Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp heterometrus laoticus và toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn bungarus fasciatus

Từ phân đoạn 4 của nọc bò cạp Heterometrus laoticus người ta đã phân lập được toxin Hetlaxin có ái lực mạnh với kênh Kv1.3, còn từ phân đoạn 5 có độc tính với côn trùng của nọc bò cạp n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN VŨ THIÊN

PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ

NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ

HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG

THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP.Hồ Chí Minh – 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN VŨ THIÊN

PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ

NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ

HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG

TP.Hồ Chí Minh – 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của

TSKH Hoàng Ngọc Anh và TS Phùng Văn Trung

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ

công trình nào khác

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021

Tác giả luận án

Trần Vũ Thiên

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới TSKH Hoàng Ngọc Anh và TS Phùng Văn Trung - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án

Tôi vô cùng biết ơn GS.TSKH Utkin Yuri Nikolaevich, Viện Sinh hóa hữu cơ mang tên Shemyakin-Ovchinnikov, Moskva, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc xác định cấu trúc phân tử của các chất

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths.Dược sĩ Nguyễn Thị Thùy Trang – giảng viên bộ môn Dược Lý, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, TS Phạm Đình Chương – giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Tôn Đức Thắng cùng các em Trần Thụy Trúc Vy, Trần Thái Đạt – sinh viên trường Đại học Tôn Đức Thắng, đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc thực hiện khảo sát các tác dụng dược lý của nọc bò cạp và nọc rắn cùng những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, bộ phận đào tạo, phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Trường Đại học Trà Vinh và các đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn

bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả

Trần Vũ Thiên

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan……… ……i

Lời cảm ơn……….………… … ii

Mục lục……… … iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt……… viii

Danh mục các bảng……… …… … xi

Danh mục các hình vẽ, đồ thị……… ………… …xiii

MỞ ĐẦU……… … 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……….……… … 3

1.1 Giới thiệu về bò cạp……….……… … 3

1.2 Giới thiệu chung về rắn……… … 5

1.2.1 Giới thiệu về rắn cạp nong……… …… … 5

1.2.2 Phân bố sinh thái……… … 6

1.3 Tình hình nghiên cứu về nọc bò cạp……… ……… … 6

1.3.1 Tình hình nghiên cứu nọc bò cạp trên thế giới……… … 6

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bò cạp ở Việt Nam……… ….11

1.4 Tình hình nghiên cứu về nọc rắn……….……… ….12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu về nọc rắn trên thế giới ……… ….12

1.4.2 Những nghiên cứu về rắn cạp nong ở Việt Nam…… …… ………… ….24

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM………… ….27

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… ….27

2.1.1 Khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp H laoticus……… ……… ….27

2.1.2 Khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong B fasciatus……… … ….27

2.2 Thiết bị nghiên cứu……… ….27

2.3 Phương pháp phân lập và xác định các toxin từ nọc bò cạp H laoticus…… 28

2.3.1 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus…… ….28 2.3.2 Tách protein trong nọc bò cạp H laoticus bằng sắc ký lọc gel trên cột

2.3.3 Phân tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao pha đảo (RP-HPLC)……… ….31 2.3.4 Khảo sát tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò

cạp H laoticus lên quá trình đông – chảy máu……… ….32 2.3.5 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính chống đông máu ….38

2.4 Phương pháp phân lập và xác định các toxin từ nọc rắn cạp nong B

fasciatus ….38

2.4.1 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B

fasciatus ….38

2.4.2 Tách protein trong nọc rắn cạp nong B fasciatus bằng sắc ký lọc gel

trên gel Superdex HR75 .39

2.4.3 Khảo sát KLPT các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus

2.4.4 Khảo sát tác dụng giảm đau……… ….44

2.4.4.1 Khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B

fasciatus toàn phần và các phân đoạn ……….………….……… ….45

2.4.4.2 Khảo sát tác dụng giảm đau trung ương của nọc rắn cạp nong B

fasciatus toàn phần và các phân đoạn ……… …46

2.4.5 Tách các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4 nọc rắn cạp nong B

fasciatus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC)………… …48 2.4.6 Khảo sát hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp tách ra từ

2.4.7 Phân tích thống kê kết quả thử hoạt tính giảm đau……… …50 2.4.8 Phương pháp xác định KLPT của protein có hoạt tính giảm đau……… …50 2.4.9 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của nọc thô và các phân

đoạn rắn cạp nong B fasciatus theo phương pháp MTT……… …51

2.4.10 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào …55

2.4.10.1 Xác định KLPT dựa trên MALDI TOF/TOF MS ……… …55

2.4.10.2 Xác định trình tự amino acid dựa trên LC-MS/MS.………… … .55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN……… ….57

3.1 Kết quả về bò cạp H laoticus……… ….57

3.1.1 Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H laoticus……….……….……… ….57

3.1.2 Tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) ……….……… ….59

3.1.3 Tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò cạp H laoticus lên quá trình đông - chảy máu……… …… ….60

3.1.4 Làm sạch hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 và 5.22……….……… ….63

3.1.4.1 Làm sạch phân đoạn 5.5 ……… .63

3.1.4.2 Làm sạch phân đoạn 5.22 ……… ………… ….64

3.1.5 Hoạt tính chống đông máu của phân đoạn 5 và các hợp chất sạch: 5.5.1, 5.22.3, 5.21.1 (dipeptide Leu – Trp)……… … ….65

3.1.6 Xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống đông máu (5.5.1 và 5.22.3) từ phân đoạn 5.5 và 5.22 bằng MS và NMR………… ……… .69

3.1.6.1 Cấu trúc của toxin 5.5.1……… 69

3.1.6.2 Cấu trúc của toxin 5.22.3 ……… …72

3.2 Kết quả về rắn cạp nong B fasciatus……… … ….75

3.2.1 Sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B fasciatus……… … ….75

3.2.2.Xác định KLPT của các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus bằng phương pháp điện di ….76

3.2.3 Tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần và các phân đoạn……… ……… ….78

3.2.4 Tác dụng giảm đau trung ương của nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần và các phân đoạn……….……… ……….…… ….79

3.2.5 Phân tách phân đoạn BF4 từ nọc rắn cạp nong B fasciatus có hoạt

tính giảm đau bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC)….……… ….81 3.2.6 Hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4 ….81 3.2.6.1 Giảm đau ngoại biên……… ……… ….81 3.2.6.2 Giảm đau trung ương……… ………… ….84 3.2.7 Xác định KLPT của protein BF4.11 và protein BF4.12 có hoạt tính

giảm đau……… ……… ……….… ….86

3.2.8 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của nọc rắn cạp nong B

fasciatus……….……… ….87 3.2.8.1 Khả năng gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của nọc thô (BF) và

các phân đoạn (BF1 – BF5) ……….……… ….87 3.2.8.2 Khả năng gây độc tế bào ung thư phổi A549 của nọc thô (BF) và

các phân đoạn (BF1 – BF5) ……….……… ….89 3.2.9 Phân lập phân đoạn BF3 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC) ….91 3.2.10 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi A549

của các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) từ phân đoạn

BF3… ….92 3.2.10.1 Khả năng gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các phân đoạn

thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) ……… ….92 3.2.10.2 Khả năng gây độc tế bào ung thư phổi A549 của các phân đoạn

thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4)……… ….94 3.2.11 Khả năng gây độc tế bào thường HK2 ở người của nọc thô (BF), các

phân đoạn (BF1 – BF5) và các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3,

3.2.12 Xác định cấu trúc bậc một (trình tự amino acid) của protein 3.3 có

hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi A549………… ….97 3.2.12.1 Xác định KLPT của BF3.3 dựa trên MALDI TOF/TOF MS … ….97 3.2.12.2 Xác định trình tự amino acid của protein 3.3 dựa trên LC-

