Mục tiêu nghiên cứu của luận án là phát hiện một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân nhi mắc bệnh u nguyên bào thần kinh. Xác định sự liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố tiên lượng và định hướng điều trị UNBTK.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_
Vũ Đình Quang
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN
VÀ MỐI TƯƠNG QUAN VỚI ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN
BÀO THẦN KINH TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62420121
DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2018
Trang 2Công trình được hoàn thành tại trường Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Người hướng dẫn khoa học:
vào hồi giờ ngày tháng năm 2018
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
Trang 3đặc (NST) hiệu cho UNBTK như khuếch đại gen MYCN hay các biến
đổi bộ NST Các thông tin di truyền này được các bác sĩ lâm sàng sử dụng để phân nhóm bệnh nhân, lựa chọn phác đồ tối ưu (giảm lượng hóa chất, điều trị đích…), tiên lượng và theo dõi trong và sau điều trị
để đạt được kết quả điều trị tốt nhất cho từng bệnh nhân Đây chính
là xu hướng cá nhân hóa trong điều trị ung thư hiện đại Tại Việt Nam, việc sử dụng các công cụ di truyền để phát hiện các biến đổi ở mức độ NST và gen cho UNBTK còn rất hạn chế Do vậy kết quả điều trị thành công thường không cao so với thế giới Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn như vậy, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với đặc điểm lâm sàng, kết quả điều trị trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh tại bệnh viện nhi Trung ương” được tiến hành với hai mục tiêu sau:
1 Phát hiện một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân nhi mắc bệnh u nguyên bào thần kinh
2 Xác định sự liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố tiên lượng và định hướng điều trị UNBTK
Nội dung nghiên cứu
1 Nghiên cứu một số biến đổi di truyền của bệnh u NBTK
- Phát hiện khuếch đại gen MYCN trên tất cả các bệnh nhân UNBTK
bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ
Trang 4- Phát hiện biến đổi NST số 2 và NST số 17 trên một số bệnh nhân UNBTK nguy cơ thấp bằng kỹ thuật MLPA
- Phát hiện biến đổi bộ NST trên một số bệnh nhân UNBTK nguy
cơ thấp bằng lai so sánh hệ gen
2 Nghiên cứu sự liên quan giữa khuếch đại gen MYCN với tuổi
chẩn đoán, giới tính, giai đoạn bệnh, nồng độ VMA, HVA, LDH, trạng thái biệt hóa của tế bào và tiên lượng mô bệnh học
3 Sử dụng kết quả phân tích biến đổi di truyền trong định hướng điều trị bệnh UNBTK: phân nhóm nguy cơ theo hướng dẫn của tổ chức u NBTK quốc tế và định hướng điều trị tối ưu cho bệnh nhân theo phác đồ SIOPEN
Tính mới của luận án
- Các biến đổi di truyền có giá trị tiên lượng trên khối UNBTK được xác định bằng các kỹ thuật di truyền hiện đại Sự khuếch đại
gen MYCN, được phát hiện bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Một số bệnh nhân không khuếch đại gen MYCN lần đầu tiên được
đánh giá các biến đổi NST bằng kỹ thuật MLPA và kỹ thuật lai so sánh hệ gen
- Các đặc điểm về di truyền của khối u NBTK được sử dụng vào việc định hướng điều trị cho các bệnh nhân u NBTK Nhóm
bệnh nhân có khuếch đại gen MYCN được điều trị theo phác đồ
nguy cơ trung bình hoặc cao, tùy thuộc vào giai đoạn bệnh Các
bệnh nhân không có khuếch đại gen MYCN nguy cơ thấp, kết quả
