Bài giảng môn học Nguyên lý và phương pháp chọn giống cây trồng: Chương 5 - TS. Trần Văn Quang

Bài giảng môn học Nguyên lý và phương pháp chọn giống cây trồng - Chương 5: Phương pháp tạo biến dị di truyền trong chọn giống cây trồng cung cấp cho người học các kiến thức: Phương pháp lai hữu tính, đột biến tạo biến dị di truyền, đa bội thể, đơn bội thể và đơn bội kép,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chương 5 PHƯƠNG PHÁP TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN

TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

5.1 PHƯƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH 5.1.1 Khái niệm

“Lai giống là sự giao phối (thụ phấn, thụ tinh) giữa hai hay nhiều dạng bố mẹ có nền di truyền khác nhau để tạo ra biến dị tái tổ hợp theo mục tiêu chọn giống ”

Sự giao phối có thể xảy ra trong tự nhiên (lai tự nhiên) hoặc do con người tiến hành (lai nhân tạo) đều tạo ra biến dị tái tổ hợp

Lai hai bố mẹ có các cặp gen alen khác nhau, không liên kết, một trong số chúng là trội, phân chia nhiễm sắc thể và giao phối ngẫu nhiên giữa giao tử đực và giao tử cái, ở thế hệ F 1 sẽ có các kiểu gen mới do tái tổ hợp gen của hai bố mẹ

Tổng quát để tính số kiểu gen khi lai hai bố mẹ khác nhau n gen ,

sẽ có 2 n giao tử và số kiểu gen là 3 n Quần thể nhỏ nhất ở F 2 cần thiết để biểu hiện các biến dị là 4 n cá thể

Phương pháp lai hữu tính tạo giống thường được ứng dụng đối

với cây trồng có cấu tạo hoa hoàn chỉnh

Trong phép lai, người ta sẽ có ký hiệu cây bố (male parent - cây

cho phấn) và cây mẹ (female parent - cây nhận phấn)

Đối với thực vật có cấu tạo hoa hoàn chỉnh gồm đủ cả nhị và

nhuỵ thì cần tiến hành khử đực (emasculation) ở cây mẹ trước

khi tiến hành lai

Các loài cây trồng có sinh sản đặc thù như: bất dục đực (male

sterility), đơn tính cái (Gynoecious), tự bất hợp (self -

incompatibility) do yếu tố di truyền gene nhân, tế bào chất hay

do yếu tố môi trường có thể lợi dụng hiện tượng này để giảm

bớt công khử đực, hạt thu được trên cây mẹ là hạt lai

Lai hữu tính tạo giống được phân chia thành lai gần và lai xa:

Lai gần là lai giữa hai bố mẹ trong cùng loài Ví dụ, lai giữa các giống trong mỗi loài lúa trồng Oryza sativa L (châu Á), O

glaberrima (châu Phi)…

Lai xa là sự giao phối giữa hai bố mẹ khác loài hay khác loài phụ

Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụ lúa Indica x Japonica; lai giữa loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại (Solanum demissum) hay lai giữa chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen (Secale) tạo ra cây Triticale

5.1.2 Các phương pháp lai hữu tính

a) Lai đơn (single cross)

A x B

Ký hiệu: A/B (theo IRRI và USDA) hoặc A - B ( theo CIMMYT)

b) Lai ba (three-way cross)

(A x B) x C

Ký hiệu A/B//C (theo IRRI và USDA) hoặc A - B x C (theo CIMMYT)

c) Lai kép (double cross)

(A x B) (C x D)

Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA); A/B//C///D (theo IRRI) hoặc A – B x C- D

( theo CIMMYT)

d) Lai đỉnh (topcross)

Dòng 1 Dòng 2

Tester Dòng 3

*

*

* Dòng n

e) Lai dialen (dialen cross)

A A x A A x B A x C A x D

B B x A B x B B x C B x D

C C x A C x B C x C C x D

D D x A D x B D x C D x D

Griffing (1956) đưa ra 4 phương pháp lai như sau:

Phương pháp 2: Lai một chiều và tự phối (bố mẹ) và số tổ hợp lai = p(p + 1)/2

Phương pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tự phối và số tổ hợp lai = p(p - 1)

Phương pháp 4: Lai một chiều không tự phối và số tổ hợp lai = p(p - 1)/2

f) Lai thuận nghịch (reciprocal cross)

A♀ x B♂ B♀ x A♂

Lai thuận Lai nghịch

g) Lai trở lại (backcross)

h) Lai trở lại nhờ marker (Marker-assisted backcrossing- MAB)

MAB có nhiều mức:

Mức thứ nhất: chọn lọc các gen hay QTL điều khiển tính trạng có lợi, nhưng tính trạng đó khó đánh giá dựa trên kiểu hình hoặc do gen lặn điều khiển Giảm bớt các gen không mong muốn liên kết kéo theo trong quá trình lai trở lại

