsis, Rhynchotylis

Cây trong nhóm này thường tăng trưởng theo chiều cao, khi cắt một đoạn ở phía ngọn của thân thì đoạn cắt rời vẫn phát triển về phía đỉnh

- Nhóm lan đa thân (Symbodial) gồm các giống Cattleya, Dendrobium, Cymbidium

Cây trong nhóm này thường tăng trưởng không liên tục mà có thời gian nghỉ sau một mùa tăng trưởng Khi cắt một đoạn thân của cây lan đa thân thì đoạn cắt ấy không thể phát triển về phía đỉnh

Ngoài ra còn có một số ít giống nằm trung gian giữa hai nhóm trên, như các giống

Pachyphyllum, Centropelalum

Lá lan thường lá đơn, mọc cách, màu xanh bóng, nhưng đôi khi có màu khác thường Nhiều loại lan lại có lá màu hồng và nổi lên các đường vẽ trắng theo các gân

17

rất đẹp Có loài lá biến đổi thành vảy tiêu biến hoàn toàn (Dendrobium indivisum)

Hình dạng lá rất phong phú: hình trụ, hình kim, bầu dục, tiết diện tròn hay có rãnh

Hoa lan phong phú đa dạng, muôn hình, muôn vẻ Thường là hoa mẫu 3 (3 lá đài, 3 cánh hoa, 3 tâm bì) đối xứng 2 bên, vặn xoắn 1800

để cánh môi khi hoa bắt đầu

nở hướng ra ngoài hoặc phía dưới Cánh môi hướng lên trên, thích hợp với loại côn trùng ưa lộn đầu xuống khi chui vào hoa Chính cánh môi quyết định phần lớn giá trị thẩm mỹ ở hoa lan Bầu hạ, nhị và nhụy hợp trục

Quả lan thuộc loại quả nang, khi chín mở theo 3-6 đường dọc, nhưng mảnh

vỏ còn dính lại ở đầu và gốc Một số loài quả không nứt Hạt lan nhỏ nhẹ, nhiều Hạt lan không có nội nhũ, chỉ gồm phôi Qua 2-18 tháng hạt mới chín Phần lớn hạt thường chết vì khó gặp nấm cộng sinh để nảy mầm Khối lượng hạt lan trong một quả chỉ bằng 1/10 – 1/1000 mg, trong đó không khí chiếm 76 - 96% thể tích của hạt [10]

1.2.3 Lịch sử nghiên cứu và thành tựu nuôi cấy mô hoa lan:

trò quan trọng trong mối quan hệ cộng sinh với cây lan là nấm Rhiroctonia

Sau đó, năm 1904: Noel Bernard & Burgeff người Đức cộng tác với nhau để đưa ra phương pháp gieo hạt lan có nhiễm nấm trong chai thạch Phương pháp này

đã làm gia tăng số lượng lớn cây con trồng từ hạt

Năm 1922, Knudson người Mỹ lại thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt Theo nghiên cứu của Knudson thì hạt của

các loài Cattleya, Epidendrum và nhiều loài lan khác có khả năng nảy mầm không cộng sinh với nấm trong nuôi cấy in vitro [4] Mặc dù đã có phát hiện của Knudson

nhưng vào năm đó vẫn chưa thể tạo nên môi trường mà các loài phong lan được lựa chọn có thể nảy mầm và phát triển [16]

Năm 1931, White và Gautheret đã nghiên cứu thành công môi trường nuôi cấy phong lan Trên môi trường của White và Gautheret hạt lan có thể nảy mầm không cần sự có mặt của nấm Rhiroctonia

