Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả đánh giá khả năng chịu lạnh ở mức độ mô sẹo của 6 giống lúa: Xuân châu hương, Q5, C27, Khang dân, U17 và Nhị ưu 63 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm chọn tạo vật liệu khởi đầu phục vụ chọn dòng chịu lạnh của lúa. Kết quả cho thấy, xử lý mô sẹo ở nhiệt độ 50C ± 0,50C với các ngưỡng thời gian (1, 5, 9, 11, 13 và 15 ngày), mô sẹo các giống nghiên cứu có tỷ lệ sống sót, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh chồi khác nhau, giống Xuân châu hương có tỷ lệ sống sót, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh chồi là cao nhất.
Trang 1ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH CỦA CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƯƠNG,
Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƯU 63 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO
Trường Đại học Sư phạm – ĐH Thái Nguyên
TÓM TẮT
Trong những năm gần đây, khí hậu thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đang có những biến
đổi bất thường Vùng miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ là những khu
vực thường xuyên chịu ảnh hưởng của lạnh Những năm gần đây nhiệt độ xuống rất thấp và thời gian kéo dài hơn, đây chính là nguyên nhân làm giảm năng suất và sản lượng lúa gạo của vùng Lúa vụ đông xuân chịu tác động mạnh nhất của nhiệt độ thấp, đặc biệt ở giai đoạn mạ, vì vậy, nghiên cứu khả năng chịu lạnh và tăng cường khả năng chống chịu với nhiệt độ thấp nhằm nâng cao năng suất và ổn định sản lượng của các giống lúa là yêu cầu cấp thiết đối với các tỉnh miền núi phía Bắc và khu vục Bắc Trung Bộ hiện nay Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả đánh giá khả năng chịu lạnh ở mức độ mô sẹo của 6 giống lúa: Xuân châu hương, Q5, C27, Khang dân,
U17 và Nhị ưu 63 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm chọn tạo vật liệu khởi đầu phục vụ chọn
dòng chịu lạnh của lúa Kết quả cho thấy, xử lý mô sẹo ở nhiệt độ 50C ± 0,50C với các ngưỡng thời gian (1, 5, 9, 11, 13 và 15 ngày), mô sẹo các giống nghiên cứu có tỷ lệ sống sót, tốc độ sinh trưởng
và khả năng tái sinh chồi khác nhau, giống Xuân châu hương có tỷ lệ sống sót, tốc độ sinh trưởng
và khả năng tái sinh chồi là cao nhất Kết quả đã tạo được 86 dòng mô và 210 dòng cây xanh đang trồng ngoài đồng ruộng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo
Từ khoá: In vitro, mô sẹo, Oryza sativa, tái sinh cây, chịu lạnh
∗ MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam, lúa (Oryza sativa L.) là cây nông
nghiệp có vị trí quan trọng trong nền kinh tế
quốc dân Vùng miền núi phía Bắc, đồng bằng
sông Hồng và Bắc Trung Bộ là những khu
vực sản xuất lúa quan trọng nhưng lại thường
xuyên chịu ảnh hưởng của điều kiện lạnh
Trong những năm gần đây, vào mùa đông,
nhiệt độ khu vực này thường hạ xuống rất
thấp (dưới 10oC) và kéo dài làm ảnh hưởng
rất lớn đến năng suất và chất lượng lúa nhất là
lúa vụ đông xuân Vì vậy, nghiên cứu khả năng
chịu lạnh và tăng cường khả năng chịu lạnh của
các giống lúa nhằm nâng cao và ổn định sản
lượng lúa trong điều kiện nhiệt độ thấp là một
đòi hỏi thực tiễn trong sản suất nông nghiệp
và đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên
cứu [1], [2], [3], [5] Để góp phần cùng các
nhà chọn giống tìm ra những giống có khả
năng chịu lạnh tốt, chúng tôi đã tiến hành
∗ Tel: 0913 383 289; Email: mauchdhtn@gmail.com