KẾT LUẬN ……… 101

KIẾN NGHỊ……… ……… 103

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN……… 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….……… .106

PHỤ LỤC……… .118

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3FTx Three – Finger Toxin

ADP Adenosine di phosphate

aPTT Activated partial thromboplastin time

A549 Adenocarcinoma human alveolar basal

epithelial cells

B fasciatus Bungarus fasciatus Rắn cạp nong

BF Bungarus fasciatus

BF – CT Bungarus fasciatus Cytotoxin

BF – LAAO Bungarus fasciatus – L - amino acid

oxidase BFPA Bungarus fasciatus Phospholipase A2

BFV Bungarus fasciatus venom Nọc rắn cạp nong toàn

phần (thô)

BF1 - BF5 Fraction 1 – Fraction 5 Phân đoạn 1 đến 5 (sau

khi chạy sắc ký lọc gel nọc rắn cạp nong)

BF3.1 - BF3.4 Fraction 3.1 – Fraction 3.4

Phân đoạn thứ cấp 3.1 đến 3.4 của phân đoạn

3 (sau khi chạy sắc ký pha đảo nọc rắn cạp nong)

Cell viability (% of control) Lƣợng tế bào sống (%) Concentration (µg/mL) Nồng độ (µg/mL)

cDMEM Complete Dulbecco's Modified

Eagle Medium

EAC Ehrlich ascites carcinoma

EC50 Half maximal effective concentration Nồng độ hiệu quả trung

bình EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ESI-MS Electrospray ionization mass

spectrometry

FDA Food and Drug Administration

H laoticus Heterometrus laoticus Bò cạp đen

HPLC High Performance Liquid

MALDI Matrix-assisted laser

desorption/ionization MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7

MTT 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,

5-diphenyl-2H-teyrazolium bromide Thuốc thử MTT

bình, g/mol nAChRs Nicotinic Acetylcholine receptors

NMR Nuclear Magnetic Resonance

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

PBS Photphat buffer saline

chạy sắc ký)

PL Phụ lục PLA2 Phospholipase A2

Q-TOF Quardrupole - Time of flight

RPC Reversed phase chromatography

RP-HPLC Reversed phase - High Performance

Liquid Chromatography SDS Sodium dodecyl sulfate

Sephadex G-50 Sephadex G series number 50

Superdex HR75 Superdex High Resolution 75

TFA Trifluoroacetic acid

TNF Tumor necrosis factor

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc bậc một của một số chất ức chế ion quan trọng từ bò cạp……….… 7

Bảng 1.2 Một số hợp chất/peptide có hoạt tính từ nọc bò cạp……… 10

Bảng 1.3 Cấu trúc hoặc chuỗi amino acid của thuốc được chế tạo từ các thành phần nọc độc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng……… ……13

Bảng 1.4 Thuốc từ nọc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng……… ……15

Bảng 1.5 Một số toxin được phân lập từ loài cạp nong – cạp nia……… 16

Bảng 1.6 Ứng dụng của nọc thô/toxin phân lập từ loài cạp nong – cạp nia………….…17

Bảng 2.1 Thành phần bản gel……….….42

Bảng 2.2 Thành phần dung dịch xử lý protein……….….43

Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm chạy điện di……….….43

Bảng 2.4 Thành phần dung dịch nhuộm Comassie Blue R-250………43

Bảng 2.5 Thành phần dung dịch giải nhuộm……… …… 44

Bảng 3.1 Khối lượng 5 phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sau khi chạy lọc gel …….….57

Bảng 3.2 Thời gian chảy máu của các phân đoạn có tác động chống đông máu từ nọc thô bò cạp H laoticus … ……….……… 58

Bảng 3.3 Thời gian đông máu của các phân đoạn có tác động chống đông máu từ nọc thô bò cạp H laoticus ……… ……… ….59

Bảng 3.4 Thời gian chảy máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 nọc bò cạp H laoticus ……….……… ……… 61

Bảng 3.5 Thời gian đông máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 nọc bò cạp H laoticus ……… 62

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình đông máu………… ……65

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình chảy máu……… 66

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu……… 67

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu ……… ………68

Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.5.1 và hợp chất tham khảo……… 70

Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.22.3 và hợp chất tham khảo……… …74

Bảng 3.12 Khối lượng 5 phân đoạn nọc rắn B fasciatus sau khi chạy sắc kí lọc gel 76

Bảng 3.13 Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF1 – BF5……… … 78 Bảng 3.14 Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF1 – BF5… 80 Bảng 3.15 Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15… ……….….82 Bảng 3.16 Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15………84 Bảng 3.17 Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5)……….……….88 Bảng 3.18 Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của nọc thô (BF) và phân đoạn BF3

……… ……… ……… ….89 Bảng 3.19 Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5)……… ……… ….… 90 Bảng 3.20 Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của nọc thô (BF) và phân đoạn BF3

……….91 Bảng 3.21 Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của phân đoạn BF3 và (BF3.1 - BF3.3)……… 93 Bảng 3.22 Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của phân đoạn BF3 và BF3.3.……….94 Bảng 3.23 Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của phân đoạn BF3 và (BF3.1 - BF3.3)……… 94 Bảng 3.24 Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của phân đoạn BF3 và BF3.3….… 96

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bò cạp đen Heterometrus laoticus ……… ……….5

Hình 1.2 Rắn cạp nong Bungarus fasciatus……… ……… ….5

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của các chất độc 3 ngón tay – 3FTx……… …… ……20

Hình 2.1 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus………….…28

Hình 2.2 Sơ đồ đông máu………34

Hình 2.3 Cơ chế tác động của các thuốc trên dòng thác đông máu……… 34

Hình 2.4 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn B fasciatus……….39

Hình 3.1 Sắc ký đồ sắc kí lọc gel của nọc bò cạp H laoticus……… …….57

Hình 3.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) của phân đoạn 5 (PĐ5) nọc bò cạp H laoticus ……….……… 60

Hình 3.3 Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian chảy máu……… ……… … 61

Hình 3.4 Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian đông máu……… ……… … 62

Hình 3.5 Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.5……… ……63

Hình 3.6 Sắc ký đồ của chất có hoạt tính chống đông máu 5.5.1……….… 64

Hình 3.7 Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.22………64

Hình 3.8 Sắc ký đồ của chất có hoạt tính chống đông máu 5.22.3……….……65

Hình 3.9 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu……… 67

Hình 3.10 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu……….… 68

Hình 3.11 Phổ MS của 5.5.1……… ……… ….69

Hình 3.12 Cấu trúc của toxin 5.5.1 (Adenosine)……… ….72

Hình 3.13 Phổ MS của 5.22.3……… ……….72

Hình 3.14 Cấu trúc của toxin 5.22.3 (Ile-Trp)……….………… 75

Hình 3.15 Hình sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B fasciatus……….….76

Hình 3.16 Hình điện di nọc rắn cạp nong B fasciatus……… ….… 77

Hình 3.17 Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF1 – BF5………… … … 79 Hình 3.18 Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF1 –

BF5……….… 80

Hình 3.19 Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF4 ……… … 81 Hình 3.20 Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15………… 83 Hình 3.21 Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF4.7 –

