Mục tiêu nghiên cứu luận án là phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam. Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Dưới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra thường xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là nguyên nhân chính làm giảm sản lượng cây trồng Trong khi đó, dân
số toàn cầu tăng nhanh, ước tính năm 1950 sẽ tăng lên 9 tỷ người, ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực, tạo ra một áp lực lớn cho việc đảm bảo lương thực Vì vậy, an ninh lương thực là vấn
đề then chốt của nền khoa học nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng
Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực quan
trọng nhất của con người Trên thế giới, cây lúa được xếp vào vị trí thứ 2 sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng Ở Việt Nam, một đất nước từ lâu đời đã gắn liền với nền văn minh lúa nước, vai trò cây lúa đặc biệt quan trọng Cây lúa đóng vai trò chính trong sản xuất lương thực, đóng góp sản lượng cao nhất (60%) và được canh tác với diện tích lớn nhất (xấp xỉ 3,8 triệu ha) Chính vì vậy, việc tạo ra các giống lúa có năng suất cao, đồng thời chống chịu được với điều kiện bất lợi ngoại cảnh đặc biệt là hạn có ý nghĩa quan trọng đối với việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định an ninh lương thực quốc gia
Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu quả đạt được không thực sự cao Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng như dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến tuy đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng vẫn có những hạn chế Phương pháp chuyển gen
ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn
Trang 42
gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng được kết hợp với nhau Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định những tính trạng quan tâm được chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra các giống lúa mang các đặc tính như mong muốn của con người
Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen mà sự biểu hiện của mỗi gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã Vì vậy, nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã tham gia điều khiển quá trình phiên mã đang là trọng tâm trong các nghiên cứu chọn tạo giống nhằm tăng cường tính chống chịu của cây trồng với điều kiện hạn Nhóm gen mã hóa nhân
tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn của thực vật Nhiều nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã vào lúa đã được chứng minh tăng cường khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen
Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC (tên gọi được bắt nguồn từ tên gọi của ba protein đầu tiên được phát hiện có chứa vùng NAC là NAM - no apica meristem, ATAF - trancription activation factor và CUC - cup shaped cotyledon) là họ nhân tố phiên mã lớn nhất đặc trưng của thực vật Nhân tố phiên mã NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa khác nhau trong tế bào, bao gồm các quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp và đáp ứng chống chịu stress môi trường như hạn, mặn và lạnh của tế bào Một
số gen đáp ứng stress thuộc nhóm NAC ở lúa như SNAC1/OsNAC9, SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 và OsNAC10 đã được chứng minh có liên
quan tới quá trình đáp ứng hạn ở cây lúa Cây lúa chuyển gen
Trang 5SNAC1/OsNAC9, OsNAC5 và OsNAC10 có khả năng kháng hạn và
năng suất cao hơn so với cây không chuyển gen
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ
“Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn” với mục tiêu thu tạo ra
các dòng lúa chuyển gen chống chịu hạn, đồng thời không gây ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển Các kết quả thu được sẽ
là nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn
Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam
Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn
Đối tượng v nội dung nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là các gen mã hóa nhân tố phiên
mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn của giống lúa Việt Nam
ác n i ung nghiên cứu ch nh
Nội dung 1: Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm
NAC gồm OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 liên quan đến tính chịu hạn
từ giống lúa Việt Nam;
Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 ở thực vật dưới sự điều khiển của promoter liên tục (Ubiquitine, 35S)/ cảm ứng (Lip9, Rd29A)
Nội dung 3: Chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC1
vào lúa
Nội dung 4: Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen
Trang 64
Địa điểm nghiên cứu
Luận án được thực hiện tại 2 địa điểm chính: ộ môn ệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam); Phòng Thí nghiệm tương tác cây trồng - vi sinh vật thuộc Trung tâm nghiên cứu vì sự phát triển tại Montpellier, Pháp
Đóng góp mới của luận án
Luận án đã phân lập được 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm
NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa bản địa Việt
Nam Luận án đã tạo được các hệ vector biểu hiện gen trong tế bào