Mức thứ hai: sử dụng hai marker liên kết hai đầu của locus mục tiêu để chọn lọc phối hợp, tối thiểu gen kéo theo và yêu cầu quần thể lớn tùy thuộc vào khoảng cách của hai marker với locus mục tiêu Yêu cầu này rất quan trọng khi thể cho (donor) là giống địa phương

Mức thứ ba: chọn lọc nền di truyền, sử dụng marker không liên kết để chọn donor tương phản, lấy lại nhanh genome của bố mẹ nhận gen Sử dụng kỹ thuật này có thể tiết kiệm 2, 3 thậm chí 4 thế

hệ lai trở lại

Alpha x Xaroza

Albidum-24 x Liutexen55/11

Xaratopca-29 Beloturca x Potapca

Hình 5.7 Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P Sekhudin)

k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization) l) Lai quy tụ gen dựa trên marker phân tử (Marker-Assisted Gene Pyramiding)

1 3 4 5 6 7 8 9 10 12

TGST ngắn Năng suất cao Kháng rầy nâu và bạc lá

1 3 4 5 6 7 8 9 10 12

1 3 4 5 6 7 8 9 10 12

1 3 4 5 6 7 8 9 10 12

Dòng/ giống mới quy tụ các gen quy định tính trạng mong muốn ở lúa

TGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc lá – O longistaminata

Thời gian sinh trưởng ngắn Năng suất cao Kháng rầy nâu và bạc lá

Lưu ý: Để tiến hành được phương pháp này, các nghiên cứu cần tạo ra các dòng đẳng gen (NIL – nearly isogenic line) Sau đó, các dòng NIL này được mong muốn để chọn

m) Lai tế bào soma (Somatic hybridization)

Các bước lai tế bào soma:

Bước 1: Phân lập tế bào soma từ mô lá của cây con, tinh sạch

Bước 2: Lai tế bào soma và kiểm tra tế bào lai

Bước 3: Tái sinh cây

Bước 4: Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau lai tế bào soma

5.1.3 Kỹ thuật lai hữu tính a) Nguyên lý chọn cặp bố mẹ Nguyên lý 1: Chọn cặp bố mẹ dựa trên loại hình sinh thái và xa cách

di truyền Nguyên lý 2: Chọn cặp bố mẹ dựa trên khả năng kết hợp Nguyên lý 3: Chọn cặp bố mẹ dựa trên khả năng chống chịu bệnh Nguyên lý 4: Chọn cặp bố mẹ dựa trên năng suất và yếu tố tạo thành năng suất

Nguyên lý 5: Dựa trên chỉ thị phân tử chọn bố mẹ có các tính trạng mục tiêu

b) Gieo trồng, chăm sóc vườn cây bố mẹ và chọn cây bố mẹ

Các dòng, giống bố mẹ được trồng ở ruộng riêng, có sơ đồ bố trí

để thuận tiện cho công tác chăm sóc cũng như chọn cây để lai

Các kỹ thuật như thời vụ, phân bón, tưới nước và phòng trừ sâu

bệnh cỏ dại tối ưu đối với loài cây trồng để cây lai sinh trưởng

phát triển tốt, cơ quan sinh sản (hoa) phát triển hoàn chỉnh thuận

tiện cho thao tác khử đực và thụ phấn

Bố trí thời điểm gieo bố và mẹ để bố mẹ nở hoa trùng nhau,

trong trường hợp bố mẹ lệch nhau có thể sử dụng kỹ thuật điều

chỉnh như ánh sáng, nhiệt độ, hóa chất…

c) Chuẩn bị cây lai và dụng cụ lai

Trước khi thực hiện thao tác lai, cây lai cần được chọn kỹ và chuẩn bị chu đáo: cắt bỏ các cây không dùng cho lai, dọn sạch lá chết, lá vàng úa, cắt bỏ các hoa không khử đực là những hoa đã nở đầu, hoa cuối trên bông

và cành hoa

Ví dụ, cây lúa được chọn làm vật liệu lai sẽ được đánh trồng trong chậu, cắt bỏ các bông thừa chỉ để lại từ 3 - 4 bông, dọn sạch lá chết Tiến hành cắt bỏ các hoa đã nở và hoa non chỉ để lại khoảng 15 - 20 hoa thành thục

