Nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây tào đông

Nghiên cứu và chiết xuất thành công các ancaloit có trong củ bình vôi đã chế ra các viên rotundin cho người mất ngủ kéo dài, Nghiên cứu hóa học và chiết nam thành một cường quốc sản xuất

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRỊNH THỊ GIANG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

RỄ CÂY TÀO ĐÔNG

LU ẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Thái Nguyên, năm 2011

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRỊNH THỊ GIANG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

RỄ CÂY TÀO ĐÔNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số

liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

TRỊNH THỊ GIANG

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm Thị Hồng Minh, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hoá - Trường Đại học

Sư phạm Thái Nguyên, các thầy của Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ và đưa ra nhiều ý kiến quý báu về mặt chuyên môn trong quá trình tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, khoa Sau Đại học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, phòng hoạt chất Sinh học - Viện hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bố,Mẹ tôi, những người thân trong gia đình và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn

Thái nguyên, tháng 8 năm 2011

Tác giả

Trịnh Thị Giang

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các hình vii

Danh mục bảng biểu, sơ đồ viii

Danh mục các từ viết tắt ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NÓ 3

1.1- KHÁI QUÁT VỀ CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS 3

1.2- NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT CHI PRUNUS 4

1.2.2- Các hợp chất Gibberellins 7

1.2.3- Các hợp chất secquiterpen 11

1.2.4- Hợp chất điterpen 11

1.2.5- Các hợp chất flavonoit 12

1.3- TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT PRUNUS ZIPPELIANA 17

1.4- GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY TÀO ĐÔNG 19

1.4.1- Mô tả cây Tào đông 20

1.4.2 – Đặc điểm phân bố 21

1.4.3 Thành phần hóa học 21

1.4.4 Tác dụng dược lý 21

1.4.5 Đặc điểm thu hoạch và chế biến 22

1.5 MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG 22

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 24

2.1.2 Thử hoạt tính sinh học 25

2.1.3 Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết 25

2.1.4 Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất 26

2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất 26

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 27

2.3 CÁC DỊCH CHIẾT CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG 27

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết 27

2.3.2 Khảo sát định tính dịch chiết.[3] 29

2.3.2.1 Phát hiện các hợp chất steroit 29

2.3.2.2 Phát hiện các ancaloit 30

2.3.2.3 Phát hiện các flavonoit 30

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin 30

2.3.2.5 Định tính các glycozit tim 31

2.3.2.6 Định tính các saponin 31

2.3.3 Thử hoạt tính sinh học 32

2.4 PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT 34

2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan của rễ cây Tào đông Prunus zippeliana var.crasistyla (Card )J.E.Vid 34

2.4.1.1 Chất HT-1: Stigmast-5,22-dien- 24R-3β-ol 34

2.4.1.2- Chất HT-2 :  - Sitosterol 35

2.4.2- Các chất có trong dịch chiết etylaxetat 36

2.4.2.1- Chất ET-1 : Axit 2α-hiđroxyursolic 36

2.4.2.2- Chất ET-2 : Kempherol 37

2.4.2.3- Chất ET-3: 5,7,3,,4,5,-pentahidroxiflavan-3-ol hay epigallocatechin 38

CHƯƠNG III THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 NGUYÊN TẮC CHUNG 39

