Đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường típ 2 của cao chiết hạt cà phê xanh

Vì vậy, trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành để đánh giá tiềm năng của các hợp chất tự nhiên được tìm thấy từ cây cỏ để chữa bệnh béo phì và tiểu đườn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

- -

NGUYỄN THỊ TRANG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA

CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

- -

NGUYỄN THỊ TRANG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA

CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y

Người hướng dẫn 1: PGS.TS Bùi Thanh Tùng Người hướng dẫn 2: PGS.TS Vũ Mạnh Hùng

Hà Nội – 2020

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, tôi đã nhận

được sự hỗ trợ, giúp đỡ cũng như là quan tâm, động viên từ gia đình, bạn bè và

toàn thể thầy cô trong khoa Nghiên cứu khoa học cũng được hoàn thành dựa

trên sự tham khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liên quan,

các sách, báo chuyên ngành của nhiều tác giả ở các cơ quan, các tổ chức nghiên

cứu, tổ chức chính trị của Việt Nam và các nước khác trên thế giới…Đặc biệt

hơn nữa là sự hỗ trợ của cán bộ giảng viên các trường đại học và sự giúp đỡ,

tạo điều kiện về vật chất và tinh thần từ phía gia đình, bạn bè và các đồng

nghiệp

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy đã hướng dẫn tôi trong

khóa luận này là PGS.TS Bùi Thanh Tùng và PGS.TS Vũ Mạnh Hùng và

các thầy cô trong Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược Các thầy

cô là người trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, công

sức hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề

tài nghiên cứu khoa học Thầy cô cũng là người luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo

những kĩ năng, kiến thức không chỉ trong khóa luận này mà còn định hướng

cho tôi trên con đường tương lai sắp tới, giúp tôi vững tin trên con đường phía

trước

Tôi xin trân trọng cám ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược cùng toàn thể

các thầy cô giáo công tác trong khoa đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý

báu, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tuy có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học này không

tránh khỏi những thiếu sót Em kính mong quý thầy cô, các chuyên gia, những

người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè tiếp tục có những

ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn

Một lần nữa em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

Chương I: TỔNG QUAN 2

1 Bệnh tiểu đường 2

1.1 Khái niệm 2

1.2 Phân loại 2

1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2 3

1.3.1 Thừa cân và béo phì 3

1.3.2 Tuổi 3

1.3.3 Tiền sử gia đình 4

1.3.4 Yếu tố gen 4

1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực 4

1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 4

1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường 6

1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường 6

1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 6

1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 7

1.7 Dịch tễ học 7

2 Mô hình gây tiểu đường 8

2.1 Tác nhân hóa học 9

2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường 12

2.3 Tiểu đường do di truyền 12

3 Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym α-glucosidase 12

3.1 Enzym và chất ức chế enzym 12

3.2 Enzym α–glucosidase 13

3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase 14

4 Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 16

4.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể 16

4.2 Cơ chế chống oxy hóa 17

4.3 Các chất chống oxy hóa 17

4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 19

5 Quan niệm về tiểu đường của đông y 21

6 Cây cà phê vối (Coffea canephora )– hạt cà phê xanh 22

6.1 Cây cà phê vối (Coffea canephora ) 22

6.2 Đặc điểm thực vật và phân bố cây cà phê vối 23

Đặc điểm thực vật của cây cà phê vối 23

6.3 Thành phần hóa học của hạt cà phê 24

6.4 Tác dụng dược lý 26

Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

1 Đối tượng nghiên cứu 28

1.1 Mẫu nghiên cứu 28

1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 29

1.3 Động vật thí nghiệm 29

2 Phương tiện nghiên cứu 30

2.1 Hóa chất và thuốc thử 30

2.2 Thiết bị và dụng cụ 30

3 Phương pháp nghiên cứu 31

3.1 Xây dựng mô hình chuột tiểu đường típ 2 31

3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết hạt cà phê xanh 32

3.3 Đánh giá tác tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH 33

3.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh 35

4 Phương pháp xử lý số liệu 36

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

1 Kết quả 37

1.1 Quy trình chiết, tách hạt cà phê xanh bằng ethanol 37

1.2 Xây dựng mô hình tiểu đường típ 2 thực nghiệm 37

1.3 Tác dụng của cao chiết hạt cà phê xanh trên chuột nhắt thực nghiệm 38 1.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH 41

1.5 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh 42

2 Bàn luận 44

Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47

1 Kết Luận 47

2 Đề Xuất 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl DMSO Dimethyl sulfoxid

EtOAc Ethyl Acetate EtOH Ethanol FDA Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ HPTLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC 50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)

IU Đơn vị quốc tế (Interational Unit) mTOR Mammalian target of the rapamycin n-BuOH n-buthanol

RNS Nitrogen hoạt tính

ROS Oxy hoạt tính

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường 6

Hình 1 3 Công thức hóa học của Streptozocin 9

Hình 1 4 Công thức hóa học của Alloxan 10

Hình 1 5 Công thức hóa học của Acarbose 14

Hình 1 6 Cây cà phê vối (Coffea canephora) 23

Hình 1 7 Cấu trúc phân tử của acid clorogenic 25

Hình 1 8 Cấu trúc phân tử của Cafein 25

Hình 2 1 Cây cà phê vối (Coffea canephora) 28

Hình 2 2 Hạt cà phê vối (Coffea canephora) 28

Hình 2 3 Chuột nhắt trắng chủng Swiss 29

Hình 2 4 Chuột được tiêm màng bụng Alloxan monohydrate 31

Hình 3 1 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết toàn phần, các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit ascorbic 41

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Các chất tự nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α – glucosidase 15Bảng 1 2 Các chất chống oxy hóa nội sinh 18Bảng 1 3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 20

Bảng 1 4 Các chất thơm trong cà phê rang Coffea canephora và Coffea

arabica 26

Bảng 3 1 Sự thay đổi nồng độ glucose huyết trước và sau 72 giờ tiêm

Alloxan 38Bảng 3 2 Chỉ số đường huyết của chuột tiểu đường do Alloxan gây ra trước

và trong 28 ngày điều trị bằng thuốc và cao chiết hạt cà phê 39Bảng 3 3 Trọng lượng của chuột trước và sau 28 ngày điều trị 40Bảng 3 4 Giá trị IC50 của cao chiết toàn phần và các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit Ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH 42Bảng 3 5 Kết quả IC50 của cao chiết của hạt cà phê xanh và Acarbose 42