phân tích bộ NST là yếu tố quan trọng trong việc quyết định điều trị hóa chất hay chỉ cần theo dõi định kỳ
Trang 5TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1 Tổng quan về UNBTK
UNBTK là dạng ung thư phổ biến nhất trong năm đầu tiên của cuộc đời Tỷ lệ mắc mới là 10,2 ca trên 1 triệu trẻ em dưới 15 tuổi với tuổi chẩn đoán trung bình khoảng 18 tháng
Khoảng 8% các khối UNBTK có tính chất gia đình Đó thường là các khối u có tuổi chẩn đoán sớm (9 tháng) và có các đột biến gen
ALK và/hoặc PHOX2B di truyền từ bố mẹ
Các biểu hiện lâm sàng của UNBTK rất đa dạng và kịch tính phụ thuộc vào vị trí u tiên phát và các biểu hiện di căn Một mặt, UNBTK giải thích cho trạng thái bệnh và tỷ lệ tử vong không cân đối giữa các loại ung thư trẻ em; mặt khác nó biểu hiện sự thoái triển tự phát và hoàn toàn cao nhất trong tất cả các loại ung thư của con người Các khối UNBTK gồm có 2 thành phần tế bào là các NBTK và các tế bào đệm Schwann, ở đó thành phần mô đệm Schwann chiếm dưới 50% toàn bộ khối u Tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của tế bào, UNBTK được chia làm 3 nhóm là chưa biệt hóa (2-3%), ít biệt hóa (65-75%) và đang biệt hóa (5%) Ngoài ra có 4-5% UNBTK không xếp loại được Căn cứ vào tuổi chẩn đoán, mức độ biệt hóa của khối u, chỉ số nhân chia/nhân tan, và nốt canxi hóa, Hiệp hội Giải phẫu bệnh u NBTK Quốc tế chia u NBTK thành 2 nhóm tiên lượng là
mô bệnh học thuận lợi và mô bệnh học không thuận lợi
2 Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng UNBTK
2.1 Một số đặc điểm lâm sàng
Trang 6UNBTK là dạng khối u có nguồn gốc phôi bào của hệ thần kinh giao cảm Chính vì thế, u NBTK thường xảy ra ở trẻ nhỏ, và xuất hiện ở nhiều vị trí khác nhau như cổ, ngực, bụng và tiểu khung
Tế bào UNBTK hoặc theo con đường bạch huyết di căn vào hạch lympho khu vực hay hạch xa, hoặc theo đường máu di căn vào tủy xương, xương, gan, da Một số trường hợp tế bào di căn vào hốc mắt/sọ gây lồi mắt hoặc khối u ở đầu
Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh cho phép khảo sát khối u nguyên phát để đánh giá khả năng phẫu thuật cắt bỏ; phát hiện di căn
xa để phân loại giai đoạn bệnh; hướng dẫn cho thủ thuật sinh thiết khối u bằng kim nhỏ; và là công cụ theo dõi, đánh giá tiến triển bệnh trong quá trình điều trị
Một trong những yếu tố tiên lượng đầu tiên của UNBK là tuổi chẩn đoán Trong khi bệnh nhân dưới 1 tuổi có tiên lượng tốt, các bệnh nhân có tuổi chẩn đoán lớn hơn lại có nhiều đặc điểm sinh học không thuận lợi, làm cho bệnh có tiên lượng xấu
Các khối UNBTK được chia thành 2 nhóm lớn là giai đoạn khu trú và giai đoạn di căn Theo hệ thống phân loại giai đoạn UNBTK theo nhóm nguy cơ, giai đoạn khu trú là L1 và L2, còn giai đoạn di căn là M và Ms Giai đoạn Ms gặp ở các bệnh nhân bệnh nhân nhỏ hơn 12 tháng, có khối u di căn đến gan, tủy xương và da Điểm đặc biệt ở đây là khả năng thoái triển ngẫu nhiên dù khối u tiên phát có kích thước lớn
2.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng
Các tế bào UNBTK đều có rối loạn chuyển hóa catecholamine, làm tăng nồng độ các chất VMA và HVA trong nước tiểu Chính vì
Trang 7vậy, xét nghiệm VMA, HVA niệu là một xét nghiệm cần thiết cho chẩn đoán và theo dõi tiến triển bệnh UNBTK
Phần lớn bệnh nhân nhi có khối UNBTK khu trú có nồng độ LDH bình thường khi chẩn đoán; trong khi đó nồng độ LDH lại tăng cao ở các bệnh nhân giai đoạn di căn, phản ánh tế bào u phát triển nhanh và khối u nhiều tế bào ác tính, là dấu ấn phân loại các bệnh nhân nguy
