Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất hóa học của cây giảo cổ lam ba lá gynostemma laxum(wall ) cogn của việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LÊ THỊ LIỂU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM BA LÁ [GYNOSTEMMA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

LÊ THỊ LIỂU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC CỦA

CÂY GIẢO CỔ LAM BA LÁ [GYNOSTEMMA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

LÊ THỊ LIỂU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ

LAM BA LÁ [GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.)

COGN.] CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

Mã số : 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH TRẦN VĂN SUNG

Đà Nẵng - Năm 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Lê Thị Liểu

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

4.1 Các phương pháp nghiên cứu lý thuyết 2

4.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 3

5 Bố cục luận văn 3

6 Tổng quan tài liệu nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CÂY GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.) COGN 5

1.2 MÔ TẢ THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CỦA CHI GYNOSTEMMA BLUME 6

1.2.1 Đặc điểm chung về hình thái 6

1.2.2 Đặc điểm phân bố 7

1.2.3 Đặc điểm thực vật và phân bố Gynostemma laxum (Wall.) Cogn 7 1.2.4 Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài khác trong chi Gynostemma Blume 9

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME 12

1.3.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino 12

1.3.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Gynostemma laxum (Wall.) Cogn 21

1.4 TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG 25

1.4.1 Tác dụng và công dụng của Gynostemma pentaphyllum 25

1.4.2 Tác dụng và công dụng của G laxum 27

1.5 HỢP CHẤT FLAVONOID 28

1.5.1 Định nghĩa 28

1.5.2 Phân loại 28

1.5.3 Tính chất một số hợp chất flavonoid 29

1.5.4 Các phương pháp định lượng 30

1.5.5 Các phương pháp chiết xuất và tổng hợp flavonoid 31

1.5.6 Tác dụng sinh học và ứng dụng 32

CHƯƠNG 2 NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 35

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 35

2.1.1 Nguyên liệu 35

2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 36

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật [18] 37

2.2.2 Phương pháp tách và tinh chế chất [18] 37

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất 38

2.2.4 Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc ký [18] 38

2.2.5 Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột [18] 39

2.2.6 Cách nạp silica gel vào cột [18] 40

2.2.7 Cách nạp mẫu vào cột [18] 41

2.3 THỰC NGHIỆM 42

2.3.1 Chiết mẫu thô 42

2.3.2 Sơ đồ thực nghiệm 44

2.3.3 Tách chất từ phần cao n–butanol 45

2.3.4 Tách chất từ phần cao n-hexan 47

2.4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG 50

2.4.1.Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần 50

2.4.2 Xác định hàm lượng hợp chất quercetin có trong nhóm chất flavonoid của cây cổ yếm lá bóng 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 NHẬN DẠNG CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 52

3.1.1 Chất GCLB17 52

3.1.1 Chất GCLH5.5 60

3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG 71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (bản sao)

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation

HMQC Heteronuclear multiple quantum coherence

HPLC High-performance liquid chromatography

NMR Nuclear magnetic resonance

PDA Photodiode Array Detector

ppm Parts per million

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

1.1 Ảnh hưởng của VN1-VN7 trên sự phát triển của

1.2 Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất 1-5 20

1.3 So sánh thành phần hoá học mẫu dược liệu giảo

cổ lam và cổ yếm lá bóng thu hái tại Hoà Bình 22

61

2.1 Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thu hái ở Hoà Bình 35 2.2 Sơ đồ chiết mẫu bộ phận trên mặt đất của cây cổ yếm lá bóng 43

3.15 Phổ UV-Vis của peak 1 và peak 2 (RT=13.486 và 16.111) 73 3.16 Phổ UV-Vis của peak 3 và peak 4 (RT=18.308 và 19.318) 74

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay trong thế giới hiện đại, công nghiệp phát triển kéo theo nhiều vấn đề về môi trường sinh thái và sức khoẻ con người Mô hình bệnh tật vì thế cũng ngày càng phức tạp hơn Gần đây, thế giới luôn phải đối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành đại dịch ở quy mô toàn cầu Có thể lấy một số ví dụ điển hình như bệnh HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, bệnh tim mạch, huyết áp v.v Thực tế đó đã thúc đẩy chúng ta luôn luôn phải tìm ra các thuốc chữa bệnh mới, có hiệu quả cao hơn, tác dụng chọn lọc hơn và giá thành rẻ hơn để điều trị các bệnh hiểm nghèo

Hơn thế nữa, Việt Nam là nước có nguồn thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài, trong đó đã điều tra được 3.850 loài được sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ Đa phần các cây mọc tự nhiên và chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, có hệ thống về mặt khoa học cũng như hoạt tính sinh học

