Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hạt cây cam thảo dây quế sơn quảng nam

Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết hạt cây cam thảo dây.... DANH MỤC CÁC BẢNG3.1 Kết quả xác định độ ẩm của hạt cam thảo dây 34 3.2 Kết quả xác định độ ẩm của n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

Mã số : 60 44 27

Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN MẠNH LỤC

Đà Nẵng - Năm 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các s ố liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được

ai công b ố trong bất kì công trình nào khác

Tác gi ả luận văn

Phạm Thị Cẩm Lai

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

6 Bố cục của luận văn 3

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 4

1.1.MÔTẢTHỰCVẬT 4

1.1.1 Đặc điểm chung của chi Abrus 4

1.1.2 Giới thiệu về cây cam thảo dây 6

1.2.GIÁTRỊSỬDỤNGCỦACÂYCAMTHẢODÂY 7

1.2.1 Dùng làm thuốc chữa bệnh 7

1.2.2 Dùng làm trang sức 9

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÂYCAMTHẢODÂY 10

1.4.TÁCDỤNGDƯỢCLÍCỦAHẠTCAMTHẢODÂY 18

1.4.1 Tính chất của abrin 18

1.4.2 Cơ chế hoạt động của abrin 20

CHƯƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.NGUYÊNLIỆU,HÓACHẤTVÀTHIẾTBỊNGHIÊNCỨU 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 24

2.2. PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 25

2.2.1 Phương pháp xác định các thông số hóa lý 25

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 25

2.2.3 Phương pháp phân tích và định danh thành phần hóa học của các

dịch chiết 26

2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 26

2.3.CÁCNGHIÊNCỨUTHỰCNGHIỆM 28

2.3.1 Sơ đồ thực nghiệm 28

2.3.2 Xử lí nguyên liệu 28

2.3.3 Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu 29

2.3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chất 31

2.3.5 Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết hạt cây cam thảo dây 32

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1.KẾTQUẢXÁCĐỊNHCÁCTHÔNGSỐHÓALÝ 34

3.1.1 Độ ẩm 34

3.1.2 Hàm lượng tro 35

3.1.3 Hàm lượng kim loại 35

3.2.KẾTQUẢKHẢOSÁTCÁCYẾUTỐẢNHHƯỞNGĐẾNQUÁTRÌNH TÁCH CHẤT VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCHCHIẾTBẰNGPHƯƠNGPHÁPGC-MS 36

3.2.1 Kết quả ảnh hưởng của các loại dung môi 36

3.2.2 Kết quả khảo sát thời gian, tỉ lệ R/L trong quá trình chiết tách và thành phần hóa học trong các dịch chiết 38

3.2.3 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao)

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Kết quả xác định độ ẩm của hạt cam thảo dây 34

3.2 Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô hạt

3.3 Kết quả xác định hàm lượng tro trong hạt cam thảo

3.4 Hàm lượng kim loại trong hạt cam thảo dây 36 3.5 Phần trăm khối lượng cao chiết trong các dung môi 37

3.6 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích

n-hexane đến khối lượng cao chiết 38 3.7 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane 39

3.8 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích

EtOAc đến khối lượng cao chiết 42

3.9 Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate 44

3.10 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích

chloroform đến khối lượng cao chiết 49

3.11 Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform 50

3.12 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích

3.13 Thành phần hóa học trong dịch chiết methanol 55 3.14 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 61

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Abrus fruticulosus Wall ex Wigh et Arn 5

1.4 Vòng đeo tay làm bằng hạt cam thảo dây 10

1.6 Cơ chế tác động độc hại của ricin 21

2.3 Nguyên liệu hạt cây cam thảo dây tươi và bột khô 29

3.1 Dịch chiết hạt cam thảo dây trong các dung môi: n-hexane,

chloroform, ethyl acetate và methanol 37

3.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích n-hexane

3.3 Phổ GC-MS dịch chiết n-hexane hạt cam thảo dây 41

3.4 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích EtOAc

3.5 Phổ GC-MS dịch chiết ethyl acetate hạt cam thảo dây 44

3.6 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích

chloroform đến khối lượng cao chiết 50 3.7 Phổ GC – MS dịch chiết chloroform hạt cam thảo dây 53

3.8 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích MeOH

3.9 Phổ GC – MS dịch chiết methanol hạt cam thảo dây 59

3.10 Bột hạt cam thảo sau khi sắc với nước, dịch nước của bột

hạt cam thảo dây và kết tủa abrin từ dịch chiết nước 61

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam nằm ở vùng nhiệt đới có thảm thực vật phong phú, rất nhiều

loài cây thuộc chi Abrus thuộc họ Fabaceae được dùng để bào chế thuốc chữa nhiều bệnh Mặc dù những loài thuộc các chi kể trên có nhiều giá trị sử dụng

như vậy nhưng các công trình nghiên cứu về thành phần hoá học, hoạt tính của các cây thuộc chi nói trên vẫn chưa hoàn toàn đầy đủ và có tính hệ thống Việc nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học, ứng dụng các phương pháp hiện đại để xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất các loài cây thuộc các chi trên ở Việt Nam là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

Cây cam thảo dây có tên khoa học là Abrus precatorius L thuộc họ Đậu (Fabaceae) Cam thảo dây là một trong những vị thuốc Ðông y lâu đời nhất;

trong sách "Thần nông bản thảo" thế kỷ thứ 3 trước công nguyên đã nói đến cam thảo Nhìn chung các sách bản thảo (sách nói về dược) Ðông y đều cho rằng Cam thảo vị ngọt tính bình, có tác dụng bổ trung ích khí, giải co thắt giảm đau, nhuận phế giảm khát, thanh nhiệt giải độc, giải độc thuốc và thức

ăn, điều hòa tính vị của các vị thuốc khác Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hạt cây cam thảo dây Quế Sơn-Quảng Nam” làm luận văn Thạc sĩ

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Hạt cây cam thảo dây ở Quế Sơn-Quảng Nam

3.2 Phạm vi nghiên cứu

Thành phần hóa học của một số dịch chiết hạt cam thảo dây

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

+ Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học và ứng dụng của cây và hạt cam thảo dây

+ Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác đinh thành phần hóa học các chất từ thực vật

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

+ Thử nghiệm hoạt tính sinh học của protein phân lập từ dịch chiết nước

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Những kết quả nghiên cứu trong công trình này sẽ góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần và các hoạt tính sinh học được chiết tách từ loài Abrus precatorius và qua đó góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của chúng trong ngành dược liệu