18

Georges Morel, học trò của R.J Gautheret đã áp dụng phương pháp nuôi cấy

mô vào cây lan lan từ năm 1956 Ông công bố thành công ấy trên A.O.S (American Orchid Society) vào năm 1960 và giống lan đầu tiên ông áp dụng thành công đó là

với giống lan Cymbidium

Từ đó đến nay nhân giống in vitro đã thành công đối với nhiều chi khác thuộc họ lan, như: Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Hoàng Thảo (Dendrobium), Kim Tuyến (Anoectochilus)… và các giống lai của chúng Với Cattleya thì có khó khăn hơn vì đòi hỏi phải cấy ở môi trường lỏng với máy lắc liên

tục Cho đến nay, đối tượng chưa thể nuôi cấy bằng phương pháp nuôi cấy mô là

Phaphiopedium

Riêng đối với chi lan Kim Tuyến (Anoectochilus), trong một số năm gần đây

bắt đầu được các nhà khoa học nghiên cứu

Năm 2001: các tác giả Yih-Juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, RuYang, và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu và nhân giống thành công loài lan Kim

Shu-Tuyến Anoectochilus formosanus Hayata từ hạt đem lại triển vọng sản xuất số

lượng lớn loài lan này

Năm 2004: Tiến sĩ Nguyễn Văn Kết cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến ( A formosanus) với vật liệu ban đầu là từ

chồi đỉnh tại trường Đại học tổng hợp quốc gia Hàn Quốc

1.2.3.2 Ở Việt Nam:

Ở nước ta hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu, nhân giống thành công nhiều loài hoa lan

Năm 2002, tác giả Phạm Thị Liên đã nghiên cứu nhân giống in vitro thành

công cho một số loài địa lan ở khu vực phía Bắc Việt Nam và đưa ra quy trình nhân giống cho loài Địa lan Hạc đính nâu

Năm 2003, trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu

xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) của

Nguyễn Quang Thạch và cộng sự

Năm 2004: Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt đã nhân giống in vitro thành công loài lan

Hài Hồng quý hiếm với cách gây vết thương

Năm 2005, Viện Di truyền Nông nghiệp – Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh phong lan Hồ Điệp từ phát hoa và chóp rễ của Khuất Hữu Trung và

19

cộng sự cho thấy: môi trường phát sinh chồi từ chồi ngủ của phát hoa là MS + 10% nước dừa + 3% đường + 1g/l than hoạt tính + 1mg/l BAP + 0,1mg/l NAA; môi trường tạo cây hoàn chỉnh từ chồi ngủ của phát hoa là MS + 10% nước dừa + 3% đường + 1 g/l than hoạt tính + 0,1mg/l BAP+ 1,0 mg/l NAA

Năm 2007, tác giả Nguyễn Thị Hồng Gấm và các cộng sự ở trường Đại học Lâm nghiệp đã tiến hành Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu

(Rhychostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm đạt kết quả

tốt

Đến nay, việc nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy mô đã thực hiện thành công trên nhiều đối tượng Đây được coi là biện pháp chính trong sản xuất cây giống ở quy mô công nghiệp đồng thời góp phần hữu hiệu vào nhiệm vụ bảo

tồn những loài lan quý hiếm

1.2.4 Giới thiệu về lan Kim Tuyến:

Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ

Orchidoideae Trên thế giới đã thống kê được 51 loài Ở Việt Nam hiện thống kê

được 12 loài, trong đó loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết

đến chủ yếu với công dụng làm thuốc

Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus Blume

đồng danh là Anoectochilus roxburghi Wall

Họ: Phong lan Orchidaceae

Bộ: Phong lan Orchidales

Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước

và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xoè sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3-4 x 2-3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng

ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt Cuống lá dài 2-3 cm Cụm hoa dài 10-15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, dài 2,5-3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn Bầu dài 13mm, có lông thưa

Mùa hoa tháng 2, tháng 4 Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây

Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia

Tác dụng dược lý: lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh [21] Theo Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến thì loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính [12] Trước đó, trong sách Khoa học quốc dược quyển I kỳ 2 (năm 1958) của ông Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào (đăng tải trong tạp chí Đài Loan dân gian dược dụng thực vật) có nói đến lan