Từ nhiều ngàn năm qua, thảo dược luôn giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe con người đã được các Lương Y sử dụng trong những bài thuốc gia truyền Ngày nay, với khoa học công nghệ hiện đại người ta còn chiết xuất các hợp chất từ thảo dược để làm thuốc nhằm nâng cao hiệu quả và

hỗ trợ điều trị ung thư, tiểu đường, giảm cân, tăng cường hệ miễn dịch cơ thể… Ưu điểm của các loại thảo dược là có tác dụng vào nhiều bộ phận cơ thể hơn là thuốc tây, không gây nghiện và không gây tác dụng phụ không mong muốn

Trong số 5 loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí Cucurbitaceae)

có mặt tại Việt Nam Giảo cổ lam là dược liệu quý được nhóm nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ phát hiện lần đầu tiên từ năm 1997 Từ đó cho tới nay, nhiều nghiên cứu trên loài dược liệu này đã được tiến hành, làm sáng tỏ

thành phần hoá học, tác dụng dược lý và từ đó, đưa vào khai thác và sử dụng nguồn dược liệu quý hiếm này phục vụ chăm sóc sức khoẻ tại cộng đồng

Trong số 4 loài còn lại, Gynostemma laxum (Wall.) Cogn (hay còn gọi

là cây cổ yếm lá bóng) là dược liệu được người dân ở Trung Quốc sử dụng tương tự như giảo cổ lam, với tác dụng điều trị viêm khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và đau nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh Tuy nhiên, cho tới nay, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu tại Việt Nam về thành phần hoá học, tác dụng dược lý cũng như độc tính của loài này

Vì vậy, việc tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học, xác định cấu trúc

và hoạt tính sinh học của cây thuộc loài Gynostemma laxum nói trên ở Việt

Nam là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng

Từ những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất hóa học của cây Giảo cổ

lam ba lá [Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.] của Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây giảo cổ lam ba lá

(Gynostemma laxum) của Việt Nam

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Dịch chiết của mẫu cây giảo cổ lam ba lá ở Việt Nam

- Chiết các mẫu thực vật bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau

- Nghiên cứu phân lập, tinh chế các hợp chất từ các dịch chiết

- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Các phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Phương pháp nghiên cứu: chiết tách xác định cấu trúc các hợp chất thiên nhiên, tổng quan các tài liệu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học,

tác dụng sinh học, ứng dụng của một số loài cây thuộc chi Gynostemma Các

phương pháp chiết tách và xác định thành phần hóa học của các hợp chất thiên nhiên trong nước và trên thế giới về các loại cây này

- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá

học, ứng dụng của một số loài cây thuộc chi Gynostemma

4.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Xử lý mẫu: nguyên liệu là thân, lá cây giảo cổ lam ba lá được thu hái tại Hòa Bình vào tháng 6 năm 2012, được rửa sạch, sấy khô và đem xay nhỏ

- Nguyên liệu đã xử lý được chiết hồi lưu với các dung môi khác nhau như methanol, hexan, ethyl acetate, butanol thu được các phần chiết

- Phân lập, tách và tinh chế các chất bằng phương pháp sắc ký cột, sắc

ký lớp mỏng, các phương pháp kết tinh phân đoạn

- Các phương pháp khảo sát cấu trúc: kết hợp các phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): 1

H-NMR, 13C-NMR, DEPT, cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR): COSY, NOESY và các phương pháp khác để tìm ra những đặc trưng cấu trúc tiêu biểu của một số hợp chất phân lập được

5 Bố cục luận văn

Luận văn gồm 80 trang trong đó có 5 bảng và 25 hình Phần mở đầu (4 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), tài liệu tham khảo (4 trang) và phần phụ lục Nội dung của luận văn chia làm 3 chương:

Chương 1 – Tổng quan (34 trang)

Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm (17 trang)

Chương 3 – Kết quả và thảo luận (23 trang)

6 Tổng quan tài liệu nghiên cứu

Luận văn đã tham khảo 36 tài liệu khoa học về loài Gynostemma

pentaphyllum, Gynostemma laxum và những kiến thức liên quan Trong đó,

có 18 tài liệu tiếng Việt, 17 tài liệu tiếng Anh và một tài liệu tiếng Trung Quốc (đã dịch ra tiếng Việt) Hiện tại trong và ngoài nước đã có nhiều công

trình nghiên cứu về loài Gynostemma pentaphyllum, về thành phần hóa học

cũng như hoạt tính sinh học của loài này Tuy nhiên, các nghiên cứu về loài

Gynostemma laxum chưa nhiều, vì vậy việc nghiên cứu phân lập và xác định

thành phần hóa học là cần thiết Có thể ứng dụng kết quả để tiêu chuẩn hóa dược liệu giảo cổ lam ba lá hay cổ yếm lá bóng, đồng thời giải thích tác dụng chữa bệnh, cũng như xây dựng cơ sở khoa học cho việc sử dụng, khai thác

loài dược liệu quý này

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Giảo cổ lam ba lá có tên khoa học là Gynostemma laxum (Wall.) Cogn

thuộc họ Bí (Cucurbitaceae) Hiện nay, trên thế giới người ta đã nhận dạng

trên 30 loài của chi Gynostemma Blume [29] Ở Việt Nam, chi Gynostemma Blume có 5 loài bao gồm Gynostemma laxum, Gynostemma pentaphyllum,