6 Bố cục của luận văn

Luận văn bao gồm trang, 14 bảng, 10 hình, 52 tài liệu tham khảo và 5 phụ lục Cấu trúc luận văn như sau:

Mở đầu (3 trang)

Chương 1 Tổng quan (20 trang)

Chương 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang)

Chương 3 Kết quả và thảo luận (21 trang)

Kết luận và kiến nghị (3 trang)

Tài liệu tham khảo (5 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Họ Fabaceae (họ đậu) là một họ thực vật cây thảo, lá kép lông chim lẻ, luôn luôn có lá kèm trong bộ Đậu Hiện nay trên thế giới có khoảng 730 chi

và 19.400 loài Ước tính các loài trong họ này chiếm 16% các loài cây trong vùng rừng mưa nhiệt đới Nam Mỹ Ngoài ra, họ này cũng có mặt nhiều ở các rừng mưa và rừng khô nhiệt đới ở châu Mỹ và châu Phi Việt Nam có khoảng

90 chi như Abrus, Apios, Callerya, Flemingia, Vicia… với trên 450 loài [36]

1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT

1.1.1 Đặc điểm chung của chi Abrus

Chi Abrus là loại cây bụi hay cây bụi thấp leo Lá có dạng lá kép lông chim chẵn, lá chét nhiều, mọc đối Cụm hoa mọc thành chùy dày đặc; hoa nhỏ, hầu như không có cuống Đài gần như cụt, với 5 răng ngắn Tràng cây màu trắng, vàng, hồng hay đỏ; cánh cờ hình trứng tới tròn có móng rộng và ngắn, không có phần phụ Nhị hoa dính thành ống chẻ ở đỉnh Bầu hoa không cuống, nhiều noãn, vòi ngắn, cong; đầu nhụy hình đầu Quả của chi này là quả đậu thuôn dẹp, có vách, mở; hạt hình cầu hay bầu dục, dẹp, có khi đỏ hay đen, bóng [51]

Ở Việt Nam hiện có 3 loài thuộc chi Abrus:

- Abrus fruticulosus (cườm thảo chồi, kê cốt thảo)

Abrus fruticulosus là loại dây leo hóa gỗ, dài 60 cm, đường kính 12 mm,

có lông mềm màu vàng nâu Lá của nó là lá kép với 7 - 12 đôi lá chét nhỏ, dài

5 - 12 mm, rộng 3 - 5 mm, có lông xám Cụm hoa mọc ở ngọn hay nách lá, thành chùy mảnh, thẳng, dài 2 - 6 cm Hoa dài 6 mm, màu tím hồng nhạt Quả đậu dài 3 - 5 cm, chứa 4 - 5 hạt bóng màu nâu đen hay nâu vàng nhạt

Hình 1.1 Abrus fruticulosus Wall ex Wigh et Arn [52]

Loại cây này được phân bố ở Trung Quốc, Thái Lan và Việt Nam Ở Việt Nam có thể gặp ở các tỉnh Tây Nguyên

Cây mọc dọc đường đi, gần các làng bản, ven rừng Cườm thảo chồi ra hoa vào mùa xuân và mùa hạ

Rễ và toàn cây cườm thảo chồi được sử dụng làm thuốc Ở Hồng Kông (Trung Quốc), cây được dùng trị viêm gan cấp và mạn tính, hoàng đản, xơ gan cổ trướng ; viêm nhiễm đường tiết niệu, đái ra máu; phong thấp đau nhức khớp, đòn ngã tổn thương ứ máu tê đau; viêm hạch bạch huyết cổ (tràng nhạc), rắn cắn và nóng sốt về mùa hạ; rễ dùng trị ứ huyết nội thương, trị đau

dạ dày, đau vú, tràng nhạc

- Abrus mollis (Cườm thảo mềm, Mao tương tư tử )

Hình 1.2 Abrus mollis Hance [30]

Abrus mollis là loài dây leo, dài 2-4m, có lông sát màu gỉ sắt Lá dài

10-15cm, mang 12-18 cặp lá chét mỏng, dài hơn 1,5cm, mặt dưới có lông dày màu xám, hai đầu tròn hay như bị cắt ngang Chùm hoa mọc ở ngọn hay ở nách lá; hoa màu hồng nhạt dài 1cm, đài hình chuông Quả đậu mỏng, dài 4-8

cm, có lông mịn; hạt có màu nâu hay đen Cây có quả vào tháng 11-2

Loài cây này phân bố ở Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam và Indonesia Ở nước ta, cây mọc dưới tán rừng trên các bãi đất hoang, trên đất có cát đá, từ vùng thấp tới vùng cao 1.200m, từ Lạng Sơn, Hải Hưng, Quảng Ninh tới Khánh Hoà, Lâm Đồng, Ninh Thuận, Đồng Nai, Sông Bé Cây có vị ngọt và nhạt, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, giải thử Cây được dùng thay thế cam thảo dây, nhưng tác dụng không mạnh bằng

- Abrus precatorius (Cam thảo dây, Dây chi chi)

1.1.2 Giới thiệu về cây cam thảo dây

a Tên gọi

Tên khoa học: Abrus precatorius L., họ Đậu (Fabaceae)

Tên Tiếng Việt: cườm thảo đỏ, chi chi, cườm cườm, tương tư đằng, tương tư thảo, cảm sảo (tiếng Tày), hương tư tử (tiếng Trung), ang krang, angkreng (Campuchia) [3] [45]

b Phân loại khoa học

Theo phân loại khoa học, cây cam thảo dây thuộc:

c Phân bố

Cam thảo dây là loài cây liên nhiệt đới, mọc hoang trong các rừng còi, rừng thưa vùng núi thấp đến trung du và đồng bằng Ở nước ta, thường gặp nhiều ở các tỉnh miền Trung từ Thừa Thiên - Huế đến Ninh Thuận Cam thảo dây cũng thường được trồng làm cảnh và làm thuốc ở nhiều nơi