cơ cao
3 Các đặc điểm di truyền bệnh UNBTK
Nhiều đặc điểm di truyền của u NBTK như sự khuếch đại gen
MYCN hay các bất thường số lượng, cấu trúc NST, hiện nay đã được
xác định là có sự liên quan với biểu hiện lâm sàng và tiên lượng bệnh
3.1 Bất thường số lượng NST
Bất thường số lượng NST là một dấu ấn di truyền có ý nghĩa tiên lượng ở nhóm bệnh nhân ít hơn 1 tuổi Ở đó, các khối u có bộ NST gần lưỡng bội có tiên lượng thuận lợi hơn so với các khối u gần tam bội Việc xác định thể bội của khối u hiện nay được xác định gián tiếp thông qua chỉ số DNA bằng hệ thống đo đạc tế bào theo dòng chảy
Trang 8vị trí 17q21-qter, và đó là kết quả của chuyển đoạn tương hỗ không cân bằng Đột biến thêm cánh dài NST số 17 có quan hệ chặt chẽ với các khối u nguy cơ xấu như giai đoạn bệnh muộn, tuổi chẩn đoán trên
1 tuổi, cùng với mất đoạn 1p, khuếch đại gen MYCN và có kết quả
điều trị kém
Giống như thêm đoạn 17q, mất đoạn NST số 1, từ vị trí 1p22 đến 1p36, có tỷ lệ cao trong bệnh UNBTK ở các khối u không thể phẫu thuật và di căn, kết quả điều trị kém Hơn nữa, mất đoạn cánh ngắn
NST số 1 thường đi kèm với khuếch đại gen MYCN (62%) Trạng
thái vùng 1p36 này có ý nghĩa tiên lượng về tiến triển của bệnh ở nhóm nguy cơ thấp Mất đoạn 1p hay gặp ở bệnh nhân tiên lượng xấu
do một vài gen ức chế khối u có thể nằm trên vùng này
Mất đoạn NST số 11 được tìm thấy ở khoảng 41% khối u NBTK, tại vị trí 11q23.3 Biến đổi di truyền này luôn xuất hiện cùng các dấu
ấn xấu của bệnh (tuổi chẩn đoán trên 1 tuổi, giai đoạn 4, mô bệnh học không thuận lợi), và gần như không đi kèm với khuếch đại gen
MYCN Về ý nghĩa lâm sàng, mất đoạn cánh dài NST số 11 là mất
đoạn phổ biến nhất ở các khối UNBTK tiên phát, và là một dấu ấn
cho tiên lượng xấu của bệnh độc lập với khuếch đại gen MYCN
Mất đoạn cánh dài NST số 14 cũng là một bất thường hay gặp trong các khối UNBTK Khoảng 22% số ca có mất đoạn tại vị trí 14q23-qter Mất đoạn 14q cho thấy sự liên hệ chặt chẽ với mất đoạn
11q trên các ca bệnh không có khuếch đại gen MYCN ở tất cả các
nhóm nguy cơ
Trang 93.3 Khuếch đại gen MYCN
Một số khối UNBTK có đặc trưng về mặt di truyền tế bào là xuất
hiện sự khuếch đại gen MYCN dưới dạng nhiều đoạn kép ngắn chất
nhiễm sắc (DM) nằm ngoài bộ NST hoặc vùng bắt màu đồng nhất
(HSR) trên 1 NST nào đó Trạng thái biểu hiện của MYCN là một đặc
điểm ổn định trong hệ gen UNBTK, và số lượng bản sao gen này là không thay đổi trong quá trình phát triển của khối u, giữa các vùng khác nhau của khối u, cũng như giữa khối u tiên phát và các khối di căn
MYCN là một gen tiền ung thư nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể
số 2, ở vị trí 2p24 Gen MYCN được biểu hiện ở giai đoạn tiền làm tổ
và giữ vai trò thiết yếu trong sự phát triển hoàn toàn của hệ thống thần kinh
Trong bệnh UNBTK, khuếch đại gen MYCN thường đi kèm với
các khối u ở giai đoạn muộn, ác tính cao Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào ung thư mang khuếch đại gen có khả năng phát triển không kiểm soát và di căn cao, thông qua sự tăng cường tổng hợp DNA và ngăn chặn sự thoát ra khỏi chu trình tế bào cũng như sự biệt hóa tế bào thần kinh
Chỉ 5% bệnh nhân UNBTK có khuếch đại gen MYCN có thời