3.2 XÁC ĐỊNH ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT THIÊN NHIÊn 39

3.3 PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG 40

3.3.1 Chất HT-1: Stigmast-5,22-dien-24R-3 β –ol 40

3.3.2 -sitosterol (HT-2)3.3.2 -sitosterol (HT-2) 47

3.3.3- Hợp chất ET-1 51

3.3.4 Kempherol (ET-2) 58

3.3.5 Epigallocatechin (ET-3) 64

KẾT LUẬN 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

PHỤ LỤC CÁC PHỔ 75

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây tào đông 20

Hình 1.3: Lá cây tào đông 20

Hình 2.1 Kết quả thử hoạt tính sinh học từ dịch chiết rễ cây tào đông 33

Hình ảnh ức chế xung quanh giếng thạch với chủng S aureus 33

Hình ảnh ức chế xung quanh giếng thạch với chủng E Col 34

Hình 3.1 Phổ FT - IR của Stimastenol 44

Hình 3.2 Phổ 1 H- NMR của HT1 45

Hình 3.3 Phổ 13 C - NMR của Stimastenol 46

Hình 3.4: Phổ FT-IR của -sitosterol (HT-2) 48

Hình 3.5: Phổ 1 H-NMR của -sitosterol (HT-2) 49

Hình 3.6: Phổ 13 C-NMR và ATP của -sitosterol (HT-2) 50

Hình 3.7 Phổ MS của ET1 54

Hình 3.8 Phổ 1H - NMR của Axit 2α,3α-dihiđroxy-urs-12-en-28 oic (ET-1) 55

Hình 3.9 Phổ 13C - NMR của (ET-1) 56

Hình 3.10 Phổ 13C CPD & DEPT của (ET-1) 57

Hình 3.11: Phổ 1H-NMR-AcetoneD6 của ET-2 61

Hình 3.12: Phổ 13C-NMR-AcetoneD6 của ET-2 62

Hình 3.13: Phổ 13 CCPD & DEPT-AcetoneD6 của ET-2 63

Hình 3.14: Phổ 1 H-NMR-của: Epigallocatechin ET-3 66

Hình 3.15: Phổ 13C-NMR- của Epigallocatechin ET-3 67

Hình 3.16: Phổ 13 CCPD & DEPT của Epigallocatechin ET-3 68

DANH M ỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu thực vật trong dung môi clorofoc và metanol của

Prunus avium (Trường ĐH Haminton-Canada) 17

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu rễ cây Tào đông 28

Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM 26

Bảng 2.2 : Khối lượng các cặn chiết thu được từ rễ cây Tào đông 29

(Prunus zippeliana var.crasistyla) 29

Bảng 2.3: Phát hiện các nhóm chất trong rễ cây tào đông (Prunus zippeliana var.crasistyla (Card )J.E.Vid 32

Bảng 2.4 : Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết MeOH 33

từ lá cây tào đông prunus zippelianna 33

Bảng 3.1: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của HT-1 và HT-2 trong rễ cây Prunus zippelianna và phổ của -sitosterol 42

Bảng 3.2 Các số liệu phổ NMR của chất ET-1 52

Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của ET-2 và số liệu phổ trong phần mềm ACD/NMR của chất kempherol 59

Bảng 3.4 Các số liệu về phổ NMR của chất ET-3 65

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

EI-MS : Electron Impact Mass Spectrometry

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HMBC : Heteronuclear multiple – Bond Correlation

Hiện nay, nhiều nước trên thế giới, nhiều công ty dược đã và đang đẩy mạnh các công trình nghiên cứu về hóa học thực vật Các thuốc chữa bệnh điều chế từ dược liệu nhất là các chất được bào chế từ thực vật ngày càng chứng minh được ưu thế trong điều trị Đó là do chúng ít gây ra tác dụng phụ

và nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn so với các sản phẩm tổng hợp

Việc sử dụng các loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng gia tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền Y học Chế phẩm thảo dược dù chỉ có một loại dược liệu nhưng lại là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong mọi trường hợp hầu hết đều chưa xác định rõ hoạt chất của từng chất Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên Từ đó định hướng cho việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm ra các loại thuốc mới hay bằng con đường tổng hợp để tạo ra những chất có hoạt chất trong việc chữa trị nhiều loại bệnh Chính vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

Nghiên cứu và chiết xuất thành công các ancaloit có trong củ bình vôi đã chế ra các viên rotundin cho người mất ngủ kéo dài, Nghiên cứu hóa học và chiết

nam thành một cường quốc sản xuất thuốc chống sốt rét, việc nghiên cứu và chiết xuất thành công axit shikimic từ cây Hồi Lạng sơn, làm nguyên liệu chính để sản xuất tamiflu làm thuốc trị dịch cúm gia cầm H5N1, hay như chè cacdorido từ cây

kết quả nói trên có phần đóng góp xứng đáng của các nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành như sinh học, hoá học, công nghệ học, hóa dược, v.v