để khử đực

Dụng cụ lai cần thiết gồm panh, kéo, thẻ đánh dấu, bao cách li bằng giấy bóng kính, lọ mầu đen đựng hạt phấn, ghim, bút chì hoặc bút dầu viết trên bao cách li không bị phai…

e) Thụ phấn và đánh dấu

Thu hoa của cây bố tách bao phấn lấy phấn và thụ hoa mẹ đã được

khử đực

Thu hoa bố trên các cây khỏa mạnh, không sâu bệnh và thời gian thu

khi hoa nở rộ thường vào buổi sáng

Một số loài cây phấn hoa dính để tách lấy phấn phải hong khô như cà

chua, khoai tây

Những loài cây giao phấn, hoa đơn tính thì có thể thu nhận hạt phấn

vào lọ tối sau đó thụ phấn cho từng hoa

Dùng panh gắp bao phấn đưa lên đầu nhụy của hoa mẹ đã khử đực

bóp nhẹ để bao phấn vỡ tung phấn lên đầu nhụy, dùng bút lông chấm

vào cốc phấn rồi chấm lên đầu nhụy, đưa phấn lên ngón tay hoặc vật

phẳng rồi vít đầu nhụy chấm vào phấn bố…

Quá trình thụ phấn cần lặp lại vài lần để đảm bảo thụ phấn thành

công

d) Khử đực và bao cách li

Có 4 phương pháp sau:

Khử đực bằng tay : áp dụng với cây trồng có hoa đủ lớn, bộ phận đực và cái trong thời điểm khử đực phân biệt rõ ràng như lúa, cà chua, thuốc lá, đậu, vừng…

Khử đực bằng máy : máy hút chân không được sử dụng để khử đực ở lúa

Khử đực bằng hoá chất: các loài cây có hoa rất nhỏ (kê, rau dền, hành…) Các hoá chất thường dùng để khử đực có hiệu quả cao là các hydrazid của axit malic và ester thơm, sodium methyl arsenate, Maleic hydrazide, NAA, IAA, FW450, Ethrel, RH531, MSMA, ZMA

Khử đực bằng nước nóng: Nhiệt độ và thời gian khử đực tuỳ thuộc vào loài cây trồng (lúa sử dụng nhiệt độ 43 0 C trong 5 phút;

lúa miến sử dụng nhiệt độ 47 - 48 0 C trong 10 phút)

Hình 5.13 Bao cách

ly và ghi thông tin trong lai tạo giống lúa

f) Chăm sóc và thu hoạch hạt lai

Sau khi lai, cây lai phải được theo dõi thường xuyên để ngăn chặn kịp thời côn trùng và động vật phá hoại quả và hạt lai

Cây yếu cần được bón thêm phân kali hydrophotphat (KH 2 PO 4 )

để hạt lai được chắc, sức sống cao

Hạt lai đã chín cần thu hoạch kịp thời, phơi khô vào bảo quản tránh mất sứ nảy mầm

Hạt lai bảo quản trong các túi ghi đầy đủ thông tin, cất trữ trong nhiệt độ thấp và khô để sử dụng trong giai đoạn tiếp theo của quá trình chọn tạo giống

5.1.4 Lai xa

a) Một số ứng dụng của lai xa

Tạo ra loài mới: kết quả lai xa giữa lúa mì và lúa mạch đen, lưỡng

bội hoá nhiễm sắc thể của con lai F 1 đã tạo ra loài mới triticale

Chọn tạo giống cây trồng mới

Tạo biến dị mới , những tính trạng, đặc điểm mới mà dạng bố mẹ

chưa có

Tạo giống kháng bệnh và kháng sâu vào cây trồng

Tạo giống cây trồng chống chịu với điều kiện bất thuận phi sinh

học

Tạo giống lai có ưu thế lai cao

Tạo dòng đơn bội, tạo con lai tế bào và đa dạng các loại bất dục tế

bào chất…

Trường hợp 2: Con lai không kết hạt (thu được hạt lai F 1 nhưng con lai F 1 bất thụ)

Nguyên nhân:

Do bố mẹ sai khác quá lớn về di truyền và sinh lý;

Hệ thống sinh sản của con lai bị phá vỡ

Biện pháp khắc phục:

Kéo dài thời gian sinh trưởng của con lai;

Kỹ thuật canh tác và chăm sóc phù hợp;

Xử lý đa bội thể

b) Những khó khăn khi lai xa và biện pháp khắc phục

Trường hợp 1: Cây lai không kết hạt

Nguyên nhân do:

Môi trường trên đầu nhụy hoa của cây mẹ không phù hợp cho hạt phấn

nảy mầm

Ống phấn ngắn không thực hiện được quá trình thụ tinh hoặc khả năng

xuyên của ống phấn phát triển chậm dẫn đến khi thụ tinh trứng đã mất sức

sống

Sai khác quá lớn về di truyền không hình thành được hợp tử, phôi hoặc

hình thành phôi nhưng không phát triển hoặc tiêu biến

Biện pháp khắc phục:

Thụ phấn bổ sung

Lai trung gian

Cứu phôi

5.2 ĐỘT BIẾN TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN 5.2.1 Khái niệm và ý nghĩa

Đột biến là thuật ngữ chỉ sự thay đổi về vật chất di truyền của tế bào (gene và nhiễm sắc thể)

Theo định nghĩa trong từ điển thuật ngữ khoa học cây trồng là sự thay đổi di truyền trong vật chất di truyền của tế bào, ở mức lớn hơn

là phá vỡ hoặc sắp xếp lại bộ nhiễm sắc thể, đột biến có thể di truyền lại cho con cái ở các thế hệ sau

