Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin, fenofibrate và ứng dụng trong phân tích

Mặt khác, ngoài việc định lượng và kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bào chế, thì cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinh học để có thể tìm hiểu khả năng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐẶNG MINH HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN, FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐẶNG MINH HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN, FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

Chuyên ngành: Hóa môi trường

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Giaoo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Kim Thường

Hà Nội – Năm 2016

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc với bố, mẹ, gia đình và các bạn đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn đề tài QG 15.14 của Đại học Quốc gia Hà nội đã hỗ trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện nghiên cứu này

Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Học viên

II

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU ATORVASTATIN 3

1.1.1 Cấu tạo của atorvastatin 3

1.1.2 Dược lực học và động học của Atorvastatin 4

Dược lực học 4

Dược động học 4

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU FENOFIBRAT 4

1.2.1 Cấu tạo của fenofibrat 4

1.2.2 Dược lực học và động lực học của Fenofibrat 5

Dược lực học 5

Dược động học 5

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ATORVASTATIN, FENOFIBRAT 5

1.3.1 Các phương pháp xác định atorvastin 6

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 6

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 6

Phương pháp von-ampe 6

1.3.2 Các phương pháp xác định fenofibrat 7

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 7

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 7

Phương pháp cực phổ và von-ampe hòa tan 8

1.4 GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ 9

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV) 9

1.4.2 Các kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan hấp phụ 11

Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (DP) 11

III

Kỹ thuật sóng vuông 12

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nội dung nghiên cứu 13

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 13

2.2.1 Thiết bị 13

2.2.2 Dụng cụ 14

2.2.3 Hóa chất 14

2.2.4 Chuẩn bị dung dịch 15

Pha dung dịch 15

Pha dung dịch gốc atorvastatin và fenofibrat 15

2.3 Xử lý mẫu 15

2.3.1 Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc atovastatin 15

2.3.2 Quy trình xử lý mẫu huyết tương xác định atorvastatin 16

2.3.3 Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat 16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ATORVASTATIN TRONG MẪU THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE 18

3.1.1 Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định atorvastatin 18

Nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin 18

Khảo sát ảnh hưởng của pH 19

Khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ 20

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ 22

Khảo sát thời gian cân bằng 23

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế 25

3.1.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp 27

Khoảng tuyến tính 27

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 28

Độ lặp lại 28

3.1.3 Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng atorvastatin trong các mẫu thuốc trên thị trường 29

IV

Phân tích mẫu thuốc Lipivastatin 20mg của công ty cổ phần hóa-dược phẩm

Mekopha 29

Phân tích mẫu thuốc Avastor (10mg) của công ty cổ phần Dược phẩm Boston Việt Nam 30

3.1.4 Nghiên cứu quy trình định lượng atorvastatin trong mẫu huyết tương 32

Khảo sát thành phần hỗn hợp dung dịch rửa tạp 32

Khảo sát hành phần hỗn hợp dung dịch rửa giải 33

3.1.5 Xác định hiệu suất thu hồi của atorvastatin trong mẫu huyết tương 34

3.2 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HỖN HỢP ATORVASTATIN VÀ FENOFIBRAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ 36

3.2.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp 36

Nghiên cứu đặc tính điện hóa của hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat 36

Khảo sát ảnh hưởng của pH 39

Khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ 41

Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ 42

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế 44

3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp 46

Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 46

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 51

Đánh giá độ lặp lại của phép đo 51

3.2.3 Áp dụng thực tế phân tích một số hỗn hợp thuốc trên thị trường 52

Phân tích hàm lượng atorvastatin trong các mẫu thuốc 52

Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng fenofibrat trong các mẫu thuốc 54

Phân tích đồng thời hàm lượng atovastatin và fenofibrat trong mẫu thuốc 56

KẾT LUẬN 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

V

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 Anodic Stripping Voltammetry Von-ampe hòa tan a-nốt ASV

2 Asorptive Stripping

4 Cathodic Stripping

6 Differential pulse stripping

Voltammetry Von-ampe hòa tan xung vi phân DPV

8 Hanging Mercury Dropping

Electrode Điện cực giọt thủy ngân treo HMDE

9 High Perfomance Liquid

11 Limit of quantityication Giới hạn định lượng LOQ

12 Mercury Film Electrode Điện cực màng thủy ngân MFE

13 Square-Wave Stripping

Voltammetry Von-ampe hòa tan sóng vuông SqW

14 Static Mercury Dropping

Electrode Điện cực giọt thủy ngân tĩnh SMDE

VI

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm-Autolab 14

Hình 3.1: Đường von-ampe vòng của atorvastatin 10-7mol.L -1 18

Hình 3.2: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào pH 20

Hình 3.3: Sự phụ thuộc cường độ dòng vào thế hấp phụ 21

Hình 3.4: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ 21

Hình 3.5: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M 22

Hình 3.6: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 10-8M 22

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ 23

Hình 3.8: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào thời gian cân bằng 24

Hình 3.9: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian cân bằng 24

Hình 3.10: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào tốc độ quét thế 26

Hình 3.11 Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế 26

Hình 3.12: Đường von-ampe hòa tan của atorvastatin từ 10-8M đến 10-7M 27

Hình 3.13 Đường chuẩn của atorvastatin từ 10-8M đến 10-7M 28

Hình 3.14: Đường chuẩn của atorvastatin từ 10 -7 M đến 10 -6 M 28

Hình 3.15: Đường von-ampe hòa tan mẫu thuốc mekopha 29

Hình 3.16 Đường von-ampe hòa tan khi đo mẫu (10mg) của công ty dược phẩm Boston bằng phương pháp thêm chuẩn 31

Hình 3.17 Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa tạp 32

Hình 3.18 Đường von-ampe phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa giải 34

Hình 3.19 Đường von–ampe hòa tan của atovastatin trong mẫu huyết tương 35

Hình 3.20: Đường CV của atorvastatin và fenofibrat 36

Hình 3.21: Đường von-ampe vòng của atorvastati và fenofibrat phụ thuộc vào tốc độ quét 38

Hình 3.22: Phản ứng điện hóa của atorvastatin 38

Hình 3.23: Phản ứng điện hóa của fenofibrat 39

Hình 3.24: Sựphụ thuộc của cường độ dòng píc vào pH 40

Hình 3.25: Đường von-ampe hòa tan khi thay đổi pH từ 5,0 đến 9,0 40

Hình 3.26: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thế hấp phụ 41

VII

Hình 3.27: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ 42

Hình 3.28: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 5.10 -7 M 43

Hình 3.29: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 5.10 -7 M 44

Hình 3.30 Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế 45

Hình 3.31: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp fenofibrat và atorvastatin 47

( fenofibrat : atorvastatin = 1: 3) 47

Hình 3.32.Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của –log C fenofibrat vào cường độ dòng I 48

Hình 3.33 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của –log C atorvastatin vào cường độ dòng I 48

Hình 3.34: Đường von-ampe hòa tan khi thay đổi nồng độ của hỗn hợp fenofibrat và atorvastatin 49

Hình 3.35 Đường chuẩn của fenofibrat trong khoảng nồng độ từ 10 -8 M đến 10 7 M. 49

Hình 3.36 Đường chuẩn của atorvastatin trong khoảng nồng độ từ 8M đến 10-7M 50

Hình 3.37 Đường von-ampe hòa tan khi đo mẫu (10mg) của công ty dược phẩm SHYT bằng phương pháp thêm chuẩn 53

Hình 3.38 Đường von-ampe hòa tan của thuốc Lipistad 300mg 55

Hình 3.39: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp Atovastatin 10mg và Fenofibrat 300mg 57

VIII

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng của píc 19

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng píc 20

Bảng 3.3: Sự ảnh hưởng của tốc độ quét thế tới cường dộ dòng píc 25

Bảng 3.4 Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc LIPIVASTIN bằng phương pháp thêm chuẩn 29

Bảng 3.5 Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Avastor bằng phương pháp thêm chuẩn 30

Bảng 3.6 Sự phụ thuộc của cường dộ dòng píc vào thành phần dung dịch rửa tạp 32 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc của cường dộ dòng píc vào thành phần dung dịch giải 33

Bảng 3.9 Cường độ dòng píc khi đo Atorvastatin trên nền mẫu huyết tương bằng phương pháp thêm chuẩn 40

Bảng 3.10 Cường độ dòng píc khi thay đổi tốc độ quét từ 25mV/s đến 200mV/s 37

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng của píc 39

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng píc 41

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ tới cường độ dòng píc tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M 43

Bảng 3.14 Sự ảnh hưởng của tốc độ quét thế tới cường dộ dòng píc 45

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ chất phân tích đến cường độ dòng píc 47

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ chất phân tích đến cường độ dòng píc 48

Bảng 3.18 Độ lặp lại của hỗn hợp Ato và Feno 52

Bảng 3.19 Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Avastor bằng phương pháp thêm chuẩn 53

Bảng 3.20 Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc bằng phương pháp thêm chuẩn 55

Bảng 3.21 Cường độ dòng píc khi đo hỗn hợp mẫu thuốc Ato và Feno bằng phương pháp thêm chuẩn 56

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có hơn mười nghìn hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học dùng làm thuốc chữa bệnh cho con người Theo sự phát triển của dịch vụ y tế, ngành Dược Việt Nam cũng đang trên đà lớn mạnh, tính đến tháng 9 năm 2015, cả nước có 171 doanh nghiệp sản xuất thuốc, trong đó có 93 doanh nghiệp sản xuất tân dược nhưng chỉ có 53 doanh nghiệp đạt chuẩn GMP – WHO [1] Theo WHO, thuốc giả chiếm tới 30% và thậm chí, có khi còn lên tới 50% lượng dược phẩm lưu hành ở một số nước đang phát triển, còn tại Nigeria và Guinee, cứ

10 viên thuốc bán ra có tới 6 viên là thuốc giả[12] Các mẫu thuốc giả chủ yếu là những thuốc được sử dụng khá phổ biến, được bệnh nhân sử dụng thường xuyên thuốc như thuốc điều chỉnh huyết áp, thuốc giảm đường huyết, giảm cholesterol, thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả ở Việt Nam ngày một diễn biến phức tạp, nên công tác kiểm tra ngày càng khó khăn hơn.Theo TS Trương Quốc Cường, Cục trưởng Cục Quản lý dược, Bộ Y tế,

tỷ lệ thuốc kém chất lượng ở Việt Nam hiện dao động khoảng 3% và thuốc giả dưới 0,02% [12] Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng của thuốc theo đúng tiêu chuẩn

là một vấn đề rất quan trọng và thực sự cần thiết

Mặt khác, ngoài việc định lượng và kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bào chế, thì cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinh học để có thể tìm hiểu khả năng tồn tại, cũng như khả năng hấp thu của thuốc trong

cơ thể Ngày nay, có rất nhiều phương pháp được sử dụng để định lượng các hoạt chất trong thuốc chủ yếu là nhóm các phương pháp sắc ký (HPLC, GC, GC-MS/MS, LC-MS/MS) và nhóm các phương pháp quang phổ (UV-VIS, IR…), phương pháp cực phổ và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ Dược điển Việt Nam sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp thường quy để định lượng hoạt chất trong thuốc [1] Phương pháp HPLC có ưu điểm có độ nhạy, độ chọn lọc cao, khả năng tách tốt, nhưng khó áp dụng rộng rãi do thiết bị, hóa chất đắt tiền và không phân tích nhanh được Phương pháp trắc quang tương đối phổ biến nhưng phải qua nhiều giai đoạn chiết tách mất thời gian, tốn hóa chất, hay mất chất phân tích và độ phân giải không cao Vì vậy, việc nhiên cứu lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ đúng, độ chọn lọc, đơn giản, giá thành không cao, thời gian phân tích nhanh có thể kiểm tra song hành với các phương pháp phân tích trong dược điển và đánh giá tương đương hoạt tính sinh học thuốc là

2

rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn Vì vậy, chúng tôi đã chọn phương pháp ampe hòa tan hấp phụ để thực hiện đề tài luận văn của mình “Nghiên cứu các đặc tính điện hóa của atorvastatin, fenofibrat và ứng dụng trong phân tích bằng phương pháp Von-ampe” Atorvastatin và fenofibrat là hai thuốc được sử dụng khá phổ biến hiện nay, có tác dụng làm giảm hàm lượng Cholesterol và triglicelid trong máu

Von-3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU ATORVASTATIN

1.1.1 Cấu tạo của atorvastatin

Atorvastatin có tên khoa học theo IUPAC:

(3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-5-propan-2-ylpyrrol-1-yl]-3,5- axit

dihydroxyheptanoic và được biết đến với tên thương mại là Lipitor hay Atorva [1]

Công thức cấu tạo của atorvastatin là

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Atorvastatin

Công thức phân tử là C33H35FN2O5, khối lượng mol là 558,64 (g/mol)

Ngoài hoạt chất hay sử dụng trong các thuốc là atorvastatin còn có hoạt chất atorvastatin canxi có công thức cấu tạo như hình 1.2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Atorvastatin canxi

Atorvastatin canxi có tên khoa học theo IUPAC là: (bR, fluorophenyl)-b,ddihydroxy-5-isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl) pyrrole-1-hepatanoicacid(1:2)trihydrate Công thức phân tử là C18H68CaF2N4O10.3H2O hay (C33H34FN2O5)2Ca.3H2O[1]

dR)-2-(r-4

Atrovastatin canxi có khối lượng mol là1155,34 g/mol[1]

Atorvastatin và dạng muối Atorvastatin canxi tồn tại ở dạng bột tinh thể rất

ít tan trong nước: 20,4 µg/mL (pH = 2,1); 1,23 mg/mL (pH = 6,0), tan ít trong etanol, tan tốt trong methanol [1]

1.1.2 Dƣợc lực học và động học của Atorvastatin

Dược lực học

Atorvastatin là chất ức chế cạnh tranh và chọn lọc men khử 3-hydroxy-3- methylglutaryl-coemzym A (HMG-CoA), ức chế quá trình chuyển hóa HMG-CoA thành mevalonat, một tiền chất của sterol, bao gồm cholesterol Do vậy atovasttin

có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol và triglicelid trong máu

Dược động học

Atorvastatin được hấp thu nhanh chóng sau khi uống, nồng độ thuốc trong huyết tương tối đa đạt được trong vòng 1-2 giờ Mức độ hấp thu và nồng độ atorvastatin tăng tỉ lệ với liều lượng atorvastatin Atorvastatin dạng viên nén có độ khả dụng sinh học 95-99% so với dạng dung dịch Độ khả dụng sinh học tuyệt đối của Atorvastatin là khoảng 14% và độ khả dụng toàn thân của hoạt động ức chế men khử HMG-CoA là khoảng 30% Khoảng 98 % atorvastatin gắn kết với các protein trong huyết tương.Nồng độ thuốc trong huyết tương khi dùng thuốc buổi chiều tối thấp hơn khi dùng buổi sáng, tuy nhiên nồng độ thuốc trong huyết tương xấp xỉ 0,25 % cho thấy sự thấm thuốc vào tế bào hồng cầu thấp, nhưng hiệu quả

giảm LDL thì như nhau [2, 3]

Thời gian bán hủy atovastatin trong huyết tương của người 14 giờ Dưới 2% lượng atorvastatin uống vào được tìm thấy trong nước tiểu [2, 3]

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU FENOFIBRAT

1.2.1 Cấu tạo của fenofibrat

Fenofibrat có tên khoa học theo IUPAC là propan-2-yl{2-4-[(4-clophenyl) cacbonyl] phenoxy}-2-methylpropanoat được biết với tên thương mại là tricor, là một dẫn xuất của axit fibric

5

Công thức cấu tạo của fenofibrat:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Fenofibrat

Công thức phân tử của fenofibrat: C20H21ClO4

Khối lượng mol (g/mol): 360,831

1.2.2 Dược lực học và động lực học của Fenofibrat

Dược lực học

Fenofibrat, dẫn chất của acid fibric, là thuốc hạ lipid máu Thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây xơ vữa động mạch và còn làm giảm triglycerid máu Do đó, cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong huyết tương

Dược động học

Fenofibrat được hấp thu tốt từ đường dạ dày ruột sau khi uống Trong một nghiên cứu ở người tình nguyện khoẻ mạnh, khoảng 80% liều duy nhất fenofibrat đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ xuất hiện trong nước tiểu chủ yếu dưới dạng acid fenofibric và các phức hợp glucuronide và 25% bài tiết trong phân Nồng độ đỉnh trong huyết tương của acid fenofibric xảy ra trong vòng 6 đến 8 giờ sau khi uống Không tìm thấy fenofibrat nguyên dạng trong huyết tương

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ATORVASTATIN,

FENOFIBRAT

Atovastatin, fenofibrat có thể xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp quang học, phương pháp sắc ký, phương pháp von-ampe

6

1.3.1 Các phương pháp xác định atorvastin

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Atorvastatin trong các mẫu dược phẩm được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột C18 [18,20,24], detector UV và detector huỳnh quang Các tác giả đã sử dụng một số pha động có thành phần khác nhau như acetonnitril: nước cất (85:15) tại pH=4,5, khoảng tuyến tính của atorvastatin trong khoảng 2-12 mg/ml, hiệu suất thu hồi của atorvastatin được xác định là đạt 99,03% [24]; acetonitril: photphat (C = 0,015 M, pH = 3, tỉ lệ thể tích v/v = 45 : 55) [18] hay pha động là hỗn hợp acetonitril : nước = 48 : 52, = 2 được điều chỉnh bằng axit orthophotphoric, khoảng tuyến tính của thuốc là 0,04 - 0,4 mg/mL, hệ số tương quan là R2 = 0,999 [20] Thời gian lưu của atorvastatin phụ thuộc vào thành phần pha động, detector sử dụng

Phương pháp HPLC có ưu điểm rất cao về độ nhạy, độ chính xác cao, nhưng rất tốn kém do thiết bị đắt tiền và quy trình phân tích phức tạp Phương pháp HPLC rất phù hợp với những phòng thí nghiệm kiểm soát chất lượng tuyến trung ương

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Baldha [19] và cộng sự đã sử dụng phương pháp quang phổ vùng tử ngoại

để xác định atorvastatin trong thuốc ở hai bước sóng hấp thụ λ = 227 nm và 246,5

nm, khoảng tuyến tính từ 5 - 30 mcg/ml Tác giả Jadhav đã xác định atorvastatin bằng cách cho tạo phức màu xanh với FeCl30,3 % và K3[Fe(CN)6]0,02 % Phức màu xanh được đo tại ước sóng hấp thụ cực đại 787 nm Hiệu suất thu hồi atorvastatin canxi đạt được trong khoảng từ 99,26 % đến 100,12 % [19]

Phương pháp von-ampe

Tác giả Ramadan [17] và cộng sự đã sử dụng phương pháp cực phổ xung vi phân trên điện cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE) để xác định atorvastatin trong mẫu dược phẩm Các điều kiện đo được tiến hành ở pH = 7,5, biên độ xung 100mV, khoảng quét thế - 0,9 V ÷ -1,5V, bước thế 8 mV, thời gian xung 40 ms, tốc độ quét thế 5,714 mV/s, giới hạn phát hiện (LOD)là 0,024μg.ml-1 và giới hạn định lượng (LOQ) là 0,071 μg.ml-1, hiệu suất thu hồi từ 97,0 đến 100,5 %

Tác giả Wli Mohammadi [23] đã xác định đồng thời amlodipin và atorvastatin canxi trên điện cực graphit được biến tính bề mặt bằng nano cacbon So

7

với điện cực glassy cabon thì điện cực graphit có diện tích bề mặt và độ dẫn điện tốt hơn nên có độ nhạy tốt hơn Bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ thì xác định được khoảng tuyến tính là 2,5 đến 100 µg/ml với độ lệch chuẩn của amlodipin

là 2,7 đến 7,1% và đối với atorvastatin canxi là 1,8 đến 8,3%, giới hạn phát hiện đối với 2 chất là 1 µg/ml ở điều kiện pH=6

Các điện cực glassy các bon và điện cực graphene oxit đã được sử dụng để xác định atorvastatin trong môi trường pH từ 2,0 đến 4,5 bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ Hơn nữa, điện cực rắn biến tính rất có triển vọng trong ứng dụng phân tích dược và môi trường vì điện cực rắn có khoảng làm việc rộng, không độc hại, thân thiện với môi trường, có thể tự chế tạo được

1.3.2 Các phương pháp xác định fenofibrat

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Tác giả [29] đã nghiên cứu xác định fenofibrat bằng phương pháp đo quang trong mẫu dược phẩm sử dụng hai thuốc thử khác nhau Với thuốc thử methylen xanh (MTB) thì fenofibrat phản ứng với MTB trong dung môi cloroform và dùng dịch đệm axit phthalat pH = 2,4 tạo ra phức chất màu xanh, có cực đại hấp thụ là 630nm, khoảng tuyến tính tuân theo Định luật Beer là 5 đến 15 mg/ml với độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,86% Ở phương pháp thứ hai, cũng tiến hành như phương pháp đầu nhưng dựa trên phản ứng của fenofibrat với saffarin tạo thành phức màu hồng và độ hấp thụ quang đo được ở 520nm, khoảng tuyến tính thu được:

10 – 30µg/ml và độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,903% Đo trên mẫu dược phẩm 200mg thì đạt hiệu suất thu hồi ở 2 phương pháp lần lượt tương ứng là 99,16% và 99,35%

Một nghiên cứu khác cũng đã fenofibrat xác định được trong mẫu dược phẩm sử dụng thuốc thử MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride) Dựa trên việc đo độ hấp thụ của fenofibrat trong hỗn hợp metanol (0,5% MBTH, 0,5% HCl, 1% FeCl3) thu được cực đại hấp thụ ở 596nm, khoảng tuyến tính là 2-5µg/ml, độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,7719%, hiệu suất thu hồi 99,36 % [8]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tác giả N.Jain xây dựng quy trình xác định đồng thời atorvastatin canxi và feniobrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo sử dụng cột tách C18

8

(250mmx46mm,5µm) Pha động gồm metanol/đệm acetate pH= 3,7 với tỉ lệ 82:18 (v/v) đã được lọc trước qua màng lọc 0,45µm Tốc độ dòng chảy 1,5ml/min, detector UV-VIS đo ở bước sóng 248nm, thời gian lưu của fenofibrat được xác định

là 9,05 ± 0,2min Khoảng tuyến tính là 16-80mg/ml với hệ số tương quan > 99,9%

và độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,79% Thực hiện xác định thuốc với mẫu dược phẩm 32µg/ml đạt hiệu suất thu hồi 100,6%, hệ số biến thiên 0,0038 [25]

Tác giả Suresh Kumar đã xác định fenofibrat bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo sử dụng cột phân tích Inertsil ODS, 250x4,6mm, cột 5µ) Pha động là hỗn hợp nước (điều chỉnh đến pH=2,5 với axit ortho phosphoric và acetonitril với tỉ lệ 30:70(v/v), tốc độ dòng chảy 1,0 ml/min, detector UV-Vis đo ở bước sóng 286 nm, thời gian lưu của fenofibrat là 20,5min, khoảng tuyến tính được 1000-3000µg/ml với hệ số tương quan >0,999 Giới hạn xác định và giới hạn phát hiện lần lượt là 0,45µg/ml và 0,14µg/ml [26]

Một nghiên cứu khác sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định đồng thời ezeimibe, atorvastatin và fenofibrate Sử dụng cột tách C18 (5µm, 280mm x 4,6mm) với thành phần pha động là hỗn hợp nước - acetonitril ở nhiệt độ phòng, detector PDA, khoảng tuyến tính của fenofibrat là 32-160µg/ml với hệ số tương quan là 0,994 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 1,9544µg/ml và 3,6225µg/ml tương ứng Độ lệch chuẩn của phương pháp nhỏ hơn 2% [27]

Phương pháp cực phổ và von-ampe hòa tan

Tác giả Ceren Yardimci xác định fenofibrat trong mẫu thuốc bằng phương pháp von-ampe hòa tan sóng vuông trên điện cực giọt thủy ngân treo (HDME) với các điều kiện: Dung dịch đệm borat pH = 9,0 có chứa tetrabutylammoni iodua (

C16H36IN) 0,01M và 12,5%(v/v) metanol, thời gian sục khí N2 để loại oxi là 10 phút, khoảng đo thế từ -0,6V đến -1,4V, tốc độ quét thế 250mV/s, tần số sóng 15Hz, biên độ xung 20mV, bước thế 4mV, thế đỉnh píc E=-1,2V, khoảng tuyến tính

là 0,146-4,96µg/ml, giới hạn phát hiện là 0,025µg/ml Tác giả đã ứng dụng phương pháp để xác định mẫu thuốc có hàm lượng fenofibrat 250mg thu được hiệu suất thu hồi là 102,44% [28] Hiện nay, phương pháp cực phổ sử dụng hệ xúc tác là một hướng quan trọng của ngành phân tích điện hóa Đặc biệt là hệ xúc tác hydro áp dụng cả với chất hữu cơ làm tăng độ nhạy phân tích và giúp nghiên cứu quá trình điện cực và động học phản ứng hóa học

9

Một nghiên cứu đã sử dụng phương pháp cực phổ dùng xúc tác hydro để xác định fenofibrat Fenofibrate và muối axit fenofibric dạng thủy phân của nó chứa nhóm cacbonyl, nhóm này nhường 2e/2H+ trong quá trình điện phân thành 2 pic tương ứng trong môi trường axit Trong điều kiện thường, fenofibrat được thủy phân hoàn toàn với muối axit fenofibric chỉ có 1 pic xuất hiện đã được xác định Khi có mặt K2S2O8 cường độ dòng pic xúc tác, giới hạn phát hiện của phương pháp 4.10-5mg/ml

Qua tổng quan tài liệu về các phương pháp xác định atorvastatin và fenofibrat cho thấy, phương pháp von-ampe đã được nghiên cứu để xác định chúng trong mẫu thuốc và mẫu sinh học, tuy nhiên các đặc tính điện hóa của chúng trên điện cực giọt thủy ngân treo chưa được sáng tỏ, đặc biệt chưa thấy có công trình nào nghiên cứu xác định đồng thời chúng trong mẫu thuốc Chính vì vậy, chúng tôi

đã lựa chọn phương pháp von-ampe để nghiên cứu các đặc tính điện hóa của atorvastatin, fenofibrat và ứng dụng trong phân tích

1.4 GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV)

Quy trình phân tích theo phương pháp AdSV cũng đư ợc thực hiện qua ba giai đoạn: giai đoạn làm giàu động, giai đoạn dừng và giai đoạn hòa tan tĩnh

[14,15]

Phương pháp AdSV về cơ bản giống phương pháp von-ampe hoà tan, chỉ có điểm khác cơ bản so với phương pháp von-ampe hoà tan là cơ chế của quá trình làm giàu (hay quá trình tích luỹ chất trên bề mặt điện cực), làm giàu bằng cách hấp phụ các chất hoặc các phức chất giữa kim loại với phối tử lên bề mặt điện cực làm việc tiếp xúc dung dịch Sau làm giàu vẫn phân cực hoà tan như phương pháp von-ampe hoà tan

Cơ chế tổng quát của giai đoạn làm giàu trong phương pháp AdSV như sau: Trước hết phức của ion kim loại với phối tử hữu cơ được hình thành sau khi thêm phối tử vào dung dịch phân tích, tiếp theo phức đó được tích luỹ bằng cách hấp phụ (điện hóa, vật lý, hóa học) lên ranh giới tiếp xúc dung dịch -điện cực làm việc Trong thời gian làm giàu, thế trên điện cực làm việc được giữ không đổi, dung dịch

10

đo được khuấy Thông thường AdSV có thể được thực hiện trên hầu hết các loại điện cực dùng trong von-ampe, ví dụ như: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hoá học Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV đều sử dụng điện cực HMDE do điện cực này có nhiều

ưu điểm: bề mặt được tự làm sạch và lặp lại, dễ tự động hoá

Sau giai đoạn làm giàu là giai đoạn dừng để chất phân bố đều trên bề mặt điện cực Tiếp theo là giai đoạn hòa tan, ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế theo chiều catot, tức là quét thế âm dần để khử chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc, có thể là phức chất của ion kim loại với phối tử tạo phức hoặc chất phân tích (chất hữu cơ) và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng một kỹ thuật von-ampe nào đó, chẳng hạn: von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), khi đó phương pháp được gọi là von-ampe hòa tan catot hấp phụ xung vi phân (DP-AdSV) hoặc von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW) khi đó phương pháp được gọi là von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông (SW-AdSV) Ngược lại, ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế theo chiều anot, tức là quét thế dương dần để oxi hóa chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và ghi tín hiệu hòa tan bằng các kỹ thuật von-ampe

Đối với phương pháp AdSV, tín hiệu hòa tan thu được có dạng đỉnh Thế đỉnh hòa tan (Ep) và cường độ dòng đỉnh hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố như: thành phần nền, phối tử ta ̣o phức , pH, thời gian tích lũy, thế tích lũy, bản chất của điện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan Trong những điều kiện xác định, Ep đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích và do đó dùng để phân tích định tính Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch, do vậy

Ip dùng để phân tích định lượng

Phương pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích các ion kim loại không thể xác định được bằng kĩ thuật cực phổ thông thường (hay quá trình xác định rất phức tạp) như Al, Ca, Be, Pt, Ga, Nb hay các chất hữu cơ Cũng như von-ampe hoà tan thông thường phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ nhạy hơn so với các phương pháp đo von-ampe điện hoá trực tiếp qua yếu tố làm giàu (tích luỹ) Ngoài những ưu điểm trên, phương pháp AdSV còn có những ưu điểm riêng so với phương pháp SV như:

11

- Độ nhạy của AdSV thường lớn hơn nhiều so với ASV do kim loại không hoà tan trong thuỷ ngân mà tạo thành các lớp phức đơn phân tử, ví dụ như điện cực màng thuỷ ngân

- Xác định được nhiều kim loại hơn và độ chọn lọc cao hơn so với phương pháp ASV và CSV do có thể lựa chọn được nhiều thuốc thử tạo phức bền và chọn lọc với kim loại cần phân tích

- AdSV đặc biệt tỏ ra có ưu điểm trong phân tích các chất có hoạt tính sinh học, dược phẩm, (có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực giọt Hg), các chất không

có khả năng khử điện hoá trên điện cực giọt cũng có thể được xác định sau khi dẫn xuất hoá bằng cách gắn với các nhóm dễ khử như nitroso, nitro… hoặc thủy phân tạo thành chất mới có hoạt tính điện hóa

- Một điểm đặc biệt của phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ là dựa vào các đặc tính hấp phụ ta có thể giải quyết được bài toán liên quan đến các quá trình điện cực, cơ chế phản ứng xảy ra trên điện cực như thế nào

- Phương pháp AdSV có thể loại trừ được ảnh hưởng của các yếu tố cản trở bằng cách chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, thế điện phân làm giàu và thế hấp phu ̣ làm giàu

1.4.2 Các kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan hấp phụ

Trong phương pháp AdSV, các kỹ thuật sử dụng để ghi đường von-ampe hòa tan là von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), von-ampe xung thường (Normal Pulse - NP) và von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW), khi đó tên của phương pháp được gắn thêm tên của kỹ thuật đo, chẳng hạn như: Von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân DP-AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ xung thường NP - AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông SW-AdSV Trong luận văn, chúng tôi

đã sử dụng kĩ thuật quét xung vi phân và kỹ thuật quét sóng vuông

Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (DP)

Trong kỹ thuật xung vi phân, điện cực được phân cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với một tốc độ chậm nhưng vào cuối mỗi chu kì xung trên khung điện áp biến đổi một chiều người ta đặt thêm một xung vuông góc với biên độ

12

thay đổi từ 10-100mV và độ dài xung từ 40-100ms Cường độ dòng được ghi hai lần, lần 1 tại thời điểm i1, thường là 17ms trước khi nạp xung và lần hai là 17ms trước khi cắt xung, lúc này ghi dòng cực phổ dưới tác dụng của xung Hai giá trị này được gửi vào bộ so sánh và kết quả ra bộ ghi là hiệu số của hai giá trị đó Tín hiệu có dạng một cực đại

Kỹ thuật sóng vuông

Theo kỹ thuật này, điện cực được phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên đều, được đặt chồng lên điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số từ 8 Hz đến 2000 Hz, biên độ từ 1 đến 50mV Trong mỗi chu kỳ xung, dòng được đo hai lần: thời điểm 1 (dòng dương I1) và thời điểm 2 (dòng âm I2) Dòng thu được là hiệu của hai giá trị dòng đó (Ip = I1 – I2) và Ip là hàm của thế áp vào điện cực làm việc Đối với các chất có tính thuận nghịch thì kỹ thuật hòa tan sóng vuông có độ nhạy cao hơn kỹ thuật xung vi phân

13

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Trong luận văn này, mục đích nghiên cứu của đề tài là nghiên cứu các đặc tính điện hóa và quy trình xác định atorvastatin và fenofibrat bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ, sử dụng điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) Từ đó, ứng dụng quy trình để phân tích một số mẫu thuốc và mẫu huyết tương

Vì vậy nội dung nghiên cứu bao gồm:

1 Nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin, hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat bằng phương pháp von-ampe vòng (CV)

2 Tối ưu hóa các điều kiện xác định atorvastatin, hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat trong mẫu thuốc và mẫu huyết tương

- Khảo sát ảnh hưởngcủa môi trường pH

- Khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ

- Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ

- Khảo sát ảnh hưởng thời gian cân bằng

- Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét

3 Đánh giá phương pháp: Khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

4 Áp dụng quy trình nghiên cứu được để phân tích atorvastatin, fenofibrat trong một số mẫu thuốc trên thị trường và atorvastatin trong mẫu huyết tương

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.2.1 Thiết bị

Máy đo pH meter TOA –Nhật Bản

Cân phân tích Torius (độ chính xác 0,1 mg)

- Dung dịch B: Dung dịch NaOH 0,2 M

- Pha dung dịch đệm Britton -Robinson bằng cách trộn hai dung dịch A và B

có tỉ lệ thích hợp [7] Giá trị pH được điều chỉnh trên máy đo pH

Pha dung dịch gốc atorvastatin và fenofibrat

- Cân 0,0288 g ± 0,0001g chất chuẩn atorvastatin canxi (M = 1155,34 g/mol), thêm 15 ml methanol, rung siêu âm 10 phút và chuyển vào bình định 25ml và định mức tới vạch, được dung dịch có nồng độ 10-3M

- Cân 0,0902± 0,0001g chất chuẩn fenofibrat (M = 360,83 g/mol) thêm trong

15 ml methanol, rung siêu âm 10 phút và chuyển vào bình định 25ml và định mức tới vạch, được dung dịch có nồng độ 10-2M

- Dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C, các dung dich đo có nồng độ thấp hơn được pha từ dung dịch gốc và dùng trong ngày

2.3 Xử lý mẫu

2.3.1 Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc atovastatin

Cân 10 viên thuốc trên cân phân tích để tính khối lượng trung bình (A g) của một viên thuốc đó Đem 10 viên thuốc đó đem nghiền mịn trên cối mã não, trộn đều mẫu thuốc Cân chính xác a g (khoảng 0,1g) mẫu thuốc bột mịn đó trên cân phân tích, cho vào cốc 100 ml, thêm 15 ml metanol, rung siêu âm 45 phút cho thuốc tan hết Chuyển dung dịch vào bình định mức 25,0 ml, định mức tới vạch bằng nước cất

2 lần, lọc dung dịch bằng giấy lọc băng xanh được dung dịch A có nồng độ C0(M) Lấy 1,0 ml dung dịch A định mức 100,0 ml được dung dịch B có nồng độ C1(M)

Từ dung dịch B có nồng độ C1(M) lấy 1,00 ml dung dịch B và 10ml dung dịch đệm

16

BR pH=9,0 định mức trong bình 25ml được dung dịch C có nồng độ Cx(M) Nồng

độ atorvastatin (Cx) trong viên thuốc được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn

Hàm lượng atorvastatin trong mẫu thuốc Ator (mg) được tính theo công thức:

2.3.2 Quy trình xử lý mẫu huyết tương xác định atorvastatin

Huyết tương (plasma) là một trong hai thành phần chính của mô máu đó là

tế bào ( hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) và huyết tương Huyết tương chứa 90% nước

về thể tích và 10% còn lại là các chất tan như: protein huyết tương (Albumin, globumin fibrinogen), các chất hữu cơ hữu cơ như axit amino, glucose, vitamin và một số loại peptide điều hòa, steroid hormone, lipide và muối vô cơ như

Na, K, Ca v.v

Mẫu huyết tương được đông lạnh ngay sau khi lấy mẫu và được bảo quản ở nhiệt độ -400C để hạn chế sự chuyển hóa của axit lactone Trước khi phân tích, mẫu huyết tương được lấy ra, để rã đông ở nhiệt độ phòng Sau khi mẫu rã đông về đến nhiệt độ phòng, lấy 1,0 ml mẫu huyết tương trắng hoặc 1,0 ml huyết tương đã được tiêm thêm chất chuẩn atorvastatin, cho vào ống nghiệm, thêm tiếp 1ml dung dịch đệm Briston-Robitson (đệm BR, pH=9,0) vào ống nghiệm, đem lắc Vortex trong 5 phút và đem quay ly tâm ở tốc độ 1600 vòng trong 15 phút

+ Quá trình hoạt hóa cột, cột C18 (thể tích 3ml) được lắp vào bộ dụng cụ hút chân không Trước tiên, cho đi qua cột 2ml nước cất 2 lần và 2 ml metanol Sau khi hoạt hóa cột xong, mẫu sẽ được đi qua cột với tốc độ 0,4 ml/ phút

17

a = 0,0450 g ± 0,0001 g) cho vào cốc, sau đó thêm vào cốc 15ml metanol, rung siêu

âm 45 phút cho thuốc tan hết Chuyển dung dịch vào bình định mức 25,0ml, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần Dung dịch được lọc qua giấy lọc băng xanh ta được dung dịch A

Tương tự, cân 10 viên thuốc fenofibrat trên cân phân tích để xác định khối lượng trung bình của một viên thuốc, đem nghiền bằng cối mã não, trộn đều Cân chính xác một lượng thuốc vừa nghiền mịn (khoảng f = 0,0200 g ± 0,0001 g), thêm 15 ml metanol vào cốc 50 ml, rung siêu âm 45 phút cho thuốc tan hết Chuyển dung dịch vào bình định mức 25,0 ml, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, ta được dung dịch F

Lấy 0,25 ml dung dich F và 2,5 ml dung dịch A chuyển vào bình định mức 25,0 ml, định mức bằng nước cất đến vạch ta được hỗn hợpdung dịch B, lấy 0,50

ml dung dịch B vào bình định mức 25,0 ml, thêm 10 ml dung dịch đệm BR tại

pH = 6,5 rồi định mức đến vạch bằng nước cất Lắc kỹ rồi chuyển vào bình điện hóa và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn Hàm lượng atorvastatin và fenofibrat được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn

Trong đó : Cx nồng độ chất phân tích trong dung dịch đo

mf, ma là khối lượng trung bình của một viên thuốc fenofibrat và atorvastatin tương ứng

f, a là lượng cân của thuốc fenofibrat và atorvastatin đem phân tích

5000 và 500 là hệ số pha loãng dung dịch của từng chất phân tích

18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu quy trình định lượng atorvastatin trong mẫu thuốc bằng

phương pháp von-ampe

3.1.1 Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định atorvastatin

Nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin

Để nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin trên bề mặt điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE), chúng tôi đã tiến hành ghi đường von-ampe vòng trong một khoảng thế rộng trong điều kiện không hấp phụ và có hấp phụ 60s Kết quả thu được như sau:

Hình 3.1: Đường von-ampe vòng của atorvastatin 10-7mol.L -1 , đường 1)

mẫu trắng, đường 2) atorvastatin 10-7mol.L-1 không có thời gian hấp phụ, đường a) atorvastatin 10-7 mol.L-1 có thời gian hấp phụ 60s, các đường b,c) ghi liên tục sau

đường a), tốc độ quét 100 mV/s

-800m -1.00 -1.20 -1.40 -1.60

U (V)

-40.0n -30.0n -20.0n -10.0n

19

Qua kết quả khảo sát đường von-ampe vòng cho thấy, trên đường phân cực catot có píc khử xuất hiện, trên đường phân cực anot không có píc oxi hóa, nên atorvastatin là chất oxi hóa trên điện cực HMDE, píc khử là bất thuận nghịch

So sánh đường von-ampe vòng ở đường 2) và đường a) thấy rằng, khi có thời gian hấp phụ 60 s tại thế -0,9V thì cường độ dòng píc khử cao hơn so với đường von-ampe vòng không có giai đoạn hấp phụ Đường b) đường c) là những đường von-ampe vòng ghi liên tục sau đường a) trên cùng một giọt thì tín hiệu cường độ dòng đường b) và và c) thấp hơn so với đường a) nhưng cao hơn đường 2) Điều này chứng tỏ atorvastatin có hấp phụ trên bề mặt điện cực HMDE tại thế -0,9V, hiện tượng hấp phụ là đa lớp nên sau khi ghi đường hòa tan ở vòng 1 (đường a)) thì chất hấp phụ chưa bị hòa tan hết nên tín hiệu ở vòng 2, 3 cao hơn tín hiệu ở đường 2 khi không có hấp phụ

Như vậy, qua kết quả khảo sát bằng phương pháp von- ampe vòng có thể kết luận rằng, atorvastatin cho píc khử bất thuận nghịch và có hấp phụ trên điện cực HMDE Phương pháp lựa chọn để định lượng atovastatin là phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông

Khảo sát ảnh hưởng của pH

Thành phần dung dịch nền, pH quyết định độ dẫn điện của nền, dạng tồn tại

và khả năng hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt điện cực tức là ảnh hưởng đến cường độ dòng, thế đỉnh píc và độ phân giải píc Vì vậy việc tìm điều kiện pH tối

ưu là rất quan trọng Do đó, tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng

20

Hình 3.2: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào pH

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH từ 7,0 đến 11,0 thấy rằng, trong khoảng pH từ 8,5 đến 9,0 thì cường độ dòng píc cao và ổn định Vì vậy, tôi chọn pH của dung dịch đệm là 9,0 cho các nghiên cứu sau

Hình 3.4: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ từ 0V đến -1V thì cường

độ dòng píc phụ thuộc nhiều vào giá trị thế hấp phụ được áp vào và đạt cao nhất tại thế hấp phụ là -0,9V Do đó, tôi chọn thế hấp phụ của atorvastatin là -0,9V

-0,9V

22

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ

Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ, nồng độ chất phân tích phụ thuộc vào thời gian hấp phụ, khi nồng độ chất phân tích nhỏ thì cần nhiều thời gian hấp phụ hơn so với nồng độ chất phân tích lớn Cho nên việc chọn thời gian hấp phụ phù hợp với nồng độ chất phân tích là yếu tố rất quan trọng Chính vì vậy mà chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ ở hai mức nồng độ

là 5.10-7M và 10-8M với các điều kiện đo dung dịch đệm BR pH=9, thế hấp phụ 0,9V.Các đường von-ampe hòa tan được biểu diễn trên hình 3.5 và kết quả đo trên hình 3.6

Hình 3.5: Đường von-ampe hòa

tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại

nồng độ chất phân tích 5.10-7M

-1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-50.0n -40.0n -30.0n -20.0n -10.0n

Hình 3.6: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 10-8M

23

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ (a): 5×10 –7 mol L –1 và (b) 10 –

8 mol L –1 , E hp = - 0,4 V, a=50 mV, f =50 Hz

Kết quả thu được từ hình 3.5 và hình 3.6 cho thấy, với nồng độ atorvastatin

là 5.10-7 M, khi tăng thời gian hấp phụ từ 0 đến 90s thì cường độ dòng píc tăng dần, nếu tiếp tục tăng thời gian hấp phụ thì cường độ dòng píc giảm dần Tại nồng độ atorvastatin là 10-8 M, khi tăng thời gian hấp phụ từ 20 đến 300s thì cường độ dòng píc tăng dần và khi tiếp tục tăng thời gian hấp phụ lên trên 300s thì cường độ dòng píc giảm dần, điều đó cho thấy sự hấp phụ là đa lớp Vì sau khi cường độ dòng píc đạt cực đại, nếu tiếp tục tăng thp thì cường độ dòng bị giảm do có thể chất đã hấp phụ thành nhiều lớp (đa lớp) nên khi hòa tan sẽ không được hoàn toàn

Với kiểu hấp phụ đa lớp thì chúng ta nên chọn thời gian hấp phụ trong khoảng tuyến tính thì tín hiệu đo cường độ dòng sẽ lặp lại và chọn lọc hơn Với nồng độ của atorvastatin là 5.10-7M thì chúng tôi chọn thời gian hấp phụ 90s và tại nồng độ chất phân tích là 10-8 M thì chúng tôi chọn thời gian hấp phụ 300s

Khảo sát thời gian cân bằng

Thời gian cân bằng là khoảng thời gian cần thiết để chất phân tích phân bố đều trên bề mặt điện cực do đó nó cũng có ảnh hưởng đến cường độ dòng píc Để chọn thời gian cân bằng phù hợp tôi tiến hành khảo sát ở các thời gian cân bằng khác nhau, điều kiện đo được tiến hành như sau: dung dịch đệm BR với pH=9, thế hấp phụ -0,9 V, thời gian hấp phụ 90s, nồng độ chất phân tích là 5.10-7M Kết quả thu được biểu diễn trên hình 3.9

a

b

Hình 3.9: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian cân bằng

Kết quả thu được từ hình 3.10 cho thấy, khi thay đổi thời gian cân bằng từ 10s đến 30s thì cường độ dòng píc ổn định, nên tôi chọn thời gian cân bằng cho các nghiên cứu tiếp theo là ở 10s

10s

5s

25

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế

Tốc độ quét thế ảnh hưởng đến giá trị cường độ píc Trong phương pháp cực phổ, khi tốc độ quét thế tăng thì cường độ dòng píc tăng, tuy nhiên nếu tốc độ quét quá cao thì quá trình ghi đường hòa tan chất hấp phụ trên bề mặt điện cực, chất phân tích sẽ không được hòa tan hết nên cường độ dòng píc sẽ giảm Vì vậy, tôi tiến hành khảo sát tốc độ quét, với các điều kiện đo như sau: dung dịch đệm là dung dịch BR ở pH=9, thế hấp phụ -0,9 V, thời gian hấp phụ 90s, thời gian cân bằng 10s, nồng độ chất đo là 5.10-7M Tốc độ quét được thay đổi từ 10mV/s đến 300mV/s Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.3: Sự ảnh hưởng của tốc độ quét thế tới cường dộ dòng píc

Hình 3.11 Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế

Từ kết quả trên ta thấy tốc độ quét tăng thì cường độ dòng píc tăng nhưng tín hiệu píc dịch chuyển theo chiều âm hơn Khi tốc độ quét là 300 mV/s thì tín hiệu píc đẹp và cân đối nhất, khi tốc độ quét thế lớn hơn 450 mV/s thì cường độ dòng píc

450mV/s

400mV/s 350mV/s

40mV/s

300mv/s 250mv/s

là 10s, tốc độ quét là 300 mV/s

3.1.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp

Khoảng tuyến tính

Để xây dựng đường chuẩn của chất phân tích, chúng tôi đã tiến hành đo nồng

độ của atovastatin trong 2 khoảng nồng độ:10-8M đến 10-7M và 10-7M đến 10-6với các điều kiện thích hợp đã khảo sát phần trên Kết quả được trình bày trên hình 3.12

U (V)

-140n -120n -100n -80.0n -60.0n -40.0n -20.0n

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp được tính toán dựa vào đường chuẩn k.S.Da/b [17, 19, 20] trong đó k = 3 cho giới hạn phát hiện và

k = 10 cho giới hạn định lượng, S.Dalà độ lệch chuẩn và b là hệ số góc của đường chuẩn Dựa vào kết quả tính toán được LOD là 9,6.10-10 mol.L-1và LOQ là 3.2.10-9 mol.L-1sau thời gian hấp phụ 300s

Độ lặp lại

Độ lặp lại của phương pháp được đo lặp lại đối với dung dịch 5.10-7 mol.L-1, thời gian hấp phụ 30s, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là 0,42%

Khối lượng trung bình của một viên thuốc là 0,3190 g ±0,0001g Cân 0,1129 g

±0,0001g thuốc đã nghiền mịn, tiến hành xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu theo quy trình 2.3.1 Hàm lượng atorvastatin trong dung dịch đo được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, kết quả đo được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 : Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Lipivastatin bằng phương pháp