Luận văn tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl Cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn này nhằm phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao trên cơ chất CMC và bã mía. Mời các bạn cùng tham khảo luận văn để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN BÃ MÍA VÀ CARBOXYMETHYL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN

ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ CỎ CỪU (Ovis aries)

LỚP:CNSH K34

Cần Thơ, Tháng 5/2012

PHẦN KÝ DUYỆT

TS Trần Nhân Dũng

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, ngày tháng năm 2012

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp

LỜI CẢM TẠ

š› & •œ

Đề tài luận văn được hoàn thành không chỉ với quá trình làm việc, học tập và nghiên cứu của tôi, mà còn có sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều người Tôi xin ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến:

- Gia đình, đã giúp đỡ tôi về mặt vật chất, và ủng hộ về mặt tinh thần trong suốt quá trình tôi học đại học

- Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ cho tôi rất nhiều

- Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, đã quan tâm và cho tôi nhiều lời khuyên bổ ích để thực hiện tốt đề tài

- Các thầy cô và anh chị cán bộ ở các phòng thí nghiệm Vi sinh Vật, thực phẩm…

đã tạo điều kiên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học việc và làm đề tài

- Các anh chị lớp Công nghệ Sinh học khóa 32TT và 33 đã tận tình chỉ dẫn tôi giúp tôi nắm được những kiến thức căn bản trong phòng thí nghiệm

- Các bạn và các em sinh viên trong Viện đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

- Thầy cô đã tận tình truyền dạy những kiến thức trong suốt quá trình học tập của tôi, để tôi có thể nắm vững và vận dụng tốt trong quá trình thực hiện đề tài cũng như trong công việc sau này

Xin chân thành cảm ơn tất cả!

¶¶¶

25 dòng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí, kết quả khảo sát đường kính thủy phân cho thấy 4 dòng vi khuẩn CD 22, CD 26, CD 11 và CD 15 có khả năng thủy phân mạnh cơ chất CMC và cơ chất bã mía Đặc biệt, dòng vi khuẩn hiếu khí CD 22 có hiệu suất thủy phân CMC và bã mía sau 5 ngày cao nhất trong nhóm hiếu khí, lần lượt là 21,581%, 9, 3147%, dòng vi khuẩn kỵ khí CD 11 có hiệu suất thủy phân CMC và dòng CD 15 có hiệu suất thủy phân bã mía cao nhất lần lượt là 30,049% và 8,8867% Tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa các dòng vi khuẩn tuyển chọn, cho thấy, dòng CD 22 tương đồng ở mức 99% với dòng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus

và dòng CD 26 tương đồng ở mức 73% với dòng Clavibacter agropygi (Corynebacterium)

Từ khóa: Clavibacter agropygi (Corynebacterium), Pediococcus pentosaceus, dạ cỏ cừu, thủy phân cellulose,

MỤC LỤC Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cellulose, CMC, bã mía 3

2.1.1 Cellulose 3

2.1.2 CMC 5

2.1.3 Bã mía 6

2.2 Hệ enzyme cellulase 7

2.2.1 Phân loại 7

2.2.2 Cơ chế tác động thủy phân cellulose 9

2.2.3 Nguồn enzyme cellulase 9

2.2.4 Ứng dụng enzyme cellulase 10

2.3 Tổng quan về dạ cỏ cừu 10

2.3.1 Cấu tạo chung dạ cỏ cừu 10

2.3.2 Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ 12

2.4 Các phương pháp vi sinh 13

2.4.1 Phân lập vi khuẩn 13

2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập 13

2.4.3 Phương pháp kiểm tra catalase 14

2.4.4 Phương pháp xác định đường kính vòng tròn thủy phân 15

2.5 Tình hình nghiên cứu 15

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu 17

3.1.1 Địa điểm, thời gian, hóa chất và thiết bị 17

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 18

3.1.2.1 Bã mía 18

3.1.2.2 Dạ cỏ cừu 18

3.1.3 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18

3.1.3.1 Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến 18

3.1.3.2 Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã mía 19

a Khảo sát hàm lượng cellulose bột bã mía 19

b Khảo sát hàm ẩm trong bã mía 20

c Khảo sát hàm lượng tro tổng số trong bột bã mía 20

3.2.2 Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu 21

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính thủy phân CMC 22

3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía 22

3.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu suất thủy phân CMC 23

3.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía 23

3.2.7 Thí nghiệm 7: Định danh vi khuẩn 24

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả khảo sát thành phần bã mía 25

4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu 27

4.2.1 Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc 27

4.2.2 Kết quả mô tả đặc điểm vi khuẩn 30

4.3 Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất CMC 33

4.4 Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất bã mía 36

4.5 Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất CMC của một số dòng

vi khuẩn được tuyển chọn 39

4.6 Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng

vi khuẩn được tuyển chọn 41

4.7 Kết quả định danh một số dòng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp định danh sinh hóa 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến 4

Bảng 2: Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến (M1) 18

Bảng 3: Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến (M2) 19

Bảng 4: Bảng bố trí thí nghiệm 3 22

Bảng 5: Bảng bố trí thí nghiệm 4 23

Bảng 6: Kết quả khảo sát thành phần bã mía sau xử lý 25

Bảng 7: Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí từ dạ cỏ cừu 27

Bảng 8: Kết quả phân lập vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ cừu 27

Bảng 9: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí 28

Bảng 10: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn kỵ khí 29

Bảng 11: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn hiếu khí 30

Bảng 12: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn kỵ khí 32

Bảng 13: Hiệu suất thủy phân các dòng vi khuẩn tuyển chọn định danh 43

Bảng 14: Tóm tắt giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn phụ lục 1 Bảng 15: Kết quả khảo sát thành phần ẩm độ và khoáng của bã mía

nguyên liệu phụ lục 2 Bảng 16: Kết quả phân tích xơ bã mía phụ lục 2 Bảng 17: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn hiếu khí phụ lục 2 Bảng 18: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn kỵ khí phụ lục 2 Bảng 19: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn

hiếu khí phụ lục 2 Bảng 20: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn kỵ khí phụ lục 2 Bảng 21: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí sau 5 ngày phụ lục 2 Bảng 22: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày phụ lục 2 Bảng 23: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn

hiếu khí phụ lục 2 Bảng 24: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí phụ lục 2 Bảng 25: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí phụ lục 2