gian sống không bệnh hơn 18 tháng, trong khi con số này ở các bệnh nhân không khuếch đại gen là 70% Mặt khác, khuếch đại gen cho thấy khả năng điều trị không thành công ngay cả ở giai đoạn sớm
Có ít nhất 6 vùng trong hệ gen cũng được khuếch đại ở các ca
UNBTK có khuếch đại MYCN như MDM2 trên nhiễm sắc thể 12q13
Trang 10và MYCL trên nhiễm sắc thể 1p32 Sự khuếch đại các gen này không
xảy ra độc lập, và góp phần vào sự ác tính của khối u
3.4 UNBTK di truyền
Một nhóm nhỏ bệnh nhân UNBTK có khuynh hướng hình thành khối u này trong gia đình Con cái trong các gia đình này thường có tuổi chẩn đoán sớm (khoảng 9 tháng) và khối u nguyên phát ở cả 2 bên tuyến thượng thận hoặc nhiều vị trí khác nhau Phần lớn các ca
UNBTK di truyền là do đột biến gen ALK, chiếm tỷ lệ khoảng 7% số
ca Người mang đột biến gen ALK có khoảng 50-60% nguy cơ hình thành khối u [68] Đột biến PHOX2B gặp ít hơn và thường xuất hiện
trên các bệnh nhân có rối loạn phát triển mào thần kinh
3.5 Mô hình biến đổi di truyền bệnh UNBTK
Sự khởi tạo khối u được bắt đầu từ một NBTK riêng lẻ, thường liên quan đến sự bất hoạt một gen ức chế khối u Mức độ biệt hóa khi các NBTK biến đổi quyết định sự biểu hiện của thụ thể neutrophin Các khối u nhóm 1 chiếm khoảng 1/3 khối u có đặc điểm biểu hiện
Trang 11TkrA cao Các khối u này đặc trưng bởi rối loạn phân bào dẫn đến bộ nhiễm sắc thể đa bội hoặc gần tam bội, có xu hướng biệt hóa hoặc tế bào chết theo chu trình phụ thuộc vào sự có mặt hay không của NGF Các bệnh nhân thường ít hơn 1 tuổi, khối u khu trú, tiên lượng rất tốt
và điều trị chỉ bằng phẫu thuật và hóa trị triệu chứng
Khối u nhóm 2 đặc trưng bởi các bất thường nhiễm sắc thể lớn và
có bộ nhiễm sắc thể gần lưỡng bội Không có biến đổi nào cố định, nhưng thêm đoạn 17q hay gặp nhất, TrkA ít biểu hiện còn TrkB biểu hiện trội hơn Trong nhóm này, các khối u lại được chia thành 2 nhóm nhỏ hơn Một nhóm (nhóm 2A) không có khuếch đại gen
MYCN và mất đoạn 1p, nhưng lại có mất đoạn 11q và 14q Các bệnh
nhân ở nhóm này thường có tuổi chẩn đoán lớn hơn, giai đoạn muộn hơn, nhưng tiến triển chậm và thường đe dọa đến tính mạng Nhóm còn lại (nhóm 2B) là nhóm ác tính nhất, đặc trưng bởi khuếch đại gen
MYCN đi kèm mất đoạn 1p Nhóm này gồm các bệnh nhân từ 1 đến 5
tuổi, giai đoạn muộn, bệnh tiến triển nhanh dẫn đến phần lớn là tử vong (trên 75% số bệnh nhân)
Như vậy, dù mỗi khối UNBTK có biểu hiện lâm sàng khác biệt, tính chất sinh học của khối u vẫn có thể dự đoán được dựa vào các đặc điểm bất thường về di truyền cũng như biểu hiện gen Các thông tin như vậy được sử dụng để tiên lượng kết quả điều trị cũng như lựa chọn liều lượng liệu pháp thích hợp nhất từng bệnh nhân
4 Các kỹ thuật di truyền đƣợc sử dụng trong bệnh UNBTK
4.1 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ
Trang 12Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một phương pháp nhằm định
vị, phát hiện các trình tự nhất định bằng cách lai một đầu dò có gắn huỳnh quang với trình tự nghiên cứu theo nguyên tắc bổ sung
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trải qua 5 bước gồm (1) gắn huỳnh quang vào đầu dò, (2) biến tính đầu dò và DNA đích, (3) phản ứng lai, (4) rửa sau lai và (5) quan sát
Hiện nay, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một trong những kỹ thuật di truyền được sử dụng rộng rãi để đánh giá trạng thái gen
MYCN trên các bệnh nhân UNBTK
4.2 Kỹ thuật MLPA