Theo hướng nghiên cứu trên, cây Tào đông có tên khoa học là Prunus zippeliana var.Crasistyla (Card) J.E.Vid là một trong số các cây thuốc dân gian được chọn làm đề tài của luận văn này Nghiên cứu sơ bộ ban đầu cho biết cây

với các công dụng chữa viêm khớp cấp và mãn tính, chữa thống phong, chữa các

ancol rễ cây có tác dụng tốt đối với một số vinh vật kiểm định

Có được nhiều ứng dụng như vậy song chưa có nhiều công trình nghiên cứu hoá học về thực vật này Vì vậy nhằm góp thêm phần hiểu biết về thành phần

hóa học cây thuốc dân gian, chúng tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu thành phần

hóa học rễ cây tào đông” là nội dung chính của bản luận văn này

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA NÓ 1.1- KHÁI QUÁT VỀ CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS

Prunus là chi thực vật khá phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, từ lâu đã được các nhà khoa học chú ý nghiên cứu và đã công bố nhiều công trình khoa

phần hóa học có trong chúng Chi Prunus thuộc họ hoa hồng, có khoảng 200 loài

chủ yếu là cây thân gỗ hoặc cây bụi Các loài cây này phần lớn mọc ở vùng ôn đới phần Bắc bán cầu Một số loài được biết đến nhiều hơn cả như các loại đào, các loại mận, mơ, xeri v.v được trồng rộng rãi để lấy trái Cũng có một số loài

trồng làm cây cảnh Phổ biến nhất của các loài này là các loài hoa anh đào ở Nhật

loại lá đơn, thuộc loại thay lá, thường lá có mép răng cưa và có hoa 5 cánh trong các chùm đong đưa hay thẳng đứng, ngoại trừ những loại có hoa kép có nhiều cánh lớn hơn Trái thường ăn được, có dạng quả hạch, một hạt.[1],[6]

Từ trước khi thực vật Prunus zippeliana được công bố năm 1858, người ta

đã công bố chi Prunus có tới 97 loài khác nhau, Cho đến hiện nay trên thế giới đã

biết được hơn 200 loài thuộc chi prunus có thể nêu ra một số loài tiêu biểu như

1.2- NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT CHI PRUNUS

thuộc chi prunus có thành phần hóa học rất đa dạng, phổ biến và phức tạp Người

khác nhau, phổ biến là các steroit, tecpenoit, các flavonoit, các poliphenol, secquitecpenlacton, nhiều nhóm glycosid, các oligosacarid và nhiều nhóm hợp

ra từ các bộ phận khác của các thực vật này cũng có hoạt tính sinh học cao nhiều

việc nghiên cứu hóa học loài thực vật này còn rất ít

caffeoylquinic (CQA), axit hydroxycinnamic, axit benzoic, cumarin, lignan và

flavonoit từ Prunus domestica L [16]

Trong lá cây Prunus laurocerasus có sáp chứa trên 80% các hợp chất ankan (C16–C22) [23]

Các nhà khoa học Hàn Quốc đã thử các hoạt tính chống ôxy hóa in vitro

của một số loài Prunus chọn lọc của Hàn Quốc như: P buergeriana, P daviana, P.padus, P pendula, P sargentii, P serrulata var Spontanea và P.yedoensis

Họ cũng đã tách được 11 flavonoit đã biết từ phân đoạn tan trong etyl axetat của

dịch chiết metanol từ lá cây P serrulata var Spontanea Các hợp chất này có

hoạt tính oxy hóa cao [23]

Từ rễ cây P ameniaca người ta cũng tách được ba đồng phân kiểu

ent-epiafzelechin- (4α 8; 2α O 7)-(+) afzelechinn và ent-epiafzelechin- (4α

8; 2α O 7)-(-) afzelechin [19]

Từ lá trong cây thuộc chi Prunus như P serotina và P virginiana cv Schubert của phân nhóm Padus và P ilicifolia và P lyonii của phân nhóm Laurocelasus, Santamour F S Jr lần đầu tiên đã phát hiện ra amygdalin diglucozit cyanua Trong lá của các cây khác ở loài (Subgenera) chỉ chứa

monoglucozit prunazin[27]