Hugo de Vries (1980) đưa ra “Học thuyết đột biến” bao gồm những nội dung chính có ý nghĩa sau:

(i) Đột biến xảy ra đột ngột, không qua bước trung gian nào;

(ii) Các dạng đột biến mới xuất hiện có thể hoàn toàn ổn định, bền vững;

(iii) Đột biến tạo nên những biến đổi rời rạc, không tập trung;

(iv) Đột biến xảy ra ngẫu nhiên, có thể có lợi hoặc có hại;

(v) Sự xuất hiện đột biến phụ thuộc vào số lượng cá thể;

(vi) Một đột biến có thể lặp lại nhiều lần

Bảng 5.1 Đột biến tạo giống thành công trên một số cây trồng ở Brazil

Cây trồng Đặc điểm và tính trạng cải tiến

Thuốc lá Kháng virus; khắc phục khó khăn khi lai xa khác loài

Cam quýt Kiểu cây gọn, chín tuần tự, không hạt

Đậu co ve Hàm lượng protein cao hơn; màu vở hạt mới, tập tính

sinh trưởng, kháng virus khảm vàng đậu

Chuối Giảm chiều cao cây, chịu mặn

Hoa cúc Màu sắc hoa mới, thấp cây, nhiều canh hoa hơn

Lúa mỳ Kháng rỉ sắt thân; rỉ sắt lá; thân mềm; chín sớm; thấp

cây; chống chịu chua phèn

Lúa Thời gian chín ngắn; chín sớm; thấp cây; cải tiến chất

lượng hạt

Đậu tương Lá hẹp, lá rộng, nhiều màu sắc, hạt to, chín sớm

Cà chua Quả ôvan; màu quả xanh đậm, chín chậm, giảm kích

thước cây, tăng độ Brix và giảm độ Brix

Ý nghĩa của đột biến:

Tạo ra nguồn biến dị di truyền phong phú cho chọn giống Đặc biệt là những tính trạng mong muốn mà nguồn biến dị tự nhiên không có

Có khả năng tạo ra giống mới, nhanh, ổn định, không phân ly, có nhiều đặc tính, tính trạng quý như chín sớm, không cảm quang (tám thơm đột biến), năng suất cao, chống chịu sâu bệnh, tăng hàm lượng protein, lipid, glucid trong sản phẩm; các dòng bất dục đực dùng trong tạo giống ưu thế lai…

Có thể tạo ra các biến dị mới cho một số loài cây trồng sinh sản bằng con đường vô tính hay nhóm cây sinh sản vô tính như đột biến khảm được ứng dụng trong tạo giống hoa cây cảnh

Làm mất đi mối liên kết cũ, xây dựng mối liên kết mới dẫn đến làm tăng khả năng tổ hợp của gen

Hạn chế của đột biến:

Tạo biến dị không định hướng;

Không xác định được vị trí, số lượng gene đột biến;

Phần lớn các đột biến là những biến dị có hại, tỉ lệ biến dị

có lợi thấp (10 -6 )

Ngày nay, công nghệ gene có thể khắc phục được những

khó khăn này

5.2.2 Phân loại đột biến a) Đột biến ở mức phân tử ADN

Đột biến làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN được gọi là “đột biển điểm” hay “đột biến gen” ở nhiều mức khác nhau:

Đột biến điểm (Point Mutation) là đột biến làm thay đổi một cặp

cơ bản trên phân tử ADN, thay một nucleotide này bằng một nucleotide khác

Đột biến mất đoạn (Deletion mutation) là đột biến làm mất một hay nhiều hơn các nucleotide trên gen hoạch nhiễm sắc thể

Đột biến chèn đoạn (Insertion mutation) là đột biến lồng thêm

ít nhất một nucleotide và chuỗi ADN

Ngoài ra còn có các đột biến tạo ra gen chức năng hoặc không

có chức năng, đột biến gây ra sắp xếp ADN trở dạng hoang dại của chúng, đột biến phá vỡ gen quyết định dẫn đến gây chết cơ quan sông đang phát triển…

b) Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể:

Bao gồm thay đổi cấu trúc NST và số lượng NST

Đột biến thiếu đoạn, đảo đoạn, đổi đoạn, lặp đoạn

Dạng đột biến này được gọi là “đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể”

Mức độ thay đổi số lượng nhiễm sắc thể như tăng hay giảm số

lượng nhiễm sắc thể tạo ra các thể đa bội, đơn bội hay lệch bội

Dạng đột biến này được gọi là “đột biến số lượng nhiễm sắc thể”

c Đột biến thể khảm (Chimaras ):

Theo R Daniel Lineberger: “Một cây được gọi là đột biến thể khảm khi các tế bào có trên một kiểu gen được tìm thấy ở các mô sinh trưởng liền kề nhau của cây”

Các cây có đốm màu khác nhau có thể là dạng chung nhất để nhận biết đột biến thể khảm