đánh giá khả năng chịu lạnh ở mức độ mô sẹo của 6 giống lúa: Xuân châu hương, Q5, C27, Khang dân, U17 và Nhị ưu 63, bằng
kỹ thuật nuôi cấy in vitro
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Vật liệu nghiên cứu là hạt của các giống lúa: Khang Dân (KD), U17 do sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Thái Nguyên cung cấp, Xuân Châu Hương (XCH), Nhị Ưu 63 (NƯ63), C27 do sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Bắc Kạn cung cấp, Q5 do sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Bắc
Giang cung cấp
Phương pháp nuôi cấy in vitro
- Khử trùng hạt: hạt lúa chín được bóc bỏ vỏ trấu và khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, lắc nhẹ trong nước javen 60% trong 20 - 25 phút Sau đó tráng nước cất 3 - 5 lần
- Tạo mô sẹo: hạt sau khi được khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản
Trang 2(Murashige và Skoog, 1962), bổ sung sucrose
3%, aga 0,8%, 2,4D 2mg/l, pH = 5,8 Mỗi
bình cấy 10 - 15 hạt Nuôi 1 tuần trong tối, 2
tuần dưới ánh sáng đèn trong phòng nuôi cấy
với cường độ 2000 lux Sau 3 tuần tiến hành
đánh giá khả năng tạo mô sẹo - Xử lý mô sẹo
: Mô sẹo tạo thành được chia nhỏ với kích
thước 3mm và chuyển sang môi trường duy
trì mô sẹo gồm: MS, sucrose 3%, aga 0,8%,
2,4D 1mg/l, pH = 5,8 và được đặt trong tủ
lạnh có nhiệt độ 50C ± 0,50C xử lý theo các
ngưỡng thời gian khác nhau (1, 5, 9, 11, 13,
15 ngày
- Tái sinh cây: Mô sẹo sau khi xử lý lạnh
được chuyển lên môi trường tái sinh (MS,
BAP 2mg/l, sucrose 3%, aga 0,8%, pH = 5,8)
Sau 3 tuần đánh giá tỷ lệ sống sót và tốc độ
sinh trưởng của mô sẹo Sau 8 tuần đánh giá
khả năng tái sinh cây
- Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi lúa tái sinh
được tách ra thành từng dòng cây và cấy
chuyển lên môi trường tạo cây hoàn chỉnh
(MS, sucrose 3%, aga 0,8%, NAA 0,2 mg/l,
pH = 5,8) Mật độ cấy 10 chồi/bình Nuôi
dưới ánh sáng đèn neon trong phòng nuôi cấy
với cường độ 2000 lux
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thăm dò khả năng tạo mô sẹo và tốc độ
sinh trưởng của mô sẹo lúa
Để đánh giá khả năng thích ứng của các giống
trong hệ thống nuôi cấy mô nhằm sử dụng
chúng trong việc đánh giá khả năng chịu lạnh
cũng như với mục đích chọn dòng tế bào sau
này, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh cây của các giống nghiên cứu Khả năng tạo mô sẹo được đánh giá sau 3 tuần nuôi cấy Sau 3 tuần nuôi cấy
mô sẹo được cắt nhỏ với kích thước 3mm2, sau đó cấy trên môi trường tái sinh Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo được tính bằng số đơn vị mô sẹo (ĐVMS), 1ĐVMS = khối mô sẹo kích thước 3mm2 Khả năng tái sinh được đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 1 Kết quả nhận được ở bảng 1 cho thấy, tất cả các giống thí nghiệm đều có khả năng tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây Tuy nhiên, tỷ lệ tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng của các giống lúa là khác nhau Khả năng tạo mô sẹo và tốc
độ sinh trưởng mô sẹo của giống C27 là cao nhất (98,59%), thấp nhất là giống Nhị ưu 63 (82,29%) Song khả năng tái sinh cây cây của giống Xuân Châu Hương là cao nhất (15,39%), thấp nhất là giống C27 (8,54%) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khả năng tái sinh cây trong nuôi cấy mô sẹo phụ thuộc vào kiểu gen của từng giống [4], [6], [7], [8] Qua thực nghiệm, chúng tôi thấy những mô
có màu vàng trắng, mô sẹo cứng và khô có khả năng tái sinh cao hơn so với những mô