Các loài trong chi Prunus khác như P perisa P armeniaca P africana để

chữa ung thư, trị ho cũng đã được mô tả trong sách thuốc chữa của Trung Hoa và trong những công bố gần đây[3]

Chúng tôi xin giới thiệu một số nhóm chất tiêu biểu mới được phát hiện trong những năm gần đây từ một số thực vật thuộc chi prunus

1.2.1- Một số hợp chất tritecpenoit

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về loài prunus africana

Từ những năm 1995, phòng thí nghiệm trường đại hoc Pari XI (Pháp) đã công bố tìm ra một số hợp chất thuộc nhóm tritecpenoit trong đó có một hợp chất mới là 24-O-trans-ferulyl-2α,3α- dihydroxy-urs -12-en- 28-oic axit, có cấu trúc như sau: [11]

Tháng 12 năm 2001 các nhà khoa học Masayoshi, Nakayama, Tsukuba,

hợp chất với 40 chất khác nhau đều đƣợc phân lập từ Prunus persica[17]

51 R1=H, R2=H 55 R1=OCH2OCH3, R2=OH

52 R1,R2=OCH2OCH3 56 R1=OCH2OCH3, R2= R1=OCH2OCH3

53 R1=OCH2OCH3, R2=OH

54 R1=OH, R2=OH

1.2.3- Các hợp chất secquiterpen

khoa học thực vật trường đại học Rutgers Mỹ đã tìm thấy một secquiterpen mới

có trong vỏ thân của loài thực vật này mà cấu trúc của nó khác với các

secquirtecpen lacton đã được biết họ gọi là amygdalactone [14],[21]

1.2.4- Hợp chất điterpen

Cũng từ loài Prunus amygdalus Shengmin Sang, Guolin Li, Shiying Tian

[20]

O

O O

H

OH HO

H H H

HO

58

1.2.5- Các hợp chất flavonoit

Tháng 12 năm 1996, Viện nghiên cứu trường Đại học khoa học Lausanne

trúc của một số hợp chất từ prunus prostrata là 7-metoxy(+)-catechin và một số

antoxyanidin, công thức cấu tạo của chúng đã được thiết lập bởi các phương pháp quang phổ [9],[18]

59 60

7- Metoxi-(+)-catechin Epicatechin

65 Ent-epiafzelechin (2α-O-7,4α-8) afzelechin

66 Ent-epiafzelechin (2α-O-7,4α-8) catechin

Năm 2009 từ loài prunus avium khi nghiên cứu về thành phần hóa học của phần thân và nhân hạt cây Prunus avium các nhà hóa học trường đại học

Hamilton (Canada) đã công bố cấu trúc của một số hợp chất thuộc nhóm

chalcone (X=OH) (+/-)-Naringenin 7-Hydroxyflavan

Đặc biệt khi nghiên cứu vỏ thân của loài cây này trong metanol và

clorofom người ta thấy kết quả nghiên cứu phổ có thể cho kết luận về một số hợp

76 Tectochrysin

Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu thực vật trong dung môi clorofoc và metanol của

Prunus avium (Trường ĐH Haminton-Canada)

1.3- TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT PRUNUS ZIPPELIANA

Loài thực vật Prunus zippeliana trên thế gới cũng đã có một số công trình

nghiên cứu về hóa thực vật Tên của thực vật này được công bố vào năm 1958,

được chú ý đến trong một số năm gần đây [1] Theo thống kê của ARS về hệ thống phân loại thực vật học trên thế giới được cập nhật vào ngày 13 tháng 10

năm 2004, từ năm 1960 ở Ấn Độ người ta đã tìm thấy một số loài của chi Prunus zippeliana ban đầu có tên là Pygeum đến năm 1985 thực vật này đã có tên trong “

Tuyển tập thực vật- Hệ thực vật Ấn Độ” [10]