Thể khảm có ý nghĩa quan trọng trong chọn tạo giống cây sinh sản vô tính, cây hoa, cây cảnh

Phân loại đột biến thể khảm: Đột biến thể khảm ra ở đỉnh sinh trưởng phát triển ở các lớp khác nhau và phân thành 3 loại khảm chính là:

Khảm từng phần

Khảm quạt

Khảm vòng

Hình 5.15 Hình thành và phát triển của khảm

5.2.3 Các tác nhân gây đột biến a) Tác nhân vật lý

Tia X Bước sóng ngắn λ = 0,05 - 10Å, sức đâm xuyên mạnh từ vài mm đến vài cm Tia Gamma (γ)

Bước sóng rất ngắn λ < 0,05Å, sức xuyên mạnh hơn tia X tiếp nhờ hiệu ứng quang điện Trong sinh học thường sử dụng tia γ là đồng vị phóng xạ Co 60 và Ce 137

Neutron (nhanh, chậm, nhiệt)

Tạo ra từ lò phản ứng nhiệt hạch, rất nguy hiểm, mức đâm xuyên mạnh

Tia alpha (α) Được hình thành từ hạt nhân của nguyên tử helium (He), gồm 2 proton và 2 nơtron tia α có khả năng xuyên sâu

0,07mm trong mô sinh vật

Tia tử ngoại UV

Bước sóng 200 – 400nm (nanomet) Photon của tia UV có năng lượng thấp, không xuyên sâu nên không tác động dụng khi xử lý hạt phấn và noãn Tần số gây đột biến của DNA hấp phụ (từ 260 – 265nm)

b) Tác nhân hoá học

Trình tự tác động của các tác nhân hoá học:

Trước hết, chúng đi vào các bộ phận tế bào, gây chấn thương

ở mức phân tử;

Sau đó, tác nhân hoá học tương tác với các sản phẩm trung

gian trong tế bào và cùng với sản phẩm của tương tác tác

động vào ADN Đây là giai đoạn tiền đột biến

Cuối cùng, các liên kết hoá học làm sai lệch thông tin đã gây

ra đột biến

Các tác nhân gây đột biến gồm:

Các chất oxy hoá khử và các gốc tự do: H 2 O 2 , HNO 2 , các aldehyd, các muối kim loại nặng

Các chất alkyl hoá: ethylmethan sunfonat (EMS), nitrozoethyl-urea (NEU), nitrozomethylurea (NMU), ethylenimin (EI), diethylsulphat (DES), dimethylsunphat (DMS),…

Các chất đồng đẳng của base nitơ: cafein, 5-bromuaraxin (5-BU), aminopurin, các hợp chất chứa halogen…

Các chất cảm ứng với base: ethylurethan, 5-aminouracin, teobromin…

Các chất nhóm acridin (C 13 H 9 N): proflavin được dùng nhiều trong nghiên cứu đột biến gene

Ngoài ra còn một số chất hóa học: H 2 S 2 O 7 , Na 2 CO 3 , Na 3 PO 4 ,

c) Tác nhân sinh học :

vào cơ thể cây trồng để gây đột biến

 Đây là một trong những công cụ của phương pháp

chuyển gen

5.2.4 Vật liệu và phương pháp xử lý đột biến a) Vật liệu xử lý là những bộ phận có khả năng hoạt động sống Các bộ phận xử lý: cây, hạt khô, hạt ướt, mầm, bộ phận sinh dưỡng, hạt phấn, tế bào, phôi, calus trong nuôi cấy mô

b) Phương pháp xử lý

Phương pháp xử lý tuỳ thuộc vào tính chất của các tia, liều lượng, loại hoá chất, nồng độ

Khi xử lý đột biến cần chú ý đến đặc tính sinh lý của cây, thời gian và

bộ phận cây trồng được xử lý

Liều lượng và nồng độ hoá chất căn cứ vào liều lượng gây chết (lethal dose) - giá trị LD 50

LD 50 được xác định bằng nghiên cứu cụ thể với loại tác nhân và vật liệu

xử lý

Liều lượng xử lý bằng TNVL được đo bằng các đơn vị Rad, Kr hay Gray

Đơn vị tiêu chuẩn thống nhất là Gray viết tắt là Gy (Gray (Gy) = 1 Joule

= 100rad, rad = 100erg/g vật chất),

Nồng độ xử lý bằng tác nhân hóa học có đơn vị là mM hoặc ppm

Bảng 5.3 Liều lượng và thời gian xử lý đột biến đối với hạt lúa khô

Tác nhân đột biến Liều lượng và thời gian xử lý

Neutrons nhanh 3 - 8 Gy

X-rays X-rays 95 - 250 Gy

Tia gamma gamma rays 100 – 350 Gy

MNH (MNU) MNH (MNU) (0,7–1,5 mM) x (3 – 5 h)

ENH (ENU) ENH (ENU) (1,7–2,5 mM) x (3 - 5 h)