Gynostemma pedata, Gynostemma longipes, Gynostemma pubescens Giảo

cổ lam còn được gọi là nhân sâm phương Nam vì những tính chất của nó

tương tự nhân sâm (Panax) mặc dù thực tế loài này không có họ hàng gì với

nhân sâm đích thực

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CÂY GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.)

COGN

Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật [6], Cây cỏ Việt

Nam [13], vị trí của G.laxum (Wall.) Cogn trong hệ thống phân loại thực vật

5b Cây thảo, thân leo, lá chét khía răng cưa rõ, có lá bắc Hạt không có cánh hoặc hiếm khi có cánh

6b Quả tự mở ở đỉnh, hoặc hiếm khi không tự mở nhưng khi đó có kích thước nhỏ hơn, hạt rủ xuống

7b Cánh hoa nhỏ hơn 3 mm, quả hình con quay hoặc hình cầu, 1-3 (-5) hạt

8b Cây đơn tính khác gốc, quả hình cầu hoặc hình chuông, không tự mở hoặc tự mở

3 Gynostemma Loài Gynostemma laxum (Wall.) Cogn được phân loại theo khoá phân

loại như sau [40]:

1a Quả mọng hình cầu, đỉnh không có mỏ, không tự mở

2b Lá kép hình bàn đạp 3-9 lá chét

3a Lá kép hình bàn đạp 3 lá chét

4a Phiến lá nhẵn hoặc có lông tơ ở gân chính; thân mảnh,

có lông tơ ở đốt; thùy tràng hình mũi giáo hẹp, 2-3 mm

2 G laxum

1.2 MÔ TẢ THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CỦA CHI GYNOSTEMMA

BLUME

1.2.1 Đặc điểm chung về hình thái

Theo các tài liệu [7], [8], [9], [13], chi Gynostemma Blume có đặc điểm

thực vật như sau:

Cây thảo, khác gốc, ít khi cùng gốc, thân leo mảnh, nhẵn hoặc có lông mịn Lá có cuống, phiến lá chân vịt có 3 – 9 lá chét Tua cuốn chẻ đôi, ít khi đơn Cụm hoa đực hình chùm kép rất dài, nhiều hoa Hoa nhỏ trắng hay lục nhạt, toả hình sao Cuống hoa mang lá bắc ở gốc Đế hoa trải ra Lá đài 5, nhỏ Cánh hoa 5, hình mũi dùi - ngọn giáo hoặc xoan thuôn, nhọn ở đỉnh Nhị

5, chỉ nhị dính thành một cột ở trung tâm, bao phấn đều đơn gắn với nhau Cụm hoa cái giống cụm hoa đực nhƣng dài hơn Bao hoa giống hoa đực Bầu hình cầu, 2-3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, vòi nhụy 3, đầu nhụy 2-3 nhánh Quả mọng, hình cầu, không mở, chứa 2-3 hạt Hạt hình trứng hoặc hình tim, hơi dẹt, hơi sần sùi

Hình 1.1 Loài giảo cổ lam 7 lá - Thất diệp đởm

- Tên Việt Nam: Cổ yếm lá bóng, Thƣ tràng thƣa [10]

- Theo các tài liệu [22], [23], [25], [26] loài này có các tên gọi khác :

Hoa khác gốc Cụm hoa đực hình chùy, mọc ở ngọn hoặc ở nách lá, dài

10 – 30cm, có lông tơ mịn, lá bắc hình mũi giáo, dài 1mm Tràng hoa 5, rời, màu vàng xanh Kích thước 1,5 x 0,5mm Nhị 5, hàn liền ở chỉ nhị và bao phấn Cụm hoa cái giống cụm hoa đực, bầu hình cầu, đường kính 1mm Vòi nhụy 3, rời, xẻ đôi ở đỉnh Ra hoa vào tháng 5