Kim tuyến (A.setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng

âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan [22]

Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây [22, 23, 24] bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài Lan kim tuyến Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3,

tháng 3/2006, trang 359-363 đăng bài “A Novel Flavonoid Glucoside from A roxburghii (Wall.) Lindl.” của tác giả Chun-Nian He, Chun-Lan Wang, Shun-Xing

Guo, Jun-Shan Yang, Pei-Gen Xiao Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được

8 hợp chất hoá học Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt Đặc biệt

có hai axít hữu cơ được phân lập là Oleanolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn … [28, 29, 30] Ở Trung Quốc hiện nay đã có nghiều nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống và gây trồng loài Lan này [23, 24, 25, 26] Điển hình như tác giả Lai WanYu, Lai Wan Nian trong tạp chí Nông nghiệp Thượng Hải, năm 2005, tập 21 số 1 trang 92- 94

đăng bài: “Triển vọng gây trồng Anoectochilus roxburghii ở đảo Hải Nam” Bài báo

đã giới thiệu về giá trị sử dụng, đặc điểm sinh thái học và triển vọng gây trồng loài

23

24

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU-NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu:

- Xác định được phương pháp tạo mẫu sạch in vitro lan Kim Tuyến

- Xác định được môi trường nuôi cấy khởi đầu thích hợp

- Xác định được loại chồi và thể chồi dùng để nhân nhanh

- Xác định được môi trường để nhân nhanh kích thích phát sinh chồi

2.2 Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu lựa chọn loại vật liệu làm mẫu cấy và biện pháp khử trùng mẫu cấy

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh của

mẫu cấy

- Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chồi/thể chồi đến khả năng nhân nhanh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và chế độ nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh thể chồi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng phát sinh chồi

từ thể chồi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến

khả năng nhân nhanh chồi lan Kim tuyến

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu:

- Đối tượng nghiên cứu của đề tài: loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus

Blume) được lấy từ Vườn Quốc gia Ba Vì – Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: thời gian tiến hành nghiên cứu từ 25/12/2008 đến

15/5/2009

- Địa điểm nghiên cứu:

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô- tế bào thực vật thuộc Trung tâm giống & Công nghệ sinh học - Khoa Lâm học - Trường Đại học Lâm Nghiệp, trong điều kiện nhân tạo với chế độ:

 Ánh sáng: Số giờ chiếu sáng: 10 h/ngày

Cường độ chiếu sáng: 2000lux

25

 Nhiệt độ phòng nuôi cây: 25 ± 2 0C

 Độ ẩm trung bình: 60% - 70%

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành

2.3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn loại vật liệu làm mẫu cấy và biện pháp khử trùng mẫu

cấy

a) Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu

sạch và khả năng tái sinh của mẫu cấy

Nghiên cứu nhằm xác định nồng độ, thời gian các loại hoá chất khử trùng phù hợp nhất cho từng loại vật liệu

 Vật liệu:

+ Vật liệu sinh dưỡng: thân ngầm, thân khí sinh

Trong đó, thân khí sinh là đoạn thân và ngọn nằm trên mặt đất

thân ngầm là đoạn thân nằm ngầm trong đất

+ Phôi hạt: lấy từ quả non và quả chín

Quả non là quả hình thái bên ngoài có màu nâu đỏ, bóp thử quả thấy móp

Quả chín là quả quan sát hình thái bên ngoài thấy quả có màu đỏ thẫm, bóp thấy chắc

 Bố trí thí nghiệm:

 Bước 1: Mẫu được khử trùng thô ở ngoài bằng dung dịch xà phòng loãng và

được rửa sạch dưới vòi nước chảy

 Bước 2: Mẫu được đưa vào trong box cấy và khử trùng với các hóa chất

thích hợp

+ Với thân ngầm: các công thức khử trùng thực hiện lần lượt: cồn 70% được dùng

khử trùng lần 1 trong 1 phút và HgCl2 0,1 % được khử trùng lần 2 trong 7 phút, lần khử trùng thứ 3 dùng NaOCl với nồng độ khác nhau (10% và 20%) và thời gian khử trùng khác nhau (10 phút và 13 phút), sau đó mẫu được tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 lần