MỞ ĐẦU

Ngày nay, bệnh tiểu đường hay còn gọi là tiểu đường ngày càng phổ biến

và có sự gia tăng về tỉ lệ và mức độ ảnh hưởng đến sức khỏe Tiểu đường là một trong những nguyên nhân gây tử vong và gây ra các biến chứng bệnh trầm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh Mặc dù

đã có những tiến bộ đáng kể trong điều trị bệnh tiểu đường bằng các thuốc đường uống nhưng việc tìm kiếm các loại thuốc mới vẫn tiếp tục vì những hạn chế do các tác dụng bất lợi và chi phí điều trị của các thuốc đang được sử dụng [60]

Ở Việt Nam, các bệnh nhân mắc bệnh mãn tính thường có xu hướng sử dụng các loại thuốc Đông Y hoặc thuốc Y học cổ truyền có nguồn gốc từ tự nhiên

do độc tính thấp, rẻ tiền và sẵn có của chúng để giảm bớt các gánh nặng về kinh

tế khi sử dụng các thuốc tân dược[40] Vì vậy, trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành để đánh giá tiềm năng của các hợp chất tự nhiên được tìm thấy từ cây cỏ để chữa bệnh béo phì và tiểu đường mà ít gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng của thuốc có hiệu quả trong thời gian kéo dài điển hình như: Thân cây Ý dĩ, thân cây Mướp đắng, quả cây Chuối hột [14], [18], [21] Các nghiên cứu này đã cho thấy kết quả khả quan, có thể dần dần đưa vào sử dụng lâm sàng [4]

Cây cà phê là loài cây công nghiệp khá phổ biến ở nước ta, được trồng nhiều ở vùng Tây Nguyên Trong đó, 3 loài cà phê được trồng nhiều nhất ở nước

ta là cà phê chè (coffea arabica), cà phê vối (coffea canephora), cà phê mít (coffea

excels) Loài được trồng nhiều, cho năng suất cao là cà phê vối (coffea canephora)

Cây cà phê là loài cây thân gỗ hoặc cây bụi chứa nhiều thành phần có tác dụng điều trị nhiều bệnh Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng cây cà phê có tác dụng trên tim mạch, thần kinh, hô hấp… Nhưng qua tìm hiểu thì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa, hạ đường huyết của hạt cà phê xanh để phục vụ cho việc phát triển thành sản phẩm có tác dụng hỗ trợ điều trị

bệnh tiểu đường Do đó, đề tài nghiên cứu khoa học: “Đánh giá tác dụng hỗ trợ

điều trị bệnh tiểu đường type 2 của cao chiết hạt cà phê xanh (Coffea canephora)” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết hạt cà phê xanh

trên mô hình in vivo của chuột nhắt bị tiểu đường bằng Alloxan

2 Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro theo phương pháp DPPH

Chương I: TỔNG QUAN

1 Bệnh tiểu đường

1.1 Khái niệm

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) “Tiểu đường là một rối loạn chuyển hóa

do rất nhiều nguyên nhân, được mô tả là sự tăng đường huyết mạn tính cùng với rối loạn chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein, nó là hậu quả của sự suy giảm tiết insulin và giảm hoạt tính insulin” [57]

Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái Tháo Đường Hoa Kỳ năm 2019 (American Diabetes Association - ADA): “Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng bởi sự tăng đường huyết, gây ra bởi sự giảm tiết insulin và/hoặc giảm hoạt tính của insulin Sự tăng đường huyết mạn tính dẫn đến những tác hại lâu dài, rối loạn hoặc suy yếu chức năng các cơ quan đặc biệt là mắt, thận, hệ thần kinh, tim và mạch máu” [30]

Theo hướng dẫn của bộ y tế Việt Nam: “Bệnh tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrat, protid, lipid, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh” [7]

Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa của cơ thể, đặc trưng bởi sự tăng glucose trong máu Bệnh gây ra nhiều biến chứng phức tạp trên nhiều bộ phận của

cơ thể

1.2 Phân loại

Tiểu đường nguyên phát [2], [6], [7], [30]

- Tiểu đường típ 1: do phá hủy tế bào β đảo tụy, thường dẫn đến sự thiếu insulin tuyệt đối

- Tiểu đường típ 2: do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin

- Tiểu đường thai kỳ: được chẩn đoán trong khoảng từ tháng thứ ba đến tháng thứ chín của thai kỳ và được phát hiện lần đầu trong lúc mang thai

Tiểu đường thứ phát:

Bệnh tiểu đường do các nguyên nhân khác: giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen; bệnh nội tiết; tăng đường huyết do thuốc và hóa chất như sử

1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2

Bệnh tiểu đường típ 2 hay còn gọi là tiểu đường không phụ thuộc insulin thường thấy ở người trên 40 tuổi và có thể trạng béo Bệnh tiểu đường típ 2 là một rối loạn mạn tính mà nguyên nhân được cho là do có sự tương tác giữ yếu tố gen

và yếu tố môi trường [24]

1.3.1 Thừa cân và béo phì

Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m2) và béo phì (BMI >30 kg/m2) trên thế giới đã được dự đoán là sẽ tăng lên 57% vào năm 2030 Thừa cân và béo phì dẫn tới viêm, tăng tiết từ mô mỡ các hoạt chất nhóm adipocytokyne Tất cả những hiện tượng này đều có vai trò gây ra kháng insulin ở gan, mô cơ và làm tăng nguy cơ dẫn đến bệnh tiểu đường [58] Theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới, đối với người châu Á, BMI từ 23-25 kg/m2 là thừa cân

và trên 25 kg/m2 là béo phì [24]

Đặc điểm của đa số bệnh nhân tiểu đường ở Việt Nam thường có BMI bình thường nhưng lượng mỡ của cơ thể thường cao, đặc biệt là ở phụ nữ [36] Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy những người có BMI > 23 kg/m2 thì có nguy cơ mắc tiểu đường typ 2 cao gấp 2,89 lần so với người bình thường