BF4.15……… ……… …85

Hình 3.22 Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF3.………92 Hình 3.23 Phổ MALDI-TOF/TOF-MS của các phân đoạn (BF3.1 – BF3.4) nọc rắn B

fasciatus……… 98 Hình 3.24 Khối phổ phân giải cao (HR-MS) của BF3.3 …… ……… ………99

Hình 3.25 Trình tự amino acid của protein 3.3 ……… ……… 100

loài rắn đuôi chuông Nam Mỹ Crotalus durissus terrificusas có tác dụng gây giảm đau

cao hơn khoảng 500 lần so với morphine hoặc Hannalgesin - một neurotoxin chuỗi dài

phân lập được từ loài rắn Ophiophagus hannah, độc tố thần kinh này có tác dụng tạo ra

giảm đau trong phạm vi liều 16–32 ng/g mà không gây ra bất kỳ rối loạn thần kinh hoặc cơ [1] Ngoài tác dụng gây giảm đau thì các toxin còn có khả năng gây độc tế bào khối u như hoạt tính gây độc tế bào của cytotoxin 1 (CTX1) - 6,7 kDa từ nọc rắn hổ

mang Naja atra Cantor lên bốn dòng tế bào khối u theo thứ tự MCF-7> P388 ≈ K562>

H22 ≈ 16HBE (dòng tế bào người bình thường) đã phản ánh tính chọn lọc của hoạt tính

từ toxin này [1] Bên cạnh nọc rắn thì nọc bò cạp chứa nhiều các polypeptide toxin, có tác động lên các receptor và các kênh ion của màng tế bào, đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu để điều chế ra các loại thuốc chữa bệnh như Parkinson, bệnh cao huyết áp, ung thư, Alzheimer [2 - 7] Ngày nay, những vấn đề về đột quỵ, mất máu, chậm đông máu, thiếu máu não, hoặc bệnh ung thư đang là vấn đề được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, trong đó có cả Việt Nam

Việt Nam với nguồn nguyên liệu dồi dào về nọc bò cạp và nọc rắn, và cũng đã

có những công trình nghiên cứu về nọc độc của hai loài này Kết quả nghiên cứu từ nọc

bò cạp Heterometrus laoticus cho thấy nọc thô và các phân đoạn có hoạt tính giảm đau, kháng viêm, độc tính với côn trùng Từ phân đoạn 4 của nọc bò cạp Heterometrus

laoticus người ta đã phân lập được toxin Hetlaxin có ái lực mạnh với kênh Kv1.3, còn

từ phân đoạn 5 có độc tính với côn trùng của nọc bò cạp này người ta đã phân lập được một dipeptide đó là Leu-Trp [8] Bên cạnh đó, người ta đã xác định các phân đoạn 2, 4

và 5 của nọc bò cạp H laoticus còn có hoạt tính chống đông máu [9] Bên cạnh các nghiên cứu nọc bò cạp, thì nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus cũng đã có những

công trình nghiên cứu Những kết quả đã công bố cho thấy nọc thô và các phân đoạn từ loài rắn này có hoạt tính giảm đau, kháng viêm, chống đông máu [10-11] Để thừa kế

và phát triển những nghiên cứu về nọc bò cạp H.laoticus và nọc rắn cạp nong

B.fasciatus, tác giả của luận án này đã tiến hành đề tài: “ Phân lập toxin có hoạt tính

chống đông máu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thƣ từ nọc rắn Bungarus fasciatus” Mục tiêu của

luận án là phân lập một số toxin có các hoạt tính kể trên từ nọc bò cạp H.laoticus, nọc rắn B.fasciatus và xác định cấu trúc của chúng, nhằm tìm kiếm ứng dụng của chúng

trong y dƣợc Đề tài này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, hứa hẹn sẽ có nhiều đóng góp mới vào việc nghiên cứu thành phần toxin và hoạt tính sinh học của nọc độc động vật, một lĩnh vực mới và chƣa có nhiều công trình nghiên cứu ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về bò cạp

Bò cạp là loài động vật chân khớp đã có từ lâu đời trên thế giới Trải qua hơn

450 triệu năm tiến hóa, hình dạng của bò cạp không thay đổi nhiều [12 – 13] Bên cạnh việc nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính đa dạng loài, phương diện sinh thái, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu các thành phần của nọc độc bò cạp Hướng nghiên cứu này đang thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì nọc bò cạp chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học

Phân bố địa lý

Bò cạp có thể gặp ở mọi miền địa lý trên thế giới, thường xuất hiện ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Bò cạp sống trong rừng, sa mạc, trong hang và vài loài còn được tìm thấy dưới các tảng đá ở những núi có độ cao 5000 m [14]

Có khoảng 2000 loài bò cạp, thuộc 20 họ khác nhau, phân bố rộng rãi nhất tại những vùng phía nam của vĩ tuyến 45 Bắc (ngoại trừ New Zealand và Nam cực) Ví dụ

như: giống Androctonus, Leiurus: phân bố chủ yếu ở Châu Á, Bắc Phi, Trung Đông [15 – 16]; giống Tityus phân bố ở Nam Mỹ (chủ yếu ở Brazil, Venezuela, Colombia và Argentina) [17]; giống Centruroides phân bố ở Trung Mỹ [18]; giống Heterometrus

phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á (Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam), cũng như Ấn Độ, Sri Lanka, Nepal và Trung Quốc (Tây Tạng) [19 - 20]

Ở Việt Nam, bò cạp phân bố khắp nơi trong nước từ đồng bằng đến miền núi trong những khu rừng ẩm ướt và hải đảo Có bốn họ thuộc bộ Bò Cạp: Buthidae, Scorpionidae, họ Chaerilidae và họ Pseudochactidae Trong đó, họ Buthidae và Scorpionidae chiếm nhiều nhất Chúng phân bố ở các vùng khác nhau [21 – 26]:

Họ Buthidae:

- Loài Lychas mucronatus Fabricius, 1798: phân bố ở các tỉnh miền Trung và

miền Nam, phát triển mạnh về số lượng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phước)

- Loài Isometrus basilicus Karsch, 1879: phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Quảng

Trị, Bình Định, Khánh Hoà (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú)

- Loài Isometrus (Reddyanus) petrzelkai Kovařik, 2003: phân bố ở Nghệ An

(Vinh)

- Loài Isometrus deharvengi Lourenco, 2010: phân bố ở Hòn Chồng, Kiên

Giang

Họ Scorpionidae:

- Loài Heterometrus spinifer Ehrenberg, 1828: phân bố ở Bình Phước (Bù Đốp,

Bù Gia Mập, Đồng Phú)

- Loài Heterometrus petersii Thorell, 1876: phân bố ở thành phố Hồ Chí Minh,

Bình Thuận, Khánh Hoà, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh

- Loài Heterometrus laoticus Couzijn, 1981: phân bố ở Thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Đồng Nai (Biên Hoà), An Giang

- Loài Heterometrus cyaneus C L Koch, 1836: phân bố ở Thừa Thiên Huế,

Quảng Trị

Họ Chaerilidae:

- Loài Chaerilus petrzelkai Kovařík, 2000: miền Nam Việt Nam, đảo Côn Sơn

- Loài Chaerilus variegatus Simon, 1877: miền Nam Việt Nam

- Loài Chaerilus vietnamicus Lourenco and Zhu, 2008: phân bố ở miền Bắc

- Loài Chaerilus julietteae Lourenco, 2011: phân bố ở miền Nam

- Loài Chaerilus phami Lourenco, 2011: tập trung ở đảo Côn Sơn

Họ Pseudochactidae:

- Loài Vietbocap canhi Lourenco & Pham, 2010

- Loài V thienduongensis Lourenco & Pham, 2012

Và trong năm 2013, vừa phát hiện loài bọ cạp mới ở miền núi phía bắc Việt

Nam có tên có tên khoa học Euscorpiops cavernicola Lourenco & Phạm Loài bò cạp

mới này thuộc họ Euscorpiidae, phân bố ở hang Hua Ma, xã Quảng Khê (huyện Ba Bể, tỉnh Bắc Kạn) [27]

Hình 1.1 Bò cạp đen Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 [26]