Quả hình cầu, không tự mở, to 6 - 8mm, màu vàng xanh, nhẵn Hạt 2 đến

3, hình trứng rộng, đường kính 4mm

b Phân bố

Theo các tài liệu [7], [9] cây mọc leo ở các rừng thưa, savan cỏ, trên đất sét hoặc các rừng cây bụi trên núi đá vôi Phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam, Mianma, Ấn Độ, Thái Lan Ở nước ta, cây mọc leo ở rừng thưa các tỉnh Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình, Quảng Trị Theo tài liệu [20], cây mọc ở độ cao 1.200m, trong các khu rừng, dọc theo các con suối Phân bố từ Ấn Độ tới Sumatra, Java và Borneo Tên địa phương: pogsot

1.2.4 Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài khác trong chi

Gynostemma Blume

a Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino

Đặc điểm thực vật: Theo Võ Văn Chi [7] cây thảo, mọc leo, thân cành

mảnh, có góc cạnh, không lông hoặc có lông thưa thớt ở mấu Lá kép chân vịt – bàn đạp, 5 - 7 lá chét dài 3 - 9cm, rộng 1,5 - 3cm, mép lá có răng cưa Tua

cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh

Cụm hoa đực dạng chùm kép Hoa có cuống mảnh cỡ 1- 4mm; ống đài rất ngắn, thuỳ đài hình tam giác, dài khoảng 0,7mm, đỉnh nhọn, thuỳ tràng hình bầu dục hoặc mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5 Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực Hoa cái có đài và tràng giống như hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, nhị lép 5, ngắn

Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5- 6mm, khi chín màu đen Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4mm, màu nâu, đỉnh tù, gốc hình tim

dẹt Mùa hoa tháng 3-10, quả tháng 4-12 [6], [12] Cây mọc trên đất đá vôi,

đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2.000m [7]

Hình 1.3 Loài giảo cổ lam 5 lá - Ngũ diệp sâm

(G pentaphyllum)

- Phân bố: Cây có ở Ấn Độ, Xri Lanca, Myanma, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Malaysia, Việt Nam Ở nước ta, cây mọc từ Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình, Thừa Thiên - Huế, Kon Tum,

Đồng Nai [7], [11]

b Gynostemma pedata Blume

Cây thảo, thân mảnh, có góc cạnh Lá hình chân vịt kép, 5 - 7 lá chét hình oval hoặc elip, mép khía răng cưa, dài 35 - 60mm, rộng 15 - 25mm Tua cuốn mảnh

Cụm hoa đực hình chuỳ rất mảnh Hoa rất nhỏ, khi nở hình sao, khi nụ

hình cầu, cuống 2 mm Đài dạng ống ngắn, đứng Tràng 5, hình oval dài 2

mm Nhị 1 bó, chỉ nhị hàn liền dạng cột ngắn Bao phấn 5; 1 ô, đi dọc theo đĩa Hoa cái dạng chuỳ ngắn hơn hoa đực Đài và tràng giống như hoa đực Nhụy bầu dưới hình cầu thóp dần ở đỉnh, 2-3 ngăn, 2-3 noãn treo ở phần trên của ngăn

Quả gần như nang, không mở, hình cầu, 5 - 6mm, màu lục đen khi chín Hạt treo, hình tim dẹt, dài 4mm Lá mầm thẳng, rễ mầm hướng lên đầu trên

Cây có ở Ba Vì, Lạng Sơn, Hà Nội, Sapa, Ninh Bình, Hoà Bình

c Gynostemma longipes C.Y.Wu

Hình 2.3 Loài Gynostemma longipes

Đặc điểm thực vật: Cây dây leo Thân cành mảnh, có 5 góc hình ngũ giác Lá kép chân vịt Mép lá răng cưa to Ngọn lá nhọn dài Mặt trên có lông cứng rải rác, mặt dưới nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thưa

Lá bên nhỏ dần Tua cuốn mảnh, rẽ đôi muộn Hoa đơn tính khác gốc

Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh Hoa đực rất nhỏ màu trắng Đài 5 rời, hình tam giác Tràng 5, hình tam giác, rời Nhị 5, chỉ nhị dính thành 1 cột

ở trung tâm, hình sao; bao phấn 2 ô Cụm hoa cái kép 3 lần chùm Hoa cái, cuống dài 1,8 - 2,0mm Đài và tràng giống như hoa đực, bộ nhụy cấu tạo thường bởi 3 lá noãn hàn liền, 2 - 3 vòi nhụy mập, rời; núm nhụy chia 2 - 3; bầu giữa, 3 ô, mỗi ô có 1 hạt Quả mọng, khi chín màu vàng xanh, cuống quả dài 8 - 15mm Hạt hình tim, rộng 3 - 4mm, dài 3 - 4mm, màu xám nhạt, viền hạt có răng cưa Ra hoa vào tháng 8-10, quả tháng 11-12

Phân bố: Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [2]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME

1.3.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino

Đã nghiên cứu phương pháp chiết xuất dược liệu giảo cổ lam bằng các dung môi hữu cơ, nhận thấy chiết bằng ethanol 70% cho khối lượng toàn phần lớn nhất [17]

Đã xác định trong giảo cổ lam có chứa saponin, flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử [12], [14], [15]

a Saponin

Theo các tài liệu [19], [24], chi Gynostemma chứa các saponin gọi chung

là các gypenosid (gynosaponin) có cấu trúc dammaran triterpen, tồn tại chủ yếu ở dạng glycosid Hơn 100 gypenosides đã được phân lập và xác định từ

Gynostemma pentaphyllum bởi các nhà khoa học ở Nhật Bản và Trung Quốc

kể từ năm 1976

Trong nhân sâm Panax các saponin được gọi là ginsenosides, trong giảo

cổ lam Gynostemma, chúng được gọi là gypenosides [27]

Trong G pentaphyllum chất Saponin rất giống nhân sâm và có tới hơn

100 loại (nhân sâm chỉ có hơn 20 loại) Các cấu trúc của gypenoside III, IV,

VIII và XII, bốn thành phần chính của G pentaphyllum, cũng giống như những ginsenosides Rb1, Rb3, Rd và F2 tương ứng có trong nhân sâm Panax

[27] Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học quý đã được nghiên cứu

Mặc dù hai loài giảo cổ lam và nhân sâm Panax này không liên quan đến

nhau nhưng chúng có các thành phần chính là saponin Trong các nghiên cứu,

để tăng cường sức đề kháng, ức chế khối u và giúp bảo vệ miễn dịch tế bào trong con người, cũng như cung cấp nhiều lợi ích tăng cường sức khỏe khác, giúp ăn ngủ tốt, mau hồi phục sức lực Làm tăng miễn dịch của cơ thể, bảo vệ gan khỏi tác hại của hóa chất, rượu [31]

Ginsenosides Rb1 Nhóm Rb1 được biết đến với tác dụng an thần nhiều hơn, tốt cho đường tiêu hóa, bảo vệ gan và là chất chống oxy hóa Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ginsenosides của nhóm Rb1 có thể chống mệt mỏi, chống co giật, giảm

đau và loét

Ginsenosides F2 Ginsenoside F2 đƣợc đánh giá cho hoạt động kháng sinh chống lại các tế bào gốc ung thƣ vú (CSC)

Ginsenosides Rb3

Ginsenosides Rd

Saponin có cấu trúc Dammarane là thành phần chính của Panax (Araliaceae) và các loài Gynostemma (Cucurbitaceae) Tuy nhiên, loài

Gynostemma có nhiều ƣu điểm có đƣợc saponin cấu trúc Dammarane dễ dàng

hơn so với các loài Panax Do đó, loài Gynostemma đã thu hút nhiều sự quan

tâm nhƣ loại thuốc thực vật mới tiềm năng [30]

Feng Yin và cộng sự đã phân lập và xác định 15 glycosid có cấu trúc khung dammaran

Xin LIU và cộng sự cũng đã tinh chế và nhận dạng đƣợc 3 glycosid có cấu trúc khung dammaran [24]

Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã phân lập đƣợc 7 saponin mới có cấu trúc khung Dammaran đề nghị gọi tên là: Gypenoside VN1 (C59H100O26), Gypenoside VN2 (C53H88O22), Gypenoside VN3 (C53H88O22), Gypenoside VN4 (C47H78O18), Gypenoside VN7 (C47H78O18) [30]

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của VN1-VN7 trên sự phát triển của tế bào ung thư

ở người

Hợp

chất

IC 50 (μM) HL-60

HT-29

(tế bào ung thư ruột kết)

A459

(tế bào ung thư phổi)

SK-OV-3

(tế bào ung thư buồng trứng)

- Mitoxantrone (MX), một tác nhân chống ung thư, đã được sử dụng như hợp chất tham khảo

Gypenosides VN1-VN7 (1-7), được phân lập từ các tổng saponin của

G pentaphyllum bộ phận thân và lá, với cấu trúc của chúng làm sáng tỏ trên

cơ sở phương pháp quang phổ và hóa học

Các hợp chất này cho thấy hoạt động gây độc tế bào vừa phải chống lại bốn dòng tế bào nhân ung thư, A549 (phổi), HT-29 (ruột kết), MCF-7 (vú), và SK-OV-3 (buồng trứng), với giá trị IC50 từ 19,6 ± 1,1 đến 43,1 ± 1,0 μM

Về dòng tế bào HL-60 (bệnh bạch cầu cấp tính), hợp chất 1, 5, và 6

cho thấy hoạt động yếu với giá trị IC50 của 62,8 ± 1,9, 72,6 ± 3,6 và 82,4 ± 3,2 nM, tương ứng, trong khi 2, 3, 4, và 7 với IC50 giá trị >100 μM