1.3.2 Tuổi

Nguy cơ tiểu đường tăng cùng với tuổi do tăng tính kháng insulin liên quan tới béo phì và tình trạng ít vận động Cùng với thời gian, các tế bào β suy yếu do chúng phải tăng tiết insulin để bù đắp cho sự tăng mức độ kháng insulin của cơ thể Ở châu Á, tỷ lệ này cao ở người trẻ tuổi và trung niên (độ tuổi lao động sản xuất chính của xã hội) Điều này gây nên gánh nặng lớn cho các nước Châu Á mà trong đó chủ yếu là những nước đang phát triển và kém phát triển [55]

Tại Việt nam, nghiên cứu dịch tễ bệnh tiểu đường tại 4 thành phố lớn thực hiện năm 2003 cho kết quả tỷ lệ mắc tiểu đường ở nhóm người dưới 35 tuổi là 0,9% còn ở nhóm người 45-54 tuổi là 6,5% và ở nhóm người 55-64 tuổi là 10,3%

Nghiên cứu này cũng chứng minh rằng tuổi cao là một yếu tố nguy cơ đặc biệt, có liên quan chặt chẽ đến bệnh tiểu đường

1.3.3 Tiền sử gia đình

Tiền sử gia đình là một yếu tố quan trọng liên quan tới bệnh tiểu đường, điều này thể hiện cho vai trò của yếu tố di truyền đối với nguy cơ mắc bệnh Những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao nếu có ít nhất 1 người trong gia đình bị bệnh Theo một nghiên cứu của Tạ Văn Bình và cộng sự, tiền sử gia đình có bố mẹ hoặc con ruột, anh, chị, em ruột bị mắc tiểu đường thì có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 3,28 lần so với nhóm bình thường không có người thân trong gia đình mắc bệnh tiểu đường [36]

1.3.4 Yếu tố gen

Nghiên cứu ở các cặp sinh đôi đã cung cấp những bằng chứng thuyết phục

về những ảnh hưởng của yếu tố di truyền đối với bệnh tiểu đường Các cặp sinh đôi cùng trứng có tỷ lệ tương đồng cao hơn so với các cặp sinh đôi khác trứng Sự tương đồng về nguy cơ mắc tiểu đường típ 2 ở người sinh đôi cùng trứng từ 34-83% và ở người sinh đôi khác trứng là 16-40% [57]

1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực

Chế độ dinh dưỡng và luyện tập phù hợp là chìa khóa để chống lại trình trạng béo phì và cao huyết áp, tăng hoạt động của insulin và giảm sự tạo glucogen

ở gan Hoạt động thể lực có vai trò đặc biệt quan trọng đối với bệnh tiểu đường típ 2 Nhóm đối tượng ít vận động (<30 phút/ ngày) có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường cao gấp 2,4 lần so với nhóm hoạt động nhiều Nhiều nghiên cứu đã có thấy rằng việc vận động thể lực thường xuyên có tác dụng làm giảm nồng độ glucose máu đồng thời giúp duy trì sự ổn định của lipid máu, huyết áp và giúp cải thiện tinh thần Sự phối hợp các hoạt động thể lực và điều chỉnh chế độ ăn phù hợp có thể giúp giảm 58% tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường típ 2 [58]

1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2

Tiểu đường típ 2 là dạng tiểu đường thường gặp nhất, chiếm khoảng 80 - 90% trong số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường Thông thường, với bệnh tiểu đường típ 2, trong cơ thể vẫn còn khả năng sản xuất insulin, nhưng insulin được sản xuất

ra không đủ hoặc các tế bào không thể sử dụng nó và được gọi là kháng insulin [30]

Có hai yếu tố cơ bản đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 là đề kháng với insulin và suy giảm chức năng tiết insulin kết hợp với nhau [30]

Glucose đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng chính cho các tế bào trong cơ thể Tuy nhiên để có thể nhận được glucose các tế bào phải cần đến insulin hoạt động như một “chiếc chìa khóa” giúp glucose có thể vào được tế bào Kháng insulin có thể xảy ra ở gan và các mô ngoại vi theo các hình thức sau: giảm sử dụng glucose ở các cơ quan, giảm thu nhận glucose ở mô ngoại vi và khả năng ức chế sản xuất glucogen ở gan bị giảm Thừa cân và béo phì là những yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin, trong đó béo phì thường là do cơ thể hấp thu quá nhiều chất béo nhưng lại ít vận động Axit béo tự do có nhiều ở những người bệnh béo phì sẽ cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân dẫn đến

sự rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên và gây nên tình trạng đề kháng insulin [14]

Khi cơ thể có hiện tượng kháng insulin, nồng độ glucose trong máu sẽ tăng cao hơn mức bình thường Tế bào β đảo tụy lại đáp ứng bằng cách sản xuất nhiều hơn insulin Quá trình này diễn ra kéo dài sẽ dẫn đến chức năng của tế bào β bị suy giảm Ngoài ra khi cả axit béo tự do và insulin đều tăng, quá trình chuyển hóa

sẽ tăng lên tại ty thể, làm gia tăng các gốc tự do dẫn đến gia tăng tình trạng viêm Thêm vào đó, insulin trong máu cao còn gây hiện tượng stress lưới nội chất Cả hai tình trạng này đều dẫn đến kết quả là tế bào sẽ chết theo chu trình Hậu quả là

tế bào β giảm tiết insulin Khi nồng độ insulin ở tế bào cửa gan thấp, gan đáp ứng bằng cách giải phóng glucose vào máu trong khi nồng độ glucose đã cao sẵn sau bữa ăn Ngoài ra ở tế bào cơ vân, nồng độ insulin thấp làm glucose ít vào tế bào, góp phần dẫn đến glucose trong máu cao Trong giai đoạn này, nồng độ insulin thấp do tụy ít sản xuất và bài tiết insulin kèm theo tình trạng kháng insulin làm khả năng kiểm soát nồng độ glucose ngày càng xấu đi và có thể gây nên nhiều biến chứng nghiêm trọng cho người bệnh [14]