1.2 Giới thiệu chung về rắn

Loài rắn sinh sống ở khắp nơi trên thế giới ngoại trừ Nam Cực, một số đảo lớn

như Ireland, New Zealand, nhiều đảo nhỏ ở Đại Tây Dương và trung tâm Thái Bình

Dương [28] Trên thế giới, rắn có khoảng gần 3000 loài sống trên cạn, dưới nước và

biển cả, đa dạng nhất là ở những vùng nhiệt đới [29] Riêng 4 loài rắn hổ mang, cạp

nong và cạp nia rất phổ biến ở các nước Châu Á Ở Việt Nam, rắn phân bố ở khắp nơi

từ vùng núi đến trung du, đồng bằng, thường gặp trong rừng thưa, hang hốc, bờ bụi, gò

đống, vườn tược [30 - 31]

1.2.1 Giới thiệu về rắn cạp nong

Rắn cạp nong có tên khoa học: Bungarus fasciatus Schneider (1801), thuộc họ

Rắn Hổ (Elapidae), chi Cạp nia (Bungarus) Ngoài ra chúng còn được gọi theo tên phổ

thông là rắn đen vàng, rắn ăn tàn, rắn cạp nong (miền Bắc), rắn mai gầm (miền Nam)

[31 - 32]

Hình 1.2 Rắn cạp nong Bungarus fasciatus [28]

1.2.2 Phân bố sinh thái

Loài rắn cạp nong Bungarus fasciatus (B fasciatus) phần lớn thường tập trung ở

các nước Châu Á, chúng xuất hiện ở vùng phía Bắc Ấn Độ lan sang phía Nam Trung Quốc và đến Việt Nam [28] Đây là loài rắn có sự phân bố rộng nhưng không có nghĩa chúng có mặt phổ biến, chúng được liệt vào sách đỏ Việt Nam ở nhóm IB – động vật cấm khai thác và sử dụng [33] Tình trạng rắn cạp nong tại Việt Nam có sự suy giảm quần thể hơn 50%, sự suy giảm đáng kể này là do việc khai thác môi trường để mở rộng đô thị, săn bắt, buôn bán trái phép [32]

1.3 Tình hình nghiên cứu về nọc bò cạp

1.3.1 Tình hình nghiên cứu nọc bò cạp trên thế giới

 Nghiên cứu ảnh hưởng của các toxin từ nọc bò cạp

Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định trong thành phần nọc bò cạp có rất nhiều các chất có hoạt tính sinh học tác động lên trên hệ thống thần kinh và quá trình đông – chảy máu

Các toxin tác động lên kênh Na+

thường là một chuỗi polypeptide được cấu tạo

từ 60 – 76 gốc amino acid và cấu trúc của chúng được ổn định bởi bốn cầu disulfide [35 – 42] Các toxin tác động lên kênh K+ là những polypeptide ngắn, được cấu tạo từ khoảng 31 – 39 gốc amino acid liên kết với ba hoặc bốn cầu disulfide [3, 43 – 47] Các toxin này liên kết với bề mặt ngoài tế bào và cản trở sự di chuyển qua màng tế bào của kênh K+ [43] Các toxin tác động lên kênh Ca2+ đã được xác định gồm hai peptide, các peptide này làm thay đổi sự liên kết của thụ thể ryanodine với kênh Ca2+

[46 – 48] Trong số đó, có một toxin được xác định là peptide có cấu tạo từ 33 amino acid làm tăng sự liên kết với thụ thể ryanodine, và toxin còn lại là heterodimer peptide cấu tạo từ

104 và 27 amino acid có vai trò làm ức chế sự liên kết với thụ thể ryanodine [48]

Chlorotoxin, độc tố cực độc tác động lên kênh Cl

là peptide cấu tạo từ 36 gốc amino acid với bốn cầu disulfide [47, 49]

Trong khi cấu trúc bậc một của các độc tố nọc bò cạp khác nhau thì cấu trúc không gian của chúng khá giống nhau Trừ cấu trúc không gian của các độc tố tác động lên kênh Ca2+ là chưa biết, phần lớn các peptide độc tố bò cạp đều cấu tạo bởi một alpha-spiral và ba hay bốn nhánh của cấu trúc beta (cấu trúc beta được tạo thành bởi các chuỗi peptide đối song song) và được ổn định bởi các cầu disulfide [35, 43]

Bảng 1.1 Cấu trúc bậc một của một số chất ức chế ion quan trọng từ bò cạp [50]

DKKADSGYCY WVHILCYCYG LPDSEPTGST KC

KDGYPVEGDN CAFACFGYDN AYCDKLCKDK KADDDGYCVW SPDCYCYGLP EHILKEPTKT

SGRC

LKASSGYCAW PACYCYGVPD HIKVWDYATN KC

KKGSSGYCAW PACYCYGLPE SVAIWPSETN KC

ESGYCQWASP YGNACWCYKL PDRVSIKEKG RCN

VRDGYIADDK DCAYFCGRNA YCDEECKKGA ESGKCWYAGQ YGNACWCYKL PDWVPIKQKV

SGKCN

() Mỗi chữ cái là ký hiệu 1 chữ viết tắt của amino acid (PL1)

 Ảnh hưởng lên quá trình đông – chảy máu

Trong tất cả các nghiên cứu về nọc độc, nọc rắn là đối tượng đã được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, và đã phân lập được các thành phần có hoạt tính chống đông

máu và gây xuất huyết từ loại nọc này như: protease, metalloproteinase, C-type lectin, disintegrin và những phospholipase [7] Các thành phần này gây rối loạn tiểu cầu và ảnh hưởng lên quá trình đông máu như: quá trình hình thành phức hợp prothrombinase, quá trình fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin không hòa tan, quá trình hình thành mạng lưới fibrin [51 -52]

Bên cạnh nọc rắn, trong nọc bò cạp của các loài: Buthidae, Caraboctonidae, Iuridae, Ischnuridae, Scorpionidae, Vejovidae,… cũng có nhiều peptide và protein có

hoạt tính chống đông máu [7] Nọc độc của loài Parabuthus transvaalicus, Parabuthus

imperator kéo dài thời gian đông máu từ 2,3 – 2,5 so với thời gian đông máu của mẫu

chứng, đối với một số loài khác chỉ từ 0,8 -2,0 lần [53] Nọc độc của bò cạp Buthus

tamulus cũng gây rối loạn đông máu nội mạch lan tỏa, và được thử nghiệm in vitro ở

liều gây chết đã làm thay đổi cơ chế đông máu của thỏ khi tiêm tĩnh mạch [54] Gần

đây, các nghiên cứu về nọc độc của loài bò cạp Tityus discrepans, cho thấy với hàm

lượng nọc cao khi tiêm vào máu sẽ làm tăng mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng ngộ độc như thay đổi thời gian thromboplastin (PTT) và thời gian prothrombin (PT), gia tăng nồng độ các cytokine, amylase và glucose [55]

Các enzyme phospholipase A2 (PLA2) chống đông máu được phân chia làm 3 nhóm khác nhau về hiệu quả ức chế quá trình chống đông máu: nhóm A là những PLA2 có tác động chống đông máu mạnh, nhóm B là những PLA2 chỉ có tác động chống đông máu ở nồng độ cao, và nhóm C là những PLA2 có tác động chống đông máu ở biên hay không có tác động [56] Những PLA2 được phân lập từ bò cạp được xếp vào giữa nhóm B và nhóm C Trong số 12 PLA2 được phân lập từ các loài bò cạp

như: Anuroctonus phaiodactylus, Pandinus imperator, Opisthacanthus cayaporum,

Hadrurus gertschi,… có enzyme Imperatoxin inhibitor (IpTxi) của Pandinus imperator

và Phaiodactyliphin của Anuroctonus phaiodactylus đã được công bố làm trì hoãn thời

gian đông máu đối với những cơ thể sống có số lượng tiểu cầu thấp và lượng huyết tương cao [57 – 58]