Bảng 26: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí phụ lục 2 Bảng 27: Số liệu khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía các dòng vi khuẩn

tuyển chọn phụ lục 2 Bảng 28: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân

của vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất CMC phụ lục 3 Bảng 29: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất CMC phụ lục 3 Bảng 30: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất bã mía phụ lục 3 Bảng 31: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất bã mía phụ lục 3 Bảng 32: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí phụ lục 3 Bảng 33: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí phụ lục 3 Bảng 34: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn

hiếu khí sau 5 ngày phụ lục 3 Bảng 35: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn

kỵ khí sau 5 ngày phụ lục 3

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Cấu trúc cellulose 3

Hình 2: Cấu trúc CMC 6

Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase 7

Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở vi sinh vật

hiếu khí (A) và vi khuẩn kỵ khí (B) 8

Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu 11

Hình 6: Một số thiết bị sử dụng 17

Hình 7: Bã mía thô và bột bã mía trước và sau xử lý 26

Hình 8: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn CD 22 và CD 28 28

Hình 9: Hình chụp nhuộm Gram một số dòng vi khuẩn 31

Hình 10: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí 34

Hình 11: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 20 và CD 26 35

Hình 12: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn kỵ khí 35

Hình 13: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 23 và CD 37 36

Hình 14: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn hiếu khí 36

Hình 15: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn kỵ khí 37

Hình 16: Hoạt tính thủy phân bã mía của một số dòng vi khuẩn 38

Hình 17: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn hiếu khí tuyển chọn 39

Hình 18: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí tuyển chọn 40

Hình 19:Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn kỵ khí

được tuyển chọn 41

Hình 20: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn hiếu khí

được tuyển chọn 42

Hình 21: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 22 44

Hình 22: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 26 45 Hình 23: Phương pháp pha loãng mẫu phụ lục 1 Hình 24: Đường chuẩn phần trăm CMC theo độ nhớt của môi trường phụ lục 2

CÁC TỪ VIẾT TẮT

nm: nanomete CMC: carboxymethyl cellulose m: meter

mm: milimete g: gram FAO: Food anh Agriculture Organization ml:mililite

EM: Effective Microorganisms UV: Untra violet

Đktp: đường kính thủy phân đvC: đơn vị cacbon

CFU: colony forming unit VSV : vi sinh vật

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Tình hình ô nhiễm môi trường đang là vấn đề nóng trên các diễn đàn trong nước và thế giới Trong các nguyên nhân dẫn đến ô nhiễm, thì nguyên nhân do các chất hữu cơ thực vật dễ xử lý và ít nguy hại nhất Tuy nhiên, việc làm thế nào để xử lý nhanh chóng và hiệu quả các chất thải hữu cơ thực vật đồng thời có thể tận dụng sản phẩm sau xử lý phục vụ cho nền nông nghiệp sạch và năng lượng xanh là vấn đề quan trọng đối với những nước có nền sản xuất nông nghiệp như nước ta

Trong tế bào thực vật, cellulose là thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất, ở các loại cây gỗ nói chung, hàm lượng cellulose khoảng 40-50% riêng ở cây bông, hàm lượng cellulose lên đến 90% Hàng năm, có đến hàng tỉ tấn cellulose được tích lũy lại trong đất dưới dạng rác thải hữu cơ thực vật, hoặc do chính thực vật thải ra trong quá trình sinh trưởng phát triển Nếu lượng cellulose này không được xử lý thì trong thời gian

không lâu, toàn bộ nguồn cacbon trong không khí sẽ được chuyển hóa thành cellulose

Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu

cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật (VSV) sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường Mặt khác, việc ứng dụng enzyme cellulase để xử lý các sản phẩm thải thực vật, đồng thời tạo ra các sản phẩm phụ như thức ăn gia súc, cồn sinh học, biogas… đang là hướng phát triển tiềm năng của công nghệ sinh học

Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn… đặc biệt, khu hệ VSV cộng sinh với các loài động vật ăn cỏ, là đối tượng VSV thủy phân cellulose được chú

ý nhất Các nhà khoa học đã phân lập được trên 200 loài vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulose từ dạ cỏ các loài động vật nhai lại (Theodorou và France, 1993)

Nhằm phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao ,

đề tài: “Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được thực hiện, góp phần cung cấp nguồn giống

vi khuẩn phân hủy cellulose có hoạt tính cao để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao trên

cơ chất CMC và bã mía

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.6 Tổng quan về cellulose

2.1.1 Cellulose

Cellulose là một chất xơ không hòa tan và là một trong những thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, chúng được cấu tạo bởi nhiều gốc β-glucose, liên kết với nhau nhờ cầu nối β 1,4-glucan có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000

Hình 1: Cấu trúc cellulose (Nguồn: http://mpronovost.ep.profweb.qc.ca/BIONP1/bionp1_molecules_glucides.html

Ngày 15/03/2012 )

Cellulose là glucan không phân nhánh, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose

và các phân tử carbohydrate phức tạp khác Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose

Khối lượng phân tử cellulose thay đổi khác nhau phụ thuộc vào từng loại thực vật và tùy phương pháp xác định (khi xác định bằng phương pháp siêu li tâm, người ta nhận thấy rằng khối lượng phân tử của cellulose ở bông là 150.000-500.000 đvC còn ở gai là 1.840.000 đvC), (Nguyễn Lân Dũng, 2008)

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công

Bảng 1: Thành phần Lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)

(Nguồn: Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2011)

Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể

và vô định hình

- Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình

- Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn

vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000 Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao Trong vùng

vô định hình, các liên kết β 1,4 - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể

vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β 1,4 - glycoside) sẽ làm giảm

độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro

Cellulose có cấu trúc rất bền, không tan trong nước, chỉ bị trương phồng do hút nước, và khó bị thủy phân, chỉ bị phân hủy do đun nóng với kềm hay acid hay do các enzyme gọi chung là cellulase Người và động vật không có enzyme phân hủy cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân hủy cellulose Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn

Trong xác thực vật (nhất là trong thành phần của thân và rễ) thì thành phần hữu

cơ chiếm tỉ lệ cao nhất bao giờ cũng là cellulose Hàm lượng cellulose trong xác thực vật thường thay đổi trong khoảng 50-80% (tính theo khối lượng khô), trong sợi bông, hàm lượng này thường vượt quá 90% Có người đã tính rằng tổng lượng cellulose trên Trái Đất là vào khoảng 3500 tỉ tấn Nếu không có quá trình phân hủy cellulose thì số lượng này sẽ tăng lên rất nhanh và chẳng bao lâu, tât cả CO2 trong không khí sẽ chuyển hóa hết thành cellulose, sự sống sẽ không tồn tại được nữa (Nguyễn Lân Dũng, 2004)

2.1.2 C arboxymethyl cellulose (CMC)

CMC còn được gọi là carboxymethyl cellulose, là một dẫn suất của cellulose, được tạo thành từ phản ứng với kiềm và acid chloroacetic có độ nhớt cao và tan trong nước

Chế phẩm CMC khác nhau phụ thuộc vào mức độ thay thế gốc hydroxyl bằng gốc carboxy methyl trong chuỗi cellulose Thông thường, mức độ thay thế ở khoảng 6-9.5 dẫn xuất trên 1 monomer

CMC có tác dụng ổn định hệ huyền phù, nên được sử dụng để bảo vệ hệ bùn trong khai thác mỏ và dầu khí, trong công nghiệp dùng CMC để hồ vải (Hồ Sĩ Tráng, 2003)

Sau khi ép tách đường, bã mía còn chứa khoảng 50% ẩm và 1 -2 % đường

Về thành phần hóa học, bã mía chứa 40 – 50% cellulose, 18 – 23 % lignin và 20 – 25% hemincellulose (Hồ Sĩ Tráng, 2003)

Các thống kê cho thấy hơn 300 triệu tấn bã mía và củ cải đường được thải ra mỗi năm, tập trung hầu hết ở các nhà máy đường Các số liệu của FAO cho thấy khoảng 1.248 tấn mía được thu hoạch vào năm 1997, trong đó là 25% bã mía ép (312 triệu tấn) Năng lượng của 1 tấn bã mía ép (độ ẩm 50%) là 2,85 GJ/tấn Đó là chưa kể các phần thừa (bã bỏ, phần ngọn và lá) và phần thải trong quá trình thu hoạch mía Các phần này lại chiếm một tiềm năng năng lượng cao hơn cả (55%), thế nhưng hiện nay phần lớn vẫn chỉ bị đốt bỏ hoặc để phân rã ngoài đồng Nói cách khác, tiềm năng lớn này hầu hết vẫn đang bị bỏ phí Cho đến năm 1999, Châu Á vẫn dẫn đầu về sản lượng

bã mía (131 triệu tấn), sau đó là đến Nam Mỹ (89 triệu tấn) Các nhà máy sản xuất đường đã có truyền thống tái sử dụng bã mía để đốt tạo hơi nước từ nhiều thế kỷ qua,

nhưng hiệu suất vẫn còn rất thấp Cho đến gần đây, do sức ép kinh tế, các nhà máy đường đã phải tìm các giải pháp khác hoặc cải thiện hiệu suất tái tạo năng lượng, một

số nhà máy thậm chí còn bán điện thừa, đặc biệt là tại Brazil, Ấn Độ, Thái Lan (Đỗ Văn Chương và Nguyễn Thị Hồng Anh, 2007)

2.7 Hệ enzyme cellulase 2.7.1 Phân loại

Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase

(Nguồn: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Cellulases&lang=1 , ngày 15/03/2012)

Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(1à4) glucoside Nói chung,

để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt

Cellulase là một phức hệ enzyme gồm:

+ Exocellulase (1,4 β-glucan cellobiohydrolase) (EC.3.2.1.91): cắt từ đầu không khử của chuỗi polymer cho sản phẩm là các gốc đường đôi cellobiose, không phân hủy cellulose kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của phân tử, giúp cho

enzyme endocellulase phân hủy chúng tốt hơn Ngoài ra exocellulase còn có các tên khác như: cellobiohydrolase (CBH), exoglucanase, cellobiosidase, avicellase

+ Endocellulase (1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase) (EC.3.2.1.4): phân hủy liên kết β-1,4 glucoside trong vùng vô định hình của cellulose thành: cellodextrin, cellobiose, glucose Tác động yếu lên vùng cellulose kết tinh Các tên gọi khác như: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase, C-cellulase

+ β-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21): phân hủy các gốc đường đôi cellobiose thành glucose Không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Các tên gọi khác như: β-glucosidase hay cellobiase (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở VSV hiếu khí (A)

và vi khuẩn kỵ khí (B)

(Nguồn: Lee R Lynd, et al 2002 )

2.7.2 Cơ chế tác động thủy phân cellulose

¶ Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose ( phân hủy hiếu khí)

Quá trình oxy hóa xảy ra bắt đầu bằng sự thủy phân sau đó chuyển hóa thành

CO2 và H2O

Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose có thể qua hai giai đoạn:

Giai đoạn thứ nhất: là sự thủy phân cellulose thành cellulobiose dưới tác dụng của nhóm cellulase Ngoài ra còn tạo thành một lượng đường glucose

Giai đọan thứ hai: là giai đoạn oxy hóa những đường đơn giản Quá trình này có qua nhiều sản phẩm trung gian loại oxi axit và cuối cùng tạo thành CO2 và H2O (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

¶ Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí

Quá trình phân hủy kỵ khí khi các chất cellulose được tiến hành qua hai giai đọan Giai đoạn thủy phân cellulose thành glucose và sau đó lên men glucose theo kiểu lên men butyric Có hai dạng lên men là lên men dạng hydro và lên men dạng methan Theo như Omelanskin thì lên men kiểu methan sản phẩm khi tạo ra bằng nửa trọng lượng cellulose còn theo kiểu hydro thì khi tạo ra bằng 1/3 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.7.3 Nguồn enzyme cellulase

Trong tự nhiên có nhiều loại VSV có khả năng sinh ra các enzyme xúc tác quá trình phân hủy cellulose Những VSV này được gọi chung là VSV phân hủy cellulose