1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường nếu không được điều trị tốt và quá trình điều trị không chặt chẽ sẽ gây ra các biến chứng nguy hiểm và các bệnh mạn tính, cấp tính kèm theo Một số biến chứng cấp tính giai đoạn đầu của tiểu đường như: Nhiễm toan ceton – thường xảy ra với tiểu đường típ 2, hạ đường huyết – thường gặp bệnh nhân dùng thuốc hạ đường huyết quá liều hoặc dùng thuốc trong lúc đói bỏ bữa, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu Một số biến chứng mãn tính như: Biến chứng mạch máu lớn (bệnh mạch vành, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, ), các bệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý võng mạc, bệnh lý thận, bệnh lý thần kinh,.)[2], [6] Hậu quả để lại nặng nề, gây ra gánh nặng cho người bệnh và gia đình người bệnh

Hình 1 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường

1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường

1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 [2], [26]

Do tế bào β tuyến tụy bị phá hủy bởi chất trung gian miễn dịch nên cơ thể không có khả năng tạo ra insulin Do đó, bệnh nhân phải tiêm insulin thường xuyên trong suốt cuộc đời để bổ xung đủ lượng insulin cho cơ thể

1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 [2], [26]

Thuốc điều trị đối với nhóm đối tượng này được chia làm 3 nhóm chính:

- Nhóm thuốc kích thích tụy bài tiết insulin như nhóm sulphonylurea: gliclazid, glibenclamid, glimepiride…

- Nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm insulin ở ngoại vi, giảm đề kháng insulin như nhóm biguanide: metformin (thuốc duy nhất được sử dụng thuộc nhóm này); nhóm thiazolidinedion

- Thuốc ức chế enzym α-glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol làm hấp thu chậm glucose từ ruột vào máu

Đối với bệnh nhân tiểu đường típ 2, ngoài uống thuốc điều trị cần phải kết hợp với chế độ ăn, vận động thể lực hợp lí để điều trị đạt hiệu quả tốt nhất Chế

độ ăn lành mạnh là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh tiểu đường, cần lựa chọn các loại thực phẩm có nhiều chất xơ, ăn nhiều đạm có nguồn gốc thực vật, ăn nhiều trái cây, ít chất béo Chế độ tập luyện thường xuyên sẽ giúp cải thiện sức khỏe, giúp chống lại bệnh tật nhất là các bệnh về tim mạch, xương khớp Vận động thường xuyên giúp tăng cường sức khỏe, giảm cân và giảm đường huyết nên được coi là một biện pháp quan trọng trong điều trị bệnh tiểu đường [58] Hơn nữa, mỗi đối tượng cụ thể sẽ có bệnh lý kèm theo cũng như thể trạng khác nhau nên việc kết hợp các thuốc trong nhóm với nhau nhằm giảm đường huyết hữu hiệu

1.7 Dịch tễ học

Bệnh tiểu đường là căn bệnh rối loạn chuyển hóa hay gặp ở các nước phát triển và đang phát triển gây ra các gánh nặng về tài chính, y tế, xã hội nghiêm trọng Bệnh gây ra các biến chứng nguy hiểm liên quan mật thiết với nhau, là nguyên nhân hàng đầu về các bệnh tim mạch, cụt chi, mù lòa, suy thận

Tiểu đường trở thành bệnh lý đáng báo động nhất trên toàn thế giới từ những năm đầu của thế kỷ 21 Theo cuộc điều tra của Liên đoàn Tiểu đường Thế giới (International Diabetes Federation - IDF): năm 2015 toàn thế giới có 415 triệu người (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh tiểu đường (tiểu đường), tương đương cứ 11 người có 1 người bị tiểu đường Năm 2017 dân số thế giới là 7,5 tỷ người trong

đó có 425 triệu người (trong độ tuổi 20 - 79) bị bệnh tiểu đường Dự tính đến năm

2040 con số này sẽ là 642 triệu, tương đương cứ 10 người có 1 người bị tiểu đường [8] và đến năm 2045 con số này sẽ là 629 triệu; đặc biệt trong hai người trưởng thành (trong độ tuổi 20 - 79) bị tiểu đường thì có một người không được chẩn đoán Đông Nam Á có số người trưởng thành bị tiểu đường cao thứ hai trong các vùng theo IDF, chiếm tỷ lệ 8,5% tổng số người bị tiểu đường trên thế giới, trong

đó khoảng 45,8% các trường hợp bị tiểu đường không được chẩn đoán và gần 48,8% người trưởng thành mắc bệnh tiểu đường sống ở các thành phố [42]

Tại Việt Nam, trong kết quả công bố của “Dự án phòng chống tiểu đường quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện năm 2012 trên 11000 người trong độ tuổi 30 - 69 sống tại 6 vùng miền gồm: miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ

đã cho thấy tỷ lệ hiện mắc tiểu đường trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5,42%, tăng gấp gần hai lần so với tỷ lệ tiểu đường năm 2012 là 2,7% Ngoài ra,

tỷ lệ tiểu đường chưa được chẩn đoán trong cộng đồng lên tới 63,6% [3] Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose trong cả nước là 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đói 1,9% (năm 2003) Theo kết quả điều tra của Bộ Y tế, hiệp hội Nội tiết – Tiểu đường Việt Nam, nước ta hiện có hơn 3,16 triệu người mắc bệnh tiểu đường Tỷ lệ này đang chiếm hơn 5% dân số trưởng thành trong độ tuổi 20-79 Và tỷ lệ người mắc bệnh tiểu đường ngày càng trẻ hoá Nhưng một điều đáng mừng là có tới 70% trường hợp tiểu đường típ 2 có thể dự phòng hoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực [8]

2 Mô hình gây tiểu đường

Thử nghiệm tiểu đường trên mô hình động vật là điều cần thiết để nâng cao nhận thức và hiểu biết về các khía cạnh khác nhau của cơ chế bệnh sinh từ đó tìm

ra các liệu pháp và các phương pháp điều trị mới Hầu hết các mô hình hiện nay đều sử dụng động vật gặm nhấm làm đối tượng thí nghiệm do nhiều ưu điểm của chúng như kích thước nhỏ, khoảng cách thế hệ ngắn, tính sẵn có và chi phí thấp Bệnh tiểu đường thực nghiệm thường được gây ra ở động vật thí nghiệm bằng các phương pháp phổ biến như: tác nhân hóa học, phẫu thuật, di truyền [45]