Imperatoxin inhibitor (IpTxi) và Phaiodactylipin là hai peptide được phân lập từ

nọc độc của loài bò cạp Pandinus imperator, đã được xác định làm trì hoãn thời gian

đông máu trên cơ thể sống [58] IpTxi với KLPT 14314 Da và Phaiodactylipin với khối

lượng phân tử 19172 Da So sánh hoạt tính ảnh hưởng lên quá trình đông máu của hai peptide này đã xác định được IpTxi có hiệu quả hơn so với Phaiodactylipin [58]

Bên cạnh những protein có KLPT cao (trên 30 kDa) và những PLA2 có KLPT trong khoảng 14 – 16 kDa, trong nọc độc của bò cạp cũng có những peptide có KLPT

nhỏ có hoạt tính chống đông máu [7] Các nghiên cứu trên nọc độc của loài Buthus

martensii Karsch cũng đã chỉ ra có tác động chống đông máu, nghiên cứu này được

thực hiện trên cả hai phương pháp in vivo và in vitro [59] Qua đó đã phân lập và đặt

tên cho peptide vừa tìm được là peptide scorpion venom active polypeptide (SVAP), peptide này ảnh hưởng lên quá trình tạo cục máu đông và làm thay đổi thromboxane B2

và 6-keto-protaglandin F1[59] Dựa trên peptide này, các nhà khoa học đã nhân bản

thành công một peptide mới và đặt tên là peptide Buthus martensii Karsch APi

(BmKAPi) [60] BmKAPi được mã hóa từ peptide cấu tạo gồm 89 amino acid và năm cầu disulfide [60] Có cấu tạo khác so với các peptide có trong nọc độc bò cạp nên cấu trúc ba chiều của BmKAPi có thể cũng sẽ khác Nghiên cứu trình tự amino acid của BmKAPi đã xác định hoạt tính chống đông máu của BmKAPi thấp hơn so với một số peptide chống đông máu được phân lập từ giun móc, ong mật [60] Gần đây, nhà khoa học Brazil và các đồng nghiệp của mình đã đưa ra một peptide ức chế plasmin, có KLPT khoảng 6000 Da, có hoạt tính chống tiêu sợi huyết tương có tên gọi là

discreplasminin, được phân lập từ loài bò cạp Tityus discrepans và đang tiếp tục nghiên

cứu các thành phần có hoạt tính từ nọc của loài này [61 – 62]

 Nghiên cứu về bò cạp H laoticus

Từ nọc độc của loài bò cạp H laoticus người ta đã phân lập được hai toxin

Toxin đầu tiên được phân lập là Heteroscorpine-1 (HS-1) thuộc họ Scorpine từ nọc bò

cạp H laoticus ở Thái Lan có khối lượng phân tử là 8293 Da với 6 gốc cysteine [63]

Toxin này đã được xác định có độc tính đối với côn trùng và có tính kháng khuẩn,

kháng nấm [63] Toxin thứ hai đã được tách từ nọc độc của bò cạp H laoticus bằng

phương pháp sắc ký lỏng cao áp, và đã xác định là polypeptide HelaTx1 có khối lượng phân tử là 2763 Da với 4 gốc cysteine [64] HelaTx1 tác động có hiệu quả đối với kênh

Kv1.1 và Kv1.6 với nồng độ thấp (Kv1.1 EC50 = 9,9 ± 1,6 µM), tuy nhiên lại không làm

thay đổi sự hoạt động của các kênh K+

này [64] HelaTx1 là peptide đầu tiên đã được

phân lập từ nọc bò cạp H laoticus có tác động lên kênh κ-KTx5 [64]

 Các ứng dụng từ nọc bò cạp

Từ các toxin tác động lên kênh K+, các nhà khoa học đã thử nghiệm sản xuất ra các loại thuốc điều trị các bệnh thần kinh như: Azheimer, Parkinson, [3, 6, 43]…

Margatoxin tách từ nọc bò cạp Centruroides margaritatus đã được hãng Merck (Đức)

đăng kí bản quyền như thuốc để điều trị bệnh tự miễn dịch hoặc ngăn cản sự đào thải trong quá trình cấy ghép các cơ quan [65 – 66 ]

Vào năm 1991, ông DeBin - nhà độc chất học đã chứng minh trong nọc bò cạp chứa chất chlorotoxin cực độc có tác động ức chế kênh vận chuyển clo qua màng tế bào [5, 67 - 68] Tác giả đã tiêm chất độc này vào chuột và quan sát hiện tượng biến đổi điện thế màng tế bào Điện thế màng tăng lên, từ -90 mV đến -20 mV và kéo dài trong khoảng 6 giây, điều này được giải thích là do sự ức chế kênh Cl- gây ra và có ý nghĩa lâm sàng lớn [48, 68] Dựa trên cở sở này, đã có những nghiên cứu phân lập

chlorotoxin từ nọc bò cạp Leiurus quinquestritus và đã được sử dụng để điều trị bệnh

ung thư não [68]

Từ nọc bò cạp xanh Rhppalurus junceus, các nhà khoa học Cuba đã bào chế ra

thuốc điều trị ung thư Vidatox, có tính kháng tế bào ung thư và kháng viêm cao [6] Dưới tác động của chất này, khối u không phát triển được do bị ngăn chặn sự nuôi dưỡng từ mạch máu và đưa đến các chất gây miễn dịch tại khối u Điều này đã mở ra hi vọng mới cho các bệnh nhân ung thư [4, 6]

Bmk AGAP Peptide giảm đau, kháng khối u Liu et al., 2003

Bên cạnh tác động gây độc thần kinh đã được nghiên cứu và khảo sát thì tác động gây rối loạn đông máu của nọc bò cạp cũng đã mở ra nhiều triển vọng mới trong

y học để điều trị tình trạng rối loại đông máu gây ra các bệnh có tỷ lệ tử vong cao [7, 70] , ảnh hưởng lên hệ tim mạch, hệ miễn dịch [71 – 72] Các nhà khoa học đã xác định được những protein, enzyme phospholipase có tác động lên quá trình đông – chảy máu và đang tiếp tục nghiên cứu để đưa vào ứng dụng [7]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bò cạp ở Việt Nam

Tại Việt Nam, một số loài bò cạp đã được nghiên cứu tính chất và thành phần

như: Lychas mucronatus, Heterometrus laoticus

Từ nọc bò cạp nâu Lychas mucronatus, nhóm nghiên cứu của tác giả Hoàng

Ngọc Anh cho thấy trong nọc này có hai nhóm toxin với khối lượng phân tử 5.000 Da và 6.000 – 8.000 Da Từ nọc bọ cạp này nhóm tác giả đã tách ra và khảo sát tính chất bảy toxin ngắn (KLPT từ 3.500 – 5.000 Da) Các neurotoxin này ức chế điện thế tác dụng của dòng điện Na+ trên dây thần kinh ếch và tác dụng này phụ thuộc vào khối lượng phân tử của các toxin [26, 43] Cấu trúc bậc một của một trong những độc

3.500-tố thần kinh này đã được xác định và đăng ký ở ngân hàng dữ liệu protein [26] Trong khi đó một phần cấu trúc bậc một của một độc tố khác cũng đã được xác định Ngoài

ra, nhóm nghiên cứu này đã xác định độc tính cấp và tác động kháng viêm giảm đau

của nọc bò cạp nâu Lychas mucronatus [73]

