Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu bù ốc leo

Ở Việt Nam, cây Bù ốc leo chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học, tác dụng sinh học cũng như tiêu chuẩn đánh giá chất lượng.. Thành phần hóa học Nghiên cứu đi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

 - -

NGUYỄN THỊ NGỌC LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

CỦA DƯỢC LIỆU BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L.f)

Benth ex Hook.f., họ Thiên lý (Asclepiadaceae))

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

 - -

NGUYỄN THỊ NGỌC LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

CỦA DƯỢC LIỆU BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L.f)

Benth ex Hook.f., họ Thiên lý Asclepiadaceae))

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH.2015Y Người hướng dẫn: 1 PGS.TS ĐỖ THỊ HÀ

2 TS VŨ ĐỨC LỢI

LỜI CẢM ƠN

Em là Nguyễn Thị Ngọc Liên, sinh viên K4 Dược học Lời đầu tiên em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến PGS.TS Đỗ Thị Hà, TS Vũ Đức Lợi, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em

hoàn thành khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến ThS Phạm Thị Thúy, DS Vũ Thị Diệp, những người chị, người thầy đã đồng hành và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu cùng các anh chị, các bạn ở Khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cám ơn Nghị định thư Việt - Hàn "Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch của một số cây thuốc Việt Nam" đã hỗ trợ

kinh phí để em thực hiện đề tài này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân

đã luôn quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc Liên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của cây Bù ốc leo 5

Bảng 3 1 Kết quả định tính dược liệu Bù ốc leo bằng phản ứng ống nghiệm 23

Bảng 3 2 Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo 26

Bảng 3 3 Tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo 26

Bảng 3 4 Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu Bù ốc leo 27

Bảng 3 5 Hàm lượng chất chiết được trong nước 27

Bảng 3 6 Hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70% 27

Bảng 3 7 Hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu Bù ốc leo 28

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 1 Hình ảnh loài Dregea volubilis (L f) Benth ex Hook.f [6] 4

Hình 1 2 Các hợp chất polyhydroxy pregnanes phân lập được từ Bù ốc leo 8

Hình 1 3 Các hợp chất polyoxypregnan glycoside phân lập được từ Bù ốc leo 9

Hình 1 4 Các hợp chất flavonoid phân lập được từ Bù ốc leo [12, 16, 23, 29] 9

Hình 1 5 Các hợp chất phenolic phân lập được từ Bù ốc leo [12] 10

Hình 1 6 Hợp chất pentacyclic triterpenoid phân lập được từ Bù ốc leo [14] 10

Hình 1 7 Các hợp chất sterol và carbohydrate phân lập được từ Bù ốc leo [14] 10

Hình 3 1 Hình ảnh dược liệu Bù ốc leo 20

Hình 3 2 Hình ảnh vi phẫu thân Bù ốc leo 21

Hình 3 3 Hình ảnh vi phẫu lá Bù ốc leo 22

Hình 3 4 Đặc điểm bột dược liệu Bù ốc leo 23

Hình 3 5 Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Bù ốc leo 25

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Dregea 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Phân bố 2

1.2 Tổng quan về loài Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f 3

1.2.1 Danh pháp 3

1.2.2 Đặc điểm thực vật 3

1.2.3 Phân bố và sinh thái 4

1.2.4 Tính vị, công năng, tác dụng 4

1.2.5 Thành phần hóa học 5

1.2.6 Tác dụng dược lý 11

1.3 Tổng quan về tiêu chuẩn cơ sở 11

1.3.1 Tình hình sử dụng dược liệu 11

1.3.2 Xây dựng TCCS 11

1.3.3 Phương thức xây dựng TCCS 11

1.3.4 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu 12

1.3.5 Tiêu chuẩn đã công bố về dược liệu Bù ốc leo 12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, máy móc, thiết bị 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Dung môi, hóa chất, thiết bị 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Mô tả 15