2.1 Tác nhân hóa học

Các tác nhân hóa học gây ra tiểu đường có thể phân thành ba loại: phá hủy

tế bào β đảo tụy, gây ức chế tạm thời việc sản xuất và/hoặc tiết insulin, làm giảm chuyển hóa insulin trong mô đích

Streptozocin (STZ 61%) và Alloxan (31%) cho đến nay là những thuốc được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về bệnh tiểu đường và giúp ích cho nghiên cứu nhiều khía cạnh của bệnh Các loại thuốc này có thể được đưa vào cơ thể bằng cách tiêm tĩnh mạch, tiêm màng bụng hoặc tiêm dưới da Liều cần thiết

để gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc vào loại động vật, đường dùng thuốc và tình trạng dinh dưỡng Tùy theo liều dùng của các thuốc này mà các hội chứng tương

tự như tiểu đường típ 1, tiểu đường típ 2 hoặc không dung nạp glucose có thể được gây ra Tác dụng gây độc tế bào của các loại thuốc này đều qua trung gian là các phản ứng oxy hóa nhưng chúng có sự khác nhau về cơ chế hoạt động [45]

 Streptozotocin

Streptozotocin (STZ) là chất hóa học thuộc nhóm hợp chất glucosamine

năm 1967 STZ tồn tại trong tự nhiên, chúng có khả năng gây độc đặc hiệu với tế bào β sản xuất insulin của tuyến tụy ở động vật có vú STZ được phát hiện có trong một chủng vi khuẩn có tên là Streptomyces achromogenes vào những năm 50 của thế kỷ 20, hiện nay STZ đang được sử dụng trong y tế để điều trị một số ung thư trên đảo tụy Langerhan và là chất gây tiểu đường được sử dụng phổ biến nhất và

có hiệu quả trên các mô hình động vật thực nghiệm, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu y học [56]

Hình 1 2 Công thức hóa học của Streptozocin

STZ xâm nhập vào tế bào β đảo tụy thông qua chất vật chuyển glucose - GLUT2 và gây ra sự alkyl hóa axit deoxyribonucleic (DNA) Ngoài ra, STZ còn gây kích hoạt sự ribosyl hóa poly adenosin diphosphat và giải phóng nitric oxid Kết quả là tế bào tụy bị phá hủy do hoại tử [45]

Sử dụng STZ trong mô hình bằng nhiều phương pháp:

- STZ cho chuột mới sinh: Mô hình tiêm STZ cho chuột mới sinh (với sự thay đổi liều và ngày tiêm STZ) biểu hiện các giai đoạn khác nhau của tiểu đường típ 2 như làm giảm dung nạp glucose, glucose máu giảm nhẹ/ trung bình/ nặng Các tế bào β ở chuột mới sinh tiêm STZ có sự tương đồng về đặc điểm bài tiết insulin ở bệnh nhân tiểu đường típ 2 [31], [61]

- Kết hợp Nicotinamid - Streptozocin (NAD - STZ): Nicotinamid là một chất chống oxy hóa có tác dụng bảo vệ bằng cách làm sạch các gốc tự do và do đó bảo vệ được một phần tế bào β khỏi tác động gây độc tế bào của STZ [52]

Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành tiêm thuốc mà có thể gây

mô hình động vật tiểu đường típ 1 hoặc tiểu đường típ 2 Liều trên chuột nhắt dao động từ 100 - 150 mg/kg [29], trên chuột cống dao động từ 40 - 100 mg/kg [28]

Một vấn đề khi sử dụng STZ là tác dụng độc hại của nó không giới hạn ở tuyến tụy vì nó có thể gây tổn thương thận, gây viêm và rối loạn chức năng nội

mô

 Alloxan

Alloxan, đôi khi được gọi là alloxan hydrate; 2,4,5,6-Tetraoxypyrimidine; 2,4,5,6-pỷimidinetetrone; Axit 5,5-dihydroxybarbituric Nó là dẫn xuất của axit uric, không bền ở pH trung tính, khá ổn định ở pH=3

Hình 1 3 Công thức hóa học của Alloxan

Alloxan cũng giống như streptozotocin là những hóa chất gây tiểu đường nổi bật nhất trong nghiên cứu bệnh tiểu đường Cả hai đều là chất tương tự glucose gây độc tế bào Mặc dù độc tính tế bào của chúng đạt được thông qua các con đường khác nhau, cơ chế hoạt động chọn lọc tế bào β của chúng là giống hệt nhau

Alloxan tác động trên tế bào qua bốn giai đoạn [54]:

Giai đoạn thứ nhất: hạ đường huyết thoáng qua đầu tiên lên đến 30 phút bắt đầu trong vòng vài phút sau khi tiêm Alloxan Phản ứng hạ đường huyết trong thời gian ngắn này là kết quả của sự kích thích thoáng qua bài tiết insulin, được ghi nhận bằng sự gia tăng nồng độ insulin trong huyết tương Cơ chế cơ bản của chúng

là giảm tiêu thụ tạm thời và tăng khả năng tiêu thụ ATP do ức chế quá trình phosphoryl hóa glucose thông qua ức chế glucokinase Giai đoạn hạ đường huyết thoáng qua ban đầu này không được quan sát khi gây mô hình tiểu đường bằng streptozotocin, vì streptozotocin không ức chế glucokinase Sự thay đổi hình thái

là tối thiểu trong giai đoạn này

Giai đoạn thứ hai bắt đầu với sự gia tăng nồng độ glucose trong máu, 1 giờ sau khi tiêm alloxan và giảm insulin huyết tương Giai đoạn tăng đường huyết này, thường kéo dài 2 - 4 giờ, được gây ra bởi sự ức chế bài tiết insulin dẫn đến hạ đường huyết Trong giai đoạn này, các tế bào β cho thấy các đặc điểm hình thái thay đổi như: không bào nội bào, giãn màng lưới nội chất thô, giảm diện tích Golgi, giảm bài tiết và hàm lượng insulin, ty thể bị sưng…