+ Với thân khí sinh: cồn 70% được dùng khử trùng lần 1 trong 2 phút và HgCl2 0,1

% được khử trùng lần 2 trong 5 phút, lần khử trùng thứ 3 dùng NaOCl với nồng độ 20% trong 13 phút), sau đó được khử trùng bằng HgCl2 0,1 % lần 4 trong thời gian khác nhau ( 1 phút, 2 phút, 3 phút), tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần

26

+ Với quả: cồn 70% được dùng khử trùng lần 1 trong (1hoặc 3) phút và HgCl2 0,1

% được khử trùng lần 2 trong (5 hoặc 7 phút), lần khử trùng thứ 3 dùng NaOCl với nồng độ 20% và thời gian khử trùng 10 phút Sau đó mẫu được tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 lần

 Bước 3: Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy khởi đầu

+ Thân ngầm và thân khí sinh được cắt thành đoạn có kích thước 1cm, có 1 mắt rồi cấy vào môi trường nuôi cấy khởi đầu: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,5 g/l AC +100 ml/l

ND +100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar

+ Quả tách ra làm đôi, lấy dao cấy gạt phôi vào bình môi trường nuôi cấy khởi đầu: Knud* + 0,3 mg/l BAP + 0,3 mg/l NAA +100 ml/l ND +100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar

Bảng 2.1: Công thức khử trùng cho từng loại mẫu

Thời gian (phút)

Nồng

độ (%)

Thời gian (phút)

Nồng

độ (%)

Thời gian (phút)

Nồng

độ (%)

Thời gian (phút)

27

Thí nghiệm được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy

Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu tái sinh

b) Thí nghiệm 2: Nghiên cứu lựa chọn loại vật liệu làm mẫu cấy:

Nghiên cứu này nhằm lựa chọn được loại vật liệu vào mẫu cho tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh cao nhất

 Bước 1: Từng loại vật liệu được khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu

quả nhất (rút ra từ thí nghiệm 1)

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của loại vật liệu nuôi cấy

Loại vật liệu Công thức khử trùng Tỷ lệ mẫu sạch

(%)

Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) Thân ngầm Tốt nhất ở thí nghiệm 1

Thân khí sinh Tốt nhất ở thí nghiệm 1

Phôi hạt từ quả non Tốt nhất ở thí nghiệm 1

Phôi hạt từ quả chín Tốt nhất ở thí nghiệm 1

 Bước 2: Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy khởi đầu, tương tự như ở thí

nghiệm 1

Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp/loại vật liệu

30 mẫu/ lần lặp - mẫu sinh dưỡng, 3 bình/lần lặp đối với mẫu phôi hạt

Thí nghiệm được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy

Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu tái sinh

2.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh của

mẫu cấy

a) Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường hóa học đến khả năng tái

sinh của mẫu cấy:

 Thí nghiệm 3.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường hóa học đến khả

năng tái sinh của vật liệu sinh dưỡng (thâm ngầm và thân khí sinh):

28

Các loại môi trường cơ bản khác nhau (MS, Knudson cải tiến, Hyponex) + 0,5 mg/l BAP +100ml/l ND +100g/l khoai tây + 0,5 g/l AC + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar Bảng 2.3 Ảnh hưởng của môi trường hóa học đến khả năng tái sinh của vật liệu

sinh dưỡng Môi trường

Thân ngầm Thân khí sinh

 Thí nghiệm 3.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường hóa học đến khả

năng tái sinh của phôi hạt

Các loại môi trường cơ bản khác nhau (Knudson cải tiến, Hyponex) + 0,25 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA + 100 ml/l ND +100 g/l khoai tây + 0,5 g/l AC + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar

Bảng 2.4 Ảnh hưởng của môi trường hóa học đến khả năng tái sinh của phôi hạt

Môi trường

Phôi chín

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, 3 bình/lần lặp

Đánh giá kết quả sau 6 tuần nuôi cấy

b) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy

 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chất ĐHST ở các nồng độ

khác nhau đến khả năng tái sinh của mẫu cấy là vật liệu sinh dưỡng

Môi trường cơ bản phù hợp nhất (tìm được ở thí nghiệm 3.1) bổ sung

(100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 0,5 g/l AC + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar) + các chất điều hòa như ở bảng 2.5

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của hàm lượng chất ĐHST đến khả năng tái sinh của thân

ngầm và thân khí sinh lan Kim tuyến

29

CTTN Chất điều hòa sinh trưởng Tỷ lệ mẫu

tái sinh (%) BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) NAA (mg/l)

Mỗi công thức đều được làm lặp lại 03 lần, 10 mẫu/lần lặp

Đánh giá kết quả sau 4 tuần nuôi cấy

 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chất ĐHST ở các nồng độ

khác nhau đến khả năng tái sinh của mẫu cấy là phôi hạt

Phôi hạt được cấy vào môi trường cơ bản phù hợp nhất (tìm được ở thí nghiệm

3.2) có bổ sung (100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar) +

các chất điều hòa như ở bảng 2.6

Bảng 2.6 Ảnh hưởng của hàm lượng chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng tái

sinh của phôi hạt lan Kim tuyến

CTNC

Chất điều hòa sinh trưởng Tỷ lệ mẫu

tái sinh (%)

TDZ mg/l

Kinetin mg/l

BAP mg/l

30

Mỗi thí nghiệm được bố trí 03 lần lặp, 3 bình/ lần lặp

Đánh giá kết quả sau 6 tuần nuôi cấy

2.3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chồi/thể chồi đến khả năng nhân nhanh,

 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chồi có nguồn gốc khác nhau

đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến in vitro

Sau khi vật liệu vào mẫu là thân ngầm và thân khí sinh tái sinh chồi, chúng tôi sử dụng các chồi này để thực hiện tiếp thí nghiệm 6 Các chồi mới phát sinh có nguồn gốc khác nhau được cấy vào công thức môi trường nhân nhanh chồi: Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar

Bảng 2.7 Ảnh hưởng của loại chồi đến khả năng nhân nhanh

Loại chồi Hệ số nhân chồi Đặc điểm chồi

mới phát sinh Chồi đỉnh

Chồi nách

Mỗi loại chồi được thử nghiệm với 03 lần lặp, 10 mẫu/lần lặp

Đánh giá kết quả sau 4 tuần nuôi cấy

 Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi thể chồi đến khả năng

nhân nhanh thể chồi lan Kim tuyến in vitro

Thể chồi từ phôi hạt chín được dùng làm vật liệu nghiên cứu cho thí nghiệm này Các thể chồi mới phát sinh có độ tuổi khác nhau được cấy vào công thức môi trường nhân nhanh thể chồi: Knud* + 0,3 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar

Tuổi thể chồi được tính từ lúc bắt gieo phôi vào môi trường nuôi cấy Các độ tuổi của thể chồi là: 6 tuần, 8 tuần và 10 tuần

Bảng 2.8 Ảnh hưởng của độ tuổi thể chồi đến khả năng nhân nhanh

Tuổi thể chồi Hệ số nhân nhanh

thể chồi Đặc điểm thể chồi

6 tuần

8 tuần

31

10 tuần

Mỗi độ tuổi được bố trí 3 lần lặp, mỗi lần 3 bình

Đánh giá kết quả sau 4 tuần cấy chuyển

2.3.2.4 Ảnh hưởng của loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng và chế độ nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh thể chồi:

 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại và nồng độ chất ĐHST đến

khả năng nhân nhanh thể chồi:

Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản thích hợp thu được từ thí nghiệm 3.2 bổ sung (100ml/l ND + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar) và các loại chất ĐHST có hàm lượng khác nhau như bảng 2.9:

Bảng 2.9: Ảnh hưởng của loại và nồng độ chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể

chồi

CTTN

Chất điều hòa sinh trưởng

Hệ số nhân nhanh thể chồi

Chất lượng thể chồi BAP

(mg/l)

Kinetin (mg/l)

NAA (mg/l)

Đánh giá kết quả sau 4 tuần cấy chuyển

 Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến khả năng

nhân nhanh thể chồi:

Thể chồi có cùng độ tuổi được cấy vào môi trường nhân nhanh thể chồi tốt

nhất (tìm ra ở thí nghiệm 8) có bổ sung agar (môi trường rắn) và không bổ sung

32

agar (môi trường lỏng) để nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh thể chồi

Bảng 2.10 Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh thể chồi:

CTTN Chế độ nuôi cấy Hệ số nhân nhanh

thể chồi

Chất lượng thể chồi CTTN 1 Môi trường rắn

CTTN 2 Môi trường lỏng, lắc

Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp, 3 bình/ lần lặp

Chỉ tiêu đánh giá: Hệ số nhân nhanh thể chồi., chất lượng thể chồi

Kết quả được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy

2.3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng phát sinh chồi

từ thể chồi:

 Thí nghiệm 10: Thể chồi có cùng độ tuổi được cấy vào môi trường nhân nhanh thể chồi tốt nhất (tìm ra ở thí nghiệm 8), đồng thời bổ sung thêm đường sucrose hàm

lượng khác nhau như bảng 2.11

Bảng 2.11 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng phát sinh chồi từ

thể chồi lan Kim tuyến:

Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp, 3 bình/ lần lặp

Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ thể chồi tạo chồi

Kết quả được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy

2.3.2.6 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi:

Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại và hàm lượng chất ĐHST đến khả

năng nhân nhanh chồi lan Kim tuyến

33

Môi trường cơ bản: môi trường (ở thí nghiệm 4) có bổ sung 100g/l khoai tây

+100ml/l ND đồng thời bổ sung thêm các chất ĐHST có hàm lượng khác nhau, như bảng 2.12

Bảng 2.12 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim

tuyến:

CTTN

Chất điều hòa sinh trưởng

Hệ số nhân chồi

Số đốt thân/chồi BAP

(mg/l)

NAA (mg/l)

TDZ (mg/l)

Kinetin (mg/l)

Mỗi công thức được tiến hành 3 lần lặp, 5 mẫu/lần lặp

Chỉ tiêu đánh giá: hệ số nhân chồi

2.3.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

 Phương pháp thu thập số liệu:

Các chỉ tiêu thu thập:

Số mẫu sạch

Tỷ lệ mẫu sạch = x 100 %

Tổng số mẫu cấy

Số mẫu tái sinh

Tỷ lệ mẫu tái sinh = x 100 %

Hệ số nhân nhanh thể chồi =

Số bình thể chồi cấy ban đầu

Số chồi phát sinh từ thể chồi

Tỷ lệ phát sinh chồi = x100%

Số thể chồi ban đầu

Tổng số chồi

Hệ số nhân nhanh chồi =

Số chồi cấy ban đầu Tổng số đốt

Hệ số nhân nhanh đốt =

Số đốt ban đầu

Số liệu được thu thập bằng phương pháp thống kê

 Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu được tính toán theo phương pháp phân

tích thống kế toán học Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính với

ứng dụng Data Analysis của chương trình Excel 5.0 Dùng hàm thống kê Anova

để phân tích phương sai một nhân tố và hai nhân tố với ba lần lặp