EMS EMS (0,2 – 0,5%) x (8–20 h)

NaN3 NaN3 (0,5 – 2 mM) x (3-5 h)

c) An toàn trong xử lý đột biến

Phải tuân thủ các quy tắc, quy định an toàn và đảm bảo hiệu quả

xử lý

Việt Nam đã ban hành luật “Luật năng lượng nguyên tử” năm

2008 Một số nguyên tắc cơ bản là:

Phải có phòng thí nghiệm chuyên dụng đủ tiêu chuẩn an toàn, hoặc khu vực xử lý an toàn

Cán bộ thực hiện phải được đào tạo

Phải đầy đủ trang thiết bị bảo hiểm an toàn cho người thực hiện

Sau khi sử lý phải có phương pháp đảm bảo phân rã hết phóng xạ hay độc tố mới được sử dụng

Hình 5.16 Cánh đồng xử lý đột biến ở Viện Đột biến tạo

giống (IRB) quốc gia Nhật Bản

5.2.5 Chọn lọc sau đột biến

Vật liệu xử lý đột biến là thế hệ M 0 được gieo trồng và thu hoạch gieo trồng M 1 và thu hoặc trồng quần thể M 2

Bắt đầu từ quần thể M 2 phân thành hai khu chọn lọc, một khu vực tiếp tục chọn lọc các thế hệ phân ly, một khu vực khác đánh giá các dòng đã thuần để phát triển giống mới hoặc làm vật liệu khởi đầu cho phương pháp tạo giống khác như lai, chuyển gen…

Chọn lọc sau đột biến đối với cây sinh sản sinh dưỡng phân thành

2 nhóm, (i) Nhóm cây cần tách đột biến riêng rẽ ra khỏi thể khảm sử dụng nhân và ghép vô tính tạo thành các dòng vô tính ở thế hệ sau Qua một số thế hệ chọn lọc đánh giá độ thuần và các đặc điểm nông sinh học khác để phát triển thành giống mới

(ii) Nhóm cây không cần tách đột biến ra khỏi thể khảm như hoa và cây cảnh đánh giá đột biến ổn định nhân vô tính phát triển thành giống mới

Chọn lọc sau đột biến với cây sinh sản hữu tính: tương tự như

chọn lọc phân ly sau lai điểm khác biệt là có thể chọn lọc một quả,

một bông để hình thành dòng ở thế hệ sau mà không nhất thiết từ

một cây hay một khóm như chọn lọc sau lai

Yêu cầu chọn lọc quần thể phân ly lớn, ước lượng độ lớn quần thể

M 1 theo Brock (1971)

1 log(1 p ) N

log(1 )





 

Trong đó: N là số cá thể M 1 sống sót để tạo gia đình M 2 ; µ là tỉ lệ đột

biến; p 1 là xác suất ít nhất xảy ra một đột biến

Bảng 5.4 Yêu cầu số cá thể của gia đình M 2 đảm bảo xuất hiện đột biến

Tỉ lệ đột biến

Số gia đình M 2

p 1 = 0,90 p 1 = 0,99

10 -5 232.600 465.200

5.3 ĐA BỘI THỂ

5.3.1 Khái niệm và ý nghĩa đa bội trong chọn giống

Khái niệm: “ Đa bội thể là những sinh vật trong tế bào sinh dưỡng có

số lượng nhiễm sắc thể tăng theo bội số nguyên lần của bộ nhiễm

sắc thể đơn bội (từ 3n trở lên)”

- Một số dạng đa bội

Bảng 5.5 Đa bội ở một số loài cây trồng

Loài cây trồng Đơn bội (n) Đa bội

Họ cà 6 hoặc 12 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108

Cải bẹ 8, 9, 10 16, 18, 20

Đặc điểm dạng đa bội

Sinh trưởng, phát triển mạnh hơn nên khả năng thích ứng tốt như cây chuối

Thân lá to nên năng suất xanh cao

Bất dục đặc biệt dạng tam bội 3n Nhiều trường hợp bất dục hoàn toàn

Hàm lượng các chất cao như đường, methol bạc hà…

Những điểm hạn chế ở cây đa bội

Đa bội thể cao (6n, 8n…) có hiện tượng sinh trưởng phát triển không bình thường, cây thấp đi do tế bào dầy không phát triển chiều dài

Hiện tượng bất dục khó khăn đối với lấy hạt

Trong trường hợp nhân giống hữu tính, quá trình sản xuất hạt giống rất khó khăn

5.3.2 Phân loại đa bội thể

a) Đa bội cùng nguồn (autopoly ploidy)

Đa bội cùng nguồn hay còn được gọi là đồng nguyên đa bội, tự đa

bội là hiện tượng đa bội thể được tạo nên từ bộ nhiễm sắc thể giống

nhau của cùng một loài

- Tam bội - Autotriploidy (3x)

- Tứ bội - Autotetraploidy (4x)