Chúng có nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vòng tuần hoàn cacbon trong tự nhiên,

góp phần rất quan trọng trong việc nâng cao độ phì cho đất cũng như vào việc tiêu hóa thức ăn ở các loài động vật nhai lại

Trong điều kiện hiếu khí thì cellulose có thể được phân hủy dưới tác dụng của nhiều loại VSV hiếu khí (vi khuẩn, niêm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm túi )

Các loài VSV có khả năng sinh cellulase thuộc về các chi sau: Achromobacter,

Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellviribrio, Bacillus, Chondromyces, Myxococcus, Cytophaga Fusarium, Chaetomium, Aspergillus, Penicilium, Trichoderma, Meralius, Fomes

Ngoài các VSV hiếu khí còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình phân hủy cellulose Người ta còn gọi quá trình phân hủy cellulose kỵ khí là quá trình “lên men cellulose”

Còn một nhóm VSV đặc biệt nữa có khả năng phân hủy cellulose một cách mạnh mẽ trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn, là nhóm VSV phát triển trong dạ cỏ của trâu bò và các động vật nhai lại khác Trâu bò sẽ không thể nào tiêu hóa được cỏ rơm

rạ nếu không có sự cộng sinh với một khu hệ đông đúc các VSV trong dạ cỏ của chúng Nhiều nghiên cứu cho thấy trong mỗi ml các chất lấy từ dạ cỏ bò có khoảng 109 – 1010 tế bào vi khuẩn Sinh khối vi khuẩn chứa đến 5 – 10% so với lượng chất khô của toàn bộ chất chứa trong dạ cỏ của trâu bò Ngoài vi khuẩn ra, trong mỗi ml các chất lấy từ dạ cỏ còn có khoảng vài triệu cơ thể động vật nguyên sinh (6 – 10% khối lượng khô dạ cỏ)

Khu hệ vi khuẩn trong dạ cỏ động vật nhai lại có thể kể đến một vài loài có khả

năng phân hủy mạnh mẽ nhất là: Ruminococcus flavefeciens, ruminococcus albus,

Ruminobacter parvum, Bacteroides succunogenes, Butyrivibrio fibrisolven, Clostridium cellobioparum, Cillobacterium cellulosolvens (Nguyễn Đức Lượng,

2003)

2.7.4 Một số ứng dụng cellulase

Theo Nguyễn Đức Lượng (2003), cellulase có một số ứng dụng như sau:

- Phá vỡ thành tế bào (cellwall) thực vật để nuôi cấy các tế bào trần, để lai tạo chúng với nhau nhằm tạo giống thực vật

- Sản xuất đường glucose thực phẩm, nguyên liệu công nghiệp hoặc nuôi cấy nấm men gia súc

- Lên men đường chuyển hóa (tạo thành bởi sự thủy phân cellulose do enzyme) thành etanol nguyên liệu động cơ đốt trong

- Tách tinh bột ra khỏi hạt và củ bằng cách dùng các enzyme tách tế bào

- Sản xuất tổ hợp EM trong xử lý rác thải

2.8 Tổng quan về dạ cỏ cừu 2.8.1 Cấu tạo chung dạ cỏ cừu

Cừu (Ovis aries) là động vật có vú thuộc họ trâu bò, chúng có cơ quan tiêu hóa

đặc trưng của nhóm động vật nhai lại

Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu

(Nguồn: http://www.sheep101.info/cud.html ngày 25/11/2011)

Trong dạ dày cừu cũng như dạ cỏ của các loài động vật nhai lại, dạ cỏ là túi lớn nhất, chiếm hầu hết nửa trái của xoang bụng, từ cơ hoành đến xương chậu Dạ cỏ chiếm 85 – 90% dung tích dạ dày, 75% dung tích đường tiêu hóa, có tác dụng tích trữ, nhào lộn và lên men phân hủy thức ăn Thức ăn sau khi ăn được nuốt xuống dạ cỏ, phần lớn được lên men bởi hệ VSV cộng sinh ở đây Chất chứa trong dạ cỏ trung bình

có khoảng 850 – 930g nước/kg, nhưng tồn tại ở hai tầng: tầng lỏng ở dưới chứa nhiều tiểu phần thức ăn mịn lơ lửng trong đó và phần trên khô hơn, chứa nhiều thức ăn kích thước lớn Ngoài chức năng lên men, dạ cỏ còn có vai trò hấp thu qua vách dạ cỏ (cũng như dạ tổ ong và dạ lá sách) vào máu và trở thành nguồn năng lượng cho vật chủ Sinh khối VSV cùng với những tiểu phần thức ăn có kích thước nhỏ (<1mm) sẽ đi xuống dạ múi khế và ruột để được tiêu hóa tiếp bởi men của đường tiêu hóa

Chất chứa dạ cỏ là một hỗn hợp gồm thức ăn vào, VSV dạ cỏ, các sản phẩm trao đổi trung gian, nước bọt và các chất chế tiết vào qua vách dạ cỏ Đây là một hệ sinh thái rất phức hợp trong đó liên tục có sự tương tác giữa thức ăn, hệ VSV và vật chủ Dạ cỏ có môi trường thuận lợi cho VSV kỵ khí phát triển Đáp lại, VSV dạ cỏ đóng góp vai trò rất quan trọng vào quá trình tiêu hóa thức ăn của vật chủ

Ngoài dinh dưỡng, môi trường dạ cỏ có những đặc điểm thiết yếu cho sự lên men cuả VSV cộng sinh như sau: độ ẩm cao (85 – 90%), pH trong khoảng 6,4 – 7,0, nhiệt độ khá ổn định (38 – 42oC), áp suất thẩm thấu ổn định và môi trường kỵ khí (nồng độ oxi < 1%) Có một cơ chế để đảm bảo duy trì ổn định các điều kiện của môi trường lên men liên tục này Nước bọt đổ vào dạ cỏ liên tục giúp duy trì độ ẩm của môi trường lên men Muối photphat và cacbonat tiết qua nước bọt có tác dụng đệm đồng thời với sự hấp thu nhanh chóng axit béo bay hơi và amoniac qua vách dạ cỏ làm cho pH dịch dạ cỏ ổn định Khí oxi nuốt vào thức ăn nhanh chóng được sử dụng,

nên môi trường kỵ khí luôn luôn được duy trì Áp suất thẩm thấu dạ cỏ được duy trì tương tự như áp suất thẩm thấu của máu nhờ có sự trao đổi ion qua vách của dạ cỏ Các chất khí (chủ yếu là CO2 và CH4) là phụ phẩm trao đổi cuối cùng của quá trình lên men dạ cỏ cũng được thải ra ngoài thông qua quá trình ợ hơi Thời gian thức ăn lưu

trong dạ cỏ kéo dài tạo điều kiện cho VSV công phá (Nguyễn Xuân Trạch et al 2008)

2.8.2 Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ

Hệ VSV cộng sinh trong dạ cỏ và dạ tổ ong rất phức tạp và thường gọi chung là

vi sinh vật dạ cỏ Hệ VSV dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính là vi khuẩn (Bacteria), động vật nguyên sinh (Protozoa) và nấm (Fungi); ngoài ta còn có mycoplasma, các loại

virus và thể thực khuẩn không đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa thức ăn Quần thể VSV dạ cỏ có sự biến đổi theo thời gian và phụ thuộc vào tính chất của khẩu phần

ăn Hệ VSV dạ cỏ đều là VSV kỵ khí và sống chủ yếu bằng năng lượng sinh ra từ quá trình lên men các chất dinh dưỡng

Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc dù chúng được nuôi cách biệt cùng với cha mẹ chúng Thông thường vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong VSV dạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa chất xơ Tính từ năm 1941 là năm Hungate công bố những công trình nghiên cứu đầu tiên về VSV dạ cỏ đến nay đã có tới 200 loài VSV dạ cỏ được mô tả (Theodorou và France, 1993) Tổng số vi khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa

dạ cỏ Trong dạ cỏ vi khuẩn ở thể tự do chiếm khoản 25-%, số còn lại bám vào các mẫu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa

Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng Vi khuẩn phân hủy cellulose: đây là nhóm có số lượng rất lớn trong dạ cỏ của những loài gia súc sử dụng khẩu phần giàu

cellulose Những loài vi khuẩn phân hủy cellulose quan trọng nhất là Bacteroides

succinogenes, Butyrivibrio fibrisolven, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolvens (Nguyễn Xuân Trạch et al 2008)

2.9 Các phương pháp vi sinh

2.4.1 Phân lập vi khuẩn

Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể ban đầu và đưa

về dạng thuần khiết

Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng

¶ Một số phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose:

Phân lập trên môi trường với nguồn carbon là CMC: Cân 1g mẫu đất trồng lúa pha loãng với 100ml nước cất khử trùng, lắc 15 phút, sau đó hút 20µl trải đều trên môi trường CMC Ủ môi trường 2 – 3 ngày ở 30oC, tách ròng từng khuẩn lạc thu được những dòng vi khuẩn riêng biệt Môi trường CMC gồm 1g (NH4)2SO4, 1g K2HPO4, 0,5g MgSO4.7H2O, 0,001g NaCl, 10g CMC, 2g Agar, thêm nước đến thể tích 1lít và điều chỉnh pH7

Phân lập trên môi trường với nguồn carbon là giấy photocopy: Cân 1g mẫu đất trồng lúa hoặc dịch dạ cỏ bò pha loãng với 100ml nước cất khử trùng, lắc 15 phút, hút 20µl dung dịch này trải đều trên môi trường M, sau đó dùng giấy photocopy (được khử trùng và cắt tròn có đường kính bằng với đường kính bề mặt đĩa môi trường) áp sát trên bề mặt môi trường, ủ môi trường 5-10 ngày ở 30oC cho đến khi khuẩn lạc phát triển trên bề mặt giấy, tiến hành tách ròng từng khuẩn lạc trên môi trường CMC (Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp, 2011)

2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập

Có nhiều cách kiểm tra:

Ø Kiểm tra vết cấy:

Quan sát sự sinh trưởng của VSV qua vết cấy trên môi trường đặc

+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại

+ Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ

Ø Kiểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc:

+ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng

+ Tách các khuẩn lạc này ra và hoà tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng

+ Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi trường

+ Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3

+ Đặt các đĩa pêtri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ loại VSV

+ Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ Sự thuần khiết của khuẩn lạc là

biểu hiện sự thuần khiết của giống (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng, 2006)

2.4.3 Phương pháp kiểm tra catalase Nguyên tắc

- Các VSV hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc, chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2

- Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc tính cao này trong tế bào

- Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí

Tiến hành

Hóa chất sử dụng:

- Dung dịch H2O2 30% được giữ trong tủ lạnh với chai màu nâu tránh ánh sáng

- Dung dịch đệm phosphate pH 7,0

Có thể thực hiện thử nghiệm catalase bằng một trong những phương pháp sau:

Ø Thử trên phiến kính (lame): dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên một phiến kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối VSV trên phiến kính Ghi nhận sự sủi bọt nếu có Hoặc có thể bằng cách chuyển một ít sinh khối của khuẩn lạc lên phiến kính, nhỏ một giọt H2O2 0,5% rồi đậy lại bằng một lame kính (lamelle) Ghi nhận nếu có sự xuất hiện của bọt khí bị giữ lại giữa phiến kính và lam kính

Ø Thử trong ống thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt thạch nghiêng Ghi nhận nếu có sự sủi bọt quanh sinh khối

Ø Thử bằng ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn thu lấy dung dịch H2O2 30%, sau đó

chấm đầu ống mao dẫn này vào tâm khuẩn lạc cần thử trên môi trường Ghi nhận nếu

có sự sủi bọt khí trong ống mao dẫn Phương pháp này có ưu điểm là thử được trên từng khuẩn lạc nên có thể thực hiện trên các khuẩn lạc của chủng chưa làm thuần

Đọc kết quả

- Dương tính (+) : khi có hiện tượng sủi bọt khí do khí O2 được tạo ra

- Âm tính (-) : khi không có hiện tượng sủi bọt khí

(Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng, 2006)