d Đặc điểm thực vật

Cam thảo dây là một loại dây leo, cành

gầy nhỏ, thân có nhiều xơ Lá kép hình lông

chim chẵn, cả cuống dài 15-24 cm, gồm 8-20

đôi lá chét, cuống chung ngắn, cuống lá chét

càng ngắn hơn, phiến lá chét hơi hình chữ nhật

dài 5-20 mm, rộng 3-8 mm

Hoa màu hồng mọc thành chùm nhỏ ở kẽ

lá hay đầu cành Cánh hoa hình cánh bướm

Quả thon dài 5 cm, rộng 12-15 mm, dày

Người ta dùng cả rễ, dây, lá, hạt để làm thuốc

Cam thảo có vị ngọt, tính bình Sinh thảo có tác dụng giải độc, tả hoả; cam thảo tẩm mật sao vàng (chích thảo) tính ấm, có tác dụng bổ (ôn trung) nhuận phế, điều hoà các vị thuốc Người ta đã nghiên cứu thực nghiệm các tác dụng gây trấn tĩnh, ức chế thần kinh trung ương, giảm ho, tác dụng giải co thắt cơ trơn, gây tăng tiết dịch vị của histamin, tăng bài tiết mật, chống viêm

và chống dị ứng, tác dụng oestrogen, tác dụng giải độc, lợi tiểu, nhuận tràng

Hình 1.3 Cây cam th ảo dây

Sinh thảo được dùng chữa cảm, ho, mất tiếng, viêm họng, mụn nhọt, đau dạ dày, ỉa chảy, ngộ độc Chích thảo dùng chữa tỳ vị hư nhược, ỉa chảy, thân thể mệt mỏi, kém ăn, khát nước do vị hư, ho do phế hư Ngày dùng 4-20g dạng thuốc bột, thuốc hãm, nước nấu và cao mềm Cam thảo còn được dùng trong Đông y chữa loét dạ dày, ruột, có tác dụng giảm loét, giảm co thắt cơ, giảm tiết acid chlorhydric, chữa bệnh Addison Ngoài ra, cam thảo dây còn dùng làm tá dược thuốc viên, thuốc ho, thuốc giải độc Cam thảo còn được sử dụng làm chất thơm trong các hỗn hợp thuốc xông, làm thuốc chống co thắt trong các nước uống nhuận tràng; còn dùng để chế nước chiết tinh hay khô, dùng trong mỹ phẩm, dùng chế nước uống giải khát, làm mứt kẹo, tẩm thuốc lá Dây, lá, rễ cam thảo dây có vị ngọt, hơi đắng, tính mát, có tác dụng tiêu viêm, lợi tiểu Người ta thường dùng dây lá cam thảo dây để điều hoà các vị thuốc khác, dùng chữa ho, giải cảm, trị hoàng đản do viêm gan siêu vi trùng

Có thể dùng thay cam thảo bắc Thường phối hợp với các vị thuốc khác Người ta còn dùng lá cam thảo dây nhai với muối và nuốt nước để chữa chứng đánh trống ngực Lá thảo dược còn được dùng để điều trị ngứa và các vấn đề về da Lá khô được làm thành bột nhão để điều trị như một chất sát trùng các vết thương ở gia súc Nước ép từ lá thúc đẩy tăng trưởng của sợi tóc con người Ngoài ra, lá còn được sử dụng để điều trị thủy cầm ở gia cầm Trong dãy Himalaya, người ta sử dụng lá cho bệnh tiểu đường, sốt, ho và hen suyễn Ở Đông Phi, có nơi dùng lá trị rắn độc cắn Ở Indonesia, người ta dùng dây lá làm thuốc chữa đau bụng, trị bệnh spru (ỉa chảy vùng nhiệt đới) Ở Philippines, lá và rễ sắc chữa ho, chữa đau mắt hột mãn tính

Rễ dùng thay cam thảo vì có tính làm dịu Rễ được dùng làm bớt đau Rễ của loại thảo dược được sử dụng để điều trị vàng da Rễ cũng được dùng để chữa đau bụng, khối u và cũng để phá thai Rễ nghiền của cam thảo dây với

bơ tinh khiết ba lần một ngày trong bốn ngày để chữa ho Rễ cũng được nhai

như là một biện pháp khắc phục vết rắn cắn Nước nóng chiết xuất từ rễ tươi được dùng để uống như một chất chống sốt rét và chống co giật Nước sắc của

rễ khô được dùng để điều trị viêm phế quản và viêm gan Tại Tích Lan, rễ của cam thảo dây được dùng để khắc phục đau họng và thấp khớp Nó được sử dụng như một phương thuốc để giảm đau ở ngực Tại Bờ Biển Ngà, lá được dùng cho các trường hợp viêm kết mạc và đau bụng Thuốc đắp của lá được cho là có một số tác dụng trong việc loại bỏ tàn nhang Rễ cũng dùng gây nôn

và chống độc Ngoài ra, nước sắc của rễ khô được sử dụng cho đau sưng trong

cổ họng

Hạt chỉ dùng ngoài để sát trùng, tiêu viêm, làm mụn nhọt chóng vỡ mủ (giã nhỏ đắp); tốt nhất là trị vú sưng đau do tắc tia sữa: người ta lấy một lượng vừa đủ, giã nát, nghiền thành bột, trộn với dầu mè bôi và đắp ngoài Hạt được sử dụng như thuốc lợi tiểu và để điều trị vàng da và bệnh lậu Hạt còn được cho là hữu ích để điều trị bệnh lỵ Theo y học dân gian những hạt giống uống để gây ra phá thai, biện pháp tránh thai (ăn hai hạt giống kết hợp với một quả chuối chín sau khi kinh nguyệt sau ba ngày), điều trị bệnh tiểu đường và thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị bệnh nan y Tại một số địa phương, hạt được dùng để giảm để đau thần kinh tọa, độ cứng của khớp vai,

tê liệt và các bệnh thần kinh Người ta nói rằng đun sôi 60-200mg hạt với sữa được sử dụng như một loại thuốc bổ hưng phấn thần kinh Hạt dùng để tẩy nhưng độc nên không dùng nhiều Ở Ấn Độ, người ta dùng hạt làm thuốc tẩy, gây nôn và kích dục, dùng trong những rối loạn thần kinh và ngộ độc của súc vật Tại châu Phi, hạt đôi khi được sử dụng cho các vấn đề tiết niệu và các bệnh hoa liễu