có màu nâu đen, mô sẹo mọng nước Như vậy, tất cả các giống nghiên cứu đều có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây đáp ứng cho các nghiên cứu tiếp theo liên quan đến nuôi
cấy in vitro
Bảng 1 Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh cây của các giống lúa
sau 3 tuần
Tốc độ sinh trưởng (đvms/hạt/3tuần)
Tỷ lệ tái sinh cây(%) sau 8 tuần
Trang 3Bảng 2 Tỷ lệ mô sẹo sống sót sau 3 tuần nuôi phục hồi
Ảnh hưởng của lạnh đến tỷ lệ sống sót của
mô sẹo
Để xây dựng quy trình chọn dòng chịu lạnh,
cần xác định ngưỡng chịu lạnh của mô sẹo
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng chịu
lạnh của các giống ở mức độ mô sẹo thông
qua chỉ tiêu về khả năng chịu lạnh và tái sinh
cây của mô sẹo sau khi xử lý ở nhiệt độ 50C ±
0,50C với các ngưỡng thời gian khác nhau (1,
5, 9, 11, 13 và 15 ngày) Khả năng chịu lạnh
của mô sẹo được đánh giá thông qua tỷ lệ
sống sót của mô sẹo sau khi nuôi phục hồi 3
tuần Kết quả thu được cho thấy, những mô
sống sót có màu trắng ngà, sau 3 tuần kích
thước mô sẹo đã lớn hơn khối mô trước khi
xử lý Những mô bị chết có màu đen, màu
vàng hoặc trắng, kích thước không thay đổi
Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau xử lý ở nhiệt
độ thấp là một trong các chỉ tiêu để đánh giá
khả năng chịu lạnh của các giống lúa Tỷ lệ
sống sót của mô sẹo các giống sau khi xử lý ở
nhiệt độ thấp được thể hiện ở bảng 2
Kết quả ở bảng 2 cho thấy, số ngày xử lý bởi
lạnh càng tăng thì tỷ lệ sống sót của mô sẹo
càng giảm Khả năng chịu lạnh của các giống
ở mức độ mô sẹo rất khác nhau Tỷ lệ mô sẹo
sống sót của U17 là cao nhất ở hầu hết các
ngưỡng xử lý (94,96%, 43,35%, 22,57%,
12,35%, 8,27% và 8,13% tương ứng với thời
gian xử lí là 1, 5, 9, 11, 13, 15 ngày) Tỷ lệ mô
sẹo sống sót của C27 là thấp nhất ở hầu hết các
ngưỡng xử lý (79,67%, 24,84%, 10,26%,
5,11% tương ứng với ngưỡng thời gian là 1, 5,
9, 11 ngày) Sau 10 ngày, tỷ lệ sống sót của mô
sẹo đều giảm nhanh ở cả 6 giống nghiên cứu Giống C27 xử lý lạnh ở ngưỡng 13, 15 ngày
mô sẹo chết hoàn toàn Mô sẹo của giống Q5 chết hoàn toàn khi xử lý lạnh ở ngưỡng 15 ngày Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trước đây Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, ở cùng một ngưỡng xử lý, thời gian xử lý càng tăng thì tỷ lệ sống sót của
mô sẹo càng giảm [4], [8]
Ảnh hưởng của lạnh đến tốc độ sinh
trưởng của mô sẹo
Đồng thời với đánh giá khả năng sống sót của
mô sẹo, chúng tôi còn theo dõi khả năng sinh trưởng của mô sẹo sau xử lý lạnh ở các ngưỡng khác nhau và nuôi phục hồi 3 tuần Kết quả được trình bày ở bảng 3
Kết quả bảng 3 cho thấy, tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo các giống không đều nhau Trong đó, khi xử lý lạnh, giống Xuân
châu hương có tốc độ sinh trưởng tương đối
cao (2,94 đvms/mô, 3,12 đvms/mô, 3,21 đvms/mô, 2,20 đvms/mô, 2,08 đvms/mô, 1,88 đvms/mô và 1,52 đvms/mô), tiếp đến là giống U17 và giống C27 là thấp nhất Tỷ lệ mô sẹo sống sót càng cao thì tốc độ sinh trưởng của
mô càng cao và ngược lại Kết quả ở bảng 3 cũng cho thấy, ở ngưỡng xử lý 1 và 5 ngày không làm ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của
mô sẹo, ngược lại còn kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo so với đối chứng, tăng cao nhất là giống U17 (3,27 đvms/mô ở ngưỡng 5 ngày) Khi tăng thời gian xử lý thì tốc độ sinh trưởng của mô sẹo giảm dần rồi dẫn tới ngừng sinh trưởng và chết hoàn toàn [8]