Năm 1976, loài thực vật này được tìm thấy ở Okinawa và quần đảo Ryukyu phía nam Nhật Bản và được ghi tên vào danh mục hệ thực vật của Nhật Bản, tiếp sau đó khoảng những năm 1986, người Trung Quốc cũng phát hiện ra

một số công dụng Y học của loài thực Prunus zippeliana với rất nhiều loài khác

Về thành phần hoá học, gần đây, một số nhà hóa học của Viện nghiên cứu thực vật Anh đã nghiên cứu và công bố một số chất hóa học có trong thành phần

của lá cây tươi Prunus zippeliana gồm: 22-dehydroclerosteryl acetate,

stigmasteryl acetate, β-sitosterol, stigmasterol, clerosterol, 22-dehydroclerosterol, β-sitosterol và stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside, ursolic acid, oleanolic acid, 2α-hydroxyursolic acid, tormentic acid, methyl linolate, phytol, prunasin,

(β-sitosterol và stigmasterol) và 24β-ethylsterols (clerosterol và 22 dehydrochosterol-) [11]

Kitaijma và Tanaka (1993) đã tách được hydroxy-phenylacetic acid

O O

OH

H

OH H

H

H

OH H

OH

COOH

OH

83

của thực vật chi Prunus và cũng có trong cây Prunus zippelianna.[10]

1.4- GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY TÀO ĐÔNG

chữa bệnh về cơ, xương, khớp của người dân địa phương miền núi phía Bắc, có

tên khoa học là Prunus zippeliana var.crasistyla (Card )J.E.Vid thuộc họ hoa

hồng (Rosaceae), bộ Amygdaleae, chi Prunus Cây tào đông còn gọi là cây vàng nương vòi mập, cây đào rừng, cây đào chịa, cây tào phia, cây chạ đào [1] được phân bố nhiều nhất ở các tỉnh miền núi phía Bắc nước ta, đặc biệt là ở các tỉnh Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Thái Nguyên và nhiều tỉnh miền núi Tây Bắc

nước ta

1.4.1- Mô tả cây Tào đông

mọc so le, cuống lá ngắn, lá thường dài từ 5-7cm, rộng từ 3-5cm, có 2 loại đỏ và trắng Loại đỏ lá non và ngọn hồng tím, loại trắng và tất cả lá và ngọn đều xanh,

rễ cũng cứng hơn, mọc bám theo vách đá hoặc chui xuống dưới đất Loại rễ đi nổi trên mặt đất thì rất cứng, loại rễ chìm thì mềm hơn, vỏ rễ mềm hơn Kinh nghiệm cho thấy sử dụng các loại rễ chìm cho hiệu quả tốt hơn cả mà lại dễ sử dụng.[7]

Hình 1.1: Cây tào đông Hình 1.2: Thân cây tào đông

Hình 1.3: Lá cây tào đông

1.4.2 – Đặc điểm phân bố

Ở nước ta, cây tào đông là loại cây mọc hoang trên những dãy núi đá, hay mọc ở khu vực miền núi phía Bắc đặc biệt ở các huyện vùng cao thuộc tỉnh Bắc Kạn như Yên Cư, Hòa Mục, Tân Sơn (Chợ Mới), Sỹ Bình, Vũ Muộn (Bạch Thông), Côn Minh, Cư Lễ (Na Rì), Nam Cường, Bản Thi (Chợ Đồn) Riêng

thác quá mức nên nguồn dược liệu tự nhiên này cũng dần bị cạn kiệt vì vậy

cơ sở sản xuất thuốc Đông y [3]

1.4.3 Thành phần hóa học

Từ dịch triết Metanol Tào đông một số flavonoit cũng được xác nhận như quecetin và quecetin – O – β – glucopyranozit, gennistin, các hợp chất này có hoạt tính chống ôxi hóa như đã được công bố, anthocyanin, saponin, steroid và tanin Một điều lí thú là trong các mẫu Tào đông thương mại một hàm lượng cao dược liệu thay đổi khá lớn có thể lên tới hai lần Điều này cho thấy càn thiết phải chuyển hóa dược liệu nhằm đề xuất việc thu hái loại cây này một cách thích hợp, để thu được cao dược liệu có hàm lượng cao nhất Cây Tào đông cũng đã được một cơ sở chữa bệnh của Hội Dược liệu triển khai thí nghiệm lâm sàng chữa một số bệnh có kết quả (Trên 50% bệnh nhân cho kết quả khả quan).Việc phát hiện các hợp chất trên cho phép giải thích được phần nào ứng dụng của cây Tào đông trong y học cổ truyền của Bắc Cạn [3]