1.2.2 Dùng làm trang sức

Hạt của Abrus precatorius có giá trị trong việc làm đồ trang sức, ngoài ra dùng làm màn cửa, khay, cổ áo của một số dân cư bản địa nhờ màu sắc rực rỡ

của nó Trong các bộ phận của châu Phi, các hạt nghiền thành bột được thêm gương trang điểm mắt truyền thống của phụ nữ Một phần ba vỏ hạt (phần có rốn hạt) có màu đen, trong khi phần còn lại có màu đỏ tươi, giống như con bọ rùa Tuy nhiên, việc làm đồ trang sức bằng hạt cam thảo dây là nguy hiểm, và

đã có thông báo về các trường hợp tử vong do bị đâm vào tay trong khi khoan

lỗ trên hạt để xỏ dây

Hình 1.4 Vòng đeo tay làm bằng hạt cam thảo dây

Ở Tây Ấn, hạt cây được xâu thành chuỗi thành vòng đeo tay và đeo

quanh cổ tay hay mắt cá chân để tránh khỏi linh hồn quỷ dữ

Bên cạnh đó, những hạt cam thảo dây rất phù hợp trong việc đo trọng lượng Trước đây Ấn Độ sử dụng những hạt này để cân vàng bằng cách sử

dụng một biện pháp được gọi là một Ratti, 8 Ratti = 1 Masha, 12 Masha = 1

Tola (11,6 Grams) [32]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

VỀ CÂY CAM THẢO DÂY

Cây cam thảo dây đã được nghiên cứu khá kĩ về thành phần hóa học và tác dụng dược lí

Lá và rễ cam thảo dây chứa một chất ngọt tương tự glycyrrhizin của cam thảo, nhưng vị khó chịu và đắng Tỷ lệ chất này chỉ có 1-2%

Lá và dây có các saponin: abrusosid A, B, C, D Đây là thành phần chính cso vị rất ngọt Các saponin này có cấu trúc 9,19 cyclo (9β) lanostan (=cycloartan), mạch nhánh được đóng vòng lacton ở C22, C26 Bốn saponin trên có phần aglycon giống nhau là abrusogenin chỉ khác phần đường nối vào

OH ở vị trí số 3

Ngoài saponin, lá và dây còn chứa các flavonoid: luteolin, abrectorin (=6,4’-dimethoxy-7,3’-dihydroxyflavon), orientin, isoorientin, desmethoxycentaure idin-7-O-rutinosid, abrusin và 2’’-O- β-apiosyl của abrusin

abrusogenin

Rễ có các chất flavonoid: abruquinon A, abruquinon B methoxyabruquinon A), abruquinon C (=8-methoxy-6-O-de-Me abruquinon A)

(=8-O glc

O HO

OH MeO

MeO

Abrusin

O

MeO MeO

O

O

OMe OMe

Abruquinon A Hạt cam thảo dây có chứa L-abrin là một ancaloid âm tính với thuốc thử Dragendorff, còn với thuốc thử Ehrlich cho màu tím Lá và rễ cũng có L-abrin nhưng hàm lượng thấp Trong hạt còn có: hypaphorin, precatorin, trigonellin, N,N-dimethyl tryptophan methyl este Hạt còn chứa một chất albumin độc là abrin, ngoài ra còn có các dẫn chất khác: stigmasterol, brassicasterol, cycloartenol, squalene, 5-β-cholanic acid [2]

N H

COOH

H3CHN

L – abrin

N H

COO(H3C)3N+

-Hypaphorin

N+O O

CH3

COOOH

-Precatorin

Vỏ hạt chứa chất màu là abarnin (anthocyanin monoglucoside) [49] Năm 2001, Nam-Cheol NC Kim, Darrick Kim và A Douglas AD Kinghorn đã tìm ra 3 triterpenoids và một triterpenoid thứ 4 được phân lập từ dịch chiết axit hòa tan trong methanol của lá cam thảo dây Cấu trúc của chúng được xác định là (20S,22S)-3beta,22-dihydroxycucurbita-5(10),24-dien-26,29-dioic axit delta-lacton ; 3-O-[6'-methyl-beta-D-glucuronopyranosyl]-3beta, 22beta-dihydroxyolean-12-en-29-oic acid methyl ester ; 3-O-beta-D-glucuronopyranosylsophoradiol methyl ester ; và sophoradiol bằng kỹ thuật quang phổ bao gồm 2D NMR [18]

Năm 2011, Xiao ZH, Wang FZ, Sun AJ, Li CR, Huang CG, Zhang S đã

tìm ra 1 saponin triterpenoid mới, 3-O-glucopyranosyl-(1 → 2) -

β-D-glucopyranosyl subprogenin D (1), cùng với sáu triterpenoids nổi tiếng: subprogenin D (2), abrusgenic acid (3), triptotriterpenic axit B (4), abruslactone A (5), abrusogenin (6) và abrusoside C (7) được phân lập từ lá

và thân của cam thảo dây trong dung môi EtOAc và n-butanol Cấu trúc của

họ đã được làm sáng tỏ trên cơ sở phân tích vật lý và NMR Hợp chất 1, 2 và

4 được phân lập từ thực vật này lần đầu tiên [27]

OH O

RO

O

3 4

12 13

20

30 29

22 28

1.3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 2) - β-D-glucopyranosyl subprogenin D

(R=β-D-glu2-β-D-glu)

2 Subprogenin D (R=H)

OH O

HO

R2

R1

3 Abrusgenic acid (R1=OH, R2=H)

4 Triptotriterpenic axit B (R1=H, R2=OH)

HO

O O

Tác dụng dược lí của cây cam thảo dây cũng được các nhà khoa học

trong và ngoài nước nghiên cứu

Ligha A và jaja B đã nghiên cứu dịch chiết từ hạt cam thảo dây và kết quả cho thấy dịch chiết này có thể bảo vệ thận chống lại tổn thương nhu mô

do rượu [16] Trong cuộc thảo luận về những phát hiện của họ, họ đã nghiên cứu cad cho rằng dịch chiết hạt giống của cam thảo dây cũng đã được chứng

tỏ là có những dược tính khác nhau Nó đã được chứng minh là có hiệu quả chống lại sự thụ thai bởi Rao (1987) [23] Sayeed Mohammed Abu et al cũng

đã nghiên cứu rằng dịch chiết methanol của hạt giống có tác dụng ngăn ngừa khả năng mang thai và có thể được uống tránh thai [24]

Theo Nwodo (1991), hạt cam thảo dây có hiệu quả trong việc chống lại

Monago EO Alumanah (2005) cho thấy hạt cam thảo dây có khả năng trị đái tháo đường [16]

Dịch chiết từ nước nóng của hạt cây được uống để chống sốt rét Hạt giống cũng được để chữa bệnh lao và sưng đau Các nghiên cứu của tác giả khác cho thấy cây cam thảo dây có khả năng hoạt động chống bệnh tiểu đường, chống oxy hóa, lợi tiểu, chống co giật bảo vệ thần kinh, ảnh hưởng

thần kinh cơ, bộ nhớ tăng cường hoạt động, hoạt động chống động kinh, ức chế hoạt động của khối u, hoạt động miễn dịch, chống khả năng sinh sản Giáo sư Peter PI (2008) đã nghiên cứu rằng hạt cam thảo dây rất có người có tóc bạc sớm [20]

Giáo sư Tolu Odugbemi (2008) nghiên cứu và cho thấy cây cam thảo dây được sử dụng như là biện pháp khắc phục cho cảm lạnh, ho, co giật, viêm kết mạc, tránh thai, kích thích tình dục, loét, thiếu máu, thuốc giải độc chống lại độc tố và kháng sinh [8]

Năm 2005, Monago, C C và Alumanah, E O đã nghiên cứu hiệu quả trị đái tháo đường của dịch chiết chloroform - methanol chiết xuất từ hạt giống cam thảo dây đối với loài thỏ bị bệnh đái đường [18]

Rashmi Arora, Naresh Singh Gill, Sukhwinder Kaur và Ajay Deep Jain

đã tìm thấy dịch chiết ethanol của cam thảo dây có chất chống oxy hóa, chống viêm và tiềm năng giảm đau Nghiên cứu này kết luận rằng hạt giống này có thể được sử dụng như chất chống oxy hóa tự nhiên tốt để điều trị bệnh gốc tự

do gây ra [22]

Mir Z Gul, Farhan Ahmad, Anand K Kondapi, Insaf A Qureshi và Irfan

A Ghazi1 đã thu thập được bằng chứng thực nghiệm rằng dịch chiết từ lá của cam thảo dây có số lượng đáng kể các polyphenol và flavonoid có hoạt động chống oxy hóa đáng kể bằng cách lọc hết gốc tự do khác nhau [15] Ngoài ra,

nó đã được chứng minh dịch chiết từ lá cam thảo dây (dịch chiết từ ethyl acetate hay dịch chiết từ ethanol) có khả năng chống lại sự tăng nhanh của các gốc tự do mà không có bất kỳ tác dụng độc hại trên tế bào bình thường Chất chống oxy hóa và các hoạt động chống lại sự tăng nhanh của các gốc tự do có thể là do những tác động đồng thời của các hợp chất có hoạt tính sinh học hiện diện trong cây

Abhilasha Shourie và Kuntal Kalra đã nghiên cứu dịch chiết ethanol của thân và lá cam thảo dây và thấy nó có hoạt tính kháng khuẩn, chống lại các

chủng vi sinh vật S aureus, P aeruginosa và C albicans Các dịch chiết

ethanol của cam thảo dây còn có khả năng ức chế ba tác nhân gây bệnh trên,

hiệu quả nhất là chống lại S aureus với nồng độ thấp nhất: 20µg/ml Hai vi sinh vật P aeruginosa và C albicans cũng bị ức chế ở nồng độ là 54 mg/ml

và 75µg/ml [6]

Nhận xét

Đã có rất nhiều những công trình nghiên cứu về thành phần cũng như tác dụng của hạt cam thảo dây đối với sức khỏe con người Qua các công trình nghiên cứu này chúng ta thấy rõ hơn giá trị của loại cây này Nhiều nước phát triển như Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, tuy có nền y học hiện đại nhưng họ vẫn rất quan tâm nghiên cứu cây thuốc nam này, đã minh chứng cho giá trị của cây cam thảo dây Qua các kết quả nghiên cứu đã cho thấy rằng toàn cây cam thảo dây đều có giá trị sử dụng chữa bệnh, mở ra khả năng khai thác hiệu quả loài cây này trong y học hiện đại để bào chế các dạng thuốc chữa bệnh hoặc thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe con người Trong khi thế giới đã nghiên cứu về loài cây này từ rất sớm nhưng ở Việt Nam loài cây này chưa được các nhà khoa học quan tâm nhiều, số công trình nghiên cứu là rất ít và mang tính riêng lẻ Mặc dù, ở nước ta loài cây này rất quen thuộc và được sử dụng phổ biến làm thuốc chữa bệnh trong dân gian Hơn nữa, khí hậu Việt Nam rất thuận lợi để loài cây cam thảo dây sinh sống

và phát triển Nếu cây cam thảo dây được nghiên cứu đầy đủ và có hệ thống

để khai thác hiệu quả thì đây sẽ là nguồn thảo dược tiềm năng của nước ta

Vì vậy, trong điều kiện cho phép, chúng tôi đã chọn hướng nghiên cứu xác định thành phần hóa học của một số dịch chiết hạt cây cam thảo dây Quế

Sơn-Quảng Nam nhằm góp một phần nhất định trong khoa học về nghiên cứu loài cây này

1.4 TÁC DỤNG DƯỢC LÍ CỦA HẠT CAM THẢO DÂY

Hạt chứa một chất protein độc gọi là abrin C12H14N2O2

N H

CH2 CH2 CH CH3

N H

CH3Abrin

Ta có thể chiết chất abrin như sau: sắc hạt hoặc pha nước sôi với hạt, lọc lấy nước rồi cho vào cồn để kết tủa rồi đem sấy khô Bột abrin có màu trắng vàng [3]

1.4.1 Tính chất của abrin

Chất abrin là một protein độc, thuộc nhóm phytoxin, nhưng so sánh với chất ricin (protit lấy từ hạt thầu dầu) thì kém độc hơn Tuy nhiên tác dụng cũng gần giống nhau

Abrin có tính chất một kháng nguyên (antigene) vào cơ thể có thể gây trong cơ thể một chất kháng thể (anticorps) Tác dụng focmon lên abrin, ta có một chất anatoxin, chất anatoxin cũng gây trong cơ thể chất kháng thể

Chất abrin chịu tác dụng của men pepsin của dạ dày khỏe hơn chất rixin Abrin gây vón hồng cầu một cách dễ dàng [3]