2.2.2 Vi phẫu 15

2.2.3 Soi bột 15

2.2.4 Định tính 15

2.2.5 Độ ẩm 17

2.2.6 Tro toàn phần 17

2.2.7 Tro không tan trong acid 17

2.2.8 Xác định hàm lượng chất chiết được 18

2.2.9 Định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 20

3.1 Kết quả khảo sát xác định các chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo 20

3.1.1 Kết quả mô tả đặc điểm dược liệu 20

3.1.2 Kết quả xác định đặc điểm vi phẫu 20

3.1.3 Kết quả xác định đặc điểm bột dược liệu 22

3.1.4 Kết quả định tính 23

3.1.5 Kết quả xác định độ ẩm 26

3.1.6 Kết quả xác định tro toàn phần 26

3.1.7 Kết quả xác định tro không tan trong acid 26

3.1.8 Hàm lượng chất chiết được trong dược liệu 27

3.1.9 Kết quả định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân 28

3.2 Kết quả xây dựng TCCS của dược liệu Bù ốc leo 28

3.2.1 Yêu cầu kỹ thuật 28

3.2.2 Phương pháp thử 29

3.2.3 Đóng gói và bảo quản 31

3.3 Bàn luận 31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu của con người về các sản phẩm chăm sóc sức khỏe chất lượng càng cao Bên cạnh đó, xu hướng nghiên cứu các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ nguồn động thực vật cũng rất được quan tâm Các nhà khoa học ở Việt Nam cũng tham gia vào tìm kiếm, phát triển lĩnh vực này Là một đất nước có nguồn thực vật phong phú, chúng ta có tiềm năng rất lớn về tài nguyên cây thuốc Đây là tiền đề tốt để nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu

Cây Bù ốc leo là cây thuốc phổ biến ở Ấn Độ Ở Việt Nam, cây có mặt ở vùng Lai Châu, Ninh Bình, Ninh Thuận, TP Hồ Chí Minh, … Toàn cây có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, chỉ thống, chỉ thổ Dân gian vẫn dùng các bộ phận trên mặt đất của cây để trị mụn nhọt, rắn cắn, đau dạ dày, các bệnh về mắt [6] Cũng có tài liệu cho thấy, nhân dân còn dùng rễ, thân mềm như một vị thuốc gây nôn, long đờm [16]

Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Bù ốc leo, đáng chú ý là: chống ung thư [21], chống viêm [23] Cũng có nhiều nghiên cứu khác chỉ ra các tác dụng như chống đái tháo đường [16], trị giun sán [22], chống mất trí nhớ [35]

Ở Việt Nam, cây Bù ốc leo chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học, tác dụng sinh học cũng như tiêu chuẩn đánh giá chất lượng Do đó, các nghiên cứu về cây sẽ là tiền đề để góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về cây Bù ốc leo, tạo nền tảng cho việc dần đưa cây thuốc vào thực tế sử dụng một cách khoa học

Xuất phát từ những thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn

cơ sở của dược liệu Bù ốc leo (Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f., họ

Thiên lý Asclepiadaceae)” được thực hiện với những mục tiêu:

1 Xác định được các chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo

2 Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu Bù ốc leo

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Dregea

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo Thực vật học [10], [9], vị trí phân loại của chi Bù ốc (Dregea) trong giới

thực vật như sau:

Giới (Kingdom) Thực vật (Planta)

Ngành (Division) Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp (Class) Hai lá mầm (Magnoliopsida)

Phân lớp (Subclass) Bạc hà (Lamiidae)

Bộ (Order) Long đởm (Gentianales)

Họ (Family) Thiên lý (Asclepiadaceae)

Chi (Genus) Bù ốc (Dregea)

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Chi Dregea gồm các loài thường là cây bụi trườn, leo hay cỏ bò, không có rễ

phụ phát triển trên thân Lá mọc đối Cụm hoa xim hình tán Thùy đài nhỏ, hình trứng

nhọn đầu đôi khi tù; gốc đài không có hoặc có 5 tuyến Tràng hình bánh xe; tràng

không dính nhau thành ống đứng, cánh hoa vặn, phủ nhau bên phải Tràng phụ đơn,

gồm 5 vảy nạc, hình cầu, dính với cột nhị-nhụy Chỉ nhị dính nhau; bao phấn hai ô;

trung đới kéo dài thành phần phụ; hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên

ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót

đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Đầu

nhụy hình nón hay gồ ghề; đỉnh bầu không thót lại thành hình vòi nhụy Quả nang

dày, có các khía lồi dạng cánh [6] Hạt có mào lông [26]

1.1.3 Phân bố

Trên thế giới: chi Dregea có khoảng 12 loài, phân bố ở châu Á và châu Phi [6,

26, 42]

Ở Việt Nam: chi Dregea là một chi nhỏ của họ Thiên lý Theo thống kê trong

Thực vật chí Việt Nam tập 15 - Họ Thiên lý (Asclepiadaceae), tính đến năm 2017, chi

Dregea ở Việt Nam có 2 loài là Bù ốc leo (Dregea volubilis (L f.) Benth & Hook.)

Trần Thế Bách và cộng sự đã phát hiện một loài Dregea chưa xác định khi nghiên cứu

thực địa tại khu vực Tây Nguyên, Vườn quốc gia Kon Ka Kinh Đến năm 2018, khi so

sánh với tiêu bản của các loài Dregea đã biết, loài này được xác định là loài mới, có tên khoa học là Dregea taynguyenensis T.B Tran & Rodda [19]

1.2 Tổng quan về loài Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f

1.2.1 Danh pháp

 Tên tiếng Việt: Bù ốc leo

 Tên khoa học: Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f

 Họ thực vật: Asclepiadaceae

 Tên nước ngoài:

Green wax flower (tiếng Anh) Harandodi (tiếng Hindi) Nan shan teng (tiếng Trung Quốc)

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Cây leo dài đến 12 m Cành màu xám tái, vỏ có bì khổng, cành non xanh, nhẵn

Lá mọc đối; phiến lá hình trứng rộng, cỡ 7-18 x 4-17 cm, nhẵn hay có lông mềm; đỉnh nhọn hay có mũi ngắn; gốc hình tim nông; gân bên 4 cặp [6, 26] Gân lá dạng mạng lưới, mặt trên của lá có màu xanh đậm và mặt dưới có màu xanh nhạt Cuống lá dài 3-

5 cm Mùi hăng đặc biệt và vị đắng [13]

Cụm hoa rũ xuống, nhiều hoa, xếp thành xim, dạng tán; cuống cụm hoa dài 2-6

cm, có lông Cuống hoa dài 2-2,5 cm Hoa màu xanh hay màu xanh-vàng nhạt, thơm Thùy đài hình trứng-thuôn, dài 2,5-3 mm, có lông, tràng hoa hình bánh xe, nhẵn; thùy tràng hình trứng rộng, vặn, phủ nhau bên phải, cỡ 6-12 x 5-12 mm, có lông Tràng phụ đơn, gồm 5 vảy nạc, màu xanh-màu vàng nhạt, đường kính 4-4,5 mm Chỉ nhị dính nhau; bao phấn hai ô; trung đới kéo dài thành phần phụ màu trắng; hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên, thuôn; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Bầu có lông Quả đại, hình trứng hẹp, cỡ 10-15 x 3-4

cm Hạt hình trứng dẹt cỡ 1,2 x 0,6 cm; mào lông dài 4,5 cm [6, 7, 26]

Hình 1 1 Hình ảnh loài Dregea volubilis (L f) Benth ex Hook.f [6]

1 cành mang hoa; 2 hoa; 3 đài (mở ra); 4 tràng (mở ra); 5 tràng phụ, cột nhị nhụy;

6 cơ quan truyền phấn và khối phấn (pollinarium); 7 nhụy; 8 quả; 9 hạt;

1.2.3 Phân bố và sinh thái

Bù ốc leo có tên là Jukti trong tiếng Bengal, phân bố ở miền nam Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Sri Lanka, Bangladesh, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Malaysia, Indonesia, Philippines [21]

Ở Việt Nam, Bù ốc leo thường phân bố ở Lạng Sơn (Hữu Lũng - Hữu Liên), Ninh Bình (Vườn quốc gia Cúc Phương), Nghệ An (Tương Dương: Tam Đình), Ninh Thuận (Phan Rang-Tháp Chàm, Ninh Hải, Vườn quốc gia Núi Chúa), Hồ Chí Minh, một số tỉnh Trung và Nam Bộ và một số nơi khác [6, 7]

1.2.4 Tính vị, công năng, tác dụng

Bộ phận dùng: Toàn cây và thân dạng rễ

Tính vị, công năng: Dây, rễ bù ốc leo có vị đắng, cay, tính mát, công năng

thanh nhiệt, tiêu viêm, trừ thấp chỉ thống, chỉ thổ, chỉ lỵ [11]

Tác dụng:

Lá ăn được, thường dùng luộc ăn Ở Sri Lanka lá được dùng làm rau ăn và dễ dàng tìm thấy ở các chợ địa phương [27] Lá cây ngâm trong dầu dùng trị bệnh mụn nhọt ở giai đoạn đầu và làm cho chóng mưng mủ ở các giai đoạn sau Lá và thân cây được ứng dụng nhiều trong dân gian, nhưng ở mức độ phổ biến còn thấp Ở nước ta, người ta sử dụng lớp bột màu nâu trên quả làm thuốc trị bệnh gia súc Ở Ấn độ, lá dùng điều trị thấp khớp, ho, sốt, cảm lạnh [33] Ngoài ra, lá còn được dùng cùng với hạt tiêu để điều trị chứng khó tiêu [24] Vỏ thân được dùng cùng sữa để trị nhiễm trùng đường tiết niệu [38] Rễ và thân mềm xem như chất gây nôn và long đờm Toàn thân cây dùng trị cảm lạnh và bệnh tật về mắt, làm hắt hơi; còn dùng trị rắn cắn [25] Ngoài ra lá còn được dùng trị viêm khí quản, đau dạ dày [40]

1.2.5 Thành phần hóa học

Nghiên cứu định tính các nhóm chất thường gặp bằng phản ứng hóa học cho thấy lá Bù ốc leo có chứa amino acid, protein, lipid, anthraquinon, flavonoid, coumarin, saponin, glycosid tim, tannin, catechin, phytosterol, alcaloid, gum, chất nhầy [37], steroid, carbohydrat, chất béo, triterpenoid, đường khử [23]; vỏ thân chứa polyphenol, flavonoid, alcaloid, proanthocyanidin [18]; hoa chứa carbohydrat, protein, amino acid, steroid, glycosid, alcaloid, tanin, flavonoid, polyhydroxy pregnan [17]; quả chứa anthocyanidin, flavonoid, các hợp chất phenolic, amino acid [12]; rễ chứa glycosid [36]

Purushoth Prabhu T và cộng sự tiến hành định tính các dịch chiết từ Bù ốc leo

bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Kết quả thấy rằng sắc ký đồ của cao chiết

n-hexan xuất hiện 5 vết với các giá trị Rf là 0,92; 0,85; 0,79; 0,64; 0,52 Sắc ký đồ của cao chiết chloroform xuất hiện 4 vết với các giá trị Rf 0,88; 0,77; 0,74; 0,66 [32]

Các nghiên cứu chiết xuất, phân lập cho thấy thành phần hóa học của Bù ốc leo gồm các hợp chất polyhydroxy pregnan [30, 37], polyoxypregnan glycosid [14, 16,

23, 34], flavonoid [12, 16, 23, 29], triterpenoid, sterol, carbohydrat [14] và các hợp chất phenolic [12]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của cây Bù ốc leo

thevetopyranosid (12)

[36]

Drevogenin A allopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl- (1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-

3-O-3-O-methyl-6-deoxy-β-D-cymaropyranosid (13)

[41]

Drevogenin A O-methyl-6-deoxy-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β- D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-3-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid

(14)

Drevogenin A allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-

3-O-3-O-methyl-6-deoxy-β-D-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (15)

Drevogenin A O-methyl-6-deoxy-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β- D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-3-(16)

Drevogenin C O-methyl-6-deoxy-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β- D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-3-(17)

Drebyssogenin K2 allopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl- (1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-

3-O-3-O-methyl-6-deoxy-β-D-cymaropyranosid (18)

drebyssogenin K2 allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-

3-O-3-O-methyl-6-deoxy-β-D-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (19)

3 Flavonoid Vitexin (20), rutin, quercetin (21), luteolin (22),

kaempferol (23), isovitexin, isoorientin, apigenin (24), delphinidin (25), petunidin (26)

(7) (8)

Hình 1 2 Các hợp chất polyhydroxy pregnanes phân lập được từ Bù ốc leo

(12)

1.2.6 Tác dụng dược lý

Theo các nghiên cứu, Bù ốc leo có các tác dụng chống ung thư [21], trị đái tháo đường [16], chống oxy hóa [15], chống viêm [23], trị ký sinh trùng [22] và hạ sốt, giảm đau [28]

1.3 Tổng quan về tiêu chuẩn cơ sở

1.3.1 Tình hình sử dụng dược liệu

Dược liệu là nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật, động vật, khoáng vật và đạt tiêu chuẩn làm thuốc [5] Tại hội thảo “Nâng cao năng lực kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu và thuốc từ dược liệu trong thời kỳ hội nhập”, ngày 7-8/7/2016 tại Cần Thơ, ông Nguyễn Thanh Long – thứ trưởng Bộ Y tế - cho biết mỗi năm ngành dược trong nước tiêu thụ khoảng 60 tấn dược liệu, nhưng dược liệu trong nước chiếm khoảng 10%, còn lại chủ yếu nhập từ Trung Quốc qua đường tiểu ngạch với chất lượng không được kiểm soát hoàn toàn

Bên cạnh đó còn vấn nạn dược liệu giả Dược liệu giả là dược liệu thuộc một trong các trường hợp sau đây:

 Không đúng loài, bộ phận hoặc nguồn gốc được cơ sở kinh doanh cố ý ghi trên nhãn hoặc ghi trong tài liệu kèm theo;

 Bị cố ý trộn lẫn hoặc thay thế bằng thành phần không phải là dược liệu ghi trên nhãn; dược liệu bị cố ý chiết xuất hoạt chất;

 Được sản xuất, trình bày hoặc dán nhãn nhằm mạo danh nhà sản xuất, nước sản xuất hoặc nước xuất xứ [5]

Dược liệu trước khi đưa vào sử dụng đều phải được kiểm tra chất lượng và phải đạt yêu cầu chất lượng theo tiêu chuẩn đã đăng ký như tiêu chuẩn Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở Vấn đề được đặt ra lúc này là làm sao để biết được dược liệu sử dụng có đạt chất lượng, vì có nhiều dược liệu chưa có chuyên luận trong Dược điển hoặc chưa được nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

1.3.2 Xây dựng TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở là tiêu chuẩn do tổ chức kinh tế, tổ chức xã hội – nghề nghiệp, cơ quan nhà nước, đơn vị sự nghiệp và các cơ quan, tổ chức khác công bố để

áp dụng trong các hoạt động của tổ chức đó

Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, kinh nghiệm, nhu cầu và khả năng thực tiễn của cơ sở Các tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế, khu vực hoặc nước ngoài tương ứng được khuyến khích sử dụng để xây dựng hoặc chấp nhận thành tiêu chuẩn cơ sở [1]

1.3.3 Phương thức xây dựng TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở có thể được xây dựng theo những phương thức cơ bản sau:

– Chấp nhận tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực hoặc tiêu chuẩn nước ngoài tương ứng thành tiêu chuẩn cơ sở Khi xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu, ta phải tham khảo các chuyên luận về tiêu chuẩn cơ sở của dược điển nước ngoài, như Dược điển Hoa Kỳ, dược điển Anh, Dược điển Trung Quốc, trên

cơ sở các chuyên luận về tiêu chuẩn cơ sở dược liệu quy định trong DĐVN V

– Xây dựng mới tiêu chuẩn cơ sở trên cơ sở sử dụng các kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, các kết quả thử nghiệm, đánh giá, phân tích và thực nghiệm Thực hiện các nghiên cứu về xây dựng tiêu chuẩn, đánh giá trên nhiều mẫu của dược liệu đó được thu hái ở những địa điểm khác nhau, để phân tích, tổng hợp thành một tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu

– Sửa đổi, bổ sung tiêu chuẩn cơ sở hiện hành Có những chuyên luận về dược liệu khi đưa ra xem xét có chỉ tiêu nào đó không đạt hoặc cần bổ sung thêm các chỉ tiêu khác, tiến hành nghiên cứu thực nghiệm để bổ sung, hoàn thiện để chuyên luận đã

có đánh giá tốt nhất về chất lượng dược liệu được sử dụng [1]

1.3.4 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu

Để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu có thể khái quát các phương pháp như sau, được quy định trong phụ lục 12.2, DĐVN V [4]

- Phương pháp cảm quan: bao gồm những mô tả về hình thái kích thước, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu hoặc đặc điểm thể chất của dược liệu

- Phương pháp định tính: bao gồm những phương pháp dùng để nhận biết dược liệu, bao gồm phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa

- Thử tinh khiết và cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu: mất khối lượng

do làm khô (Phụ lục 9.6), tro toàn phần và tro không tan trong acid (Phụ lục 9.7 và 9.8), các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối (Phụ lục 12.11), …

- Phương pháp định lượng: là việc xác định hàm lượng của một hay một số chất có trong dược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học

1.3.5 Tiêu chuẩn đã công bố về dược liệu Bù ốc leo

Hiện nay, các nghiên cứu đánh giá chất lượng và tiêu chuẩn hóa dược liệu Bù

ốc leo còn rất hạn chế Dược liệu này chưa có chuyên luận riêng trong các Dược điển

Theo nghiên cứu của Sudhakar P và cộng sự, vi phẫu thân và lá bù ốc leo có các đặc điểm: biểu bì gồm một lớp tế bào hình trụ, hình bầu dục đến hình tròn, dưới

bao quanh bởi nhiều lục lạp Bột dược liệu có các đặc điểm: màu nâu vàng, vị đắng, quan sát dưới kính hiển vi thấy các mảnh biểu bì hình đa giác hoặc có cấu trúc song song và tinh thể calci oxalat dày đặc [39]

Biswas M và cộng sự đã tiến hành định lượng phenolic tổng số Bù ốc leo bằng phương pháp đo quang Kết quả thấy rằng, hàm lượng phenolic tổng số trong cao chiết quả bù ốc leo là 95,03 μg pyrocatechol/mg cao chiết [15, 20]

Das B và cộng sự đã định lượng hàm lượng phenolic tổng số và hàm lượng flavonoid tổng số trong hoa Bù ốc leo bằng phương pháp đo quang Kết quả thấy rằng hàm lượng phenolic tổng số trong cao chiết hoa khô Bù ốc leo là 39,82 ± 1,22 μg acid gallic/mg cao chiết Hàm lượng flavonoid tổng số trong cao chiết hoa khô Bù ốc leo là 27,50 ± 0,87 μg quercetin/mg cao chiết [16, 31]

Nghiên cứu của Purushoth Prabhu T và cộng sự đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của Bù ốc leo, gồm độ ẩm (11,25%), tro toàn phần (18%), tro không tan trong acid (0,75%), hao tổn khi làm khô (6,27%) [32]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, máy móc, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (lá, thân, cụm hoa, quả) được thu hái tại bản Vàng Pheo, xã Mường So, huyện Phong Thổ, tỉnh Lai Châu vào ngày

25/4/2018 Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Dregea volubilis (L.f.)

Benth ex Hook.f (Phụ lục 1) Tiêu bản thực vật khô có cành mang lá, cuống lá, phiến

lá, cụm hoa và đang được lưu giữ tại Bảo tàng Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với mã số tiêu bản HNU 024062 (Phụ lục 2) Sau khi thu hái, một phần thân và lá được được bảo quản trong EtOH 60% để nghiên cứu đặc điểm vi phẫu Phần thân và lá còn lại được làm nhỏ, sấy khô ở 50ºC, bảo quản trong túi nilon sạch làm nguyên liệu nghiên cứu các chỉ tiêu chất lượng

2.1.2 Dung môi, hóa chất, thiết bị

 Dung môi, hóa chất dùng trong định tính:

Magie bột kim loại, HCl đậm đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 10%, anhydrid acetic, chloroform, H2SO4 đậm đặc

 Máy móc, thiết bị

- Kính hiển vi Axioskop 40

- Máy siêu âm Ultrasonic JPS – 100A

- Máy cất quay Rotavapor R-210

- Tủ sấy Binder FD115

- Cân phân tích Mettler toledo MS204

- Cân xác định độ ẩm AND MF-50

- Bản mỏng: DC-Alufolien 60 GF254 (Merck) và RP18 (Merck)

- Dụng cụ: các dụng cụ thí nghiệm thường quy (vải lọc, bông, giấy lọc, ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, pitpet…), các dụng cụ thí nghiệm khác (mao quản, bình khai triển sắc ký…)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo dựa trên các chỉ tiêu chung được qui định tại phụ lục 12.2 DĐVN V [4] gồm: Mô tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, định tính, định lượng,…

2.2.1 Mô tả

Tiến hành trên mẫu dược liệu là bộ phận trên mặt đất của cây Bù ốc leo đã sấy khô Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan Kiểm tra kích thước bằng cách đo

2.2.2 Vi phẫu

Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 12.18

Mẫu dược liệu Bù ốc leo tươi gồm 2 phần lá, thân được tiến hành cắt vi phẫu, tẩy sáng trong dung dịch javel trong ít nhất 30 phút, rửa sạch bằng nước 3 lần, tẩy bằng acid acetic khoảng 15 phút, rửa sạch bằng nước 3 lần, rồi nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với xanh methylen trong 5-30 giây và đỏ carmin trong khoảng 30 phút, sau mỗi thao tác đều phải rửa sạch bằng nước [8]

Lên tiêu bản, sử dụng kính hiển vi để quan sát các đặc điểm vi phẫu của dược liệu

2.2.3 Soi bột

Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 12.18

Phần trên mặt đất của dược liệu Bù ốc leo được làm khô rồi nghiền thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch glycerin, quan sát các đặc điểm của bột bằng kính hiển vi [8]

2.2.4 Định tính

2.2.4.1 Định tính bằng phản ứng ống nghiệm

Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo các tài liệu [2, 3]

 Định tính flavonoid:

Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet Chiết bằng n-hexan đến khi dung môi trong bình chiết không màu Bã dược liệu sau khi chiết bằng n-

hexan để bay hơi dung môi đến khô Chiết hồi lưu với 50 ml cồn 90º trong 30 phút Lọc thu dịch chiết để làm các phản ứng sau:

- Phản ứng Cyanidin: cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm

một ít bột magie kim loại, rồi thêm 3 – 5 giọt acid HCl đậm đặc, đun nóng cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ thì phản ứng dương tính

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống

nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh đen thì phản ứng dương tính

- Phản ứng với kiềm: cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, cho

thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, màu vàng đậm hơn thì phản ứng dương tính

 Định tính saponin:

- Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml EtOH

90% đun sôi cách thủy Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn Hòa tan cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách

2.2.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 5.4

Chuẩn bị mẫu: Lấy 1g bột thân, thêm 10 ml EtOH 70%, đun cách thủy 15

phút, lọc Dịch lọc được dùng chấm sắc ký Lặp lại quá trình chiết 3 lần thu được 3 mẫu dung dịch thử Khai triển 3 mẫu trên cùng một bản mỏng với điều kiện sắc ký như sau:

Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), bản mỏng silical gel 60 RP – 18

F254S (Merck) đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phút trước khi dùng

Pha động: tiến hành với các hệ dung môi sau:

+ Hệ 1: dicloromethan - methanol (9:1, v/v);

+ Hệ 2: cloroform - ethyl acetat - methanol - nước (2:4:2:1, v/v/v/v, lớp dưới) + Hệ 3: aceton – nước (3:1, v/v)

Phát hiện vết: quan sát dưới ánh sáng tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm,

phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong EtOH và quan sát dưới ánh sáng thường

Tiến hành: chấm riêng biệt 10 µl mỗi mẫu thử lên bản mỏng đã hoạt hóa ở