thực vật mang gen OsNAC1 được điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin và 35S) và promoter hoạt động cảm ứng (Lip9 và Rd29A) Luận án đã tạo được một số dòng lúa chuyển gen biểu hiện
gen đích, sinh trưởng bình thường trong điều kiện không xử lý hạn và
có khả năng chịu hạn tốt hơn cây đối chứng không chuyển gen
Ứng dụng thực tiễn của luận án
Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra được các dòng lúa T2
mang một bản sao của gen OsNAC1 ở dạng đồng hợp đặt dưới sự
điều khiển của promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 và promoter hoạt động liên tục Ubiquitin Cây chuyển gen có kiểu hình tương đồng với cây đối chứng không chuyển gen (về khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất) trong điều kiện bình thường không
có stress hạn, trong khi tỷ lệ sống sót cao hơn trong điều kiện xử lý stress hạn ở giai đoạn cây non và các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý, sinh hóa thể hiện khả năng chịu hạn cao hơn ở giai đoạn sinh sản trong điều kiện xử lý stress hạn Đây là kết quả quan trọng, chứng tỏ
tiềm năng ứng dụng của gen OsNAC1 nói riêng và các gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC liên quan tới đáp ứng stress nói
chung trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn Trên cơ sở
Trang 7kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNAC1 do luận án tạo
ra đang được nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng như ngô, bông, đậu tương… để tạo ra các giống cây chuyển gen kháng hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu ở Việt Nam
2 Bố cục của luận án
Luận án gồm 144 trang, bao gồm: Phần mở đầu (04 trang); Tổng quan tài liệu (42 trang); Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (15 trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (47 trang); Kết luận (02 trang); Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (22 trang) với 215 tài liệu gồm 2 thứ tiếng: tiếng Việt (11 tài liệu) và tiếng Anh (204 tài liệu); Phụ lục (7 trang) Luận án có 9 bảng, 27 hình
Trang 86
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA
1.1.1 Đặc điểm nông sinh học của cây lúa Oryza sativa
Lúa Oryza sativa thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza Chi Oryza phân bố rộng trên thế giới và
có từ 19 – 23 loài, trong đó có loài Oryza sativa L (2n = 24) được
trồng phổ biến ở khắp các nước trên thế giới và tập trung chủ yếu ở
châu Á Loài Oryza gluberrima S được trồng một diện tích nhỏ ở
một số nước thuộc châu Phi
1.1.2 Ảnh hưởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo
Việt Nam là một trong số các quốc gia bị tác động nặng nề nhất bởi biến đổi khí hậu Sự xuất hiện thường xuyên của hạn hán tiếp tục
đe dọa nghiêm trọng đến nền sản xuất lúa gạo trong nước Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa gạo trên thị trường thế giới do Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới
1.1.3 Ảnh hưởng của hạn tới đặc điểm chịu hạn cuả cây lúa
Hạn hán luôn là mối đe dọa nghiêm trọng đối với nền sản xuất lúa gạo Hạn ảnh hưởng tiêu cực đến cây lúa ở tất cả các đặc điểm, bao gồm hình thái, sinh lý, sinh hóa, phân tử
1.2 VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN TỚI ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Ở THỰC VẬT
Nhân tố phiên mã (Transcription factor - TF) là những protein hoạt động kết hợp với một số yếu tố điều hòa khác, bao gồm các protein cải biến/thay đổi cấu trúc sợi nhiễm sắc, để điều hòa tương tác của RNA polymerase với DNA
NAC là nhân tố phiên mã lớn nhất đặc chưng của thực vật Tên gọi
NAC bắt nguồn từ tên của ba protein đầu tiên được phát hiện có chứa
Trang 9vùng liên kết DNA tương tự nhau (domain NAC), bao gồm NAM (no
apical meristem), ATAF (Arabidopsis transcription activation factor) và
CUC (cup-shaped cotyledon) NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh
lý, hóa sinh khác nhau trong tế bào, bao gồm các quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp, đáp ứng các yếu tố stress phi sinh học và hữu sinh NAC là thành phần rất quan trọng của con đường truyền tín hiệu trong đáp ứng chống chịu stress của thực vật cho thấy tiềm năng ứng dụng của họ gen NAC trong nghiên cứu tạo giống cây trồng chống chịu stress
1.3 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ CƠ CHẾ CHUYỂN
GEN VÀO THỰC VẬT
Stress sinh học và phi sinh học là nguyên nhân chính làm giảm năng suất trên nhiều đối tượng cây trồng quan trọng như lúa, ngô, bông, lúa mì, cà chua Và để đối phó với vấn đề này, công nghệ chuyển gen thực vật được sử dụng và được coi là một công cụ hiệu quả để chuyển các gen ngoại lai nhằm cải thiện nguồn gen cây trồng 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỐNG CHỊU HẠN
Một hướng giải quyết được chính phủ, các tổ chức xã hội và các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đó là nghiên cứu tạo ra các giống lúa mới có năng suất cao, đồng thời có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn Định hướng nghiên cứu phổ biến và rất được quan tâm hiện nay đó tăng cường biểu hiện các gen đáp ứng hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa chuyển gen Ở Việt Nam, định hướng chuyển gen vào lúa đã bắt đầu hình thành vào những năm 1995 của thế