Phương pháp MLPA là phương pháp sử dụng nhiều phản ứng PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen khác nhau với chỉ một cặp mồi duy nhất
Phản ứng MLPA có thể chia thành năm bước: (1) biến tính sợi DNA và lai đầu dò; (2) ghép nối; (3) khuếch đại; (4) phân tích dữ liệu
Do có khả năng phát hiện được các thay đổi về số lượng bản sao của một gen hay một đoạn nhiễm sắc thể, kỹ thuật MLPA là một kỹ thuật phù hợp để phát hiện các mất đoạn hay thêm đoạn trên các khối
u NBTK
4.3 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen
Kỹ thuật lai so sánh hệ gen là một kỹ thuật di truyền dựa trên việc
so sánh 2 hệ gen, nghiên cứu và đối chứng, để phát hiện các CNV Mỗi một hệ gen được lai với 1 màu huỳnh quang khác nhau (thường
là xanh và đỏ), và tín hiệu tổng hợp của 2 màu huỳnh quang cho biết vùng gen/NST đó là mất hay thêm vật chất di truyền
Trang 13Kỹ thuật lai so sánh hệ gen có năm bước chính gồm (1) tách DNA, (2) khuếch đại và gắn huỳnh quang vào hệ gen, (3) lai với DNA chip, (4) rửa sau lai và (5) quét và phân tích kết quả
Phương pháp lai so sánh hệ gen được coi là kỹ thuật “đầu bảng” trong việc xác định các thay đổi về số lượng bản sao trên các bệnh nhân u NBTK với khả năng phát hiện các biến đổi nhỏ trên toàn bộ
hệ gen chỉ với 1 lần chạy
5 Tình hình nghiên cứu bệnh UNBTK ở Việt Nam
Do thường xảy ra ở trẻ nhỏ, phần lớn các bệnh nhân UNBTK được khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương (ở miền Bắc), bệnh viện U bướu thành phố Hồ Chí Minh (ở miền Nam)
U nguyên bào thần kinh đã bắt đầu được nghiên cứu tại bệnh viện Nhi Trung uơng từ giữa những năm 1990 Năm 2005 và 2007, tác giả Phùng Tuyết Lan lần lượt công bố kết quả nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng cũng như kết quả điều trị bệnh nhân UNBTK tại Bệnh viện Nhi Trung ương Năm 2016, tác giả Nguyễn Xuân Huy
công bố kết quả nghiên cứu khuếch đại gen MYCN trên 54 bệnh nhân
UNBTK bằng kỹ thuật FISH
Các nghiên cứu của Trần Chánh Khương và Nguyễn Thị Khen mở đầu cho hướng nghiên cứu UNBTK tại phía Nam Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Trương Đinh Kiều Diễm đã đánh giá khuếch đại gen
MYCN bằng kỹ thuật Realtime PCR trên 60 bệnh nhân UNBTK
Trang 14VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
141 bệnh nhân UNBTK sau khi khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 01 năm 2015 đến tháng 06 năm 2017
1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
- Các bệnh nhân đến khám và được chẩn đoán xác định mắc u nguyên bào thần kinh bằng xét nghiệm giải phẫu bệnh
- Có mẫu bệnh phẩm đủ tiêu chuẩn cho xét nghiệm di truyền
- Gia đình đồng ý tham gia vào nghiên cứu
1.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân
- Không có mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu bệnh phẩm không đủ tiêu chuẩn cho xét nghiệm di truyền
- Gia đình từ chối tham gia vào nghiên cứu
1.3 Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu cắt ngang và mô tả
Nghiên cứu trạng thái gen MYCN và một số biến đổi di truyền
trên bệnh nhân UNBTK
Nghiên cứu sự liên quan giữa một số biến đổi di truyền này với một số yếu tố lâm sàng có ý nghĩa tiên lượng
- Nghiên cứu tiến cứu
Các bệnh nhân nghi ngờ UNBTK được thu thập mẫu bệnh phẩm Sau khi có kết quả chẩn đoán xác định bằng mô bệnh học, tiến hành nghiên cứu biến đổi di truyền trên các khối UNBTK
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm