Nghiên cứu được thực hiện nhằm thiết lập phản ứng trung hòa sử dụng chủng virus thực địa để làm công cụ đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin chống lại các chủng PEDV gây bệnh lưu hành tại Việt Nam.
Trang 1KẾT QUẢ THIẾT LẬP PHẢN ỨNG TRUNG HÒA PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS (PEDV)
SỬ DỤNG CHỦNG THỰC ĐỊA PHÂN LẬP TẠI MIỀN BẮC
Nguyễn Thị Bích1*, Trần Văn Khánh1, Nguyễn Thanh Ba1, Chu Thị Thanh Hương2
1Công ty TNHH Dược Hanvet 2
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
*Tác giả liên hệ: Bichvn8078@gmail.com
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm thiết lập phản ứng trung hòa sử dụng chủng virus thực địa để làm công cụ đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin chống lại các chủng PEDV gây bệnh lưu hành tại Việt Nam Bằng cách lựa chọn môi trường DMEM không chứa huyết thanh bào thai bê (FBS), không chứa trypsin để pha mẫu phản ứng, pha hỗn dịch virus, lựa chọn môi trường duy trì chứa 8µg trypsin/ml đã tối ưu được quy trình trung hòa virus, tối ưu cách đánh giá kháng thể trung hòa bằng phương pháp nhuộm hóa miễn dịch trên tế bào một lớp, kết quả thí nghiệm cho thấy phản ứng trung hòa virus thực địa có độ nhạy 87,46% và độ đặc hiệu 98,18% khi so sánh với phản ứng ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu lớp IgG Ứng dụng phản ứng trung hòa phát hiện biến động kháng thể trung hòa PEDV
ở mẫu sữa đầu và huyết thanh của lợn nái và lợn con theo mẹ
Từ khóa: Porcine epidemic diarrhea virus, phản ứng trung hòa virus
Establishing Virus Neutralizing Test Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
using Isolated Field Strains in the North of Viet Nam
ABSTRACT
The study aimed to establish a virus neutralization test for field isolated virus, create a tool for assessing the protection of vaccines against pathogenic porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) strains in Vietnam By using DMEM medium free calf fetal serum (FBS) and without trypsin for dilution sample preparation/viral suspensions, and the maintenance medium containing 8 µg of trypsin/ml, the virus neutralization test and evaluation of neutralizing antibodies by immunochemical staining on monolayer cells were optimized The results showed that the virus neutralization test for field isolated virus with the sensitivity of 87.46% and specificity 98.18% with compared to ELISA kit It also pointed out that the virus neutralization test could be applicated to detect fluctuation of PEDV neutralization antibody in colostrum and serum of mother and piglets
Keywords: Porcine epidemic diarrhea virus, virus neutralizing test (VNT)
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)
thuûc hõ Coronaviridae, giøng Alphacoronavirus
là nguyên nhân gây tiêu chây cçp và mçt nāĉc
træm trõng Ċ lČn (Debouck & Pensaert, 1980;
Stevenson & cs., 2013) PEDV đāČc phát hiện læn
đæu tiên trên thế giĉi vào nëm 1971 täi mût ù
dðch tiêu chây cçp Ċ Anh Đến nëm 1977 bệnh
tiêu chây trên lČn xây ra nghiêm trõng täi Bî,
chþng virus phân lêp đāČc vĉi tên gõi CV777
(Pensaert & De Bouck, 1978) Dðch tiêu chây do PEDV gây ra xây ra rûng khíp Ċ châu Âu trong nhąng nëm 1970 đến nëm 1980 TĂ nëm 1980 đến nëm 1990, sø ù dðch giâm dæn Ċ châu lĀc này Nëm 2013 bệnh læn đæu tiên bùng phát Ċ châu
MĐ vĉi báo cáo dðch đæu tiên Ċ nāĉc MĐ (Wang & cs., 2014), sau đò dðch lan nhanh các nāĉc có biên giĉi vĉi MĐ Phân tích di truyền cho thçy hæu hết virus phân lêp Ċ châu Á và châu MĐ thuûc nhóm mĉi nùi G2b, nìm Ċ nhánh khác hoàn toàn vĉi chþng virus thuûc nhòm G1 thāĈng dùng chế
Trang 2vacxin trāĉc đị (Lee, 2015) Việt Nam là nāĉc
xuçt hiện bệnh PED mủn so vĉi các nāĉc trong
khu vĆc PED chính thăc đāČc phát hiện tĂ nëm
2008, đāČc xác đðnh cĩ quan hệ gỉn vĉi các chþng
Trung Qùc (Toan & cs., 2011) Cĩ 2 nhĩm di
truyền cþa PEDV Ċ miền Bíc và Bíc Trung Bû,
trong đị nhịm mĉi nùi G2 chiếm āu thế (Nguyễn
Trung Tiến & cs., 2017)) PEDV là mût virus luơn
biến đùi, kể tĂ nëm 2010, đã cị sĆ biến đùi cþa
PEDV täi thĆc đða so vĉi các chþng vacxin (Sun
& cs., 2012; Stevenson & cs., 2013; Lee & Lee,
2014; Bongkyun Park & Song, 2016) Do đị, dü
chāćng trình düng vacxin PED đỉy đþ trên lČn Ċ
các cć sĊ chën nuưi, nhāng dðch tiêu chây do
PEDV vén xây ra Ở Việt Nam, cho đến thĈi
điểm hiện täi, vacxin thāćng mäi chþ yếu là
vacxin vơ hột hoặc nhāČc đûc dĆa vào các chþng
thủc nhĩm cù điển nhā: CV777, DR13, SM98
Protein S cþa PEDV cị vai trđ kích thích cć
thể vêt chþ sinh kháng thể trung hđa, đ÷ng thĈi
giúp virus tiếp cên và xâm nhêp vào tế vào vêt
chþ (Bosch & cs., 2003; D Song & Park, 2012)
Do đị, phân ăng trung hđa là phāćng pháp gián
tiếp đánh giá tình träng miễn dðch chøng läi
PEDV (Oh & cs., 2005), vĉi ngāċng kháng thể
trung hịa 5 log2 cĩ khâ nëng bâo hû chøng läi
cưng cāĈng đûc (Clement & cs., 2016) So vĉi
nhĩm cù điển, các chþng PEDV thủc nhĩm mĉi
nùi đāČc chăng minh đề kháng cao vĉi
interferon và khơng bð trung hịa bĊi kháng thể
kích thích täo ra bĊi chþng PEDV cù điển (Shin
& Park, 2019) Các kết quâ nghiên cău trên cho
thçy đáp ăng miễn dðch täo ra chỵ cĩ khâ nëng
bâo hû đ÷ng chþng Do đị tāćng quan giąa bâo
hû và hiệu giá kháng thể trung hịa cỉn dĆa trên
chþng virus hiện lāu hành Ċ thĆc đða Để gĩp
phỉn xây dĆng cơng cĀ giám sát lāu hành huyết
thanh hõc và đánh giá khâ nëng bâo hû cþa víc
xin, phân ăng trung hịa PEDV vĉi chþng virus
phân lêp thĆc đða cỉn đāČc thiết lêp
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
- Chþng PEDV 0118 phân lêp tĂ lČn con
theo mẹ míc tiêu chây cçp do phịng thí nghiệm
Cơng ty Hanvet cung cçp Chþng virus này đã giám đðnh là PEDV, thủc nhĩm di truyền G2 bìng cặp m÷i đặc hiệu genogroup (Zhao & cs., 2014) Chþng PEDV 0118 cđn đāČc khỵng đðnh khơng täp TGEV, Rotavirus theo phāćng pháp
và trình tĆ m÷i mơ tâ trāĉc đåy (Song & cs., 2006) Mût sø đặc tính sinh hõc cþa chþng PEDV 0118 là: cĩ hiệu giá 106,1 TCID50/ml, cĩ đûc lĆc khi gây chết 5/5 lČn 2 ngày túi vĉi liều
104,5 TCID50/ml/ con theo đāĈng ùng Chþng virus đāČc chia nhĩ và bâo quân Ċ -80C Chuèn
đû ngāČc (back titration) Ċ múi lỉn thĆc hiện phân ăng nhìm đâm bâo hiệu giá virus thĆc düng dao đûng xung quanh 100 TCID50/100µl
- Huyết thanh lČn (nái, lČn con theo mẹ) Ċ träi åm tính và dāćng tính PEDV, sąa đỉu cþa lČn nái;
- Dịng tế bào Vero (ATCC - CCL-81);
- Mưi trāĈng: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM- Gibco), huyết thanh bào thai
bị (FBS-Gibco); Tryptose Phosphate Broth (TBP-Merck); Yeast extract (YE-Merck); Trypsin 1: 250 (Gibco);
- Sinh phèm, hĩa chçt dùng nhủm IPMA: anti- PEDV monoclonal antibody
(Median Diagnostics Inc), HRP- conjugated goat
anti- mouse IgG (US Biological); N, N-Dimethylformamide (Sigma); cć chçt 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC- Sigma);
- PBS 1X, pH 7,2;
- Bû kít tùng hČp cDNA (MMLV reverse transcriptase, Promega, M1705), kít PCR (GoTaq G2 Hot Start Master, Promega, M7423); các bû m÷i đặc hiệu giám đðnh genogroup PEDV, phát hiện TGEV, Rotavirus đāČc lçy theo nghiên cău trāĉc đåy (Song & cs., 2006; Zhao & cs., 2014);
- Bû kít ELISA (đāČc thiết lêp theo tiêu chuèn cć sĊ) phát hiện kháng thể kháng protein
S cþa PEDV;
- DĀng cĀ và thiết bð: đïa nuưi tế bào 96 giếng, đïa làm phân ăng ELISA, tþ nuơi çm 5%
CO2, kính hiển vi soi ngāČc, máy đõc ELISA; máy PCR
Trang 32.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thiết lập phản ứng trung hịa PEDV
Phāćng pháp trung hđa virus đāČc thiết lêp
vĉi sĆ điều chỵnh tĂ các tài liệu đã mư tâ trāĉc
đåy (Paudel & cs., 2014b; Collin & cs., 2015;
Clement & cs., 2016) Phân ăng đāČc thiết lêp
dĆa trên lột huyết thanh lČn dāćng tính và
huyết thanh âm tính vĉi kháng thể kháng
PEDV Các méu này đāČc chõn tĂ bû huyết
thanh theo tiêu chuèn cć sĊ CĀ thể, huyết
thanh đāČc thu thêp Ċ lČn tĂ 2 trang träi: mût
trang träi lČn khơng cĩ tiền sĄ bệnh tiêu chây
do virus, xét nghiệm virus hõc âm tính vĉi
PEDV; trang träi cịn läi đã tĂng míc PED, cĩ
kết quâ xét nghiệm dāćng tính vĉi PEDV bìng
phāćng pháp RT-PCR vĉi cặp m÷i đặc hiệu đāČc
tâ trāĉc đåy (Song & cs., 2006) Méu huyết
thanh đāČc bçt hột Ċ 56C/30 phút và khỵng
đðnh chíc chín dāćng tính hoặc âm tính kháng
thể kháng PEDV bìng phân ăng ELISA cć sĊ
Huyết thanh cỉn xác đðnh hiệu giá kháng
thể trung hđa đāČc pha lỗng liên tiếp theo cć sø
2 Múi đû pha lỗng đāČc trûn vĉi thể tích virus
cø đðnh (hiệu giá 100 TCID50/100µl) theo tď lệ
1:1 Ủ huyễn dðch huyết thanh: virus Ċ 37C/5%
CO2 trong vịng 1 giĈ 30 phút Chuyển 100µl hún
dðch huyết thanh: virus vào tế bào Vero 1 lĉp
(đã đāČc rĄa 3 lỉn bìng PBS- 1X) Sau thĈi gian
hçp phĀ 1 giĈ 30 phút, hút bĩ dðch huyễn dðch,
rĄa tế bào 3 lỉn và thêm 100µl DMEM duy trì
cĩ TPB (0,3%), YE (0,02%) và trypsin (8 µg/ml)
Xác đðnh giếng cĩ kháng thể trung hịa
dāćng tính bìng phāćng pháp hịa miễn dðch,
phân ăng miễn dðch trên tế bào mût lĉp, cø đðnh
thâm tế bào bìng dung dðch PBS chăa 10%
Formalin và 1% NP40, sau đị thêm kháng thể
đặc hiệu PEDV (anti- PEDV monoclonal
antibody - Median Diagnostics Inc), rĄa đïa
phân ăng, thêm kháng thể cûng hČp (HRP-
conjugated goat anti- mouse IgG (US
Biological), thêm cć chçt AEC Tế bào nhiễm
virus đặc hiệu khi quan sát qua kính hiển vi soi
ngāČc nguyên sinh chçt cþa tế bào bít màu đĩ
cþa cć chçt AEC Đõc kết quâ trung hịa theo mơ
tâ trāĉc đåy (Paudel & cs., 2014a), dĆa vào măc
đû giâm 90% sø tế bào/sø cĀm tế bào nhiễm
virus so vĉi đøi chăng âm Hiệu giá kháng thể trung hịa là sø nghðch đâo cþa đû pha lỗng cao nhçt mà Ċ đû pha lỗng đị dāćng tính Méu đāČc coi dāćng tính khi hiệu giá kháng thể trung hịa ≥8 (Chen & cs., 2016) Nhąng báo cáo khác thçy rìng 90% sø lČn nghiên cău cĩ hiệu giá kháng thể trung hịa ≥20, nên ngāċng dāćng đāČc xác đðnh hiệu giá kháng thể ≥20 (Collin & cs., 2015; Chen & cs., 2016)
2.2.2 Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PEDV
Để làm cć sĊ tính đû nhäy và đû đặc hiệu cþa phân ăng trung hịa, nghiên cău này chõn phân ăng ELISA (phát hiện kháng thể lĉp IgG) làm tham chiếu Kít ELISA đã thiết lêp theo tiêu chuèn cć sĊ (ELISA cć sĊ) đāČc đánh giá đû nhäy/đặc hiệu vĉi kít ELISA thāćng mäi SwinecheckPED indirect, BioVet (khơng trình bày) Các bāĉc thĆc hiện tĩm tít nhā sau: chþng PEDV 0118 cāĈng đûc phþ đïa Ċ hiệu giá 104,2 TCID50/ml trong coating buffer (pH = 9,6) Ċ 4C trong 12 giĈ; huyết thanh chèn đốn đāČc pha 1/200 trong sąa tách bć 3% - PBS - Tween 20 0,05%; kháng thể kháng lČn gín enzyme đāČc pha 1/1.200 trong sąa tách bć 3% - PBS - Tween
20 0,05% Giąa các bāĉc, þ Ċ nhiệt đû 37C, trong vịng 60 phút; rĄa 3 lỉn bìng dung dðch PBS - Tween 20 0,05% để lội bĩ các thành phỉn khưng đặc hiệu Méu cĩ giá trð ngāċng
OD450 <0,225 đāČc xác đðnh âm tính vĉi kháng thể kháng PEDV
2.2.3 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa virus
Phân ăng ELISA đāČc dùng làm tiêu chuèn
để đøi chiếu kết quâ cþa phāćng pháp trung hđa virus đāČc thiết lêp CĀ thể, múi méu huyết thanh sẽ đāČc phân tích lỉn lāČt bìng phân ăng ELISA cć sĊ và phân ăng trung hịa virus Møi tāćng quan giąa giá trð OD450 cþa ELISA cć sĊ
và hiệu giá trung hđa đāČc xác đðnh bìng giá trð
R (Pearson Correlation Coefficient), tính theo dén liệu tĂ ngu÷n: https://www.socscistatistics com/tests/pearson/default2.aspx Cách tính đû nhäy và đû đặc hiệu cþa phāćng pháp đāČc trình bày Ċ bâng 1
Trang 4Bâng 1 Cách tính độ nhạy, độ đặc hiệu của phân ứng trung hòa
Kết quả phản ứng trung hòa Kết quả ELISA cơ sở
Số mẫu dương tính Số mẫu âm tính
Ghi chú: TP: dương tính thêt, FP: dương tính giâ, TN: âm tính thêt, FN: âm tính giâ
Bâng 2 Hiệu giá trung hòa ở các môi trường bổ sung trypsin voiw nồng độ khác nhau
Loại huyết thanh
Nồng độ trypsin ở mỗi loại môi trường
Môi trường duy trì Môi trường pha virus/ huyết thanh
Ghi chú: KXĐ: Không xác định được hiệu giá kháng thể do thâm tế bào bị co tròn và bong hoặc CPE xuçt hiện không theo quy luêt
Xác đðnh đû nhäy (phát hiện đýng khi cò
kháng thể) theo công thăc: Sn = TP/(TP + FN) ×
100; xác đðnh đû đặc hiệu (không phát hiện khi
không có mặt kháng thể) theo công thăc Sp =
TN/(TN + FP) × 100
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quâ tối ưu môi trường của phân
ứng trung hòa
Phân ăng trung hòa sĄ dĀng chþng PEDV
0118 phân lêp thĆc đða đāČc thiết lêp dĆa trên
cć sĊ các thí nghiệm: tøi āu möi trāĈng pha
loãng virus, pha loãng huyết thanh; tøi āu möi
trāĈng duy trì tế bào Vero khi nhiễm hún dðch
trung hòa Bâng 2 trình bày kết quâ tøi āu n÷ng
đû trypsin cþa möi trāĈng dùng trong phân ăng
Kết quâ cho thçy möi trāĈng dùng pha
virus/huyết thanh chèn đoán có trypsin (8 µg/ml
hoặc 10 µg/ml) đều dén tĉi hiện tāČng tế bào
trong giếng co tròn và bong tĂ 10-50% NgāČc
läi, möi trāĈng pha virus/huyết thanh không có
trypsin, thâm tế bào không bong, hiệu giá trung
hòa virus cþa méu huyết thanh chuèn dāćng,
chuèn âm læn lāČt là 6 log2 và 0 Bâng 2 còn cho biết lāČng trypsin trong möi trāĈng duy trì (8 µg/ml hoặc 10 µg/ml) không làm thay đùi hiệu giá trung hòa cþa méu huyết thanh và thâm tế bào ùn đðnh Hàm lāČng trypsin này phù hČp vĉi hàm lāČng trypsin trong möi trāĈng phân lêp virus trên tế bào Vero mà các tác giâ trāĉc đã sĄ dĀng (Chung & cs., 2015; Nguyễn Thð Hoa & cs., 2018)
Nghiên cău trāĉc đåy đã khîng đðnh trong möi trāĈng duy trì để phân lêp virus không thể thiếu trypsin trong vñng 25 đĈi đæu (Hofmann & Wyler, 1988) Nhāng tế bào có thể bð co và bong
vì sĆ có mặt cþa trypsin và không thể giúp virus nhån lên Đã cò nhiều công bø khoa hõc ăng dĀng phân ăng trung hña virus nhāng khöng nêu rô thành phæn möi trāĈng dùng cho múi bāĉc cþa phân ăng (Paudel & cs., 2014a; Clement & cs., 2016; Song & cs., 2016) Trong mût nghiên cău đāČc công bø, möi trāĈng DMEM bù sung 1 µg/ml trypsin đāČc düng chung để pha virus/huyết thanh và là möi trāĈng duy trì (Lee & cs., 2018) Tuy nhiên, chþng virus dùng trong nghiên cău
kể trên đã thích nghi cao đû trên möi trāĈng tế
Trang 5bào (tiếp đĈi 70 lỉn), do đị ít phĀ thủc vào
trypsin NgāČc läi, nghiên cău này dùng chþng
PEDV cĩ sø lỉn tiếp đĈi thçp (đĈi 7), nên đđi hĩi
lāČng trypsin cao gçp 10 lỉn mĉi giýp xác đðnh
đāČc kết quâ cþa phân ăng mût cách rõ ràng
Khác vĉi các virus khác thủc nhĩm
Alphacoronavirus cþa hõ Coronaviridae, trypsin
khưng địng vai trđ hột hịa PEDV trāĉc khi
virus gín vào tế bào vêt chþ hoặc tế bào Vero, mà
trypsin chỵ cĩ vai trị giúp virus xâm nhêp khi
PEDV đã tiếp xúc vĉi thĀ thể cþa tế bào (Park &
cs., 2011) Kết quâ thí nghiệm cþa nhĩm tác giâ
Park & cs., 2011 cho thçy, virus hình thành thể
hČp bào và tëng hiệu giá virus khi virus hçp phĀ
vào tế bào Vero trong mưi trāĈng khơng cĩ
trypsin mà chỵ cĩ trypsin bù sung trong mơi
trāĈng duy trì (Park & cs., 2011) Mût lý do nąa
mà trypsin khơng thể bù sung vào mưi trāĈng
pha virus và huyết thanh vì trypsin bð kìm chế,
bð ngën cân bĊi hột đûng cþa huyết thanh chèn đốn khi n÷ng đû pha lỗng méu thçp (Oh & cs., 2005; Paudel & cs., 2014b) Nhąng điều này lý giâi việc chỵ cỉn cị trypsin trong giai độn duy trì
tế bào nhiễm mà khơng cỉn bù sung trypsin trong giai độn tāćng tác giąa virus và kháng thể đặc hiệu là phù hČp
3.2 Kết quâ thiết lập phương pháp đọc kết quâ phân ứng trung hịa
PEDV täo ra bệnh tích khĩ quan sát bìng kính hiển vi soi ngāČc Ċ các lỉn tiếp đĈi thçp Nhìm tëng tính chính xác, thay vì quan sát bệnh tích tế bào, nghiên cău dùng kĐ thuêt hĩa miễn dðch trên tế bào 1 lĉp (IPMA) để xác đðnh giếng cĩ/khưng cị virus nhån lên và làm cën că xác đðnh hiệu giá trung hịa (dĆa vào măc đû giâm 90% sø tế bào/sø cĀm tế bào nhiễm virus
so vĉi đøi chăng âm)
Ghi chú: Huyết thanh âm chuèn (a-c) và huyết thanh dương chuèn (d-f) pha lỗng tëng dỉn từ 32, 64 và 128 lỉn Tế bào nhiễm PEDV bít màu của cơ chçt (mũi tên) Độ pha lỗng huyết thanh cao nhçt cĩ khâ nëng ức chế 90% số tế bào nhiễm virus (so với đối chứng) được xác định là hiệu giá trung hịa (e)
Hình 1 Kết quâ đọc phân ứng trung hịa PEDV bằng phương pháp IPMA
Trang 6Kết quâ Ċ hình 1 cho thçy cách đõc phân
ăng bìng phāćng pháp nhuûm IPMA phân biệt
rõ giąa méu không có kháng thể trung hòa (a-c)
và méu có kháng thể trung hña dāćng tính
(d-e) Ở méu huyết thanh âm chuèn, sø lāČng tế
bào nhiễm PEDV (mÿi tên) khöng cò sĆ khác
biệt đáng kể giąa các đû pha loãng Ở méu
huyết thanh dāćng chuèn, theo chiều tëng cþa
đû pha loãng huyết thanh (tāćng ăng vĉi hàm
lāČng kháng thể trung hòa giâm dæn), sø lāČng
tế bào nhiễm virus (mÿi tên) tëng dæn
Trong quá trình nhân lên cþa virus trong
möi trāĈng tế bào Vero, PEDV gây bệnh tích
điển hình là thể hČp bào (Hofmann & Wyler,
1988) Dù vêy, do lāČng virus dùng cho phân
ăng trung hña tāćng đøi nhó (30-300
TCID50/giếng) việc đõc kết quâ cþa phân ăng
thông qua bệnh tích tế bào gặp khò khën Hæu
hết các tác giâ đõc phân ăng bìng cách nhuûm
miễn dðch hučnh quang gián tiếp (De Arriba &
cs., 1995; Song & cs., 2016) hoặc nhuûm hóa
miễn dðch (Paudel & cs., 2014a)
3.3 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phân ứng trung hòa
Đû nhäy và đû đặc hiệu cþa phân ăng trung hòa mĉi đāČc thiết lêp và tøi āu đāČc tính toán trên cć sĊ so sánh vĉi kết quâ cþa phân ăng ELISA cć sĊ Kết quâ biểu diễn møi tāćng quan giąa hiệu giá trung hòa và giá trð
OD450 đāČc trình bày Ċ hình 2 Kết quâ cho thçy Ċ mût hiệu giá trung hòa cø đðnh, giá trð
OD450 có khoâng biến đûng lĉn, ví dĀ giá trð
OD450 dao đûng tĂ 0,21-0,74 đøi vĉi nhóm g÷m
30 méu có hiệu giá trung hña là 6 log2 (mÿi tên, Hình 2) Ở chiều ngāČc läi, phân ăng trung hòa (liên quan tĉi khâ nëng bâo hû chøng läi cöng cāĈng đûc) thể hiện āu điểm hćn so vĉi phân ăng ELISA Ví dĀ, phân ăng trung hòa cho biết nhóm méu huyết thanh có giá trð
OD450 = 0,6 khöng cò tính đ÷ng nhçt về hiệu giá trung hòa, biến đûng tĂ 5 log2 đến 9 log 2 (vüng đòng khung, Hình 2)
Ghi chú: Mỗi méu huyết thanh (biểu diễn bởi 1 chçm tròn) được xét nghiệm bìng phân ứng trung hòa và ELISA
để xác định hiệu giá trung hòa và giá trị OD 450 Méu được đánh giá là có kháng thể trung hòa nếu có hiệu giá tối thiểu là 5 log2 (giới hän bởi đường nét đứt)
Hình 2 Tương quan giữa hiệu giá trung hòa và giá trị OD
Trang 7Bâng 3 Độ nhạy, độ đặc hiệu của phân ứng trung hịa
Dương tính Âm tính
Ghi chú: (*) méu huyết thanh ở độ pha lỗng >1/20 làm giâm 90% số tế bào nhiễm PEDV
giâm so đối chứng åm được xác định là cĩ kháng thể trung hịa (Clement và cs., 2016)
Trong nghiên cứu này lçy giá trị ngưỡng dương tính kháng thể trung hịa là ≥5 log2
TĂ cơng thăc tính (Pearson Correlation
Coefficient Calculator), đã xác đðnh cị tāćng
quan tď lệ thuên giąa giá trð OD450 và hiệu giá
kháng thể trung hịa (giá trð Pearson's R = 0,61)
Kết quâ này là phù hČp vĉi mût sø nghiên cău
trāĉc đåy khi đều xác đðnh đāČc tāćng quan
giąa kết quâ phát hiện kháng thể kháng PEDV
bìng phân ăng trung hịa và phân ăng ELISA
(Oh & cs., 2005; Paudel & cs., 2014b; Hao & cs.,
2017) Mặc dü cị Ď nghïa thøng kê (P <0,00001)
nhāng tāćng quan kể trên chỵ Ċ măc trung bình
Điều này đāČc giâi thích là do trong thành phỉn
huyết thanh cþa lČn cĩ nhiều lĉp khác thể trung
hịa PEDV (ví dĀ nhā IgG, IgA) nhāng phân ăng
ELISA dùng trong nghiên cău này chỵ phát hiện
đāČc lĉp kháng thể IgG (Oh & cs., 2005) Trong
các nghiên cău tiếp theo nhìm hồn thiện phân
ăng trung hịa virus, cỉn sĄ dĀng thêm các kĐ
thuêt phát hiện đāČc lĉp kháng thể đặc hiệu
IgG và IgA (hoặc sIgA tiết qua sąa), ví dĀ nhā
kĐ thuêt alphaLISA (Kimpston-Burkgren & cs.,
2020) So sánh kết quâ phát hiện méu âm
tính/dāćng tính vĉi kháng thể kháng PEDV
đāČc tĩm tít Ċ bâng 3
Bâng 3 cho biết phỉn lĉn các méu (125/198
méu dāćng tính, 54/198 åm tính) đều cĩ kết quâ
phát hiện giøng nhau giąa hai phāćng pháp
DĆa vào cơng thăc tính, đû nhäy cþa phân ăng
trung hịa so vĉi phân ăng ELISA cć sĊ là
87,46% và đû đặc hiệu là 98,18% SĆ khơng phù
hČp hồn tồn giąa kết quâ cþa phân ăng trung
hịa và phân ăng ELISA đã đāČc chỵ ra Ċ mût
vài nghiên cău tāćng tĆ (Oh & cs., 2005; Okda
& cs., 2015) Đặc điểm này cÿng quan sát đāČc Ċ
nghiên cău này: cĩ 18 méu đāČc xác đðnh là âm
tính giâ (kết quâ phát hiện kháng thể trung hịa
so vĉi kết quâ phát hiện kháng thể lĉp IgG tùng
sø bìng ELISA) SĆ khác biệt trên cĩ thể do mût
sø nguyên nhân Thă nhçt, phân ăng trung hịa phát hiện kháng thể làm mçt hột tính nhiễm cþa virus (kháng thể trung hđa) Trong khi đị, protein bề mặt cþa virus (ví dĀ nhā protein S) läi bao g÷m các epitope kích thích sân sinh kháng thể trung hịa và kháng thể khơng cĩ khâ nëng trung hđa virus (Song & cs., 2016) Ngồi
ra, thĈi điểm xuçt hiện kháng thể trung hịa và đät hiệu giá cao nhçt thāĈng chêm hćn so vĉi kháng thể khơng cĩ tác dĀng trung hịa virus (Okda & cs., 2015; Thomas & cs., 2015)
3.4 Kết quâ ứng dụng phân ứng trung hịa với mẫu thực địa
Kết quâ ăng dĀng phân ăng trung hịa trong khâo sát kháng thể cþa các cặp lČn nái - lČn con (sau bú sąa đỉu) Ċ mût sø trang träi đāČc trình bày Ċ hình 3 Hình 3A cho biết phân ăng trung hịa cĩ thể phát hiện đāČc kháng thể trung hịa Ċ 2 lội méu khác nhau (huyết thanh
- sąa đỉu) Trong cùng nhĩm lČn, cĩ thể thçy kháng thể trong sąa non cao hćn hỵn so kháng thể trong huyết thanh mẹ (P <0,05) Đặc điểm trên phù hČp vĉi kết quâ đã cưng bø (Clement & cs., 2016) và phân ánh đặc điểm sinh lý tiết sąa vĉi hàm lāČng IgG, IgM và IgA Ċ sąa đỉu luơn cao hćn tøi thiểu 2 lỉn so vĉi hàm lāČng trong máu lČn nái (Porter, 1969) Khi tùng hČp kết quâ theo nhĩm lČn, dễ dàng thçy phân ăng trung hịa mĉi thiết lêp cịn phát hiện đāČc sĆ biến đûng về hiệu giá kháng thể trung hịa Ċ múi nhĩm lČn (Hình 3B), đặc biệt là nhĩm lČn con theo mẹ vĉi không biến đûng tĂ 5 log2- 10 log2 Đåy cị thể do lČn nái cị hàm lāČng kháng thể thçp và/hoặc măc tiếp nhên kháng thể truyền qua sąa đỉu khưng đ÷ng đều giąa các lČn con
Trang 8Ghi chú: Hiệu giá kháng thể trung hòa ở nhóm lợn nái và lợn con của chúng (A) Méu huyết thanh và sữa đæu được lçy ở cùng nhóm lợn nái Méu huyết thanh của lợn con thu thêp 2 ngày sau khi bú sữa đæu (D2) Hiệu giá kháng thể trung hòa biểu diễn cho từng nhóm méu (B)
Hình 3 Biến động hiệu giá kháng thể trung hòa ở các nhóm mẫu
Nhā vêy, các kết quâ nêu trên đã chăng tó
phân ăng trung hña đāČc thiết lêp thành công
Nghiên cău về huyết thanh hõc, nghiên cău trāĉc
đåy đã báo cáo, ăng dĀng phân ăng trung hòa
đánh giá khâ nëng kháng chéo giąa huyết thanh
kháng dòng mĉi nùi cò đûc lĆc thçp (S- INDEL)
vĉi virus đ÷ng chþng cao hćn hiệu giá kháng thể
trung hòa vĉi virus dð chþng dòng mĉi nùi cò đûc
lĆc cao (non- S INDEL) 4 læn, trong khi đò, giąa
huyết thanh kháng PEDV cþa dòng CV777 cù
điển vĉi virus đ÷ng chþng cao hćn hiệu giá kháng
thể trung hòa dð chþng (dòng mĉi nùi) 16 læn
(Chen & cs., 2016) Mặc dù vêy, cæn ăng dĀng
phân ăng trung hòa vĉi mût dung lāČng méu lĉn hćn để tiếp tĀc đánh giá chçt lāČng cÿng nhā hoàn thiện các điểm yếu có thể đāČc phát hiện trong quá trình thĆc hiện
4 KẾT LUẬN
Đã thiết lêp đāČc phân ăng trung hòa dùng chþng PEDV thĆc đða vĉi đû nhäy 87,46% và đû đặc hiệu là 98,18% Phân ăng trung hña đã phát hiện đāČc và phân ánh đýng đặc điểm hiệu giá kháng thể trung hòa trong sąa đæu luön cao hćn
Ċ huyết thanh cþa lČn nái
Trang 9TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bosch B.J., Van Der Zee R., De Haan C.A & Rottier
P.J (2003) The coronavirus spike protein is a
class I virus fusion protein: structural and
functional characterization of the fusion core
complex, Journal of virology 77(16): 8801-8811
Clement T., Singrey A., Lawson S., Okda F., Nelson J.,
Diel D., Nelson E.A & Christopher-Hennings J
(2016) Measurement of neutralizing antibodies
against porcine epidemic diarrhea virus in sow
serum, colostrum, and milk samples and in piglet
serum samples after feedback, Journal of Swine
Health and Production 24(3): 147-153
Chen Q., Thomas J.T., Giménez-Lirola L.G., Hardham
J.M., Gao Q., Gerber P.F., Opriessnig T., Zheng Y.,
Li G & Gauger P.C (2016) Evaluation of
serological cross-reactivity and cross-neutralization
between the United States porcine epidemic diarrhea
virus prototype and S-INDEL-variant strains, BMC
veterinary research 12(1): 70
Chung H.C., Nguyen V.G., Moon H.J., Lee J.H., Park
S.J., Lee G.E., Kim H.K., Noh Y.S., Lee C.H.,
Goede D & Park B.K (2015) Isolation of Porcine
Epidemic Diarrhea Virus during Outbreaks in
South Korea, 2013-2014, Emerg Infect Dis
21(12): 2238-40
De Arriba M., Carvajal A., Lanza I., Rubio P &
Blanchard P (1995) Development of an ELISA
for the detection of antibody isotypes against
porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) in sow’s
milk, Proc 3rd Congr ESVV pp 222-225
Collin E.A., Anbalagan S., Okda F., Batman R., Nelson
E & Hause B.M (2015) An inactivated vaccine
made from a US field isolate of porcine epidemic
disease virus is immunogenic in pigs as
demonstrated by a dose-titration, BMC veterinary
research 11(1): 62
Debouck P & Pensaert M (1980) Experimental
infection of pigs with a new porcine enteric
coronavirus, CV 777 Am J Vet Res 41(2): 219-23
Kimpston-Burkgren K., Mora-Diaz J.C., Roby P.,
Bjustrom-Kraft J., Main R., Bosse R &
Gimenez-Lirola L.G (2020) Characterization of the
humoral immune response to porcine epidemic
diarrhea virus infection under experimental and
field conditions using an AlphaLISA platform,
Pathogens 9(3)
Hao J., Zhang Y., Fang S., Wen Z., Zhang X., Xue C
& Cao Y (2017) Evaluation of purified
recombinant spike fragments for assessment of the
presence of serum neutralizing antibodies against a
variant strain of porcine epidemic diarrhea virus,
Virol Sin 32(4): 307-316
Hofmann M & Wyler R (1988) Propagation of the
virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture, J
Clin Microbiol 26(11): 2235-9
Lee C (2015) Porcine epidemic diarrhea virus: An emerging and re-emerging epizootic swine virus, Virol J 12(1): 193
Lee S & Lee C (2014) Outbreak-related porcine epidemic diarrhea virus strains similar to US strains, South Korea, 2013, Emerg Infect Dis 20(7): 1223-6
Lee S.H., Yang D.K., Kim H.H & Cho I.S (2018) Efficacy of inactivated variant porcine epidemic diarrhea virus vaccines in growing pigs, Clin Exp Vaccine Res 7(1): 61-69
Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Trương Quang Lâm, Trịnh Đình Thâu & Ngô Thị Hạnh (2018) Nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus PED (Porcine epidemic diarrhea
virus), Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
16(3): 257-267 Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ
Lệ, Nguyễn Bá Hiên & Lê Văn Phan (2017) Một
số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây ra dịch tiêu chảy cấp ở lợn (porcine epidemic diarrhea- PED) tại Quảng Trị, Thái Nguyên và Thái Bình từ năm 2013-2014, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 13(7): 1089-1100
Oh J.S., Song D.S., Yang J.S., Song J.Y., Moon H.J., Kim T.Y & Park B.K (2005) Comparison of an enzyme-linked immunosorbent assay with serum neutralization test for serodiagnosis of porcine
epidemic diarrhea virus infection, J Vet Sci
6(4): 349-52
Okda F., Liu X., Singrey A., Clement T., Nelson J., Christopher-Hennings J., Nelson E.A & Lawson
S (2015) Development of an indirect ELISA, blocking ELISA, fluorescent microsphere immunoassay and fluorescent focus neutralization assay for serologic evaluation of exposure to North American strains of Porcine Epidemic Diarrhea
Virus, BMC Vet Res 11(1): 180
Park B & Song, D (2016) Recent outbreaks and emergence of mutants of porcine epidemic diarrhea viruses (PEDV) in Korea, Japanese Journal of
Veterinary Research 64(Supplement 1): S25-S32
Park J.E., Cruz D.J & Shin H.J (2011) Receptor-bound porcine epidemic diarrhea virus spike protein cleaved by trypsin induces membrane
fusion, Arch Virol 156(10): 1749-56
Paudel S., Park, J.E., Jang H., Hyun B.H., Yang D.G
& Shin H.J (2014a) Evaluation of antibody response of killed and live vaccines against porcine
epidemic diarrhea virus in a field study, Vet Q
34(4): 194-200
Paudel S., Park J.E., Jang H & Shin H.J (2014b) Comparison of serum neutralization and enzyme-linked immunosorbent assay on sera from porcine
epidemic diarrhea virus vaccinated pigs, Vet Q
34(4): 218-23
Trang 10Pensaert M & De Bouck P (1978) A new
coronavirus-like particle associated with diarrhea
in swine, Archives of virology 58(3): 243-247
Porter P (1969) Transfer of immunoglobulins IgG,
IgA and IgM to lacteal secretions in the parturient
sow and their absorption by the neonatal piglet,
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein
Structure 181(2): 381-392
Shin H.J & Park J.E (2019) Newly isolated porcine
epidemic diarrhea virus resistance to interferon and
neutralizing antibody, The Journal of Immunology
202(1 Supplement): 73.12
Song D & Park B (2012) Porcine epidemic diarrhoea
virus: a comprehensive review of molecular
epidemiology, diagnosis, and vaccines Virus
Genes 44(2): 167-75
Song D.S., Kang B.K., Oh J.S., Ha G.W., Yang J.S.,
Moon H.J., Jang Y.S & Park B.K (2006)
Multiplex reverse transcription-PCR for rapid
differential detection of porcine epidemic diarrhea
virus, transmissible gastroenteritis virus, and
porcine group A rotavirus J Vet Diagn Invest
18(3): 278-81
Song Q., Stone S., Drebes D., Greiner L.L., Dvorak
C.M.T & Murtaugh M.P (2016) Characterization
of anti-porcine epidemic diarrhea virus
neutralizing activity in mammary secretions Virus
Res 226: 85-92
Stevenson G.W., Hoang H., Schwartz K.J., Burrough
E.R., Sun D., Madson D., Cooper V.L., Pillatzki
A., Gauger P & Schmitt B.J (2013) Emergence
of porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs, lesions, and viral genomic sequences Journal of veterinary diagnostic
investigation 25(5): 649-654
Sun R.Q., Cai R.J., Chen Y.Q., Liang P.S., Chen D.K
& Song C.X (2012) Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China Emerg Infect
Dis 18(1): 161-3
Toan N.T., Puranaveja S & Thanawongnuwech R (2011) Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) isolates from southern Vietnam during 2009-2010 outbreaks, The Thai Journal of Veterinary Medicine 41(1): 55-64
Thomas J.T., Chen Q., Gauger P.C., Gimenez-Lirola L.G., Sinha A., Harmon K.M., Madson D.M., Burrough E.R., Magstadt D.R., Salzbrenner H.M., Welch M.W., Yoon K.J., Zimmerman J.J & Zhang
J (2015) Effect of porcine epidemic diarrhea virus infectious doses on infection outcomes in naive
conventional neonatal and weaned pigs PLoS One
10(10): e0139266
Wang L., Byrum B & Zhang Y (2014) New variant
of porcine epidemic diarrhea virus, United States
Emerg Infect Dis 20(5): 917-9
Zhao P.D., Bai J., Jiang P., Tang T.S., Li Y., Tan C & Shi X (2014) Development of a multiplex TaqMan probe-based real-time PCR for discrimination of variant and classical porcine epidemic diarrhea virus J Virol Methods 206: 150-5