Giai đoạn thứ ba, một lần nữa là giai đoạn hạ đường huyết, thường xảy ra sau khi tiêm alloxan và kéo dài vài giờ Nó có thể gây co giật và thậm chí có thể gây tử vong nếu không sử dụng glucose, đặc biệt là khi glycogen ở gan bị cạn kiệt

do đói Sự hạ đường huyết nghiêm trọng này được tạo ra do lưu thông insulin (kết quả của việc tiết ra chất độc làm vỡ màng tế bào) Ngoài những thay đổi về hình thái được thấy trong giai đoạn đầu tiên, các nhân tế bào β có hình chóp và không

có màu dương tính với TUNEL

Giai đoạn thứ tư là giai đoạn tăng đường huyết vĩnh viễn Sự thoái hóa hoàn toàn và mất tính toàn vẹn của tế bào β được nhìn thấy trong 48-72 giờ sau khi tiêm Alloxan Các tế bào khác vẫn còn nguyên vẹn, thể hiện tính chất chọn lọc tế bào

β Các mảnh vụn tế bào có nguồn gốc từ các tế bào β bị phá hủy được loại bỏ bởi các đại thực bào

2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường

Phương pháp này bao gồm cắt bỏ hoàn toàn hoặc một phần tụy để gây tiểu đường típ 1 hoặc típ 2 Trong lịch sử, mô hình mắc bệnh tiểu đường ở chó được Oskar Minkowski phát hiện thông qua phẫu thuật cắt bỏ tụy được coi là mô hình động vật đầu tiên về bệnh tiểu đường [51] Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng mô hình này để thử nghiệm các sản phẩm tự nhiên trên chuột, chó, linh trưởng [48], [77]

2.3 Tiểu đường do di truyền

Các động vật mắc bệnh tiểu đường típ 2 có thể được lấy từ việc chọn giống (các động vật có một hoặc một số gen đột biến được truyền từ thế hệ này sang thế

hệ khác) hoặc từ lai tạo chuột ob không bị tiểu đường bằng nhân giống lặp đi lặp lại qua nhiều thế hệ với chuột BB, chuột tiểu đường béo phì Tsumara Suzuki Những động vật này bị tiểu đường là do di truyền hoặc do khiếm khuyết đơn hoặc

đa gen (chuột KK, chuột db/db hoặc chuột béo Zucker) Bệnh tiểu đường típ 2 ở người phần lớn là kết quả của sự tương tác giữa môi trường và sự khiếm khuyết

đa gen Do đó, động vật khiếm khuyết đa gen sẽ gần giống với người hơn động vật khiếm khuyết đơn gen [71]

3 Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym glucosidase

α-3.1 Enzym và chất ức chế enzym

Enzym là chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào sinh vật có cấu trúc đặc thù và có thành phần cơ bản là protein Trong tế bào sinh vật luôn xảy ra quá trình trao đổi chất, nhờ có enzym mà nhiều phản ứng hóa học xảy ra nhanh chóng với hiệu suất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH Các phân tử tham gia vào ngay lúc đầu của quá trình phản ứng được gọi là chất nền và enzym biến đổi chất nền thành các phân tử khác Chúng có thể được thu nhận từ các cơ thể sống khác nhau của động vật, thực vật và vi sinh vật [27] Enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc rất cao đối với các chất nền của nó [19] Vì vậy trong cơ thể sinh vật enzym có chức năng xúc tác chọn lọc, đóng vai trò định hướng tất cả các phản ứng xảy ra trong tế bào Khi ở ngoài tế bào, nhiều enzym vẫn có khả năng hoạt động tương tự [75]

Chất ức chế enzym là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzym Các chất ức chế enzym có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là các cation, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ hoặc thậm chí là các protein Chất ức chế có thể có phản ứng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch với enzym Thông thường được phân chia thành hai loại ức chế thuận nghịch là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh [76]

Đối với chất ức chế cạnh tranh: chất kìm hãm có cấu trúc tương tự cơ chất, gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzym, gây giảm chức năng xúc tác của enzym

Đối với chất ức chế không cạnh tranh: chất kìm hãm gắn thuận nghịch vào

vị trí khác trên enzym (vị trí dị lập thể) chứ không gắn vào vị trí xúc tác và làm thay đổi cấu hình vị trí hoạt động của enzym khiến chúng không phù hợp để cơ chất gắn vào Dù theo hình thức ức chế nào thì khi chất kìm hãm được giải phóng, hoạt động xúc tác của enzym sẽ bình thường trở lại [19]

3.2 Enzym α–glucosidase

Enzym α-glucosidase có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase,

glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzym làm gẫy các liên kết bằng thủy phân) [64]

Enzym α-glucosidase là enzym 1 thành phần, có hoạt tính exohydrolysis, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbonhydrate để giải phóng phân tử α-D-glucose Chất nền đặc trưng của enzym này là các disaccharide, oligosaccharide, các aryl và akyl- α-glucosidase khác [74]

Enzym α-glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycoside hydrolase – là một lớp các enzym thường tách liên kết glycoside giữa 2 phân tử carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer

tự nhiên Các enzym này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh hơn

10-17 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác [34]

Nguồn gốc, phân bố: Enzym α-glucosidase được tìm thấy trên màng bề mặt của đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa [10]

 Cơ chế hoạt động

Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp đường cho cơ thể Sau khi vào cơ thể, chúng được thủy phân thành những phân tử đường đơn bởi những enzym trong ruột non và các phân tử đường này được đưa đến các

cơ quan, các tế bào ở khắp cơ thể [80]

Nguồn carbohydrat này sau khi vào cơ thể sẽ được các enzym ở tụy amylase) và ruột non (α-glucosidase) tiết ra, thủy phân thành những phân tử đường đơn rồi thẩm thấu vào máu Enzym α-glucosidase có chức năng xúc tác việc cắt đứt các liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng α-D-glucose [80]

(α-Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase có thể làm giảm

sự thủy phân của carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu [34]