Đối với nọc bò cạp đen Heterometrus laoticus, năm 2017, tác giả Võ Đỗ Minh

Hoàng [8] cũng đã có nghiên cứu về nọc bò cạp này, qua đó đã xác định loại nọc này

có độc tính cấp với LD50 là 12,4 ± 0,46 mg/kg theo phương pháp Miller – Tainter Từ nọc thô tách được 5 phân đoạn, trong đó có ba phân đoạn (2,3 và 4) có độc tính Phân đoạn 4 độc gây chết trên chuột với LD50 24,07 ± 1,09 mg/kg Đối với dế, chỉ có phân đoạn 5 có độc gây chết với LD50 = 180,35 ± 23,99 µg/g, nọc toàn phần có tác động kháng viêm, giảm đau [73, 74 – 75] Từ phân đoạn 4 đã phân tách được một toxin được đặt tên là Hetlaxin có KLPT là 3669,2 Da với 8 gốc cysteine hình thành nên 4 cầu

disulfide, đây là toxin tác động lên kênh Kv1.3 với nồng độ nanomol (EC50 = 0,48 ±

0,01 µM), toxin này lần đầu tiên được phân lập từ nọc bò cạp H laoticus Từ phân

đoạn 5 được phân tách thành 24 phân đoạn thứ cấp, từ phân đoạn 5.21 tách được hai chuỗi polypeptide 5.21.1 và 5.21.2 với KLPT xác định được lần lượt là 318,0 Da và 832,6 Da Sử dụng phổ NMR đã xác định được cấu trúc của toxin 5.21.1 là Leu-Trp [76 – 77]

Bên cạnh đó, qua những nghiên cứu sơ bộ ban đầu cho thấy nọc bò cạp

H.laoticus còn chứa các thành phần tác động lên quá trình đông – chảy máu, đây là một

hoạt tính mới phát hiện của nọc bò cạp H laoticus [34, 78, 9] Nghiên cứu ban đầu về tác động chống đông máu của các phân đoạn được tách ra từ nọc bò cạp H laoticus

bằng sắc ký lọc gel cho thấy 3 phân đoạn có tác động đông – chảy máu, đó là: phân đoạn 2, phân đoạn 4 và phân đoạn 5 [9] Kết quả nghiên này đã định hướng cho những

nghiên cứu sâu hơn về các toxin có hoạt tính chống đông máu trong nọc bò cạp H

laoticus

1.4 Tình hình nghiên cứu về nọc rắn

1.4.1 Tình hình nghiên cứu về nọc rắn trên thế giới

Rắn được chia làm 3 họ chủ yếu: Họ rắn hổ (Elapidae) gồm: Hổ mang bành

(Naja atra), Hổ đất (Naja kaouthia), Hổ mèo (Naja siamensis), Hổ chúa (Ophiophagus

hannah), Cạp nia (Bungarus candidus), Cạp nong (Bungarus fasciatus); Họ rắn lục

(Viperidae) gồm: Lục tre (White lipped green pit viper, Trimeresurus albolabris,

Chàm quạp (Malayan pit viper, Calloselasma rhodostoma và Họ Colubridae

Một số toxin được phân lập từ các loài rắn cùng với hoạt tính và ứng dụng của

nó trong các bảng dưới đây:

Bảng 1.3 Cấu trúc hoặc chuỗi amino acid của thuốc được chế tạo từ các thành

phần nọc độc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng [1]

Captopril

Eptifibatide

Tirofiban

α-Cobratoxin

Bảng 1.4 Thuốc từ nọc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng [1]

dụng

Captopril

Dẫn xuất của potentiating peptide từ

bradykinin-loài Bothrops jaracusa

Điều trị tăng huyết

Eptifibatide

Dẫn xuất của disintegrin

từ loài Sistrurus miliarus

quốc gia ngoài Mỹ

Hemocoagulase

Thromboplastin-like và thrombin-like enzymes từ

loài B atrox

Điều trị xuất huyết

FDA không chấp nhận nhưng đã được bán ở một số

quốc gia ngoài Mỹ

Ximelagatran Peptides từ loài rắn hổ

mang Cobra Thuốc kháng đông

Đã được chấp nhận

ở một số quốc gia nhưng đã rút khỏi

thị trường; gần đây

có nghiên cứu lâm

sàn giai đoạn III

Naja kaouthia, tương ứng

Thuốc giảm đau

Theo nghiên cứu lâm sàn trên người

ở Trung Quốc

Bảng 1.5 Một số toxin được phân lập từ loài cạp nong – cạp nia [79]

1975 B.F.III B fasciatus Hậu synap Jiang et al, 1986

κ 2-

BUNGAROTOXIN B multicinctus

Sự truyền tải đối

kháng của nicotinic Chiappinelliet al,

1990

γ-

BUNGAROTOXIN B multicinctus

Collagen ức chế giảm kết tập tiểu

cầu

Chang et al, 2002 α-

BUNGAROTOXIN B candidus Hậu synap Kuchet al, 2003 ALPHA N3 B candidus Hậu synap Karsaniet al, 2009

BUCAIN B candidus Độc tố thần kinh Murakami et al,

2009

FRACTION X B fasciatus Tác nhân hoạt hóa

X (factor X) Zhang et al, 1995

BF-F47 B fasciatus Độc tố protein Gomes et al, 2016

BF-CT1 B fasciatus Độc tố tế bào Bhattacharya et al,

2013 BFAC-1, & 2 B fasciatus Protein, PLA2

chống đông máu Chen et al, 2014 BF-15 B fasciatus Cathelicidin Chen et al, 2011

BF-IV8, BF-V4 B fasciatus Protein chống đông

máu UTKIN et al., 2015 α-ELAPITOXIN-

viêm

Wang et al, 2008

BFPA B fasciatus venom Kháng vi khuẩn Xu et al, 2007

Crude venom Bungaurs sp

Kháng HIV, FIV và bệnh sởi

Neri et al, 1990; Sönnerborg et al,

1993 Whole venom B caeruleus

Chống ký sinh trùng đơn bào Leishmania

Bhattacharya (2014)

α-BUNGAROTOXIN B multicinetus Kháng ung thư Kuch et al, 2003;

Calderon et al, 2014 Whole venom

2013 Whole venom B fasciatus Kháng viêm khớp Ghosh et al, 2015 BFV-F47 B fasciatus Kháng viêm khớp Gomes et al, 2016 BFAC-1, & 2 B fasciatus

Protein, PLA2 chống đông

máu Chen et al, 2014

BF-IV8 B fasciatus Protein chống đông

máu UTKIN et al., 2015 BF-V4 B fasciatus Protein chống đông

máu UTKIN et al., 2015

 Thành phần nọc cạp nong B fasciatus

Nọc cạp nong chứa chủ yếu phospholipase A2 (PLA2), chất độc thần kinh (neurotoxin), các chất ức chế protein kiểu Kunitz Một ít các enzyme có khối lượng phân tử lớn như L-amino acid oxidase (LAAOs), hyaluronidases (enzyme gây xuất huyết, giúp nọc mau chóng hòa tan vào máu con mồi), và enzyme xúc tác cho việc dẫn truyền thần kinh acetylcholinesterase [80 – 81] Ngoài ra, nghiên cứu gần đây từ nọc cạp nong Malaysia người ta đã tìm thấy độc tố cạp nia bungarotoxin – một loại độc tố

thần kinh chỉ có duy nhất trong nọc cạp nia (Bungarus candidus) theo các tài liệu trước