1.4.4 Tác dụng dược lý

Tào đông là một cây thuốc mà người dân tộc ở một số vùng và một số thầy thuốc sử dụng dưới dạng sắc hoặc ngâm rượu uống để chữa viêm khớp, đau lưng Một vị thuốc mà bệnh viện Y học cổ truyền Tỉnh Bắc Cạn đã sử dụng nhiều năm nay để điều trị các chứng bệnh đau lưng, đau khớp và viêm đa khớp nên trong

chương trình của Bác sĩ Chinh ưu tiên cho việc xác định giá trị của cây thuốc, tác dụng của vị thuốc theo kinh nghiệm dân gian Trữ lượng sơ bộ và đặc biệt là nghiên cứu hoạt tính sinh học, tác dụng chống viêm, độc tính của vị thuốc, trên

cơ sở đó chứng minh cho kinh nghiệm dân gian trong việc sử dụng cây thuốc này

để điều trị các bệnh về khớp

Kết quả của Bác sĩ Chinh được ghi nhận như sau: Dung dịch vị thuốc Tào đông dùng chống viêm cấp trên thí nghiệm gây phù bàn chân chuột kết quả chống viêm này phù hợp với kinh nghiệm của dân gian đã sử dụng để chữa các trường hợp thấp khớp sưng nóng đỏ

Độc tính: Độc tính thấp, LD50 là 31,5g/kg cân nặng [3]

1.4.5 Đặc điểm thu hoạch và chế biến

Bộ phận được dùng để làm thuốc là rễ, có thể thu hoạch quanh năm Theo kinh nghiệm của nhân dân, rễ cây tào đông được đào về được rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô ở chỗ dâm mát trước khi đem sử dụng, việc sử dụng thì tùy từng mục đích chữa bệnh khác nhau mà phối hợp với các vị thuốc khác.[3]

1.5 MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG

Theo một số nghiên cứu gần đây, cây tào đông là một trong những vị thuốc có giá trị chữa bệnh cao Các tỉnh miền núi vận động đồng bào các dân tộc trồng cây tào đông nhằm góp phần phủ xanh đất trống đồi trọc, hạn chế xói mòn chống lũ lụt, lấy gỗ để tạo ra các vật gia dụng sản phẩm còn lại là rễ có tác dụng làm thuốc chữa bệnh, kết quả thực nghiệm cho thấy rễ cây tào đông dùng kết hợp với các vị thuốc khác, có thể trị được các bệnh viêm cơ cấp, bong gân, thấp khớp

cấp tính

làm thuốc chữa bệnh đau khớp, đau cột sống và đau dây thần kinh ngoại biên, một số thầy thuốc dân gian dùng làm thuốc kiện cường gân cơ, cường tráng cơ

thể Thông thường người ta lấy rễ đã phơi khô sắc nước uống, liều lượng từ 10 đến 20g/ ngày

Dây cắm, thổ phục linh, dây đau xương Người dân địa phương hay dùng nhất là đem ngâm rượu, cách ngâm như sau: 1 kg rễ cây, 4 lít rượu ngâm trong 1 tuần

chắt lấy rượu rồi lại đổ tiếp 2 lít rượu nữa, ngâm tiếp 1 tuần, trộn lẫn 2 loại rượu này, mỗi ngày uống 2 lần, mỗi lần 30ml sau bữa ăn 1tiếng đồng hồ, ngoài ra có thể dùng rượu này để xoa bóp các khớp đau nhức Phương thuốc này dùng để chữa các trường hợp thấp khớp, viêm đa khớp, đau cột sống thắt lưng [3]