Gypenoside VN2

Gypenoside VN3

Gypenoside VN4

Gypenoside VN5

Gypenoside VN6

Gypenoside VN7 Theo tài liệu [28], năm triterpen mới đƣợc phân lập từ thủy phân của

tổng số saponin từ Gynostemma pentaphyllum và xác định là gypensapogenin

A (1), gypensapogenin B (2), gypensapogenin C (3),

3-O-β-D-gluco-pyranosyl-gypensapogenin D (4) và gypensapogenin D (5)

Gypensapogenin C Các hợp chất 1-5 được đánh giá cho các hoạt động gây độc tế bào trong

ba dòng tế bào bao gồm A549, U87 và Hep3B và hợp chất 3 cho thấy các hoạt động quan trọng trong việc ức chế tế bào ung thư A549 và U87 ở người (với IC50 giá trị tại 0,11 và 0,58 μm tương ứng)

Bảng 1.2 Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất 1-5

Hợp chất

IC 50 (μM) A549

(tế bào ung thư phổi)

U87

(tế bào ung thư não)

Hep3B

(tế bào ung thư gan)

b Flavonoid

Đã phân lập được một số flavonoid như: Ombuin; quercetin; ombuosid; rutin; rhamnazin; quercetin–di-(rhamno)-hexosid; quercetin–rhamno-hexosid; kaempferol-rhamno-hexosid; kaempferol-3-O-rutinosid; 5,6-dimethoxy-

7,3’,4’-trihydroxyflavon; 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon [2], [15], [19]

c Acid hữu cơ

Đã phân lập được hai acid hữu cơ là acid benzoic và 4–hydroxyl–3–methoxy benzoic acid (acid vanillic) [2]

d Sterol

Chiếm một lượng nhỏ (khoảng 0.0001%) trong G pentaphyllum bao

gồm ergostanol, sitosterol và stigmasterol [2]

e Nguyên tố vi lượng

Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X, đã xác định được trong cây có

Al, Si, Ca, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag Trong đó, nguyên tố

có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag ( 0,0001%) [10]

1.3.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Gynostemma

laxum (Wall.) Cogn

Theo tài liệu [34], hàm lượng tổng saponin trong G laxum thấp, trong

đó, lá chứa nhiều saponin hơn thân

Ding, Shuli, Zhu và Zhaoyi [21] đã nghiên cứu hàm lượng saponin

trong G laxum và 6 loài khác trong chi Gynostemma Blume Theo đó, lá và

thân tất cả các loài này đều chứa 2,37 – 6,98 % (so với trọng lượng khô) saponin Hàm lượng saponin đạt cao nhất vào tháng 8

Các tác giả đã so sánh tổng lượng flavonoid có trong 6 loài của chi

Gynostemma Blume bao gồm: G pentaphyllum, G laxum, G pubescens, G compressum, G longipes, G guanxiense Kết quả cho thấy trong các mẫu đều

chứa flavonoids, trong đó G guanxiense có lượng tổng flavonoid lớn nhất

Gynostemma laxum có chứa protein trong lá và thân cây, hàm lượng

protein trong lá cao hơn nhiều so với trong thân Nghiên cứu trên cũng cho

thấy, có 7 loại acid amin thiết yếu trong G laxum, 9 loại acid amin khác cần cho cơ thể Về thành phần chất khoáng, trong G laxum có hàm lượng Kali

cao, hàm lượng Natri thấp [34]

Các thành phần vi lượng có trong lá và thân G laxum đã được ghi nhận

là Zn, Cu, Fe, Mn và Sr [34]