Liều gây tử vong ở người lớn cho abrin khoảng 0,0026 mg nếu ăn phải, hoặc khoảng 0,04 microgram cho mỗi kg (µg / kg) trọng lượng cơ thể Liều gây tử vong có thể khác nhau giữa các cá nhân [47] Mức độ nghiêm trọng của những ảnh hưởng của ngộ độc abrin khác nhau tùy thuộc vào cách thức tiếp xúc

Hít phải: Trong vòng một vài giờ hít phải một lượng đáng kể của abrin, các triệu chứng có khả năng sẽ là suy hô hấp (khó thở), sốt, ho, buồn nôn, và

đau thắt ngực, phù phổi Điều này sẽ làm cho hơi thở thậm chí còn khó khăn hơn, và da có thể chuyển sang màu xanh Cuối cùng, hạ huyết áp và suy hô hấp có thể xảy ra, dẫn đến tử vong

Nuốt phải: Nếu nuốt ai đó một số lượng đáng kể của abrin, họ sẽ nôn mửa và tiêu chảy Mất nước nghiêm trọng có thể là kết quả, theo sau là huyết

áp thấp Dấu hiệu hoặc triệu chứng khác có thể bao gồm ảo giác, co giật, và

có máu trong nước tiểu Trong vòng vài ngày, người gan, lá lách và thận có thể ngừng làm việc, và dẫn đến nguy cơ có thể chết Da và mắt tiếp xúc: abrin

ở dạng bột hoặc sương mù có thể gây mẩn đỏ và đau đớn ở vùng da và mắt

Tử vong từ ngộ độc abrin có thể diễn ra trong vòng 36 đến 72 giờ của tiếp xúc, tùy thuộc vào các tuyến đường tiếp xúc (qua đường hô hấp, tiêu hóa, hoặc tiêm) và liều nhận được Nếu trong 3-5 ngày không có hiện tượng gì thì nạn nhân thường hồi phục nhưng sẽ bị tổn thương lâu dài một số cơ quan Cần chú ý rằng các biểu hiện lâm sàng thực tế khi tiếp xúc với chất abrin có thể có nhiều biến đổi hơn so với hội chứng được mô tả ở trên Cũng đã có một

số báo cáo của những người đã ăn những hạt giống và rơi vào tình trạng hôn

mê, một tình trạng gọi là "viêm não cấp tính" [23]

Độ độc của hạt dây cam thảo được một số dân tộc vùng Tây Ấn Độ dùng đầu độc: Ngâm hạt với nước, giã nát, thêm ít dầu vào, nặn thành những múi nhọn, khi những mũi tên này đâm vào da, gây loét tại chỗ, ngấm vào máu và gây chết trong 48 giờ

Tuy nhiên, abrin lại được sử dụng trong y tế, chẳng hạn như trong điều trị để tiêu diệt tế bào ung thư [31] Theo E.J Wawrzynczak và cộng sự, tính chất phân tử và sinh học của chuỗi abrin A được dùng để điều trị ung thư tế bào phổi cho con người [11]

Hay CT Lin đã nghiên cứu dưới kính hiển vi tính chất độc hại của abrin trên tế bào khối u [10]

1.4.2 Cơ chế hoạt động của abrin

Các triệu chứng ngộ độc là y như ngộ độc ricin, ngoại trừ liều gây tử vong của ricin là khoảng 75 lần cao hơn của abrin Abrin là một chất nhị trùng bao gồm hai cấu trúc dưới phân tử protein, gọi là A và B (là abrin và L Abrin) liên kết với nhau bởi một liên kết disulfide duy nhất Cả hai loại đều bao gồm hai chuỗi dây chuyền, một chuỗi A và chuỗi B Một liên kết trái ngược giữa Cys247 của chuỗi A và Cys8 của các liên kết chuỗi B-A và chuỗi

B

Hình 1.5 C ấu trúc Abrin

Cơ chế tác động độc hại của abrin là giống hệt với chất ricin Chuỗi A(RTA) là một N-glycosidase Chuỗi B (RTB) là một lectin galactose cụ thể tạo điều kiện ràng buộc của abrin lên màng tế bào Chuỗi B của cả loại abrin bao gồm 268 amino acid và được chia thành 256 lượng thành phần giống hệt nhau

Hình 1.6 C ơ chế tác động độc hại của ricin [43]

Khả năng của các chất ricin để nhập vào bào tương phụ thuộc vào tương tác liên kết hydro giữa các amino acid RTB và carbohydrate phức tạp trên bề mặt của tế bào nhân điển hình có chứa một trong hai thiết bị đầu cuối N-acetylgalactosamine hoặc liên kết beta 1,4- galactose Ngoài ra, mannose, 1 loại polisacarit của chất ricin có thể buộc các tế bào thể hiện thụ thể mannose Thực nghiệm, RTB đã được chứng minh là liên kết với bề mặt tế bào ở thứ tự của 106 -108 phân tử ricin mỗi bề mặt tế bào

Các liên kết rộng rãi của ricin đến bề mặt màng cho phép tiếp thu tất cả các loại màng lõm vào Bằng chứng thực nghiệm cho thấy ricin hấp thụ trong

cả hố phủ clathrin, cũng như con đường clathrin độc lập bao gồm caveolae và macropinocytosis Túi đưa ricin đến nội bào được gửi đến các bộ máy Golgi Phân tử ricin vận chuyển ngược qua đầu nội bào, xuyên qua mạng lưới Golgi,

và Golgi nhập vào lòng của mạng lưới nội chất (ER)

Để ricin gây độc, RTA phải được cắt giảm từ RTB để giải phóng một khối các vị trí hoạt động RTA Quá trình này được xúc tác bởi protein PDI (protein disulfua isomerase) nằm trong lòng của ER RTA được giải phóng trong lòng ER sau đó mở ra một phần và một phần chôn vào màng ER, nơi

mà nó được cho là bắt chước một màng tế bào được bọc lại liên quan protein Vai trò của ER đi kèm GRP94 và EDEM đã được đề xuất trước sự dời chỗ của RTA từ lòng ER đến bào tương theo một cách nào đó mà sử dụng các thành phần của mạng lưới nội chất liên quan đến suy thoái protein (ERAD) ERAD thường loại bỏ protein của ER mà được bọc lại vào bào tương để tiêu hủy bằng các bào tương proteasomes Sự di chuyển RTA đòi hỏi màng ER, toàn bộ sự có mặt E3 rất phức tạp, nhưng RTA tránh việc có mặt khắp nơi của các chất nền ERAD vì hàm lượng dư của lysine rất thấp, đó là những vị trí đính kèm thông thường cho sự có mặt Như vậy RTA tránh sự di chuyển thông thường của protein (hủy diệt qua trung gian nhắm mục tiêu tạo sự có mặt khắp nơi của protein đến bào tương proteasomes) Trong bào tương tế bào động vật có vú, RTA sau đó trải qua phân loại bởi các phân tử bào tương