đây [81 – 82] Độc tố thần kinh trong nọc cạp nong là các neurotoxin khác nhau bao gồm α-neurotoxin, κ-bungarotoxin và β-bungarotoxin [83] Hai loại toxin đầu tiên thuộc dòng chất độc ba ngón tay (3FTx), nhưng loại toxin thứ 3 lại thuộc dòng dị thể dimer phospholipase A2 [84] Tuy cùng một chi cạp nia (Bungarus) nhưng tỉ lệ thành

phần nọc độc của 2 loài rắn cạp nong và cạp nia không giống nhau [80 – 81] Thành phần chiếm chủ yếu trong nọc cạp nong là PLA2, sau đó đến các loại neurotoxin và các thành phần khác chiếm số ít Ngược lại đối với nọc cạp nia, neurotoxin chiếm tỉ lệ cao

nhất, tiếp sau đó là PLA2, do vậy nọc cạp nia thường có nguy cơ gây tử vong cao do việc tác động mạnh lên hệ thần kinh gây co cứng cơ, tê liệt cơ hoành, suy hô hấp và tử vong rất nhanh [85]

 Cấu trúc các toxin từ nọc cạp nong B fasciatus:

Các độc tố thần kinh được chia thành 3 loại: alpha-neurotoxin, bungarotoxin và muscarinic Mỗi loại chất độc này liên kết với các thụ thể nhất định gây ra các tác dụng dược lý khác nhau [83, 86]

kappa-● Alpha-Neurotoxin Những độc tố này có khả năng ngăn chặn sự dẫn truyền

thần kinh bằng cách liên kết đặc biệt với các thụ thể nicotinic acetylcholine (nAChRs) trên lớp màng của khung cơ hay các neuron hậu thần kinh Theo cấu trúc chúng được chia thành hai nhóm chính là α-neurotoxin ngắn (57-64 gốc amino acid với bốn cầu disulfide) và các α-neurotoxin dài (66-79 gốc amino acid với năm cầu disulfide) Những toxin này có cấu trúc không gian giống nhau (cấu trúc dạng ba ngón tay) nhưng cấu trúc bậc một của chúng rất khác nhau Các neurotoxin dài kiên kết mạnh với cả hai loại thụ thể nAChR của khung cơ (loại α1) và tế bào thần kinh (loại α7), trong khi đó các neurotoxin ngắn chỉ tác dụng mạnh với thụ thể nAChR của khung cơ (loại α1) [83, 86]

● Kappa-Bungarotoxin liên kết đặc hiệu với các thụ thể thần kinh nicotinic

acetylcholine và có cấu trúc tương tự các α-neurotoxin dây dài với 66-74 amino acid và

5 cầu disulfide Tuy nhiên, các κ-bungarotoxin tồn tại ở dạng dimer, khác với các toxin

3 ngón tay [86]

● Muscarinic toxin liên kết đặc hiệu với thụ thể muscarinic acetylcholine

(mACh) [86]

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của các chất độc 3 ngón tay – 3FTx [83]

Các neurotoxin hậu synap thường xuất hiện nhiều trong thành phần nọc của rắn cạp nong Các loại neurotoxin này kết hợp với các thụ thể nicotinic (N) loại cơ và ngăn chặn sự liên kết với các chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine Một loại neurotoxin hậu synap được phân lập trong nọc cạp nong Malaysia có tên gọi là alpha-elapitoxin-Bf1b, độc tố này có khối lượng phân tử bằng 6,9 kDa và có trình tự amino acid tương khớp đến 72% với một loại độc tố ba ngón tay đã tìm thấy trước đây trong nọc cạp nong là Neurotoxin 3FTx-RI [82] Độc tố alpha-elapitoxin-Bf1b thuộc nhóm neurotoxin ngắn mạch gồm 62-64 amino acid với 4 cầu disulfide, chúng tương tác mạnh mẽ với thụ thể thần kinh cơ nicotinic acetylcholine Ngoài ra nghiên cứu này còn cho thấy alpha-elapitoxin-Bf1b gây độc thần kinh nhiều hơn alpha-bungarotoxin (độc

tố cạp nia) ở cùng một nồng độ, tuy vậy mà alpha-elapitoxin-Bf1b không phải là thành phần chính của nọc cạp nong do đó khả năng chúng thể hiện độc tính là rất ít

 Phospholipase A2

PLA2 được biết đến là một thành phần chiếm tỷ lệ lớn nhất trong nọc cạp nong, chúng là các enzyme xúc tác cho sự thủy phân tại liên kết acyl sn-2 của các màng phospholipid, tạo thành acid arachidonic và acid lysophosphatidic Các acid arachidonic được biến đổi thành các hợp chất có hoạt tính gọi là eicosanoid Eicosanoid bao gồm prostaglandin, thromboxane và leukotriene, chúng là các chất trung gian gây viêm sưng Còn các lysophospholipid như một chất hoạt động bề mặt, chúng phá vỡ màng erythrocyte gián tiếp gây ra sự tan huyết [85] PLA2 có nhiều trong nọc rắn, chúng được xem như là một loại độc tuần hoàn do vậy khi nạn nhân bị rắn

cắn, hàm lượng PLA2 tăng lên làm sinh ra một lượng lớn các acid arachidonic gây viêm sưng tại vết thương Một PLA2 được phân lập từ nọc cạp nong lấy từ tỉnh Quảng Tây, Trung Quốc có cấu trúc là một chuỗi gồm 145 amino acid chứa 14 phân tử cystein được cố định bằng 7 liên kết disulfide [87]

Ngoài tác động gây độc tuần hoàn, PLA2 trong nọc rắn cũng ảnh hưởng đến các

tế bào thần kinh tiền synap, các chất độc thần kinh tiền synap từ nọc độc rắn đã được báo cáo cho đến nay hầu hết là phức hợp protein PLA2 Chúng liên kết với thụ thể hoặc các vùng lipid trong màng tế bào ở khớp nối thần kinh cơ và thay đổi chức năng của màng, kết quả gây ra sự thiếu hụt điện thế trên màng do một lượng lớn dòng ion Ca2+

từ môi trường bên ngoài cung cấp vào, gây ra sự tê liệt [85]

 Độc tế bào L-amino acid oxidase (LAAO)

LAAOs từ nọc rắn làm xúc tác cho quá trình oxi hóa khử amin của một số nhóm

L - amino acid tạo thành keto acid, nhóm NH4+ và H2O2 Nọc độc của các loài rắn hổ và rắn lục rất giàu LAAOs Hầu hết các LAAOs từ nọc rắn thường là các homodimers (đồng nguyên dimer) với nhiều tiểu đơn vị protein tương đồng kết hợp lại, có trọng lượng phân tử khoảng 50-70 kDa [88]

Một nghiên cứu từ nọc cạp nong lấy tại tỉnh Quảng Châu - Trung Quốc, phân lập được một LAAOs có khối lượng phân tử trong khoảng 55-70 kDa, được đặt tên là BF-LAAO [89] Chất độc này có trình tự amino acid tương khớp với trình tự amino acid của một LAAOs được phát hiện lần đầu tiên từ loài rắn hổ mang Naja Naja vào năm 1992 BF-LAAO có hoạt tính gây độc tế bào và gây viêm nặng ở dạ dày chuột sau

3 giờ tiêm phúc mô, đó có thể là nguyên nhân chính gây ra chứng viêm sưng, nóng đỏ, đau tấy của nạn nhân sau khi bị rắn cắn Ngoài ra, chúng còn có khả năng gây tập kết tiểu cầu

 Tác dụng dược lý của nọc cạp nong trên thế giới:

 Tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn

Nọc cạp nong với liều 1,25 mg/kg có tác dụng ức chế các yếu tố trung gian gây viêm cytokine như TNF-α, IL-1β and IL-17 và có thể khôi phục lại cân bằng của các loại cytokine, giúp chúng hoạt động như một tác nhân chống viêm làm giảm thể tích tai chuột tương đương với thuốc kháng viêm thông thường Indomethacin liều 1,0 mg/kg

thể hiện qua mô hình in vivo gây viêm tai chuột Mặt khác, khảo sát một nhóm chuột

viêm khớp được điều trị bằng nọc cạp nong, hàm lượng glucosamine tăng lên rõ rệt trong nước tiểu của chuột, điều này chứng tỏ nọc cạp nong đã cải thiện đáng kể hàm lượng glucosamine, chúng ngăn ngừa việc thoái hóa sụn khớp và tái tạo lại các tế bào sụn [90 – 91] Bên cạnh đó, một loại PLA2 được phân lập từ rắn cạp nong Trung Quốc

có tên BFPA, chúng có tác dụng diệt khuẩn gram dương mạnh mẽ trên mô hình in

vitro, chúng gây ức chế 2 chủng vi khuẩn là Escherichia coli 0,4 mM và Staphylococcus aureus 0,1 mM [87]