- Ngũ bội - Autopentaploidy (5x)

- Lục bội - Autohexaploidy (6x)

b) Đa bội khác nguồn (Allopolyploidy)

- Tứ bội khác nguồn - Allotetraploidy (2x1+2x2)

- Lục bội khác nguồn - Allohexaploidy (2x1+2x2 + 2x3)

- Bát bội khác nguồn - Allooctaploidy (2x1+2x2 + 2x3 + 2x4)

Hình 5.17 Những con đường chủ yếu hình thành đa bội

c Đa bội lệch (aneuploid)

Đa bội lệch là sự thay đổi bộ NST không bằng bội số mà từng NST

riêng biệt

Công thức tổng quát: 2n ± x (x: số NST)

Đa bội lệch được phát hiện ở nhiều loài cây trồng: lúa mì, ngô, cà

chua, bông, thuốc lá…

Các dạng đa bội lệch dẫn tới biến dị dị hình, sức sống kém do mất

cân bằng bộ NST, không phân bào được nên bất dục, không hoặc ít

có giá trị trong chọn giống mà chỉ có thể sử dụng để xác định nhóm

gen liên kết

5.3.3 Phương pháp tạo đa bội thể

Nguyên tắc xử lý đa bội: xử lý đa bội có thể dùng tác nhân lí, hoá học tác động vào sơ thể sinh vật đặc biệt lúc tế bào đang phân chia dẫn đến phân chia không bình thường và hình thành đa bội

Các phương pháp xử lý

Phương pháp gây chấn thương: có hiệu quả nhất ở cây họ cà

Phương pháp thay đổi nhiệt độ đột ngột

Phương pháp hoá học: xử lý bằng chất colchicine, idol axetic axit, sunfamit

Phương pháp tạo đa bội thể bằng colchicine (C 22 H 25 NO 6 )

Colchicine là một chất hoá học được chiết từ cây (Colchicum

autumnale) có nhiều ở vùng Địa Trung Hải, colchicine dạng tinh thể,

màu trắng tan trong rượu và benzen, không tan trong nước

Nồng độ và thời gian xử lý tùy thuộc vào vật liệu và loài cây trồng,

nồng độ dao động từ 0,01 – 1,6%, thời gian xử lý từ 30 phút đến 10

giờ

Một số loài cây trồng khi xử lý có bổ sung thêm hóa chất khác như

DMSO (Dimethyl sulfoxide - (CH 3 ) 2 SO)

Khi xử lý trực tiếp lên đỉnh sinh trưởng của cây trên đồng ruộng thời

gian ngắn hơn và lặp lại một vài ngày

Sau khi xử lý phải rửa sạch bằng nước vô trùng 30 phút

Phương pháp xử lý tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể

Tiêm vào đỉnh sinh trưởng

Dùng bông thấm đặt lên đỉnh sinh trưởng cây con khi lá mầm mở

Nhúng đỉnh sinh trưởng hoặc đỉnh rễ vào dung dịch colchicine

Phun dung dịch colchicine lên đỉnh sinh trưởng của cây con

Tạo đa bội thể bằng lai

Các thể đa bội có thể tiến hành lai với nhau như lai giữa dạng tứ bội (4n) và nhị bội (2n) tạo ra dạng tam bội (3n)

Phương pháp này đã được áp dụng thành công ở một số loài cây trồng như dưa hấu tam bội, dâu tằm tam bội

Sử dụng các vật liệu đa bội theo các hướng sau:

Chọn lọc sử dụng trực tiếp

Tạo giống lai làm vật liệu cho các tổ hợp lai

Khắc phục hiện tượng bất dục trong lai xa

5.4 ĐƠN BỘI THỂ VÀ ĐƠN BỘI KÉP

5.4.1 Khái niệm

Đơn bội (Haploid) là thực vật có bộ nhiễm sắc thể n = 1 như một

giao tử đực là hạt phấn hoặc giao tử cái là tế bào trứng

Đơn bội kép (Double Haploid - DH) có bộ nhiễm sắc thể 2n giống hệt

nhau do nhân lên từ bộ NST đơn bội và có thể hình thành từ tế bào

trứng hoặc hạt phấn

Chawla (2002) khái niệm đơn bội kép (DH) là một kiểu gen được

được hình thành khi các tế bào đơn bội trải qua quá trình nhân đôi

nhiễm sắc thể

5.4.2 Giá trị của cây đơn bội và đơn bội kép

Để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng

Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro

Đến nay, số lượng các cây đơn bội của hơn 247 loài thuộc 88 chi

và 34 họ thực vật hạt kín đã được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

H.H Geiger và G.A Gordillo (2010) cho rằng tiến bộ chủ yếu của dòng DH trong chọn tạo giống ngô lai là

(i) biến di di truyền tối đa, (ii) đồng hợp hoàn toàn, (iii) nhanh thương mại, (iv) đơn giản, (v) giảm chi phí (vi) (vi) tối ưu cho ứng dụng marker

