Mục tiêu nghiên cứu đề tài là ứng dụng vật liệu nano bán dẫn PbS để nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose trong dung dịch. Ứng dụng vật liệu nano từ tính – kim loại trong phân lập và khảo sát tế bào gốc máu từ mẫu tủy xương.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Văn Vũ
tiến sĩ họp tại : Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
vào hồi …… giờ 00, ngày …… tháng …… năm ………
Có thể tìm hiểu luận án tại :
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin – Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Lý do chọn đề tài
Cảm biến sinh học chuyển hóa tín hiệu sinh học thành các tín hiệu đọc được với độ chọn lọc cao, được ứng dụng nhiều trong trong nhiều ngành khoa học, như công nghệ sinh học, công nghệ môi trường hay công nghệ thực phẩm Các cảm biến sinh học thế hệ đầu tiên là các cảm biến có tín hiệu đầu ra là tín hiệu điện hóa ở dạng giản đồ thể quét vòng (CV) Cùng với CV, các quá trình điện hóa xảy ra trên bề mặt điện cực của cảm biến điện hóa có thể được khảo sát thông qua phương pháp đo điện tổng trở (total impedance)
Trong các cảm biến sinh học điện hóa, vật liệu nano thường được đưa lên trên bề mặt điện cực để làm tăng diện tích tiếp xúc giữa đối tượng sinh học với điện cực; từ đó tăng cường tín hiệu đọc được, giúp tăng độ nhạy của cảm biến
Gắn liền với tín hiệu thế quét vòng là đối tượng glucose Mặc dù là đối tượng đã cũ, nhưng cảm biến sinh học điện hóa xác định nồng độ glucose vẫn luôn được dùng để đánh giá phẩm chất của cảm biến Thông qua đây, vai trò của vật liệu nano trong việc hỗ trợ làm tăng độ nhạy của cảm biến thể hiện
rõ rệt Các nghiên cứu trong nước hầu như chỉ tập trung vào khai thác khả năng làm tăng diện tích tiếp xúc giữa vật liệu nano được cố định trên bề mặt điện cực và đối tượng sinh học Chưa có nghiên cứu sử dụng cảm biến điện hóa nào đánh giá sự tương thích giữa vật liệu và đối tượng sinh học Trong khi đó, một số nghiên cứu tính chất quang của các chấm lượng tử đã bước đầu cho thấy sự tương thích bề mặt giữa các phân tử sinh học với các chấm lượng tử chứa lưu huỳnh như ZnS hay PbS
Trang 4Trong đó vật liệu nano PbS là vật liệu mới, vì vậy, là đối tượng phù hợp để ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học
Một trong những đối tượng quan trọng của cảm biến sinh học điện tổng trở là tế bào Trong đó, tế bào gốc máu là đối tượng mới, có tính ứng dụng trong y học cao và đang được nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm Các hạt nano thường được điều khiển để bám lên bề mặt của tế bào một cách đặc hiệu Sau
đó, tín hiệu điện tổng trở được sử dụng như tín hiệu đầu ra của cảm biến sinh học Ý tưởng tạo ra một loại vật liệu đa chức năng vừa có từ tính vừa có tính chất quang như các hạt nano kim loại nhằm tách chiết chụp ảnh và đo đạc tế bào được rất nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm Việc sử dụng vật liệu nano
đa chức năng trong tách lọc tế bào gốc kết hợp với chụp ảnh và
đo đạc nồng độ tế bào đang rất hạn chế
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Nghiên cứu chế tạo và tính chất của cảm biến điện hóa sử
dụng hạt nano kim loại, bán dẫn”
2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Ứng dụng vật liệu nano bán dẫn PbS để nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose trong dung dịch Ứng dụng vật liệu nano từ tính – kim loại trong phân lập và khảo sát tế bào gốc máu từ mẫu tủy xương
3 Nội dung nghiên cứu
Vật liệu nano chì sulfide (PbS) được chế tạo bằng phương pháp hóa siêu âm
Các hạt nano vàng (Au) và đa chức năng từ tính – kim loại, bao gồm Fe3O4-Ag và Fe3O4-Au, được nghiên cứu chế tạo và phân tán trong môi trường nước bằng phương pháp hóa ướt
Trang 5Vật liệu nano PbS đã được nghiên cứu ứng dụng để chế tạo cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose
Vật liệu đa chức năng Fe3O4-Ag được ứng dụng trong nghiên cứu phân lập và đo đạc nồng độ tế bào gốc máu từ mẫu tủy xương
4 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu của luận án là thực nghiệm kết hợp với mô phỏng tính toán
Các phép đo được sử dụng trong nghiên cứu là hiển vi điện
tử truyền qua (TEM), hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (HR-TEM), giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD), phổ hấp thụ quang học vùng tử ngoại khả kiến (UV-vis), phổ huỳnh quang (PL) và phổ tán xạ Raman Các tín hiệu đầu ra của cảm biến là các tín hiệu điện bao gồm giản đồ thế quét vòng (CV) và tổng trở được
đo trên hệ điện hóa tích hợp (PGSTATS)
Phương pháp tính toán mô phỏng được sử dụng để đánh giá tương tác giữa vật liệu nano với các phân tử hữu cơ
5 Những đóng góp mới của luận án
Đã chế tạo cảm biến sinh học điện hóa sử dụng vật liệu nano PbS với độ nhạy lên tới 546,2 µAcm-2mM-1
Sử dụng phương pháp tính toán mô phỏng để khảo sát liên kết giữa các hạt PbS với các phân tử hữu cơ, từ đó đưa ra lời giải thích về khả năng chuyển tiếp điện tích giữa các hạt nano PbS với enzyme Glucose Oxidase (GOx), dẫn tới làm tăng độ nhạy cảm biến
Chế tạo thành công cảm biến sinh học điện tổng trở sử dụng các hạt nano Fe3O4-Ag để khảo sát nồng độ tế bào gốc
Trang 6Trong quá trình chế tạo cảm biến, chúng tôi đã thành công ứng dụng tính chất từ của vật liệu nano và tính huỳnh quang của chất nhạy quang đính trên kháng thể để khảo sát hiệu suất gắn kháng thể của vật liệu
6 Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 137 trang bao gồm: Phần mở đầu (8 trang); Tổng quan (37trang); Phương pháp chế tạo và nghiên cứu tính chất vật liệu (14 trang); Phân tích tính chất vật liệu (31 trang); Ứng dụng vật liệu nano trong chế tạo cảm biến sinh học (32 trang); Kết luận (1 trang); Danh mục các công trình đã công bố của luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (13 trang), với 149 tài liệu Luận án có 7 bảng, 72 hình vẽ
CHƯƠNG I TỔNG QUAN
1.1 Cảm biến sinh học
Cảm biến sinh học bao gồm 3 bộ phận chính: (i) phần tử nhận biết sinh học hay đầu thu sinh học (biological recognition element hay bioreceptor) dùng để phân biệt đối tượng cần nhận biết một cách đặc hiệu, (ii) phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer) đóng vai trò chuyển đổi tín hiệu sinh học thành tín hiệu đo được, và (iii) phần tử xử lý tín hiệu (signal processing system) đóng vai trò biến đổi tín hiệu đo được thành tín hiệu đọc được; từ đây đưa ra thông tin về đối tượng sinh học cần nhận biết
Các tiêu chí chất lượng (performance criteria) đóng vai trò không thể thiếu trong đánh giá, so sánh cảm biến sinh học Các tiêu chí này tập trung vào đánh giá hiệu suất sử dụng nhiều hơn
là đánh giá bản chất quá trình sinh hóa xảy ra bên trong một cảm biến sinh học Các tiêu chí phẩm chất của cảm biến sinh
Trang 7học bao gồm: các thông số hiệu chỉnh, tính lọc lựa và độ tin cậy, thời gian phản ứng và tính lặp lại, độ bền và thời gian sống Cảm biến sinh học điện hóa là cảm biến sinh học có tín hiệu đầu ra là tín hiệu điện hóa; thông thường là các tín hiệu điện thế quét vòng (cyclic voltammetry – CV), tín hiệu tổng trở (total impedance)
Gắn liền với lịch sử cảm biến sinh học, cảm biến điện hóa sử dụng tín hiệu CV để xác định glucose trong dung dịch hoạt động dựa trên cơ sở tương tác của glucose với enzyme, đóng vai trò là những cảm biến đầu tiên Tương tác giữa các enzyme
và các phân tử glucose tạo ra phản ứng ô xi hóa khử để ô xi hóa glucose thành gluconic acid Các cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose được sử dụng trong các nghiên cứu hiện đại thường là cảm biến thế hệ II hoặc thế hệ III Ở cảm biến thể hệ