2.4.4 Phương pháp xác định đường kính vòng tròn thủy phân

Mục đích: Đánh giá sơ lược về khả năng phân hủy cơ chất cellulose của vi

khuẩn, làm cơ sở khảo sát cho những thí nghiệm sau

Nguyên tắc: Khi cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose trong môi trường thạch,

cơ chất bị phân hủy làm cho độ đục môi trường giảm và dần trong suốt Độ trong suốt được tạo ra của môi trường tỉ lệ với độ hoạt động của cellulase (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

2.10 Tình hình nghiên cứu 2.10.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nguyễn Hoài Phong et al (2003) đã phân lập được 7 chủng vi sinh vật từ mạt dừa của các cơ sở sản xuất chỉ sơ dừa Bằng kỹ thuật định danh sơ bộ dựa vào hình dạng, tất cả đều là xạ khuẩn, sau đó tiến hành sơ chọn các vi sinh vật có khả năng tạo

ra enzyme cellulase để phân hủy cellulose

Nguyễn Lân Dũng et al đã tiến hành phân lập tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân hủy cellulose từ 343 chủng nấm men nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn chăn nuôi Kết quả đã tuyển chọn được các chủng 9B1, 30B1, 97m, VTCC 2.0243, 4B2 có khả năng phân hủy cellulose cao

Võ Hoài Bắc et al (2010) đã chọn được 2 chủng vi sinh vật từ 17 chủng ban đầu có khả năng thủy phân mạnh cơ chất cellulose, qua định danh đã xác định được các chủng này là Bacillus lichenformis (Li) và Bacillus subtilis VTCC-B-505, sau đó tiến hành ứng dụng 2 giống này trong thủy phân bã thải agar

Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp et al (2010) khảo sát khả năng phân hủy rác thải hữu cơ của 3 dòng vi khuẩn gồm có 1 dòng vi khuẩn bình nhiệt (30oC) (dòng C1b), 2 dòng vi khuẩn ái nhiệt (55oC) (dòng 3a1và 3a2) Kết quả cho thấy hai nghiệm thức C2 (chủng vi khuẩn phân hủy cellulose bình nhiệt dòng C1b) và nghiệm thức C4

(chủng vi khuẩn ái nhiệt dòng 3a2) đạt được các chỉ tiêu phù hợp nhất Hơn nữa, hai nghiệm thức này có lượng khí CO2, CH4 thải ra thấp, không gây ảnh hưởng đến môi trường

Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp (2011) phân lập và nhận diện vi khuẩn phân hủy cellulose từ đất trồng lúa và dạ cỏ bò Kết quả thu được 4 dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme cellulase ngoại bào và thủy phân hiệu quả giấy photocopy

và rơm rạ Phân tích di truyền phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA cho thấy dòng vi

khuẩn Q5, Q8 và Q9 đồng hình 99-100% tương ứng với dòng Bacillus megaterium, dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% tương ứng với dòng Cellulomonas flavigena

2.10.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Oyeleke và Okusanmi (2008), đã tiến hành phân lập và khảo sát hoạt tính thủy phân cellulose của vi sinh vật từ dạ cỏ động vât nhai lại như bò, cừu và dê Kết quả

phân lập được một số dòng vi khuẩn và nấm có khả năng thủy phân cellulose như P

eruginosa, Streptococcus, Bacillus, Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium

Phân tích lượng cellulose được phân hủy và sự sinh trưởng của vi khuẩn phân hủy cellulose trong dạ cỏ (Russell et al., 2009)

Khảo sát sự cạnh tranh của 3 nhóm vi khuẩn dạ cỏ có khả năng phân hủy cellulose chủ yếu trong trường hợp có hoặc không có nhóm vi sinh vật không phân hủy cellulose (Chen và Weimer, 2001)

Barbara et al (1968), phân lập được 30 dòng vi khuẩn từ dạ cỏ cừu Trong đó có

19 dòng phẩy khuẩn Gram âm thuộc chi Butyrivibrio, bốn dòng cầu khuẩn thuộc nhóm

Ruminococcus albus, năm dòng cầu khuẩn thuộc nhóm R.flavefacien, 2 dòng còn lại

được xác định thuộc chi Clostridium

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.3 Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu 3.3.1 Địa điểm, thời gian, hóa chất và thiết bị

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh hóa và Công nghệ Enzyme, Vi sinh Thực

phẩm, Vi sinh, Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ

Thời gian : Tiến hành từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 4 năm 2012

Hóa chất: Ammonium sulfate (Merck), Congo Red, NaCl, agar, cacboxyl

methyl cellulose (CMC), H2SO4, NaOH, gellan Gum, MgSO4.7H2O, K2HPO4, Pluronic F.68, Fuchsin, Iod, Crystal violet, cồn 96o …

Thiết bị:

- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp), kính hiển vi Olympus CHT (Nhật), máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức), nồi trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức), biolog Gen II Microbial Identification System, hệ thống phân tích chất xơ VELP, máy đo độ nhớt Handheld Viscometer SKF TMVM1, máy tro hóa Nabertherm, bộ micropipet biorad P10, P20, P200, P1000, P5000 (Đức), Tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử Sartorius (Đức), ống nghiệm 15 ml (Đức), chai Durham 8cc (Đức), đĩa petri đường kính 8cm, 16cm (Đức), tủ lạnh – 20 ºC Electrolux Confor plus (Thụy Điển), tủ lạnh – 4 ºC Akira (Việt Nam), máy chụp ảnh kỹ thuật số,

máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

- Một số dụng cụ khác như: kính lúp, que cấy, lam, lammen, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylong, ốngđong, đèn cồn,…

Hình 6: Một số thiết bị sử dụng Máy tro hóa Nabertherm

Hệ thống phân tích chất xơ Máy đo độ nhớt

3.3.2 Vật liệu thí nghiệm

¶ Bã mía

Bã mía được lấy từ nhà máy đường Hậu Giang, thị xã Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang Bã mía được ngâm và rửa nước nhiều lần để loại bỏ lượng đường của bã mía, sấy khô ở 70oC và nghiền mịn thành bột với kích thước hạt là 0,2mm

3.3.3 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 3.3.3.1 Môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến Bảng 2: Môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M1)

3.3.3.2 Môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến Bảng 3: Môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M2)

( Nguồn: Ryckeboer et al, 2003)

Tùy theo mục đích cấy chuyển vi sinh vật, có thể bổ sung yeast extract nhằm kích hoạt vi khuẩn

3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã mía Chuẩn bị bã mía: bã mía sau khi lấy từ nhà máy mía đường sẽ được sấy ở 700C trong khoảng 60 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lổ lưới là 0,2mm Bột bã mía sau khi nghiền được rửa với nước lọc để loại đường

a Khảo sát hàm lượng cellulose trong bột bã mía Nguyên tắc: phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền nhiệt của

cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh Các chất như hemicellulose, lignin, tinh bột ít bền hơn với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh nên bị oxy hóa, phân hủy và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu ( Phạm Thị Ánh Hồng, 2003)

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố, 3 lần

lặp lại Tổng số đơn vị thí nghiệm là 3

a: trọng lượng cellulose còn (g) X: phần trăm cellulose có trong mẫu (%)

b Xác định độ ẩm trong bã mía Nguyên tắc: dùng nhiệt làm bay hơi nước trong nguyên liệu

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại

Tổng số đơn vị thí nghiệm là 3

Tiến hành: sấy 3 gram bột bã mía ở 105oC trong 120 phút ở; phần trăm độ ẩm được tính theo công thức:

X = (G1 – G2)*100/m Trong đó

G1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g)

G2 : khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

m: khối lượng nguyên liệu (g)

X: phần trăm nước có trong bã mía (%)

c Xác định hàm lượng tro tổng số trong bã mía

Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ Tro thật sự chỉ gồm các loại muối khoáng có trong nguyên liệu (do đó tro còn được gọi

là tổng số muối khoáng)

Nguyên tắc: Các chất hữu cơ sẽ bị nung cháy hoàn toàn ở nhiệt độ cao (550 –

6000C); những thành phần còn lại được dùng để xác định phần trăm tro có trong nguyên liệu

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại,

tổng số đơn vị thí nghiệm là 3

Tiến hành: Nung 3 gram bột bã mía ở 5500C trong 5 giờ

Hàm lượng tro toàn phần được tính theo công thức sau:

X = G2*100/G1 Trong đó:

G1: trọng lượng mẫu ban đầu (g)

G2: trọng lượng mẫu sau khi nung (g)

X: phần trăm tro có trong mẫu phân tích

(Nguyễn Thị Thu Thủy và Nguyễn Công Hà, 2009)

3.1.2 Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu Mục đích: phân lập những dòng vi khuẩn sống trong dạ cỏ cừu có khả năng sử

dụng cơ chất bã mía làm nguồn cacbon

Tiến hành thí nghiệm:

Vi khuẩn dạ cỏ được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường M1 (cơ chất bã mía) cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc ròng

- Đối với vi sinh vật hiếu khí: Mẫu được ủ ở 38oC trong 48 giờ

- Đối với vi sinh vật kỵ khí: Mẫu được ủ trong bình hút ẩm kỵ khí, ủ ở 38oC trong

48 giờ

Mô tả khuẩn lạc: Nuôi cấy mỗi vi khuẩn trên từng đĩa petri riêng ở điều kiện

38oC, trong 48 giờ Quan sát và mô tả khuẩn lạc bằng kính lúp ở độ phóng đại 5X dựa vào một số đặc điểm sau

+ Hình dạng: dạng tròn có kích thước nhỏ (punctiform) và lớn (circular);

dạng không đều (irregular), dạng thoi (spindle), rễ cây dạng sợi (filamentous) và rễ (rhizoid)

+ Độ nổi: Dạng phẳng (flat) thường thấp và ngang với mặt môi trường;

dạng lài (raised) có chiều cao khuẩn lạc khá hơn dạng phẳng nhưng có hai dốc (phía vành khuẩn lạc lài xuống; dạng mô (convex) thường nổi mô cao lên trên môi trường đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có dạng như nổi gò (pulvinat), nổi bướu (umbonate), nổi hố (umbilicate)

+ Dạng bìa: có 5 dạng bìa phổ biến như sau: bìa nguyên (entire), bìa gợn

sóng (curled), bìa chia thùy (lobate), bìa răng cưa (erose), bìa sợi (filamentous)

+ Màu sắc: Khuẩn lạc thường có màu trắng trong, trắng đục, xám, đỏ,

vàng, lục,

Mô tả vi khuẩn: Một số đặc điểm hình thái của vi khuẩn bao gồm hình dạng,

trạng thái, khả năng chuyển động của vi khuẩn

+ Hình dạng, trạng thái vi khuẩn được quan sát bằng phương pháp giọt ép ở vật kính 100X (phụ lục 1)

+ Khả năng di động vi khuẩn: vi khuẩn được chuyển vào môi trường thạch bán lỏng (0,3 - 0,6% thạch); đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ 38oC và quan sát sau

3 ngày (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thị Thúy Hằng, 2006)

+ Gram vi khuẩn được khảo sát dựa theo phương pháp nhuộm Gram của nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 – 1938) (phụ lục 1)

3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính thủy phân cơ chất CMC của vi khuẩn thủy phân

Mục đích: Khảo sát vi khuẩn có khả năng thủy phân cơ chất CMC trong điều

kiện hiếu khí và kỵ khí

- Nguyên tắc: Vi khuẩn phân hủy cellulose trong cơ chất sẽ tạo thành vòng halo

bao quanh khuẩn lạc khi nhuộm với thuốc nhuộm Congo Red

- Hoạt lực của các dòng vi khuẩn được đánh giá thông qua khả năng tạo vòng

tròn đường kính thủy phân trên môi trường M1 (cơ chất CMC)

3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính thủy phân cơ chất bã mía của vi khuẩn

Mục đích: Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng thủy phân mạnh cơ chất

bã mía trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí

Nguyên tắc: Vi khuẩn phân hủy cellulose trong cơ chất sẽ tạo thành vòng halo

bao quanh khuẩn lạc khi nhuộm với thuốc nhuộm Congo Red

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiêm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (nhân tố là từng dòng vi

khuẩn riêng biệt), 3 lần lặp lại Thí nghiệm được bố trí theo bảng 3

Hoạt tính thủy phân = đường kính vòng tròn thủy phân – đường kính lỗ đục Chỉ tiêu đánh giá:

Hoạt lực của các dòng vi khuẩn được đánh giá thông qua khả năng tạo vòng tròn

đường kính thủy phân trên môi trường M1 (cơ chất bã mía)

3.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu suất thủy phân CMC

Mục đích: Đánh giá hoạt lực của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn để thủy

Chỉ tiêu đánh giá

- Sự giảm độ nhớt của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn (phụ lục 1.4)

3.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía

Mục đích: Đánh giá hoạt lực của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn để thủy

phân bã mía

Mẫu thử: 4 dòng vi khuẩn hiếu khí và 4 dòng vi khuẩn kỵ khí được tuyển chọn

trong thí nghiệm 3

Tiến hành thí nghiệm

Chủng 1% dịch vi khuẩn mật số khoảng 107 CFU/ml vào 50 ml môi trường M2 (cơ chất bã mía), ủ ở 38oC trong 5 ngày (ủ lắc vận tốc 100 vòng/phút đối với vi khuẩn hiếu khí, )

Chỉ tiêu đánh giá:

Hiệu suất thủy phân bã mía = % xơ ban đầu – % xơ sau nuôi cấy

3.1.7 Thí nghiệm 7: Định danh vi khuẩn Mục tiêu thí nghiệm: Định danh dòng vi khuẩn được chọn lọc Nguyên tắc: Mỗi loài vi khuẩn có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau

(chủ yếu là nhiều loại đường), trong trường hợp chúng sử dụng cùng một loại đường thì nhu cầu về hàm lượng đường cũng khác nhau ở từng loài

Tiến hành thí nghiệm:

- Vi khuẩn đã được chọn có khả năng đường hóa mạnh bã mía được dùng để xác định tên loài của vi khuẩn bằng hệ thống định danh vi sinh vật Biolog Gen II Microbial Identification System tại phòng thí nghiệm VSV Công nghiệp, Viện NC &

PT Công Nghệ Sinh Học

- Mỗi dòng vi khuẩn được nuôi cấy riêng trên đĩa petri với thành phần môi trường bã mía-agar Dùng que có đầu bông gòn vô trùng lấy vi khuẩn chuyển vào dung dịch chuyên biệt sao cho dung dịch sau khi lấy vi khuẩn đạt độ đục nhất định (đo bằng máy đo độ đục) Bơm rút 100 μl dung dịch sau khi lấy vi khuẩn chuyển vào mỗi giếng trên khay 96 giếng chuyên dùng để định danh vi khuẩn do công ty Victory (Hà Nội) cung cấp Ủ ở 33oC trong 18-24 giờ, lấy khay ra đọc kết quả

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát thành phần bã mía

Nhận xét: theo kết quả từ bảng 6 cho thấy:

Sau khi phân tích 1 gram bã mía bằng máy phân tích xơ, lượng xơ bã mía còn lại là 58,57% Kết quả này cao hơn so với kết quả của Issay (1980) với lượng chất cellulose trong xơ mía là 56,5%, cao hơn thành phần cellulose trong bã mía của Hồ Sĩ Tráng (2003) là 40-50% Mặt khác, kết quả này cũng cho thấy hàm lượng xơ trong bã mía cao hơn 7,27% so với hàm lượng xơ bã mía của Nguyễn Thị Thanh Trúc et al (2011) Có thể là do sự khác nhau về giống mía nguyên liệu dẫn đến sự khác biệt về thành phần chất xơ

Thành phần cellulose trong bã mía khá cao, hơn nhiều so với thành phần cellulose trong các nguồn nguyên liệu khác như: vỏ trấu (32,1 %), lá cây (15-20%)…

do đó, bã mía rất thích hợp để làm nguồn nguyên liệu cho quá trình thủy phân cellulose của vi khuẩn

Bột bã mía sử dụng có chứa 7,96 % nước

Bã mía sau xử lý có 3,59% chất khoáng Kết quả này cao hơn kết quả của Issay (1980) là 1,3 % Cao hơn hàm lượng khoáng trong xơ dừa là 2,22% (Sudhakaran và Vasudev, 2001)

Bảng 6: kết quả khảo sát thành phần của bã mía sau xử lý Hàm lượng Cellulose

(%)

Hàm lượng ẩm độ

(%)

Hàm lượng tro (%)

Hình 7: Bã mía thô và bột bã mía trước và sau xử lý

4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu

Quá trình phân lập đã tách ròng được 46 dòng vi khuẩn từ dạ cỏ cừu, bao gồm

21 dòng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí và 25 dòng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí Tất cả 46 dòng vi khuẩn đều phát triển tốt ở 38oC sau 48 giờ

Bảng 7: Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí từ dạ cỏ cừu Stt Tên dòng vi khuẩn hiếu khí Stt Tên dòng vi khuẩn hiếu khí

Bảng 8: Kết quả phân lập vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ cừu Stt Tên dòng vi khuẩn kỵ khí Stt Tên dòng vi khuẩn kỵ khí

4.2.1 Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc

Bảng 9: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí

Stt

Tên dòng

vi khuẩn

Hình dạng khuẩn lạc

Độ nổi khuẩn lạc

Dạng bìa khuẩn lạc

Màu sắc khuẩn lạc

Bảng 9 cho thấy: đa số khuẩn lạc các dòng vi khuẩn hiếu khí có dạng hình tròn, bìa nguyên, lài, chuyển màu xám khi vi khuẩn già Có thể phân nhóm sơ bộ 19 dòng vi khuẩn hiếu khí này này như sau: nhóm vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, lài, nguyên, xám có

8 dòng bao gồm CD 2, CD 6, CD 12, CD 14, CD 18, CD 32, CD 34 và CD 40; nhóm

vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, lài, bìa gợn sóng màu xám có 5 dòng CD 8, CD 20, CD 38,

CD 26 và CD 28, 8 dòng vi khuẩn còn lại đều có những đặc điểm khuẩn lạc riêng biệt

Hình 8: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn CD 22 và CD 28

CD 22

CD 28