3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase

Một số chất tổng hợp được sử dụng để ức chế hoạt động của enzym này được được sử dụng rộng rãi như Acarbose, Miglitol, Voglibose …[2] Các chất này được sử dụng như một thuốc giúp điều trị tiểu đường típ 2, chúng ức chế các enzym α-glucosidase ở ruột Acarbose là một tetrasaccharid, ít hấp thụ ở đường tiêu hóa và ức chế cạnh tranh với enzym α-glucosidase ở ruột non [26] có tác dụng chống tăng đường huyết sau ăn và không làm tăng tiết insulin, không làm hạ đường huyết Tuy nhiên, Acarbose có tác dụng phụ thường gặp trên đường tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng, tiêu chảy, buồn nôn… nhất là khi ăn đường mía và thực phẩm có đường do carbohydrate không được hấp thu và lên men ở đại tràng [26]

Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase rất cần thiết để giúp quá trình điều trị tiểu đường típ 2 có nhiều lựa chọn phù hợp

Hình 1 4 Công thức hóa học của Acarbose

Ngoài các chất được tổng hợp hóa học thì trong tự nhiên cũng có nhiều chất

có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase như: flavonoid, anthocyanidin, isoflavone, phenolic, curcuminoids, terpinoid,… trong khi các chất hóa học được tổng hợp để sử dụng gây ra nhiều tác dụng phụ cho người dùng thì việc tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng tương tự là rất cần thiết và được quan tâm trên toàn thế giới [80]

Bảng 1 1 Các chất tự nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α – glucosidase

Luteolin, Apigennin, Hesperetin, Cyaniding-3-galactoside,

2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4-dihydroxypyrrolidine, 1-deoxynojirimycin…

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O- α-larabinopyranosyl-(14)- α-1-arabinopyranosyl-(13)-β-d-xylopyranosyl-

α-lrhamnopyranosyl-(12)-β-d-fucopyranosyl ester,…

Curcumin Demethoxycurcumin Bídemethoxycurcumin

Bromophenols 2,4,6-tribromophenol 2,4-dibromophenol

4 Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro

Tiểu đường là một trong những những bệnh rối loạn chuyển hóa do sản xuất quá mức các loại oxy phản ứng (ROS) so với mức bình thường hoặc rối loạn chức năng trong cơ chế bảo vệ chống oxy hóa hoặc cả hai xảy ra đồng thời ROS dư thừa được quét bởi các chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa chống lại các gốc

tự do thông qua các cơ chế sau: suy thoái gốc tự do; nhặt các gốc tự do… Theo một số nghiên cứu, người bệnh bị tiểu đường mức độ chống oxy hóa giảm Điều

đó góp phần gây ra các biến chứng bệnh tiểu đường như chấn thương mô, tổn thương tế bào, dây thần kinh [9], [82]

4.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể

Oxy hóa là quá trình xảy ra các phản ứng hóa học, trong đó các electron được chuyển sang chất oxy hóa hình thành nên gốc tự do Sự gia tăng các gốc tự

do trong cơ thể sinh ra các phản ứng dây chuyền gây phá hủy tế bào

Các gốc tự do là nguyên tử, phân tử hoặc ion với các electron chưa được ghép cặp rất không ổn định và chúng có xu hướng đạt cân bằng bằng cách lấy một electron từ một phân tử mà nó tiếp xúc Phần lớn các phân tử sinh học không phải

là gốc

Các gốc tự do trong cơ thể có 2 nguồn gốc chính sau: nguồn gốc nội sinh

và nguồn gốc ngoại sinh

- Gốc tự do nội sinh: các gốc tự do được chính cơ thể tạo ra trong những quá trình chuyển hóa tự nhiên như hô hấp tế bào (chủ yếu là superoxide sau đó H2O2), lưới nội chất (tạo thành superoxide – bởi cytochrome P450), quá trình trao đổi chất của tế bào… Trong cơ thể, ty thể là nguồn tạo ra nhiều gốc tự do nội bào

- Gốc tự do ngoại sinh: Do tác động bởi các yếu tố ngoại lai như tia tử ngoại

từ ánh sáng mặt trời, thuốc lá, ô nhiễm môi trường…

Các dạng hoạt động của gốc tự do gồm có ROS (oxy hoạt tính), RNS (nitrogen hoạt tính), RSS có tác dụng chống lại vi sinh vật [12], [16], [65] Bản chất của các gốc tự do là có khả năng phản ứng cao, thời gian tồn tại ngắn phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà nó tồn tại [22], [65]

Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể, gồm 3 cơ chế:

Đích phân tử chính của các gốc tự do là protein, ADN (acid deoxyribonucleic), ARN (acid ribonucleic), đường và lipid Những phản ứng của gốc tự do có liên quan đến nhiều bệnh nguy hiểm như ung thư, tim mạch, béo phì, tiểu đường, bệnh Alzheimer, Parkinson, lupus ban đỏ, loét dạ dày…[65], [68]

4.2 Cơ chế chống oxy hóa

Các cơ chế chống oxy hóa [73]:

- Ức chế các enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS

- Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy quá trình chống oxy hóa của tế bào

- Phản ứng trực tiếp với ROS/ RNS tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa các chất oxy hóa và chất chống oxy hóa dẫn đến sự gián đoạn chuyền tín hiệu và kiểm soát oxy hóa khử gây ra nhiều thiệt hại cho các phân tử sinh học ảnh hưởng xấu đến cơ thể [78]

- Tổn hại tới lipid do bị oxy hóa: làm mất các dây nội chưa bão hòa (gây thay đổi trong tính lưu chảy và tính thấm của màng), tạo ra các chất có hoạt tính mạnh (gây ảnh hưởng tới tính đồng nhất của enzym màng)

- Tổn hại tới protein do bị oxy hóa: làm kết tập, phân mảnh, phân tách protein; phản ứng với ion sắt của hem; biến đổi nhóm chức năng Hậu quả: thay đổi hoạt tính enzym và phân giải protein

- Tổn hại tới DNA: bị oxy hóa làm đứt, gẫy chuỗi; tách vòng saccharide dẫn đến các đột biến, lỗi di truyền hoặc ức chế tổng hợp protein

- Các bệnh lý rối loạn: già hóa, béo phì, tiểu đường, viêm nhiễm, viêm tụy cấp, các bệnh thoái hóa thần kinh (bệnh Parkinson và bệnh Alzheimers)