II, các electron chuyển tiếp một lần nữa qua các dung môi điện hóa trước khi đi về phía các điện cực Cảm biến thế hệ III, với mong muốn đơn giản hóa quá trình pha thêm dung môi, chuyển tiếp trực tiếp điện tử tới bề mặt điện cực thông qua tiếp xúc giữa enzyme với vật liệu làm điện cực
Một trong những đối tượng xuất hiện nhiều trong các cảm biến sinh học tổng trở là tế bào; trong đó, tế bào gốc máu đang được nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm Trong các cảm biến khảo sát tế bào, bộ phận nhận biết sinh học hoạt động dựa trên tương tác kháng nguyên – kháng thể Các nghiên cứu về tế bào gốc thường là chỉ tập trung vào phân lập tế bào gốc, sau đó tiến hành nuôi biệt hóa với các mục đích khác nhau; hoặc nếu muốn khảo sát hàm lượng tế bào gốc thì lại có những phép đo riêng
Trang 8biệt Rất hiếm thấy những nghiên cứu kết hợp việc phân lập tế bào gốc máu rồi xác định làm lượng
1.2 Vật liệu nano trong cảm biến sinh học điện hóa
Với kích thước nhỏ đạt đến cấp độ kích thước của tế bào, vật liệu nano được cho là vật liệu làm thay đổi nên khoa học công nghệ bởi rất nhiều tính năng đặc biệt: tổng diện tích bề mặt lớn, kích thước phù hợp để nghiên cứu sinh học cấp độ tế bào, xuất hiện các tính năng lý hóa đặc biệt và tiết kiệm vật liệu, thu nhỏ kích thước linh kiện Các ưu điểm trên hoàn toàn có thể được ứng dụng trong cảm biến sinh học điện hóa nhằm làm tăng độ nhạy cũng như tăng khả năng điều khiển các đối tượng sinh học trước khi đo đạc
Trong cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose, vật liệu nano được cố định trên bề mặt điện cực để tạo ra cấu trúc xốp với diện tích bề mặt lớn Sau đó, dung dịch chứa được nhỏ lên bên trên, để trong điều kiện phù hợp cho Sau có toàn bộ hệ được cố định bởi một lớp polymer dẫn Hầu hết các nghiên cứu đều hướng tới tăng độ xốp của vật liệu, hoặc đơn giản hơn là dựa vào việc chế tạo vật liệu mới sau đó ứng dụng mà chưa đề cập nhiều đến sự tương thích của enzyme với vật liệu nhằm nâng cao chất lượng quá trình trao đổi điện tử từ vật liệu tới enzyme Một số nghiên cứu ứng dụng tính chất quang của vật liệu trong cảm biến xác định nồng độ glucose cho thấy vật liệu sulfide kim loại biểu hiện tính tương thích sinh học với glucose oxidase
Giải pháp dùng các hạt nano từ bám đặc hiệu lên bề mặt tế bào gốc máu, phân lập trước khi khảo sát được cho là giải pháp đơn giản, chi phí thấp Vật liệu nano từ tính – kim loại hứa hẹn
Trang 9là vật liệu đa năng có tính ứng dụng cao trong các cảm biến điện vì chúng có thể sử dụng trong tách chiết tế bào nhờ tính chất từ, có khả năng tăng cường tín hiệu điện (từ bản chất của vật liệu kim loại quý) và khả năng đánh dấu bằng tín hiệu Raman tăng cường bề mặt
CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN
CỨU TÍNH CHẤT VẬT LIỆU Các phương pháp chế tạo vật liệu
2.1 Chế tạo các hạt nano bán dẫn PbS
Phản ứng tạo sulfide kim loại đã từ muối chứa ion kim loại
và thioacetamide (TAA) đã được nghiên cứu từ rất sớm Trong thí nghiệm chế tạo các hạt nano PbS, sóng siêu âm được sử dụng như yếu tố xúc tác phản ứng và cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) được sử dụng như chất hoạt động bề mặt để hạn chế sự phát triển kích thước hạt
2.2 Chế tạo các hạt nano vàng
Quá trình phát triển kích thước có thể được điều khiển bởi sự
có mặt của các chất hoạt hóa bề mặt Phân tử CTAB có cấu trúc một đầu ái nước và một đầu kị nước, nên khi được phân tán vào môi trường nước, chúng thường tạo thành các tiểu cầu có kích thước nhỏ Các tiểu cầu này có xu thế bao bọc xung quanh các hạt nano vàng, vừa hạn chế quá trình phát triển đồng thời hỗ trợ điều khiển hình dạng của các hạt
2.3 Chế tạo các hạt nano Fe3O4