Trang 4Bảng 3 Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo sau xử lý bởi lạnh và nuôi phục hồi 3 tuần
Bảng 4 Khả năng tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý lạnh
Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo sau khi
xử lý lạnh
Khả năng tái sinh chồi sau 8 tuần nuôi cấy
của mô sẹo sống sót sau xử lý lạnh được trình
bày ở bảng 4 Kết quả cho thấy mô sẹo của
hầu hết các giống sau xử lý lạnh ở các
ngưỡng thời gian khác nhau đều còn giữ được
khả năng tái sinh chồi Mô sẹo bị xử lý ở các
ngưỡng 1, 5, 9 ngày có khả năng tái sinh cao
hơn so với đối chứng ở tất cả các giống
Kết quả bảng 4 cho thấy, giống XCH có tỷ lệ
tái sinh chồi cao nhất ở tất cả các ngưỡng xử
lý (23,24%, 14,39%, 23,24%, 17,12%,
14,32%, 16,00% tương ứng với các ngưỡng
thời gian 1, 5, 9, 11, 13, 15) Giống có tỷ lệ
tái sinh chồi thấp nhất là giống C27 (8,32%,
6,42%, 8,32%, 1,35% tương ứng với ngưỡng
thời gian 1, 5, 9, 11 ngày) Ở ngưỡng 13, 15
ngày mô sẹo của giống C27 bị chết hoàn toàn
Mô sẹo của giống Q5 cũng bị chết hoàn toàn
ở ngưỡng 15 ngày Như vậy, thời gian xử lý
càng tăng thì tỷ lệ tái sinh chồi càng giảm
Kết quả cho thấy, hầu hết mô của các giống sau xử lý lạnh khi sống sót thường có khả năng tái sinh cao hơn so với đối chứng Theo
Lê Trần Bình và cs (1998), khi xử lý cực đoan những tế bào mẫn cảm đã bị giết chết, chọn ra những tế bào có sức sống và khả năng tái sinh cao hơn [5] Như vậy, khả năng tái sinh không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen mà còn phụ thuộc vào thời gian xử lý lạnh mô sẹo Qua thực nghiệm chúng tôi đã thu được 86 dòng
mô có khả năng chịu lạnh và 210 dòng cây xanh của 6 giống lúa, hiện đang trồng ngoài đồng ruộng để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo
Từ những khảo sát về khả năng chịu lạnh và tái sinh cây của các giống, chúng tôi xác định được ngưỡng chọn dòng chịu lạnh của các giống U17, Nhị ưu 63, Khang dân, Xuân châu hương là 15 ngày, ngưỡng chọn dòng chịu lạnh của giống C27 là 11 ngày và ngưỡng chọn dòng chịu lạnh của giống Q5 là 13 ngày Tuy nhiên, để khẳng định được chắc chắn đó
Trang 5là các ngưỡng xử lý có hiệu quả đối với các
giống cần phải tiếp tục theo dõi ngoài đồng
ruộng, phân tích về di truyền, hoá sinh cũng
như kiểm tra khả năng chống chịu lạnh của
các thế hệ tái sinh từ các dòng mô chịu lạnh
thu được
KẾT LUẬN
- Cả 6 giống lúa đều có khả năng tạo mô sẹo
và khả năng tái sinh cây từ mô sẹo Khả năng
tạo mô sẹo của giống C27 là cao nhất, thấp
nhất là giống Nhị ưu 63 Song khả năng tái
sinh cây của giống Xuân châu hương là cao
nhất, thấp nhất là giống C27
- Xử lý mô sẹo ở 50C ± 0,50C với thời gian 1
và 5 ngày không làm ảnh hưởng tới sự sinh
trưởng của mô sẹo, ngược lại còn kích thích
sự sinh trưởng của mô sẹo Tăng thời gian xử
lý lạnh lên 9, 11, 13 và 15 ngày làm ức chế sự
sinh trưởng của mô sẹo so với đối chứng
- Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sống sót
sau xử lý lạnh ở ngưỡng thời gian 9 ngày cao
hơn hẳn so với đối chứng
-Ngưỡng chọn dòng chịu lạnh của các giống
U17, Nhị ưu 63, Khang dân, Xuân châu
hương là 15 ngày, ngưỡng chọn dòng chịu
lạnh của giống Q5 là 13 ngày và ngưỡng chọn
dòng chịu lạnh của giống C27 là 11 ngày ở
50C ± 0,50C
- Khả năng chịu lạnh của các giống lúa ở mức
độ mô sẹo có sự khác nhau Khả năng chịu
lạnh ở mức độ mô sẹo các giống được sắp xếp
thep thứ tự từ cao đến thấp như sau:
XCH > U17 > KD > NƯ > Q5 > C27