 Tác dụng giảm đau

Nọc cạp nong làm giảm cơn đau vì chúng tác dụng thông qua thụ thể thần kinh µ-opioid, một loại thụ thể có ở tủy sống hoặc ở các trung khu thần kinh, chúng có tác dụng ức chế cảm giác đau một cách có chọn lọc Về cơ chế giảm đau của nọc rắn cạp

nong B fasciatus, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng việc hoạt hóa các

thụ thể nicotinic acetylcholin như thụ thể nicotinic acetylcholin loại cơ và đặc biệt là

loại α-7 gây tê liệt cảm giác đau Trong mô hình in vivo gây đau bằng formalin 2,5%,

chuột được điều trị bằng nọc cạp nong liều 1,25 mg/kg và lô thuốc đối chứng Aspirin liều 150 mg/kg, kết quả cho thấy khả năng điều trị bằng nọc cạp nong làm giảm số lần liếm chân chuột tốt hơn cả thuốc đối chứng Aspirin tại các thời điểm khảo sát [90 – 91]

 Tác dụng chống đông máu

BFPA từ nọc cạp nong Trung Quốc, với liều 10,0 mg/mL có tác dụng kéo dài thời gian đông máu hơn lô chứng cùng thời điểm và khi tăng dần nồng độ BFPA thì thời gian đông máu cũng tăng dần, chứng tỏ phospholipase A2 trong nọc cạp nong có tác dụng chống đông máu [87]

 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

● L-amino acid oxidase từ nọc rắn cạp nong (BF-LAAO) [89]

Một loại L - amino acid từ nọc rắn cạp nong tại tỉnh Quảng Tây - Trung Quốc có tên gọi BF-LAAO, chúng gây độc đối với tế bào ung thư phổi ở người (A549) trong

mô hình in vitro, kết quả cho thấy 41,2% lượng tế bào A549 chết thông qua quá trình

diệt tế bào apoptosis sau 12 giờ ủ với nọc cạp nong

● Khả năng gây độc tế bào ung thư của Cathelicidin từ nọc rắn cạp nong [92

- 93]

Cathelicidin-BF (BF-30) là một loại peptide kháng khuẩn được phân lập từ nọc

rắn cạp nong B fasciatus, gồm 30 amino acid Độc tố này đã được nghiên cứu hoạt

tính gây độc tế bào ung thư trên các khối u ác tính đang di căn trong mô hình thử

nghiệm in vitro và in vivo Kết quả cho thấy BF-30 sở hữu khả năng gây độc tế bào ung

thư, chống lại sự di căn và sự hình thành mạch máu nuôi dưỡng khối u ác tính

● Hoạt tính gây độc tế bào của Phospholipase A2 (PLA2)

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng PLA2 tinh sạch từ nọc rắn có đặc tính kháng khối u và chống tạo mạch CC-PLA2-1 và CC-PLA2-2, hai PLA2 phân lập được

từ nọc độc Cerastes cerastes, gây ra sự ức chế phụ thuộc vào liều lượng đối với sự kết

dính và di chuyển của tế bào nội mô vi mạch não người MVL-PLA2, một Asp49 PLA2

có tính axit từ nọc độc Macrovipera lebetina thể hiện hoạt tính chống phân chia bằng

cách ức chế sự kết dính và sự di chuyển của khối u ở người và các tế bào nội mô vi mạch Crotoxin đã được báo cáo là có hoạt tính chống tăng sinh tế bào thông qua điều hòa thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) trên tế bào ung thư biểu mô vảy Mặt khác, việc loại bỏ hoạt tính enzyme của PLA2 bởi 4-BPB (p-bromophenacyl-bromide) thì không làm giảm tác dụng kháng khối u, cho thấy tác dụng kháng khối u là không phụ thuộc vào đặc tính xúc tác enzyme của PLA2 Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoạt tính enzyme của PLA2 không liên quan đến các hoạt tính gây độc tế bào mà cơ chế có thể là sự tương tác với một thụ thể đặc hiệu nào đó Các ảnh hưởng kháng khối u của PLA2 có tính axit từ nọc độc của Bothrops jararacussu, BthA-I-PLA2, được cho là gây

ra quá trình apoptosis ở ung thư biểu mô tuyến vú và bệnh bạch cầu ở người Ngoài ra, các độc tố tế bào hoặc độc tố liên quan đến tim mạch từ nọc độc loài elapid cũng gây tổn thương màng và hoại tử tế bào Những tác động này được thực hiện thông qua sự tương tác trực tiếp của những độc tố này với màng tế bào phospholipid dẫn đến hình thành lỗ màng Hai độc tố tế bào từ nọc rắn hổ mang Cobra, CTX-I và CTX-II, sở hữu hoạt tính kháng ung thư đáng kể thông qua con đường lysosome và sự xâm nhập của cathepsin vào dịch bào mà ít gây ảnh hưởng tới các tế bào bình thường Hơn nữa,

cardiotoxin III, được phân lập từ nọc độc Naja naja atra (Taiwan cobra) cũng cho thấy

khả năng chống xâm lấn và kháng nguyên bào thông qua việc ức chế yếu tố tăng trưởng của tế bào gan (HGF) gây ra quá trình phosphoryl hóa c-Met trong tế bào ung

thư vú ở người [94]

Khunsap và cộng sự đã phân lập được một PLA2 (Drs-PLA2) từ nọc độc của

Daboia russelii siamensis có các hoạt tính tan máu gián tiếp, chống đông máu và gây

độc tế bào Hơn nữa, PLA2 này làm giảm khả năng sống sót của tế bào hắc tố da ở người (SK-MEL-28) theo cách phụ thuộc vào liều lượng cũng như sự di chuyển với

IC50 là 25,6 nM Hơn nữa, Drs-PLA2 ức chế sự xâm chiếm của tế bào hắc tố da (B16F10) trong phổi chuột BALB/c tới 65% [95]

BF-CT1 (Bungarus fasciatus Cytotoxin), một PLA2 protein được phân lập từ

nọc rắn cạp nong B fasciatus bằng sắc ký trao đổi ion có khối lượng phân tử là 13 kDa,

có hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity) trong các mô hình thí nghiệm in vitro và in

vivo Ở mô hình thử nghiệm in vivo trên tế bào ung thư cổ tử cung ở chuột (EAC),

BF-CT1 đã làm giảm tế bào ung thư đáng kể thông qua quá trình đào thải tế bào chết apoptosis, tăng hoạt động của caspase 3, caspase 9 Điều trị bằng BF-CT1 (ở liều 235 µg/kg và 470 µg/kg) làm giảm đáng kể số lượng tế bào EAC khoảng 26,3 % và 48,6%

so với nhóm chứng không được điều trị [96]

Từ những nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng gây độc tế bào ung thư của nọc

rắn cạp nong B fasciatus Điều này góp phần rất ý nghĩa cho y học trong việc điều trị

ung thư bằng những liệu pháp tự nhiên có hiệu quả cao hơn là những phương thức xạ

trị và đem lại hy vọng cho những bệnh nhân ung thư

1.4.2 Tình hình nghiên cứu về rắn cạp nong ở Viêt Nam