kỷ trước Tuy nhiên, chúng ta hầu như chưa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào về các gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress, đặc biệt
là nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng hạn ở lúa
Trang 108
Chương 2 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 VẬT LIỆU
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Giống lúa J02 được mua từ Công ty Cổ phần giống – vật tư nông nghiệp công nghệ cao Việt Nam;
Các giống lúa nương và IR64 do Trung tâm Tài nguyên môi trường – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp
Các cặp oligonucleotide sử dụng làm mồi cho PCR được thiết kế dựa trên các trình tự đã được công bố trên Gen ank và được đặt mua
từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ)
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Xử lý mẫu thực vật theo phương pháp của Qin (2007), Dubouzet (2003) và Tran (2004)
Trang 11Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-Rd/OsNAC1
Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế pBI-Lip9/ OsNAC1, pBI-35S/ OsNAC1 và
pBI-Ubi/ OsNAC1
- Tạo cây lúa chuyển gen biểu hiện OsNAC1
- Sàng lọc kiểu gen, kiểu hình của các cây chuyển gen
- Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen ở điều kiện nhà lưới bằng các phương pháp định lượng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa: hàm nước tương đối theo phương pháp của Schonfeld (2002), hàm lượng chlorophyll theo phương pháp của Robert J Porra (2006), hàm lượng proline theo phương pháp của Bates (1973), sự sản sinh ROS theo phương pháp Thorda- Christensen (1997)
Trang 1210
Chương 3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
3.1 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA
3.1.1 Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam
10 giống lúa Việt Nam và giống lúa đối chứng IR64 khảo sát khả nănng chịu theo phương pháp chuẩn của Viện Lúa quốc tế IRRI, 1996 Kết quả thể hiện ở Bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở lúa STT Tên giống Phương pháp đánh
giá theo IRRI
3.1.2 Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn
3.1.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn
Kết quả điện di RNA trên gel agarose 1% cho thấy, các mẫu RNA
Trang 13tinh sạch phục vụ cho thí nghiệm phân lập gen (Hình 3.1)
Hình 3.1: Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn
Ghi chú: giếng 1 – 4: RNA tổng số tách chiết từ mẫu lá lúa xử lý hạn
trong 1, 6, 12 và 24 giờ được điện di trên gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb
3.1.2.2 Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC
3.1.2.2.1 Nhân bản gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC
Các đoạn gen đích đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế, sau đó kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%
Hình 3.2: Nhân bản gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 bằng kỹ
thuật PCR từ cDNA lúa Tẻ đỏ xử lý hạn
Ghi chú: Sản phẩm PCR nhân gen đích từ cDNA của các mẫu lúa Tẻ đỏ được điện di trên gel agarose 1% (A) PCR nhân bản gen OsNAC1,
giếng 1: mẫu lúa xử lý hạn giếng 2: đối chứng âm (mẫu lúa không xử lý
hạn); (B) PCR nhân bản gen OsNAC, giếng 2: khuôn là cDNA; giếng 1: đối chứng âm (C) PCR nhân bản gen OsNAC10, giếng 2: khuôn là
cDNA; giếng 1: đối chứng âm Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb
Trang 14một vùng tín hiệu định vị nhân PRDRKYP phổ biến cho các nhân tố phiên mã, nằm ở domain C (Hình 3.3) Kết quả này hoàn toàn phù hợp
với các công bố trước đây
Hình 3.3: Phân tích trình tự axit amin của protein OsNAC1,
OsNAC5 và OsNAC10 của giống lúa Tẻ đỏ
Ghi chú: Vùng tín hiệu định vị nhân được kí hiệu bởi dấu ngoặc; các
vùng bảo thủ của protein NAC được kí hiệu A, B, C, D, E; TĐ: gen phân lập từ lúa Tẻ đỏ, JA: gen phân lập từ lúa Japonica (Niponbare)
đã công bố trên ngân hàng gen mã số AY596808.1, AB028184.1 và AK069257.1
Trang 153.1.3 Phân tích biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10
trong điều kiện hạn
Hình 3.4: Mức độ biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10
trong điều kiện xử lý hạn
Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen OsNAC1 (cột màu xanh), OsNAC5
(cột màu đỏ) và OsNAC10 (cột màu vàng) của lúa Tẻ đỏ đã xử lý hạn (PEG 20%) trong thời gian 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ được xác định bằng RT - PCR Mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử
lý stress (0 h) có giá trị bằng 1 Actin được sử dụng làm gen nội chuẩn Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp RT-PCR
nghiên cứu mức độ biểu hiện của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 ở giống lúa Tẻ đỏ trong điều kiện xử lý stress hạn Mức độ biểu hiện khác nhau ở các gen khác nhau, trong đó OsNAC1 có mức
độ biểu hiện cao hơn rõ rệt và duy trì mức độ biểu hiện cao trong thời gian dài hơn đáng kể so với hai gen còn lại khi xử lý stress hạn Điều
này cho phép dự đoán OsNAC1 đóng góp vai trò nhiều hơn trong đáp ứng chống chịu hạn của cây lúa Tẻ đỏ so với OsNAC5 và OsNAC10, đặc biệt là đối với stress hạn kéo dài Chính vì vậy, OsNAC1 được
lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu chính cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm tạo ra dòng lúa chuyển gen có khả năng chống chịu hạn