Theo tài liệu [1], thành phần hoá học của cổ yếm lá bóng Gynostemma

laxum thu hái ở Hoà Bình có flavonoid, saponin, đường khử, sterol,

polysaccharid, trong đó flavonoid là thành phần chính

Về cơ bản, thành phần hoá học của G laxum giống G pentaphyllum Có

2 điểm khác nhau: G laxum chứa thành phần chính là flavonoid, G

pentaphyllum có thành phần chính là saponin; G laxum không chứa acid hữu

cơ, G pentaphyllum có chứa acid hữu cơ

Bảng 1.3 So sánh thành phần hoá học mẫu dược liệu giảo cổ lam và cổ

yếm lá bóng thu hái tại Hoà Bình

Thành phần

Mẫu dược liệu

G.pentaphyllum Giảo cổ lam

G.laxum

Cổ yếm lá bóng

Saponin, flavonoid, polysaccharid,

Alcaloid, glycosid tim, coumarin,

tanin, anthranoid, caroten, acid amin Không Không

Kết quả định lượng cắn các phân đoạn chiết cho thấy, ở lá và thân G

laxum, lượng cắn trong phân đoạn chiết bằng nước cho tỉ lệ nhiều nhất

(8,35%), sau đó là phân đoạn EtOAc (4,02 %), n-BuOH (2,44 %) Phân đoạn

Hai flavonol này cũng đã đƣợc phân lập và xác định có trong loài

Gynostemma pentaphyllum [16] Nhƣ vậy, có thể có nhiều hợp chất flavonoid

của G laxum và của G pentaphyllum giống nhau

Theo tài liệu [29], các tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất benzyl glycoside là: 2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranoside; benzyl-O-β-D- glucopyranoside; benzyl β-D-xylopyranosyl-(1→6)-O- β-D-glucopyranoside ; benzoic acid; 3,4-dihydroxybenzoic acid; vanillic acid; ethyl 3,4-dihydroxybenzoat; quercetin; rhamnetin 3-O-rutinoside và

2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranoside

Ethyl 3,4-dihydroxybenzoate

1.4 TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG

1.4.1 Tác dụng và công dụng của Gynostemma pentaphyllum

Giảo cổ lam còn gọi là cây trường sinh, cỏ thần kỳ, thất diệp đởm, lần

đầu tiên được ghi trong sách cổ “Nông chính toàn thư hạch chú” quyển hạ

năm 1639 Từ xa xưa giảo cổ lam được sử dụng cho vua chúa để tăng sức khoẻ, kéo dài tuổi thọ và làm đẹp Người Trung Quốc từ lâu xem cây này như thuốc trường sinh, bởi lẽ người dân ở tỉnh Quý Châu uống trà thất diệp đởm thường xuyên thì sống rất thọ Giảo cổ lam là một dược liệu rất quý hiếm được phát hiện và sử dụng lần đầu ở Nhật Bản với tên gọi cây thuốc trường sinh Ở Trung Quốc gọi là Jiaogulan, cây sâm nam Các nhà khoa học Trung Quốc, Nhật Bản khi nghiên cứu về cây này đã rất ngạc nhiên về những lợi ích cho sức khỏe mà nó mang lại cho con người Sự thật khoa học đã nghiên cứu

và thừa nhận rằng, trong giảo cổ lam chất saponin rất giống nhân sâm và có tới hơn 100 loại (nhân sâm chỉ có hơn 20 loại)

Mặc dù hai loài giảo cổ lam và nhân sâm Panax này không liên quan

đến nhau nhưng chúng có các thành phần chính là saponin Trong các nghiên cứu, để tăng cường sức đề kháng, ức chế khối u và giúp bảo vệ miễn dịch tế bào trong con người, cũng như cung cấp nhiều lợi ích tăng cường sức khỏe khác Giảo cổ lam giúp bệnh nhân sau phẫu thuật, chiếu tia xạ, truyền hóa chất ăn ngủ tốt, mau hồi phục sức lực Làm tăng miễn dịch của cơ thể, bảo vệ gan khỏi tác hại của hóa chất, rượu Chữa các trường hợp viêm phế quản mãn tính, mất ngủ, béo phì [31]

Nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng gypenosides nhiều vai trò trong hệ thống cơ thể con người, trong đó có hạ đường huyết, làm giảm đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường, giúp giảm các biến chứng do bệnh tiểu đường gây ra, bảo vệ gan, thúc đẩy sự trao đổi chất tế bào, kiểm soát xơ vữa động mạch, chống lão hóa, miễn dịch nâng cao, ức chế khối u, chống ung thư, ảnh hưởng đến hoạt động tim mạch và điều trị hen suyễn Kết quả nghiên cứu

về độc tính đã chứng minh rằng gypenosides không tạo ra bất kỳ tác dụng phụ nào đáng kể

Giảo cổ lam là một loại dược liệu quý, tuy nhiên nó cũng là thuốc nên khi sử dụng cần có liều lượng và sự chỉ dẫn đúng của thầy thuốc thì việc dùng

mới an toàn và có lợi cho sức khỏe Như kết quả khoa học cho thấy, thành

phần hóa học chính của nó là flavonoid và saponin Số saponin của giảo cổ lam nhiều gấp 3 – 4 lần so với nhân sâm Vậy nên khi lạm dụng dược liệu có thể xảy ra ngộ độc như nhân sâm, nhất là đối với những người lạm dụng liều dùng mà khả năng tự điều tiết bị suy giảm kết hợp cơ địa dễ bị kích ứng

Đối với đường huyết kết quả thử tác dụng dược lý cho thấy: Giảo cổ lam có tác dụng hạ và bình ổn đường huyết thông qua cơ chế làm tăng tiết insulin và cơ chế làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin Bởi lẽ đó, nếu như những người sử dụng với khả năng tự điều tiết của cơ thể bị suy giảm, kết

hợp lạm dụng khiến cho tăng tiết insulin làm cho sự tiêu hủy đường quá mức cho phép dễ dẫn tới tình trạng hạ đường huyết đột ngột gây nguy hiểm cho sức khỏe