5.4.3 Phương pháp tạo đơn bội (Haploid) và đơn bội kép (DH)

Phương pháp 1: Tạo đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn

Một số kỹ thuật tạo đơn bội như:

Chiếu xạ hạt phấn

Trì hoãn thụ phấn

Sử dụng tế bào chất lạ hoặc tác nhân thụ phấn

Lai xa

Tạo đa phôi

Ghép cây con

Xử lý hóa chất

Các bước nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội:

Bước 1: Lựa chọn kiểu gen Bước 2: Trồng và chăm sóc cây cho phấn Bước 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Bước 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây Bước 6: Chuyển cây ra giá thể, ngoài đất và đánh giá chọn lọc dòng

Bước 1: Lựa chọn kiểu gen

Kiểu gen là dòng, giống thuần, giống thụ phấn tự do hoặc con lai

F 1 được chọn để trồng cây cho phấn

Bước lựa chọn kiểu gen rất quan trọng, quyết định khả năng nuôi

cấy thành công Kiểu gen của mỗi loài cây trồng phản ứng khác

nhau với nuôi cấy bao phấn

Nhiều nhà nghiên cứu khẳng định nuôi cấy bao phấn ở lúa (Ozyza

sativa L.) gặp khó khăn là khả năng tạo calus của hạt phấn rất thấp

và sai khác lớn khi tái sinh cây

Loài phụ Japonica khả năng tạo calus tốt hơn loài phụ Indica

Kết quả nuối cấy tạo ra cây đơn bội, cây lưỡng bội và cây tam bội,

sau nuôi cấy tiến hành đánh giá và chọn lọc cây đơn bội

Bước 2: Trồng và chăm sóc cây

Trồng và chăm sóc cây lấy bao phấn trong điều kiện phù hợp với loài,

trong một số trường hợp trồng trong nhà kính, nhà lưới và trong chậu vại

Bước 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy bao phấn trên môi trường MS cơ bản, một số loài cây trên môi trường N6 của Chu (1978)

Môi trường nuối cấy bao phấn nghiên cứu cải tiến phù hợp với mỗi loài cây trồng và kiểu gen

Ví dụ đối với lúa loài phụ Indica môi trường N6 bổ sung thêm galactose (0,1M), lactose (0,1M), nước dừa (5%), caseine hydrolisate (0,05% w/v), L-glutamine (1,3mM), biotin (2mM), ascorbic acid (2,8mM) và các chất điều tiết sinh trưởng

Loài phụ Japonica môi trường SK-I hiệu quả cao hơn

Môi trường MS bổ sung thêm 2,4D và BAP hiệu quả đối nuôi cấy bao phấn cây họ thập tự

Các nhà khoa học Úc cho rằng môi trường B5 + 2,4-D (2mg/l) + 9%

sucrose phù hợp cho cây họ đậu

Bước 4: Thu nụ hoa, khử trùng và tách bao phấn nuôi cấy

Thu nụ hoa giai đoạn hình thành tiểu bào tử đơn nhân (lúa khi

bông vẫn trong bẹ lá đòng, khoảng cách giữa lá đòng và tai lá cuối

cùng là 3cm)

Sau khi thu hoa, phương pháp nhuộm màu để xác định thời điểm

nuôi cấy phù hợp, một số hóa chất nhuộm màu sử dụng như iron -

alum haematoxylin nhuộm màu bao phấn lúa, DAPI (4,6 diamidino

2-phenylindol dichloride) với bao phấn cây họ cam quýt

Thu hoa khử trùng và bảo quản trong nhiệt độ thấp

Sau khi bảo quản, tách bao phấn ra khỏi hoa đưa vào môi trường

nuôi cấy trên đĩa petri

Số lượng nuôi cấy tùy theo loài, cơ sở vật chất Bình quân số lượng

bao phấn nuôi cấy trên mỗi đĩa petri khoảng 30 bao phấn, nuôi cấy

tổng số 100 bao phấn cho một kiểu gen

Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây

Môi trường nuôi cấy bao phấn dựa trên môi trường MS hoặc N6 cải tiến phù hợp với mỗi loài cây trồng và kiểu gen

Môi trường cải tiến thường bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng và hóa chất khác (xem bước chuẩn bị môi trường)

Điều kiện buồng nuôi cấy thường ở nhiệt độ 25 ± 1 o C, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ ánh sáng 1000lux (đối với lúa)

Một số loài cây trồng yêu cầu môi trường tạo calus và môi trường tái sinh cây khác nhau như: lúa sau khi tạo calus 3 tuần chuyển sang môi trường tái sinh cây là môi trường MS bổ sung thêm 1-2mg NAA (Naphthalene acetic acid), 4mg/l kinetin, 40mg/l adenine sulfat và 15%

CM

Điều kiện nuôi cấy giống như nuôi cấy tạo calus nhưng cường độ ánh sáng tăng lên 2000lux