Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp heterometrus laoticus và toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn bungarus fasciatus

Những kết quả đã công bố cho thấy nọc thô và các phân đoạn từ loài rắn này có hoạt tính giảm đau,kháng viêm, chống đông máu [10-11].. và phát triển những nghiên cứu về nọc bò cạp H.laoti

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-TRẦN VŨ THIÊN

PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ

NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ

HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG

THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP.Hồ Chí Minh – 2021

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-TRẦN VŨ THIÊN

PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ

NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ

HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TSKH Hoàng Ngọc Anh và TS Phùng Văn Trung

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021

Tác giả luận án

Trần Vũ Thiên

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới TSKH Hoàng Ngọc Anh và TS Phùng Văn Trung - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi vô cùng biết ơn GS.TSKH Utkin Yuri Nikolaevich, Viện Sinh hóa hữu cơ mang tên Shemyakin-Ovchinnikov, Moskva, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc xác định cấu trúc phân tử của các chất.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths.Dược sĩ Nguyễn Thị Thùy Trang – giảng viên bộ môn Dược Lý, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, TS Phạm Đình Chương – giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Tôn Đức Thắng cùng các em Trần Thụy Trúc Vy, Trần Thái Đạt – sinh viên trường Đại học Tôn Đức Thắng, đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc thực hiện khảo sát các tác dụng dược lý của nọc bò cạp và nọc rắn cùng những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, bộ phận đào tạo, phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Trường Đại học Trà Vinh và các đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn

bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả

Trần Vũ Thiên

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan……… ……i

Lời cảm ơn……….………… … ii

Mục lục……… … iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt……… viii

Danh mục các bảng……… …… … xi

Danh mục các hình vẽ, đồ thị……… ………… …xiii

MỞ ĐẦU……… … 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……….……… … 3

1.1 Giới thiệu về bò cạp……….……… … 3

1.2 Giới thiệu chung về rắn……… … 5

1.2.1 Giới thiệu về rắn cạp nong……… …… … 5

1.2.2 Phân bố sinh thái……… … 6

1.3 Tình hình nghiên cứu về nọc bò cạp……… ……… … 6

1.3.1 Tình hình nghiên cứu nọc bò cạp trên thế giới……… … 6

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bò cạp ở Việt Nam……… ….11

1.4 Tình hình nghiên cứu về nọc rắn……….……… ….12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu về nọc rắn trên thế giới ……… ….12

1.4.2 Những nghiên cứu về rắn cạp nong ở Việt Nam…… …… ………… ….24

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM………… ….27

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… ….27

2.1.1 Khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp H laoticus……… ……… ….27

2.1.2 Khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong B fasciatus……… … ….27

2.2 Thiết bị nghiên cứu……… ….27

2.3 Phương pháp phân lập và xác định các toxin từ nọc bò cạp H laoticus…… 28

2.3.1 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus…… ….28

2.3.2 Tách protein trong nọc bò cạp H laoticus bằng sắc ký lọc gel trên cột

2.3.3 Phân tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu

2.3.4 Khảo sát tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò

cạp H laoticus lên quá trình đông – chảy máu……… ….322.3.5 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính chống đông máu ….38

2.4 Phương pháp phân lập và xác định các toxin từ nọc rắn cạp nong B.

fasciatus ….38

2.4.1 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B.

fasciatus ….38

2.4.2 Tách protein trong nọc rắn cạp nong B fasciatus bằng sắc ký lọc gel

trên gel Superdex HR75 39

2.4.3 Khảo sát KLPT các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus

2.4.4 Khảo sát tác dụng giảm đau……… ….44

2.4.4.1 Khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B.

2.4.4.2 Khảo sát tác dụng giảm đau trung ương của nọc rắn cạp nong B.

2.4.5 Tách các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4 nọc rắn cạp nong B.

2.4.6 Khảo sát hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp tách ra từ

2.4.7 Phân tích thống kê kết quả thử hoạt tính giảm đau……… …502.4.8 Phương pháp xác định KLPT của protein có hoạt tính giảm đau……… …502.4.9 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của nọc thô và các phân

đoạn rắn cạp nong B fasciatus theo phương pháp MTT………. …51

2.4.10 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào …55

2.4.10.1 Xác định KLPT dựa trên MALDI TOF/TOF MS ……… …55

2.4.10.2 Xác định trình tự amino acid dựa trên LC-MS/MS.………… … .55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN……… ….57

3.1 Kết quả về bò cạp H laoticus……… ….57

3.1.1 Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H laoticus……….……….……… ….57

3.1.2 Tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) ……….……… ….59

3.1.3 Tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò cạp H laoticus lên quá trình đông - chảy máu……… …… ….60

3.1.4 Làm sạch hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 và 5.22……….……… ….63

3.1.4.1 Làm sạch phân đoạn 5.5 ……… 63

3.1.4.2 Làm sạch phân đoạn 5.22 ……… ………… ….64

3.1.5 Hoạt tính chống đông máu của phân đoạn 5 và các hợp chất sạch: 5.5.1, 5.22.3, 5.21.1 (dipeptide Leu – Trp)……… … ….65

3.1.6 Xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống đông máu (5.5.1 và 5.22.3) từ phân đoạn 5.5 và 5.22 bằng MS và NMR………… ……… .69

3.1.6.1 Cấu trúc của toxin 5.5.1……… .69

3.1.6.2 Cấu trúc của toxin 5.22.3 ……… …72

3.2 Kết quả về rắn cạp nong B fasciatus……… … ….75

3.2.1 Sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B fasciatus……… … ….75

3.2.2 Xác định KLPT của các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus bằng phương pháp điện di ….76

3.2.3 Tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần và các phân đoạn……… ……… ….78

3.2.4 Tác dụng giảm đau trung ương của nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần và các phân đoạn……….……… ……….…… ….79

3.2.5 Phân tách phân đoạn BF4 từ nọc rắn cạp nong B fasciatus có hoạt

tính giảm đau bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC)….……… ….813.2.6 Hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4 ….813.2.6.1 Giảm đau ngoại biên……… ……… ….813.2.6.2 Giảm đau trung ương……… ………… ….843.2.7 Xác định KLPT của protein BF4.11 và protein BF4.12 có hoạt tính

3.2.9 Phân lập phân đoạn BF3 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC) ….91

3.2.10 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi A549 của các

phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) từ phân đoạn

3.2.11 Khả năng gây độc tế bào thường HK2 ở người của nọc thô (BF), các

phân đoạn (BF1 – BF5) và các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3,

3.2.12 Xác định cấu trúc bậc một (trình tự amino acid) của protein 3.3 có

hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi A549………… ….97

3.2.12.1 Xác định KLPT của BF3.3 dựa trên MALDI TOF/TOF MS … ….97

3.2.12.2 Xác định trình tự amino acid của protein 3.3 dựa trên

LC-MS/MS………

….98

KẾT LUẬN ……… 101

KIẾN NGHỊ……… ……… 103

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN……… 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….……… .106

PHỤ LỤC……… 118

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aPTT Activated partial thromboplastin time

A549 Adenocarcinoma human alveolar basal

epithelial cells

BF–CT Bungarus fasciatus Cytotoxin

BF – LAAO Bungarus fasciatus – L - amino acid

oxidase

phần (thô)

Fraction 1 – Fraction 5 khi chạy sắc ký lọc gel

nọc rắn cạp nong)Phân đoạn thứ cấp 3.1đến 3.4 của phân đoạnBF3.1 - BF3.4 Fraction 3.1 – Fraction 3.4 3 (sau khi chạy sắc ký

pha đảo nọc rắn cạpnong)

Cell viability (% of control) Lƣợng tế bào sống (%)

EAC Ehrlich ascites carcinoma

EC50 Half maximal effective concentration Nồng độ hiệu quả trung

bìnhEDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ESI-MS Electrospray ionization mass

spectrometry

FDA Food and Drug Administration

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

IC50

The half maximal inhibitory

Nồng độ ức chế 50%concentration

MALDI Matrix-assisted laser

desorption/ionizationMCF-7 Michigan Cancer Foundation 7

NMR Nuclear Magnetic Resonance

PBS Photphat buffer saline

chạy sắc ký)

PL Phụ lục

Q-TOF Quardrupole - Time of flight

RPC Reversed phase chromatography

RP-HPLC Reversed phase - High Performance

Liquid Chromatography

Sephadex G-50 Sephadex G series number 50

Superdex HR75 Superdex High Resolution 75

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc bậc một của một số chất ức chế ion quan trọng từ bò cạp……….… 7 Bảng 1.2 Một số hợp chất/peptide có hoạt tính từ nọc bò cạp……… 10 Bảng 1.3 Cấu trúc hoặc chuỗi amino acid của thuốc được chế tạo từ các thành phần nọc độc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng……… …… 13

Bảng 1.4 Thuốc từ nọc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng……… ……15 Bảng 1.5 Một số toxin được phân lập từ loài cạp nong – cạp

nia……… 16

Bảng 1.6 Ứng dụng của nọc thô/toxin phân lập từ loài cạp nong – cạp nia………….…17 Bảng 2.1 Thành phần bản gel……….….42 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch xử lý protein……….

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình chảy máu……… 66 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu……… 67

Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.5.1 và hợp chất tham khảo……… 70 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.22.3 và hợp chất tham khảo……… …74 Bảng 3.12 Khối lượng 5 phân đoạn nọc rắn B fasciatus sau khi chạy sắc kí lọc gel 76

Bảng 3.13 Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF1 – BF5………

Bảng 3.17 Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5)……….

……….88 Bảng 3.18 Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của nọc thô (BF) và phân đoạn BF3

……… ……… ……… ….89 Bảng 3.19 Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5)……… ……… ….

… 90 Bảng 3.20 Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của nọc thô (BF) và phân đoạn BF3

……….9 1

Bảng 3.21 Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của phân đoạn BF3 và (BF3.1 - BF3.3)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bò cạp đen Heterometrus laoticus ……… ……….5

Hình 1.2 Rắn cạp nong Bungarus fasciatus……… ……… ….5

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của các chất độc 3 ngón tay – 3FTx……… …… ……

20 Hình 2.1 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus………….…28

Hình 2.2 Sơ đồ đông máu………34

Hình 2.3 Cơ chế tác động của các thuốc trên dòng thác đông máu……… 34

Hình 2.4 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn B fasciatus……….39

Hình 3.1 Sắc ký đồ sắc kí lọc gel của nọc bò cạp H laoticus……… …….57

Hình 3.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) của phân đoạn 5 (PĐ5) nọc bò cạp H laoticus ……….……… 60

Hình 3.3 Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian chảy máu……… ……… … 61

Hình 3.4 Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian đông máu……… ……… … 62

Hình 3.5 Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.5……… ……63

Hình 3.6 Sắc ký đồ của chất có hoạt tính chống đông máu 5.5.1……….… 64

Hình 3.7 Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.22………64

Hình 3.8 Sắc ký đồ của chất có hoạt tính chống đông máu 5.22.3……….……65

Hình 3.9 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu……… 67

Hình 3.10 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu……….… 68

Hình 3.11 Phổ MS của 5.5.1……… ……… ….69

Hình 3.12 Cấu trúc của toxin 5.5.1 (Adenosine)………

….72 Hình 3.13 Phổ MS của 5.22.3……… ……….72

Hình 3.14 Cấu trúc của toxin 5.22.3 (Ile-Trp)……….………… 75

Hình 3.15 Hình sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B fasciatus……….

….76 Hình 3.16 Hình điện di nọc rắn cạp nong B fasciatus……… ….… 77

Hình 3.18 Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF1 –

BF5……….… 80 Hình 3.19 Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF4 ……… … 81 Hình 3.20 Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15………… 83 Hình 3.21 Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF4.7 –

BF4.15……… ……… …85 Hình 3.22 Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF3.……… 92

Hình 3.23 Phổ MALDI-TOF/TOF-MS của các phân đoạn (BF3.1 – BF3.4) nọc rắn B fasciatus……… 9 8

Hình 3.24 Khối phổ phân giải cao (HR-MS) của BF3.3 …… ……… ………99 Hình 3.25 Trình tự amino acid của protein 3.3 ……… ……… 100

loài rắn đuôi chuông Nam Mỹ Crotalus durissus terrificusas có tác dụng gây giảm đau

cao hơn khoảng 500 lần so với morphine hoặc Hannalgesin - một neurotoxin chuỗi dài

phân lập được từ loài rắn Ophiophagus hannah, độc tố thần kinh này có tác dụng tạo

ra giảm đau trong phạm vi liều 16–32 ng/g mà không gây ra bất kỳ rối loạn thần kinhhoặc cơ [1] Ngoài tác dụng gây giảm đau thì các toxin còn có khả năng gây độc tế bàokhối u như hoạt tính gây độc tế bào của cytotoxin 1 (CTX1) - 6,7 kDa từ nọc rắn hổ

mang Naja atra Cantor lên bốn dòng tế bào khối u theo thứ tự MCF-7> P388 ≈ K562>

H22 ≈ 16HBE (dòng tế bào người bình thường) đã phản ánh tính chọn lọc của hoạttính từ toxin này [1] Bên cạnh nọc rắn thì nọc bò cạp chứa nhiều các polypeptidetoxin, có tác động lên các receptor và các kênh ion của màng tế bào, đã và đang đượccác nhà khoa học nghiên cứu để điều chế ra các loại thuốc chữa bệnh như Parkinson,bệnh cao huyết áp, ung thư, Alzheimer [2 - 7] Ngày nay, những vấn đề về đột quỵ,mất máu, chậm đông máu, thiếu máu não, hoặc bệnh ung thư đang là vấn đề được rấtnhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, trong đó có cả Việt Nam

Việt Nam với nguồn nguyên liệu dồi dào về nọc bò cạp và nọc rắn, và cũng đã cónhững công trình nghiên cứu về nọc độc của hai loài này Kết quả nghiên cứu từ nọc bò

cạp Heterometrus laoticus cho thấy nọc thô và các phân đoạn có hoạt tính giảm đau, kháng viêm, độc tính với côn trùng Từ phân đoạn 4 của nọc bò cạp Heterometrus laoticus người

ta đã phân lập được toxin Hetlaxin có ái lực mạnh với kênh Kv1.3, còn từ phân đoạn 5 có

độc tính với côn trùng của nọc bò cạp này người ta đã phân lập được một dipeptide đó là

Leu-Trp [8] Bên cạnh đó, người ta đã xác định các phân đoạn 2, 4 và 5 của nọc bò cạp H.

laoticus còn có hoạt tính chống đông máu [9] Bên cạnh các nghiên cứu nọc bò cạp, thì

nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus cũng đã có những công trình nghiên cứu Những kết

quả đã công bố cho thấy nọc thô và các phân đoạn từ loài rắn này có hoạt tính giảm đau,kháng viêm, chống đông máu [10-11] Để thừa kế

và phát triển những nghiên cứu về nọc bò cạp H.laoticus và nọc rắn cạp nong

B.fasciatus, tác giả của luận án này đã tiến hành đề tài: “ Phân lập toxin có hoạt tính

chống đông máu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thƣ từ nọc rắn Bungarus fasciatus” Mục tiêu của

luận án là phân lập một số toxin có các hoạt tính kể trên từ nọc bò cạp H.laoticus, nọc rắn B.fasciatus và xác định cấu trúc của chúng, nhằm tìm kiếm ứng dụng của chúng

trong y dƣợc Đề tài này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, hứa hẹn sẽ có nhiềuđóng góp mới vào việc nghiên cứu thành phần toxin và hoạt tính sinh học của nọc độcđộng vật, một lĩnh vực mới và chƣa có nhiều công trình nghiên cứu ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Giới thiệu về bò cạp

Bò cạp là loài động vật chân khớp đã có từ lâu đời trên thế giới Trải qua hơn

450 triệu năm tiến hóa, hình dạng của bò cạp không thay đổi nhiều [12 – 13] Bên cạnhviệc nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính đa dạng loài, phương diện sinh thái, các nhà khoahọc đã và đang nghiên cứu các thành phần của nọc độc bò cạp Hướng nghiên cứu này đangthu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì nọc bò cạp chứa nhiều thành phần

có hoạt tính sinh học

Phân bố địa lý

Bò cạp có thể gặp ở mọi miền địa lý trên thế giới, thường xuất hiện ở nhữngvùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Bò cạp sống trong rừng, sa mạc, trong hang và vài loàicòn được tìm thấy dưới các tảng đá ở những núi có độ cao 5000 m [14]

Có khoảng 2000 loài bò cạp, thuộc 20 họ khác nhau, phân bố rộng rãi nhất tạinhững vùng phía nam của vĩ tuyến 45 Bắc (ngoại trừ New Zealand và Nam cực) Ví dụ

như: giống Androctonus, Leiurus: phân bố chủ yếu ở Châu Á, Bắc Phi, Trung Đông [15 – 16]; giống Tityus phân bố ở Nam Mỹ (chủ yếu ở Brazil, Venezuela, Colombia và Argentina) [17]; giống Centruroides phân bố ở Trung Mỹ [18]; giống Heterometrus

phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á (Campuchia, Lào, Thái Lan,Việt Nam), cũng như Ấn Độ, Sri Lanka, Nepal và Trung Quốc (Tây Tạng) [19 - 20]

Ở Việt Nam, bò cạp phân bố khắp nơi trong nước từ đồng bằng đến miền núitrong những khu rừng ẩm ướt và hải đảo Có bốn họ thuộc bộ Bò Cạp: Buthidae,Scorpionidae, họ Chaerilidae và họ Pseudochactidae Trong đó, họ Buthidae vàScorpionidae chiếm nhiều nhất Chúng phân bố ở các vùng khác nhau [21 – 26]:

Họ Buthidae:

- Loài Lychas mucronatus Fabricius, 1798: phân bố ở các tỉnh miền Trung và

miền Nam, phát triển mạnh về số lượng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phước)

- Loài Isometrus basilicus Karsch, 1879: phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Quảng

Trị, Bình Định, Khánh Hoà (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú)

- Loài Isometrus (Reddyanus) petrzelkai Kovařik, 2003: phân bố ở Nghệ An

(Vinh)

- Loài Isometrus deharvengi Lourenco, 2010: phân bố ở Hòn Chồng, Kiên

Giang

Họ Scorpionidae:

- Loài Heterometrus spinifer Ehrenberg, 1828: phân bố ở Bình Phước (Bù Đốp,

Bù Gia Mập, Đồng Phú)

- Loài Heterometrus petersii Thorell, 1876: phân bố ở thành phố Hồ Chí Minh,

Bình Thuận, Khánh Hoà, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh

- Loài Heterometrus laoticus Couzijn, 1981: phân bố ở Thành phố Hồ Chí Minh,

- Loài Heterometrus cyaneus C L Koch, 1836: phân bố ở Thừa Thiên Huế,

Quảng Trị

Họ Chaerilidae:

- Loài Chaerilus petrzelkai Kovařík, 2000: miền Nam Việt Nam, đảo Côn Sơn.

- Loài Chaerilus variegatus Simon, 1877: miền Nam Việt Nam.

- Loài Chaerilus vietnamicus Lourenco and Zhu, 2008: phân bố ở miền Bắc.

- Loài Chaerilus julietteae Lourenco, 2011: phân bố ở miền Nam.

- Loài Chaerilus phami Lourenco, 2011: tập trung ở đảo Côn Sơn.

Họ Pseudochactidae:

- Loài Vietbocap canhi Lourenco & Pham, 2010.

- Loài V thienduongensis Lourenco & Pham, 2012.

Và trong năm 2013, vừa phát hiện loài bọ cạp mới ở miền núi phía bắc Việt

Nam có tên có tên khoa học Euscorpiops cavernicola Lourenco & Phạm Loài bò cạp

mới này thuộc họ Euscorpiidae, phân bố ở hang Hua Ma, xã Quảng Khê (huyện Ba Bể,tỉnh Bắc Kạn) [27]

Hình 1.1 Bò cạp đen Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 [26]

1.2 Giới thiệu chung về rắn

Loài rắn sinh sống ở khắp nơi trên thế giới ngoại trừ Nam Cực, một số đảo lớnnhư Ireland, New Zealand, nhiều đảo nhỏ ở Đại Tây Dương và trung tâm Thái BìnhDương [28] Trên thế giới, rắn có khoảng gần 3000 loài sống trên cạn, dưới nước vàbiển cả, đa dạng nhất là ở những vùng nhiệt đới [29] Riêng 4 loài rắn hổ mang, cạpnong và cạp nia rất phổ biến ở các nước Châu Á Ở Việt Nam, rắn phân bố ở khắp nơi

từ vùng núi đến trung du, đồng bằng, thường gặp trong rừng thưa, hang hốc, bờ bụi,

gò đống, vườn tược [30 - 31]

1.2.1 Giới thiệu về rắn cạp nong

Rắn cạp nong có tên khoa học: Bungarus fasciatus Schneider (1801), thuộc họ Rắn Hổ (Elapidae), chi Cạp nia (Bungarus) Ngoài ra chúng còn được gọi theo tên phổ

thông là rắn đen vàng, rắn ăn tàn, rắn cạp nong (miền Bắc), rắn mai gầm (miền Nam)[31 - 32]

Hình 1.2 Rắn cạp nong Bungarus fasciatus [28]

1.2.2 Phân bố sinh thái

Loài rắn cạp nong Bungarus fasciatus (B fasciatus) phần lớn thường tập trung

ở các nước Châu Á, chúng xuất hiện ở vùng phía Bắc Ấn Độ lan sang phía Nam TrungQuốc và đến Việt Nam [28] Đây là loài rắn có sự phân bố rộng nhưng không có nghĩachúng có mặt phổ biến, chúng được liệt vào sách đỏ Việt Nam ở nhóm IB – động vậtcấm khai thác và sử dụng [33] Tình trạng rắn cạp nong tại Việt Nam có sự suy giảmquần thể hơn 50%, sự suy giảm đáng kể này là do việc khai thác môi trường để mởrộng đô thị, săn bắt, buôn bán trái phép [32]

1.3 Tình hình nghiên cứu về nọc bò cạp

1.3.1 Tình hình nghiên cứu nọc bò cạp trên thế giới

Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định trong thành phần nọc bò cạp có rấtnhiều các chất có hoạt tính sinh học tác động lên trên hệ thống thần kinh và quá trìnhđông – chảy máu

Các toxin tác động lên kênh Na+ thường là một chuỗi polypeptide được cấu tạo

từ 60 – 76 gốc amino acid và cấu trúc của chúng được ổn định bởi bốn cầu disulfide[35 – 42] Các toxin tác động lên kênh K+ là những polypeptide ngắn, được cấu tạo từkhoảng 31 – 39 gốc amino acid liên kết với ba hoặc bốn cầu disulfide [3, 43 – 47] Cáctoxin này liên kết với bề mặt ngoài tế bào và cản trở sự di chuyển qua màng tế bào củakênh K+ [43] Các toxin tác động lên kênh Ca2+ đã được xác định gồm hai peptide, cácpeptide này làm thay đổi sự liên kết của thụ thể ryanodine với kênh Ca2+ [46 – 48].Trong số đó, có một toxin được xác định là peptide có cấu tạo từ 33 amino acid làmtăng sự liên kết với thụ thể ryanodine, và toxin còn lại là heterodimer peptide cấu tạo từ

104 và 27 amino acid có vai trò làm ức chế sự liên kết với thụ thể ryanodine [48]

Chlorotoxin, độc tố cực độc tác động lên kênh Cl- là peptide cấu tạo từ 36 gốc aminoacid với bốn cầu disulfide [47, 49].

Trong khi cấu trúc bậc một của các độc tố nọc bò cạp khác nhau thì cấu trúckhông gian của chúng khá giống nhau Trừ cấu trúc không gian của các độc tố tác độnglên kênh Ca2+ là chưa biết, phần lớn các peptide độc tố bò cạp đều cấu tạo bởi mộtalpha-spiral và ba hay bốn nhánh của cấu trúc beta (cấu trúc beta được tạo thành bởicác chuỗi peptide đối song song) và được ổn định bởi các cầu disulfide [35, 43]

Bảng 1.1 Cấu trúc bậc một của một số chất ức chế ion quan trọng từ bò cạp [50]

DKKADSGYCY WVHILCYCYG LPDSEPTGST KCKDGYPVEGDN CAFACFGYDN AYCDKLCKDK

SGRC

LKASSGYCAW PACYCYGVPD HIKVWDYATN KC

KKGSSGYCAW PACYCYGLPE SVAIWPSETN KC

GKCKCYPMRDGYIAQPE NCVYHCFPGS SGCDTLCKEH

GGEKCHGVRDGYIAQP HNCVYHCFPG SGGCDTLCKE

CDGEKCHLKDGYIIDDL NCTFFCGRNA YCDDECKKKG

GRCN

ESGYCQWASP YGNACWCYKL PDRVSIKEKG RCNVRDGYIADDK DCAYFCGRNA YCDEECKKGA

SGKCN

() Mỗi chữ cái là ký hiệu 1 chữ viết tắt của amino acid (PL1)

 Ảnh hưởng lên quá trình đông – chảy máu

Trong tất cả các nghiên cứu về nọc độc, nọc rắn là đối tượng đã được quan tâm

máu và gây xuất huyết từ loại nọc này như: protease, metalloproteinase, C-type lectin,disintegrin và những phospholipase [7] Các thành phần này gây rối loạn tiểu cầu vàảnh hưởng lên quá trình đông máu như: quá trình hình thành phức hợpprothrombinase, quá trình fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin không hòa tan,quá trình hình thành mạng lưới fibrin [51 -52].

Bên cạnh nọc rắn, trong nọc bò cạp của các loài: Buthidae, Caraboctonidae,Iuridae, Ischnuridae, Scorpionidae, Vejovidae,… cũng có nhiều peptide và protein có

hoạt tính chống đông máu [7] Nọc độc của loài Parabuthus transvaalicus, Parabuthus

imperator kéo dài thời gian đông máu từ 2,3 – 2,5 so với thời gian đông máu của mẫu

chứng, đối với một số loài khác chỉ từ 0,8 -2,0 lần [53] Nọc độc của bò cạp Buthus

tamulus cũng gây rối loạn đông máu nội mạch lan tỏa, và được thử nghiệm in vitro ở

liều gây chết đã làm thay đổi cơ chế đông máu của thỏ khi tiêm tĩnh mạch [54] Gần

đây, các nghiên cứu về nọc độc của loài bò cạp Tityus discrepans, cho thấy với hàm

lượng nọc cao khi tiêm vào máu sẽ làm tăng mức độ nghiêm trọng của các triệu chứngngộ độc như thay đổi thời gian thromboplastin (PTT) và thời gian prothrombin (PT),gia tăng nồng độ các cytokine, amylase và glucose [55]

Các enzyme phospholipase A2 (PLA2) chống đông máu được phân chia làm 3nhóm khác nhau về hiệu quả ức chế quá trình chống đông máu: nhóm A là nhữngPLA2 có tác động chống đông máu mạnh, nhóm B là những PLA2 chỉ có tác độngchống đông máu ở nồng độ cao, và nhóm C là những PLA2 có tác động chống đôngmáu ở biên hay không có tác động [56] Những PLA2 được phân lập từ bò cạp đượcxếp vào giữa nhóm B và nhóm C Trong số 12 PLA2 được phân lập từ các loài bò cạp

như: Anuroctonus phaiodactylus, Pandinus imperator, Opisthacanthus cayaporum,

Hadrurus gertschi,… có enzyme Imperatoxin inhibitor (IpTxi) của Pandinus imperator và Phaiodactyliphin của Anuroctonus phaiodactylus đã được công bố làm trì

hoãn thời gian đông máu đối với những cơ thể sống có số lượng tiểu cầu thấp và lượnghuyết tương cao [57 – 58]

Imperatoxin inhibitor (IpTxi) và Phaiodactylipin là hai peptide được phân lập từ

nọc độc của loài bò cạp Pandinus imperator, đã được xác định làm trì hoãn thời gian

đông máu trên cơ thể sống [58] IpTxi với KLPT 14314 Da và Phaiodactylipin với khối

lượng phân tử 19172 Da So sánh hoạt tính ảnh hưởng lên quá trình đông máu của haipeptide này đã xác định được IpTxi có hiệu quả hơn so với Phaiodactylipin [58].

Bên cạnh những protein có KLPT cao (trên 30 kDa) và những PLA2 có KLPTtrong khoảng 14 – 16 kDa, trong nọc độc của bò cạp cũng có những peptide có KLPT

nhỏ có hoạt tính chống đông máu [7] Các nghiên cứu trên nọc độc của loài Buthus

martensii Karsch cũng đã chỉ ra có tác động chống đông máu, nghiên cứu này được

thực hiện trên cả hai phương pháp in vivo và in vitro [59] Qua đó đã phân lập và đặt

tên cho peptide vừa tìm được là peptide scorpion venom active polypeptide (SVAP),peptide này ảnh hưởng lên quá trình tạo cục máu đông và làm thay đổi thromboxane

B2 và 6-keto-protaglandin F1 [59] Dựa trên peptide này, các nhà khoa học đã nhân

bản thành công một peptide mới và đặt tên là peptide Buthus martensii Karsch APi

(BmKAPi) [60] BmKAPi được mã hóa từ peptide cấu tạo gồm 89 amino acid và nămcầu disulfide [60] Có cấu tạo khác so với các peptide có trong nọc độc bò cạp nên cấutrúc ba chiều của BmKAPi có thể cũng sẽ khác Nghiên cứu trình tự amino acid củaBmKAPi đã xác định hoạt tính chống đông máu của BmKAPi thấp hơn so với một sốpeptide chống đông máu được phân lập từ giun móc, ong mật [60] Gần đây, nhà khoahọc Brazil và các đồng nghiệp của mình đã đưa ra một peptide ức chế plasmin, cóKLPT khoảng 6000 Da, có hoạt tính chống tiêu sợi huyết tương có tên gọi là

discreplasminin, được phân lập từ loài bò cạp Tityus discrepans và đang tiếp tục

nghiên cứu các thành phần có hoạt tính từ nọc của loài này [61 – 62]

 Nghiên cứu về bò cạp H laoticus

Từ nọc độc của loài bò cạp H laoticus người ta đã phân lập được hai toxin Toxin đầu tiên được phân lập là Heteroscorpine-1 (HS-1) thuộc họ Scorpine từ nọc bò cạp H.

laoticus ở Thái Lan có khối lượng phân tử là 8293 Da với 6 gốc cysteine [63] Toxin này

đã được xác định có độc tính đối với côn trùng và có tính kháng khuẩn, kháng nấm [63]

Toxin thứ hai đã được tách từ nọc độc của bò cạp H laoticus bằng phương pháp sắc ký

lỏng cao áp, và đã xác định là polypeptide HelaTx1 có khối lượng phân tử là 2763 Da với

4 gốc cysteine [64] HelaTx1 tác động có hiệu quả đối với kênh Kv1.1 và Kv1.6 với nồng

độ thấp (Kv1.1 EC50 = 9,9 ± 1,6 µM), tuy nhiên lại không làm

thay đổi sự hoạt động của các kênh K+ này [64] HelaTx1 là peptide đầu tiên đã được

phân lập từ nọc bò cạp H laoticus có tác động lên kênh κ-KTx5 [64].

Từ các toxin tác động lên kênh K+, các nhà khoa học đã thử nghiệm sản xuất racác loại thuốc điều trị các bệnh thần kinh như: Azheimer, Parkinson, [3, 6, 43]…

Margatoxin tách từ nọc bò cạp Centruroides margaritatus đã được hãng Merck (Đức)

đăng kí bản quyền như thuốc để điều trị bệnh tự miễn dịch hoặc ngăn cản sự đào thảitrong quá trình cấy ghép các cơ quan [65 – 66 ]

Vào năm 1991, ông DeBin - nhà độc chất học đã chứng minh trong nọc bò cạpchứa chất chlorotoxin cực độc có tác động ức chế kênh vận chuyển clo qua màng tếbào [5, 67 - 68] Tác giả đã tiêm chất độc này vào chuột và quan sát hiện tượng biếnđổi điện thế màng tế bào Điện thế màng tăng lên, từ -90 mV đến -20 mV và kéo dàitrong khoảng 6 giây, điều này được giải thích là do sự ức chế kênh Cl- gây ra và có ýnghĩa lâm sàng lớn [48, 68] Dựa trên cở sở này, đã có những nghiên cứu phân lập

chlorotoxin từ nọc bò cạp Leiurus quinquestritus và đã được sử dụng để điều trị bệnh

ung thư não [68]

Từ nọc bò cạp xanh Rhppalurus junceus, các nhà khoa học Cuba đã bào chế ra

thuốc điều trị ung thư Vidatox, có tính kháng tế bào ung thư và kháng viêm cao [6].Dưới tác động của chất này, khối u không phát triển được do bị ngăn chặn sự nuôidưỡng từ mạch máu và đưa đến các chất gây miễn dịch tại khối u Điều này đã mở ra

hi vọng mới cho các bệnh nhân ung thư [4, 6]

Bảng 1.2 Một số hợp chất/peptide có hoạt tính từ nọc bò cạp [69]

khảo

Scorpion

toxins BmK ITAP Độc tố côn trùng và giảm đau Xiong et al., 1999

Độc tố gây độc thần kinh cônBmK dITAP3 trùng, hạ huyết áp, giảm đau ngoại Guan et al., 2001a

biênBmk AS Hạ huyết áp, giảm đau ngoại biên Chen and Ji, 2002

Bmk AGAP Peptide giảm đau, kháng khối u Liu et al., 2003

Bên cạnh tác động gây độc thần kinh đã được nghiên cứu và khảo sát thì tácđộng gây rối loạn đông máu của nọc bò cạp cũng đã mở ra nhiều triển vọng mới trong

y học để điều trị tình trạng rối loại đông máu gây ra các bệnh có tỷ lệ tử vong cao [7, 70], ảnh hưởng lên hệ tim mạch, hệ miễn dịch [71 – 72] Các nhà khoa học đã xác định đượcnhững protein, enzyme phospholipase có tác động lên quá trình đông – chảy

máu và đang tiếp tục nghiên cứu để đưa vào ứng dụng [7]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bò cạp ở Việt Nam

Tại Việt Nam, một số loài bò cạp đã được nghiên cứu tính chất và thành phần

như: Lychas mucronatus, Heterometrus laoticus.

Từ nọc bò cạp nâu Lychas mucronatus, nhóm nghiên cứu của tác giả Hoàng

Ngọc Anh cho thấy trong nọc này có hai nhóm toxin với khối lượng phân tử 5.000 Da và 6.000 – 8.000 Da Từ nọc bọ cạp này nhóm tác giả đã tách ra và khảo sáttính chất bảy toxin ngắn (KLPT từ 3.500 – 5.000 Da) Các neurotoxin này ức chế điệnthế tác dụng của dòng điện Na+ trên dây thần kinh ếch và tác dụng này phụ thuộc vàokhối lượng phân tử của các toxin [26, 43] Cấu trúc bậc một của một trong những độc

3.500-tố thần kinh này đã được xác định và đăng ký ở ngân hàng dữ liệu protein [26] Trongkhi đó một phần cấu trúc bậc một của một độc tố khác cũng đã được xác định Ngoài

ra, nhóm nghiên cứu này đã xác định độc tính cấp và tác động kháng viêm giảm đau

của nọc bò cạp nâu Lychas mucronatus [73].

Đối với nọc bò cạp đen Heterometrus laoticus, năm 2017, tác giả Võ Đỗ Minh

Hoàng [8] cũng đã có nghiên cứu về nọc bò cạp này, qua đó đã xác định loại nọc này cóđộc tính cấp với LD50 là 12,4 ± 0,46 mg/kg theo phương pháp Miller – Tainter Từ nọc thôtách được 5 phân đoạn, trong đó có ba phân đoạn (2,3 và 4) có độc tính Phân đoạn 4 độcgây chết trên chuột với LD50 24,07 ± 1,09 mg/kg Đối với dế, chỉ có phân đoạn 5 có độcgây chết với LD50 = 180,35 ± 23,99 µg/g, nọc toàn phần có tác động kháng viêm, giảmđau [73, 74 – 75] Từ phân đoạn 4 đã phân tách được một toxin được đặt tên là Hetlaxin

có KLPT là 3669,2 Da với 8 gốc cysteine hình thành nên 4 cầu

disulfide, đây là toxin tác động lên kênh Kv1.3 với nồng độ nanomol (EC50 = 0,48 ±

0,01 µM), toxin này lần đầu tiên được phân lập từ nọc bò cạp H laoticus Từ phân

đoạn 5 được phân tách thành 24 phân đoạn thứ cấp, từ phân đoạn 5.21 tách được haichuỗi polypeptide 5.21.1 và 5.21.2 với KLPT xác định được lần lượt là 318,0 Da và832,6 Da Sử dụng phổ NMR đã xác định được cấu trúc của toxin 5.21.1 là Leu-Trp.[76 – 77]

Bên cạnh đó, qua những nghiên cứu sơ bộ ban đầu cho thấy nọc bò cạp

H.laoticus còn chứa các thành phần tác động lên quá trình đông – chảy máu, đây là một

hoạt tính mới phát hiện của nọc bò cạp H laoticus [34, 78, 9] Nghiên cứu ban đầu về tác động chống đông máu của các phân đoạn được tách ra từ nọc bò cạp H laoticus

bằng sắc ký lọc gel cho thấy 3 phân đoạn có tác động đông – chảy máu, đó là: phânđoạn 2, phân đoạn 4 và phân đoạn 5 [9] Kết quả nghiên này đã định hướng cho những

nghiên cứu sâu hơn về các toxin có hoạt tính chống đông máu trong nọc bò cạp H.

laoticus.

1.4 Tình hình nghiên cứu về nọc rắn

1.4.1 Tình hình nghiên cứu về nọc rắn trên thế giới

Rắn được chia làm 3 họ chủ yếu: Họ rắn hổ (Elapidae) gồm: Hổ mang bành

(Naja atra), Hổ đất (Naja kaouthia), Hổ mèo (Naja siamensis), Hổ chúa (Ophiophagus

hannah), Cạp nia (Bungarus candidus), Cạp nong (Bungarus fasciatus); Họ rắn lục

(Viperidae) gồm: Lục tre (White lipped green pit viper, Trimeresurus albolabris, Chàm quạp (Malayan pit viper, Calloselasma rhodostoma và Họ Colubridae.

Một số toxin được phân lập từ các loài rắn cùng với hoạt tính và ứng dụng của

nó trong các bảng dưới đây:

Bảng 1.3 Cấu trúc hoặc chuỗi amino acid của thuốc được chế tạo từ các thành

phần nọc độc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng [1]

Captopril

Eptifibatide

Tirofiban

Bảng 1.4 Thuốc từ nọc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng [1]

dụng

Dẫn xuất của

bradykinin-Điều trị tăng huyết

áp

loài Bothrops jaracusa

Dẫn xuất của disintegrin

Thuốc chống kếtEptifibatide từ loài Sistrurus miliarus FDA chấp nhận

fibrinogen được bán ở một số

và B moojeni

quốc gia ngoài Mỹ

nhận nhưng đãHemocoagulase thrombin-like enzymes từ Điều trị xuất huyết

được bán ở một số

loài B atrox

quốc gia ngoài Mỹ

Đã được chấp nhận

Ximelagatran Peptides từ loài rắn hổ Thuốc kháng đông ở một số quốc gia

thị trường.Enzymes từ loài Tác nhân chống tạo Đã được chấp nhận

nhƣng đã rút khỏi

thị trường; gần đây

có nghiên cứu lâmsàn giai đoạn III

Dendroaspis- Natriuretic peptide từ loài Điều trị suy tim Nghiên cứu lâm

angusticeps

Cobrotoxin/α- nivea và Thuốc giảm đau lâm sàn trên người

Bảng 1.5 Một số toxin được phân lập từ loài cạp nong – cạp nia [79]

TOXIN-F B multicinctus Hậu synap Loringet al, 1984

BUNGAROTOXIN

1985CERULEOTOXIN B caeruleus Hậu synap Bon &Changeux,

1975