Đối với huyết áp, tim mạch và cholesterol: làm hạ mỡ máu (đã nghiên cứu cả dược lý thực nghiệm và thử lâm sàng), nhất là đối với cholesterol toàn phần Điều trị cho kết quả tốt, ngăn ngừa xơ vữa mạch máu, chống huyết khối

và bình ổn huyết áp, phòng ngừa các biến chứng tim mạch, não Các thử nghiệm lâm sàng tại bệnh viện cho thấy, giảo cổ lam giúp hạ mỡ máu và huyết áp, hạ đường huyết, rất tốt cho tim mạch Nhưng vì việc sử dụng quá liều không được sự chỉ định của thầy thuốc rất có thể làm hạ hàm lượng cholesterol toàn phần dẫn đến thiếu hụt cholesterol Còn việc giảo cổ lam sử dụng trong trị liệu ung thư chỉ mang khả năng hỗ trợ chứ không như một số người nhầm tưởng là thuốc trị bệnh ung thư [27]

1.4.2 Tác dụng và công dụng của G laxum

Theo Phạm Hoàng Hộ [13] và Võ Văn Chi [7], ở Trung Quốc, người ta

dùng G.laxum (Wall.) Cogn tương tự như G pentaphyllum (Thunb.) Markino Trong Flora of China [32], Jeffrey cũng cho rằng có thể sử dụng 2

loài này theo cách tương tự nhau

Bộ phận dùng: Toàn cây [7]

Tính vị và tác dụng: Vị đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt giải

độc, ngừng ho, long đờm, kiện tráng, cường tinh, chống lão suy, chống mệt

mỏi, kháng ung thư [7]

Công dụng: Ở Vân Nam (Trung Quốc), cây được dùng điều trị viêm

khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và đau nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh [7]

1.5 HỢP CHẤT FLAVONOID 1.5.1 Định nghĩa

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phổ biến rộng rãi nhất trong thiên nhiên Ở thực vật thì flavonoid có trong tất cả các bộ phận của cây nhƣ: lá, hoa, quả, phấn hoa, rễ, thân Có khoảng 4000 flavonoid đã biết rõ cấu trúc (chỉ riêng hai nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế OH hoặc OCH3 có thể gặp 38000 chất) Phần lớn các flavonoid có màu vàng Ở tảo, nấm hầu nhƣ không có flavonoid Flavonoid tham gia vào sự tạo màu sắc của cây nhất là hoa

Flavonoid là những chất màu thực vật có cấu trúc C6 – C3 – C6 trong đó mỗi C6 là một vòng benzen gắn với nhau qua mạch 3 cacbon

1.5.2 Phân loại

Flavonoid có cấu trúc mạch C6 - C3 - C6, đều có 2 vòng thơm Tùy thuộc vào vị trí gốc aryl (vòng B) và tình trạng oxi hoá vòng pyran trung tâm, flavonoids đƣợc phân thành các loại nhƣ sau:

- Eucoflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C2, bao gồm:

flavan, flavan-3-ol, flavan-4-ol, flavan-3,4-điol, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, auron, anthoxyanidin…

- Isoflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C3

- Neoflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C4

- Ngoài ra còn có biflavonoid, triflavonoid, flavolignan

1.5.3 Tính chất một số hợp chất flavonoid

- Flavon, flavonol: là hợp chất phân cực nên tan trong nước, ít tan trong dung môi hữu cơ Hơ tờ giấy có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ amoniac cho màu vàng sáng, dung dịch H2SO4 nhỏ lên cho màu vàng đậm, dung dịch SbCl5/CCl4 cũng cho màu vàng đậm

- Flavanon, flavanol: Các dẫn xuất flavan-3,4-diol đều không màu, có tính quang hoạt nhưng khi tác dụng với dung dịch acid vô cơ thì có màu đỏ

Dể bị oxi hóa và trùng hợp hóa nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn Kém bền trong môi trường kiềm Tác dụng với dung dịch FeCl3: cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử Dễ tan trong nước nóng, rượu, ….tạo dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như benzene hoặc chloroform Dưới tác dụng của H+ hoặc OH-, flavanon có thể chuyển sang chalcon Khi tạo liên kết glycosid phần đường nối vào vị trí 4’, một số ở 2’

O

O

OHHO

OH

- Chalcon: có hai vòng A, B nối với nhau bởi một mạch hở ba cacbon, không có dị vòng C như các flavonoid khác Đây là những hợp chất có màu