Các hạt nano Fe3O4 được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa Tiền chất sử dụng là FeCl2.4H2O, FeCl3.6H2O và dung dịch amoni NH4OH Dung dịch chứa 2 muối FeCl2 và FeCl3
Trang 10được trộn với nhau theo tỉ lệ số mol là FeCl2:FeCl3 = 1:2
NH4OH được bổ sung từ từ trong khi nhiệt độ dung dịch giữ tại
60oC Kết tủa Fe3O4 hình thành có màu đen và được để ổn định trong thời gian 30 phút trước khi lọc rửa
2.4 Chế tạo các hạt nano composite Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag
Các hạt Fe 3 O 4 -Au
Các hạt Fe3O4-Au được chế tạo theo 2 bước: Cho HAuCl4
vào dung dịch chứa các hạt nano Fe3O4 với các pH khác nhau, sau khi ion AuCl4 hấp phụ lên bề mặt Fe3O4, sử dụng NaBH4 để khử thành Au
Các hạt Fe 3 O 4 -Ag
Các hạt Fe3O4-Ag được chế tạo theo 3 bước: chức năng hóa
bề mặt các hạt Fe3O4 bằng APTES (Aminopropl triethyl orthosilane), ion Ag+ được cho hấp phụ lên bề mặt các hạt
Fe3O4 sau khi chức năng hóa và dùng NaBH4 để khử Ag+ thành
Trang 11thấy, tại biên các hạt nhỏ kích thước 2-3 nm vẫn còn tồn tại một lớp PbS vô định hình Sau khi xạ nhiệt laser trong thời gian 3 phút, các phần biên hạt này mới kết tinh hoàn toàn Độ rộng vùng cấm của các hạt nano PbS được tính toán từ phổ hấp thụ quang học UV-vis và bằng 3,12 eV Độ rộng vùng cấm của các hạt nano PbS nhỏ hơn rất nhiều so với của vật liệu khối PbS và được giải thích là do hiệu ứng lượng tử - khi kích thước hạt nhỏ hơn nhiều so với bán kính tương tác Bohr của vật liệu
Hình 3.1 Ảnh TEM (A) và HRTEM (B) và ảnh chụp nhiễu xạ
điện tử (C) của mẫu các hạt nano PbS được chế tạo bằng phương pháp hóa siêu âm
3.2 Sự phát triển các hạt nano vàng trong dung dịch chứa các chất hoạt động bề mặt
Hình 3.2 là ảnh hiển vi điện tử truyền qua của các hạt nano vàng ngay sau khi chế tạo (A), sau khi được ngâm trong 75 mM CTAB trong thời gian 6 tháng (B) và phân bố kích thước hạt trong hai trường hợp trên (C) Phân bố kích thước hạt đều có dạng log-normal – nghĩa là tần suất xuất hiện hạt có kích thước
D phụ thuộc vào D theo dạng hàm 2
2 2 ) (ln
đó σ và μ là phương sai và số trung vị của phân bố Kích thước
hạt trung bình theo hàm phân bố 2
Trang 12chế tạo và sau khi ngâm trong CTAB 4 tháng lần lượt là 4,2 ±
0,5 (12%) nm và 23,6 ± 1,2 (3%) nm
Hình 3.2 Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của các hạt
nano Au Hình A: ảnh TEM của các hạt ngay sau khi chế tạo Hình B: ảnh TEM của các hạt sau khi ngâm trong 70 mM CTAB 4 tháng Hình C: phổ phân bố kích thước hạt của hai trường hợp trên
Các phân tử CTAB phân ly trong dung dịch thành các ion dương Ctyltrimethyl ammonium (CTA+
) và Br- Các ion CTA+
có một đầu mang điện tích dương là gốc amin cấp III – cả 3 nguyên tử H trong NH3 bị thay thế bằng các cụm CH3, sẽ liên kết với bề mặt các hạt nano vàng bằng liên kết tĩnh điện – do điện tích bề mặt của các hạt nano vàng là âm Đầu còn lại của ion CTA+ là một chuỗi dài phân tử hữu cơ (C16), vì vậy chúng
Trang 13chỉ có thể tạo liên kết kị nước với các đuôi hữu cơ C16 của các ion CTA+ khác tạo thành một “gói” để bao bọc các hạt nano vàng lại Chính cấu trúc “gói” này hạn chế quá trình khuếch tán của các hạt Au với nhau; đồng thời làm cho các hạt sau khi phát triển có kích thước đều hơn
Hình 3.3 Sự phụ thuộc của kích thước hạt nano Au theo thời
gian khi được ngâm trong các môi trường dung môi khác nhau Kích thước hạt được tính toán từ lý thuyết Mie
Hình 3.3 là kết quả tính toán thể tích của các hạt nano Au theo thời gian trong môi trường dung môi là CTAB có nồng độ
25 mM, 35 mM, 70 mM và CTAB có nồng độ 25 mM bổ sung
100 mg/L PVP Có thể thấy, khi nồng độ CTAB thay đổi, sự phát triển của kích thước hạt nano vàng theo thời gian không thay đổi quá nhiều Nhưng khi bổ sung thêm 500 mg PVP vào trong dung dịch thì tốc độ già hóa của các hạt nano vàng tăng lên; không chỉ thế thể tích hạt nano Au cũng lớn hơn so với thể