đi kèm mà kết quả là viêc xếp lại một cấu xúc tác, do đó ngăn chặn sự tổng hợp protein [38]

Chuỗi B có tác dụng "gắn" ricin vào tế bào: nó liên kết với các protein vận chuyển trong màng tế bào để sau đó vận chuyển chất độc vào trong tế bào Khi đã ở trong tế bào, chuỗi A ngăn cản việc tổng hợp bằng cách thụ

động hóa cấu trúc dưới phân tử 26S của ribosom Một phân tử RTA sẽ làm cho khoảng 1.500 ribosom bị thụ động mỗi phút [46]

Như vậy, abrin hoạt động bằng cách xâm nhập các tế bào của cơ thể và

tế bào ức chế tổng hợp protein Bằng cách gắn một chuỗi carbohydrate trên bề mặt tế bào, phân tử abrin neo chính nó vào tế bào, sau đó chuyển hóa và đi vào các bộ phận bên trong của tế bào Tại đây, nó phản ứng với một tiểu đơn

vị ribosome và cản trở quá trình tổng hợp protein của tế bào bình thường Nếu không có các protein này, các tế bào không thể tồn tại Điều này là có hại cho

cơ thể con người và có thể dẫn đến tử vong

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là hạt cây cam thảo dây được thu hái vào tháng 4/2012 tại huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam (Hình 2.1), xác định tên khoa học

thuộc loài Abrus precatorius L

Hình 2.1 Cây cam th ảo dây

Cây cam thảo dây mọc ở các bụi, bờ và cũng được người dân trồng dọc các hàng rào

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) của Trung tâm khí tượng thủy văn khu vực Trung trung bộ, TP Đà Nẵng

- Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GS–MS) Agilent 7890A/5975C của Trung tâm Dịch vụ phân tích thí nghiệm TP HCM

- Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, máy quay cất chân không Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cốc thủy tinh, bình tam giác, bếp cách thuỷ, cốc sứ, pipet, bình định mức, bình hút ẩm, nhiệt kế, cối chày sứ, giấy lọc

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xác định các thông số hóa lý

a Phương pháp trọng lượng

Độ ẩm của hạt cây cam thảo dây khô, của nguyên liệu bột khô và hàm

lượng tro của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp trọng lượng

b Phương pháp vật lý

Hàm lượng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu nghiên cứu được xác định phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được chiết theo hai cách:

 Cách thứ nhất: Chiết mẫu với dung môi là MeOH ở nhiệt độ thường Rút

dịch chiết và thêm dung môi mới, thực hiện chiết mẫu 3 lần Dịch chiết thu được được cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45oC bằng máy quay cất chân không Thu được cao chiết MeOH tổng Cao chiết tổng này được chế thêm nước và chiết phân lớp lần lượt với n–hexane, chloroform, EtOAc và MeOH bằng phễu chiết Với mỗi loại dung môi ta cũng thực hiện chiết 3 lần Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao n–hexane, cao chloroform, cao EtOAc, cao MeOH) để tiếp tục nghiên cứu

 Cách th ứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với từng loại dung môi

có độ phân cực khác nhau như n–hexane, chloroform, EtOAc và MeOH Với mỗi loại dung môi được chiết ba lần Cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng để tiếp tục nghiên cứu [4], [5]

 Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi thực hiện việc chiết mẫu theo cách thứ hai

2.2.3 Phương pháp phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết

 Trong luận văn này chúng tôi phân tích và định danh thành phần hóa học các dịch chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol của hạt cây cam thảo dây bằng phương pháp đo sắc kí khí ghép phổ khối (GC-MS) Phương pháp GC - MS dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc kí khí (GC) với máy khối phổ (MS) Các chất sau khi đi qua cột GC có thể bị ion hóa và

có khả năng đầy đủ để phân tích bởi máy khối phổ MS Kĩ thuật sắc kí cho phép tách các cấu tử của hỗn hợp, có được các chất “nguyên chất” để đưa vào máy khối phổ với khả năng nhận diện rất ưu việt, đặc biệt là những chất có đặc trưng lưu giữ giống nhau hoặc tương tự nhau nhưng có phổ khối khác nhau nhờ đó có thể nhận diện được chúng Phương pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dưới thể hơi

2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

 Dựa theo tính độc của hạt cam thảo dây theo các tài liệu, chúng tôi tiến hành thăm dò hoạt tính gây độc tế bào nhằm kiểm định dịch chiết từ nước của hạt cây cam thảo dây trong đề tài nghiên cứu này

Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A

và cộng sự [25] Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện

Ung thư Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát

triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm có:

– Human epidemic carcinoma (KB): Ung thư biểu mô

– Heptatocellular carcinoma (Hep–G2): Ung thư gan

– Human lung carcinoma (LU): Ung thư phổi

– Human breast carcinoma (MCF–7): Ung thư vú

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha lỏng sẽ được sử dụng để thử độc tính

Quy trình thử độc tế bào: Cho 200 µg dung dịch tế bào pha loãng nồng

độ ở 3×104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI

1640 cho các dòng tế bào Hep–G2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho dòng

tế bào LU Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 µg/ml; 32 µg/ml; 8 µg/ml; 2 µg/ml; 0,5 µg/ml Ủ ở 37oC, 5% CO2 3 ngày Giếng điều khiển gồm 200 µl dung dịch

tế bào nồng độ 3×104 tế bào/ml ủ ở 39oC, 5% CO2 3 ngày, thêm 50 µl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ ở 37oC trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectro photometer Genios TECAN

Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% số tế bào thử) được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị OD (mật độ quang) đo được trên máy [12]

Việc thử hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện tại phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hoá học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

Thu nguyên liệu

Xử lý thành dạng bột

Xác định hàm lượng kim loại

Xác định độ ẩm,

hàm lượng hữu cơ

Khảo sát điều kiện tối ưu:

thời gian, tỉ

lệ rắn/lỏng

Định danh bằng các phương pháp GC-MS, LC-

Hạt cam thảo sau khi hái, loại bỏ những hạt đã bị hư, sâu, rửa sạch và để khô tự nhiên Lấy một phần đi khảo sát độ ẩm, phần còn lại đem đi phơi khô rồi đem xay nhỏ, bảo quản trong bình kín