4.3 Các chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là các chất khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng, vì vậy người ta hay dùng các chất khử để chống oxy hóa

 Các chất chống oxy hóa nội sinh

Các chất chống oxy hóa nội sinh do cơ thể sinh ra được chia thành 2 loại, các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym và các chất chống oxy hóa không phải enzym

Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym quan trọng ngăn chặn sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể là: glutathion peroxidase, catalase, superoxid dismutase, Glucose-6-phosphat dehydrogenase Các chất chống oxy hóa không phải enzym cũng được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít và chủ yếu được bổ sung từ thức ăn [65]

Mỗi chất chống oxy hóa có cơ chế tác dụng riêng với từng loại gốc tự do khác nhau và có thể hiệp đồng với nhau để loại trừ gốc tự do Nhờ các chất chống oxy hóa mà quá trình oxy hóa chỉ xảy ra ở mức độ sinh lý nhất định, khi đó các dạng oxy hóa hoạt động thực hiện được chức năng sinh lý và duy trì được sự cân bằng quá trình trao đổi chất Việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới có thể tạo ra sự kết hợp hiệu quả trong điều trị một số bệnh có liên quan đến quá trình oxy hóa trong cơ thể

Bảng 1 2 Các chất chống oxy hóa nội sinh

 Chất chống oxy hóa trong hóa dược

Thuốc chống viêm: Theo nghiên cứu, nhóm thuốc nàyđược chứng minh là có tác

dụng chống oxy hóa và được chia thành 3 nhóm:

Các chất chống oxy hóa tổng hợp: BHA (butylated hydroxyanisole), BHT

(butylated hydroxytoluene), PG (propyl gallate), OG (octyl gallate), TBHQ (tert –

butylhydroquinon)…

 Các chất oxy hóa có nguồn gốc thực vật

Trong thế giới thực vật có rất nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa và thuộc nhiều nhóm khác nhau Đáng chú ý nhất là các vitamin và dẫn xuất của phenol:

tử chức năng khỏi sự oxy hóa quá mức do đó có tác dụng chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ

nước của tế bào, có khả năng tái tạo Vitamin E từ dạng oxy hóa về dạng khử [35]

và tạo phức chelat rất đáng chú ý Chúng tập trung nhiều nhất trong các loại trái cây, rau quả, rượu, trà và cacao Flavonoid tồn tại trong thực phẩm dưới dạng glycoside và polymer, được thoái hóa ở nhiều mức độ khác nhau trong đường tiêu hóa Xu hướng ức chế quá trình trung gian tạo gốc tự do của một số flavonoid bị chi phối bởi cấu trúc hóa học của nó (cấu trúc nhân flavan, số lượng và vị trí các nhóm thế) Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao EGCG trong chè xanh, Genistein trong đậu nành, quercetin, resveratrol [69]

mặt trong một số thực vật nhiệt đới

Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng

có tác dụng chống oxy hóa như carotenoid, acid phenolic, lignin…

4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro

Đánh giá khả năng chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp thường được sử dụng,

chúng được chia thành 2 loại: phương pháp in vitro và phương pháp in vivo [63]:

Bảng 1 3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

Các phương pháp in vitro Các phương pháp in vivo

Ưu điểm: Nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốn kém Tuy nhiên, DPPH không tồn tại trong cơ thể sống nên phép thử này chỉ mang

ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử Dùng trong sàng lọc các mẫu dược liệu [22], [49], [63], [65]

Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O 2 ●

ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ ở bước sóng

560 nm, đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng 560 nm sẽ biết lượng O2 ● tham gia phản ứng [22], [50], [63], [65]

Ưu điểm: Nhanh chóng, dễ thực hiện, yêu cầu ít máy móc, kết quả thu được tương đối ổn định và chính xác

Thử tác dụng dọn gốc tự do hydroxyl ● OH

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng của đường 2–deoxyribose của

cùng là MDA (maloydialdehyd) Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại

ở bước sóng 532 nm Đo hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng 532 nm sẽ cho biết nồng độ MDA được tạo ra sau quá trình oxy hóa Từ đó tính được mức

hoạt tính rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quả ít chính xác hơn các thử nghiệm khác [22], [49], [63], [65]

5 Quan niệm về tiểu đường của đông y

Bệnh tiểu đường trong y học cổ truyền được gọi là chứng tiêu khát mà nguyên nhân chủ yếu là do ăn uống không điều độ, ăn nhiều các chất cay nóng, béo, ngọt, do lao lực, do căng thẳng thần kinh tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt làm phần âm của phủ tạng: phế, vị, thận bị hao tổn Hải Thượng Lãn Ông có viết trong cuốn Y Trung Quan Kiện như sau: “chứng bệnh tiêu khát phần nhiều do hỏa làm tiêu hao chân âm 5 chất dịch bị khô cạn mà sinh ra” [4].Muốn chữa bệnh phải trị

cả gốc và ngọn: trị ngọn là trị chứng khát nước, đói, tiểu nhiều Bệnh tiểu đường trong y học cổ truyền chia ra làm ba mức độ: Nếu bệnh nhân thích uống nước nhiều thì bệnh chủ yếu ở thượng tiêu do phế âm hư; nếu thích ăn nhiều bệnh chủ yếu ở trung tiêu do vị âm hư gây đói và gầy; nếu bị đi tiểu nhiều thì bệnh chủ yếu

ở phần hạ tiêu do thận âm hư không tàng trữ được tinh hoa của ngũ cốc, không làm chủ được thủy gây tiểu nhiều và nước tiểu có đường [4]

Muốn chữa bệnh tiểu đường phải trị cả gốc và ngọn: trị ngọn là trị chứng khát nước, đói, tiểu nhiều; trị gốc là trị phế, tỳ, thận là những cơ quan có chức năng chuyển hóa và điều tiết trong cơ thể

Các thuốc Đông y được sử dụng trong điều trị tiểu đường: Sử dụng thuốc

có nguồn gốc thực vật trong phòng và chữa bệnh là thói quen, kinh nghiệm và truyền thống của người dân Việt Nam và một số nước trên thế giới Một nghiên