- Đã tạo được 86 dòng mô và 210 dòng cây xanh phục vụ cho nghiên cứu chọn dòng tiếp theo
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bertin P., Bouharmont J., Kinet J M (1997),
“Somaclonal variation and improvement of chilling tolerance in rice:
Chance in chilling-induce chlorophyll
fluorescence”, Crop Sci, 37, pp 1727-1735
[2] Bertin P., Kinet J M., Bouharmont J (1995),
“Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line
selection”, Aust J Bot, 44, pp 91-105
[3] Bouharmont J., Dekeyser A (1989), “In vitro selection for cold and salt tolerance in rice”,
Review of Advance in Plant Biotechnology, 1985 –
88 IMWIC & IRRI, pp 308 – 313
[4] Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Điệp, Lê Thị
Muội (1995), "Nghiên cứu khả năng chịu lạnh và
chịu khô ở mức độ mô sẹo lúa của các giống có
nguồn gốc sinh thái khác nhau", Tạp chí Sinh học,
17 (1), tr25 – 29
[5]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập
gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học quốc gia, Hà Nội
[6] Gamborg O L., Phillip G C (1995), Basal
media for plant cell and tissue culture in: Plant
Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental
methods, Springer Heidelberg, pp 301-306 [7] M Al – Forkan, M A Rahim, T Chowdhury,
P Akter and L Khaleda (2005), “Deverlopment of
highly in vitro callogeenesis and regeneration
system for some salt tolerance rice cultivars of
bangladesh”, Biotechnology 4 (3), pp 230 – 234
[8]. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả
năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ
Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội
Hình 1 Một số hình ảnh trong đánh giá khả năng chịu lạnh ở lúa
(A) Mô sẹo hình thành từ hạt; (B) Mô sẹo sống sót tái sinh sau 4 tuần nuôi phục hồi; (C) Tái sinh chồi
từ mô sẹo sống sót sau 8 tuần
Trang 6SUMMARY
EVALUATION OF COLD TOLERANCE ABILITY OF XUAN CHAU HUONG,
Q5, C27, KHANG DAN, U17, NHI UU 63 RICE CULTIVARS BY IN VITRO
CULTIVATION TECHNIQUE
College of Education - TNU
In recent years, global climate in general and VietNam in particular have witnessed abnormal changes The Northern mountainous provice, Red River Delta and Northen central regions are often affected by cold weather, with temperature getting low and cold period prolonged in recent years This is the major cause of the decreasing rice yield in these regions, in which winter-spring rice is most seriously affected by low temperature, especially at seeding stage As such, studying on enhanced cold tolerance ability and resistance to low temperature to improve productivity and stabilize yield of rice breeds is practically required for these regions In this paper, we announce the results of evaluating cold tolerance at callus level of six rice cultivars: Khang Dan, Xuan Chau Huong, Nhi Uu 63, C27, U17 and Q5 by in vitro cultivation technique to create the initial material to serve selection of cold-tolerant rice lines Results showed that after cold treatment at different time thresholds (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15 days), callus tissue of all six rice cultivars have different rate of survival, growth rate and regeneration capacity, of which the highest are of Xuan Chau Huong Finally, 86 callus and 210 rice lines have been created and serving for further research
Key words: Callus, cold tolerance, in vitro, Oryza sativa, plant regeneration.
∗ Tel: 0913 383 289; Email: mauchdhtn@gmail.com