Hình 2.3 Nguyên li ệu hạt cây cam thảo dây tươi và bột khô

2.3.3 Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu

a Xác định độ ẩm

D ụng cụ, thiết bị: chén sứ để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích

Ti ến hành: chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ được rửa sạch và sấy trong tủ

sấy đến khối lượng không đổi Sấy xong để vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các chén sứ

+ Xác định độ ẩm của hạt cam thảo dây tươi: Lấy vào 3 chén sứ, mỗi

chén khoảng 1 gam hạt cam thảo dây tươi đã được xử lí ở trên (theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ) Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 900C, cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân, cứ tiến hành như vậy đến khi khối lượng của mẫu và chén sứ giữa 2 lần cân không đổi (sai số 0,01 gam) là được Ghi lại giá trị khối lượng đó Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân Từ đó suy ra độ ẩm trung bình của 3 mẫu

+ Xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu bột: cho vào 3 chén sứ, mỗi

chén khoảng 1 gam nguyên liệu bột đã chuẩn bị ở trên Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như đối với xác định độ ẩm của hạt tươi

 Cách tính độ ẩm:

m1 (gam): Khối lượng hạt cam thảo dây sau khi sấy

ω (%) : Độ ẩm của mỗi mẫu

ωTB (%) : Độ ẩm trung bình

b Xác định hàm lượng tro

Tro toàn ph ần: Là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn

một mẫu thử trong điều kiện nhất định

D ụng cụ: chén sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích

Ti ến hành: Để xác định hàm lượng tro trong hạt cam thảo dây, ta cân

khoảng 1 gam hạt tươi, cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lượng Cho cốc sứ có chứa mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 5000C(nếu nhiệt độ cao hơn thì một số các kim loại sẽ bị bay hơi) Sau thời gian tro hoá khoảng 12 giờ, ta thấy hạt cam thảo dây bị tro hoá hoàn toàn Lúc này tro ở dạng bột mịn, màu xám trắng Dùng kẹp sắt dài lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi giá trị khối lượng Tiếp tục cho cốc vào lò nung, nung 30 phút, lấy ra, thực hiện lại quá trình trên đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp nhau không đổi hoặc sai số 0.001 thì dừng lại Hàm lượng tro trong hạt cam thảo dây tươi được tính theo công thức:

1 0.100%

m H m

=

(2.3) Trong đó, m0 (gam): khối lượng mẫu hạt cam thảo dây tươi trước khi tro hoá

m1 (gam): khối lượng tro

H (%) : hàm lượng tro trong hạt cam thảo dây

c Xác định hàm lượng một số kim loại nặng

Mẫu hạt cam thảo dây sau khi tro hoá được vô cơ hóa về dạng muối vô

cơ dễ tan hoà tan cách cho toàn bộ mẫu tro hóa hòa tan trong dung dịch dung dịch HNO3 10% và định mức đến 100 ml Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại nặng là Pb, Cu, Zn, As bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại phòng thí nghiệm phân tích môi trường – Đài khí tượng thủy văn khu vực Trung trung bộ, số 660 - Trưng Nữ Vương, TP Đà Nẵng

Công thức chuyển đổi từ hàm lượng mg/l sang hàm lượng mg/kg như sau:

(m g /l) (m g/kg )

Trong đó, m0 : khối lượng mẫu hạt cam thảo dây trước khi tro hóa

2.3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chất

a Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi

Cân 10g mẫu và 50ml dung môi cho vào mỗi bình thủy tinh có nút nhám, bình 1 chứa mẫu và dung môi methanol, bình 2 chứa mẫu và ethyl acetate, bình 3 chứa mẫu và n-hexane, bình 4 chứa mẫu và chlorofom

Ngâm các mẫu thí nghiệm trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng Quan sát kết quả sự hòa tan hạt cam thảo dây trong các dung môi khác nhau

Sau đó, đem lọc và cho bay hơi dung môi thu được các cắn trong các dung môi khác nhau Đem cân khối lượng cắn

b Khảo sát thời gian

Hiệu suất của quá trình chiết các hợp chất từ mẫu rắn bằng dung môi còn phụ thuộc vào thời gian, thông thường hiệu suất chiết tăng theo thời gian và đến một lúc thì dừng lại

Cân 10 gam các mẫu hạt cam thảo dây, sau đó cho một lượng dung môi xác định V ml như nhau của cùng một dung môi Tiến hành chiết bằng phương pháp ngâm dầm với nhiệt độ như nhau tùy thuộc vào từng dung môi trong khoảng thời gian khác nhau: 4, 6, 8, 10 ngày

Cô quay dung môi của các dịch chiết thu được cắn ở các thời gian chiết khác nhau, đem cân Chọn thời gian chiết tối ưu

c Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ R/L

Cho cùng một lượng hạt cam thảo dây là 10 gam được, sau đó cho các thể tích khác nhau của từng loại dung môi vào (V1, V2, V3,…ml) Tiến hành tách chất trong khoảng thời gian tối ưu đã chọn

Cô quay dung môi của các dịch chiết thu được cắn ở các tỉ lệ R/L khác nhau Xác định tỉ lệ R/L tối ưu

2.3.5 Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết hạt cây cam thảo dây

* Trong dung môi hữu cơ thông thường:

20g nguyên liệu bột khô được ngâm chiết trong bốn dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol ba lần với mỗi lần 200 ml dung môi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 9 ngày, thu lấy dịch chiết

Lấy ở mỗi dịch chiết khoảng 5 ml để đem phân tích GC – MS xác định thành phần và hàm lượng các cấu tử có trong mỗi dịch chiết Hệ thống GC-

MS với cột tách mao quản DB-5MS, khí mang He 10psi, thể tích tiêm mẫu 1µl (split 10:1), ghép máy MS EI+ kèm ngân hàng dữ liệu và theo chương trình gradient nhiệt độ: từ 500C đến 3000C (5 phút); injector 2500C và detector

500, chế độ quét Fullscan

* Quá trình chiết abrin bằng nước:

Bột hạt cam thảo dây cho vào cốc, cho nước đến thể tích gấp đôi phần bột, đun sôi nhẹ, khuấy đều đến khi thể tích phần nước phía trên xấp xỉ phần