Hiện nay Công ty cổ phần sản xuất thuốc thành phẩm Y học cổ truyền

để sản xuất thuốc xoa bóp, phối hợp với một số cây khác chế biến thành thuốc

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

Cây Tào đông - Prunus zippeliana var.Crasistyla (Card )J.E.Vid có nhiều

tác dụng trong việc điều trị bệnh Theo kinh nghiệm của dân gian, dùng rễ cây

một số lang y còn rễ cây này dùng làm thuốc kiện cường gân cơ, cường tráng cơ thể Về thành phần hóa học của cây này cho đến nay có rất ít kết quả nghiên cứu được công bố

Nhiệm vụ của luận văn là nhận dạng, phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các chất tinh khiết thu được từ rễ cây Tào đông mọc ở vùng núi đất

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu là rễ cây Tào đông Mẫu cây tươi được thu vào tháng 11 năm 2010 tại xã Bản Thi huyện Chợ Đồn tỉnh Bắc Kạn

Mẫu cây dùng để nghiên cứu hoá thực vật đã được PGS TS Lê Ngọc

giám định tên khoa học là Prunus zippeliana var.crasistyla (Card) J.E.Vid họ

của người dân tộc Tày là cây Tào đông, cây Đào rừng, cây Vàng nương vòi mập,

Chạ đào[2],[5],[8]

C trong 15 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát hoặc sấy ở nhiệt độ 500

C - 60 0C tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô được nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với

mất màu

Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được dưới dạng xiro thêm nước vào đến 500ml sau đó chiết lần lượt bằng dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat, metanol

Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500

C dưới áp suất thấp Thu được 3 loại cặn tương ứng n-hexan, etylaxetat và metanol Các cặn thô sẽ được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có

độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch (Bảng 2.1)

Những phần cặn chiết cho phản ứng dương tính với các loại biotest được định hướng là những đối tượng ưu tiên để phân lập các hoạt chất của mẫu cây đem nghiên cứu

Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm

2.1.2 Thử hoạt tính sinh học

Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định đối với các dịch chiết thô được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên, từ kết quả thử hoạt tính sẽ xác định bản chất hoá học của hoạt chất

2.1.3 Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết

Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của rễ cây Tào đông chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí, hòa tan và kết tinh lại trong dung môi thích hợp Các phương pháp gồm:

- Sắc kí cột silicagen, thường dùng silicagen Merck 63- 200nm

- Rửa nhanh bằng dung môi và kết tinh lại

2.1.4 Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất

Các chất phân lập ở dạng tinh khiết được xác định những hằng số vật

lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

13

thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng

2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA)

tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được

Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM

STT Hệ dung môi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu

Các bản SKLM sau khi sấy khô được hiện màu bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol - H2SO4 5%, sau đó sấy trên 1000

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200

dụng mode ESI và đầu dò DAD

- Phổ 1

2.3 CÁC D ỊCH CHIẾT CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết

Mẫu cây tươi sau khi thu hái, rửa sạch được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi hầu như hết màu Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm Cặn dịch chiết metanol sau khi thêm nước được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat phần không hòa tan trong

Chiều dài di chuyển của chất thử

Chiều dài di chuyển của dung môi

Rf =

chiết tương ứng, làm khan bằng Na2SO4 Việc thu nhận các dịch chiết từ rễ cây Tào đông tóm tắt trong sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu rễ cây Tào đông

Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng không

đổi Như vậy, từ rễ cây tào đông Prunus zippeliana var.crasistyla (Card )J.E.Vid, sẽ có 3 loại cặn chiết được ký hiệu là HT, ET, MT

Trong đó:

HT: Cặn chiết n-Hexan của rễ cây Prunus zippeliana var.crasistyla

ET : Cặn chiết EtOAc của rễ cây Prunus zippeliana var.crasistyla

MT : Cặn chiết MeOH của rễ cây Prunus zippeliana var.crasistyla

Kết quả thu nhận các dịch chiết từ rễ cây Prunus zippeliana var.crasistyla

được nêu trong bảng 2.2

Bảng 2.2 : Khối lượng các cặn chiết thu được từ rễ cây Tào đông

(Prunus zippeliana var Crasistyla)

Mẫu tươi

(g)

Mẫu khô (g)

Cặn n-hexan (g)

Cặn EtOAc (g)

Cặn MeOH (g)

C, sau đó cho thêm

1 giọt H2SO4 đậm đặc) Lấy 1ml dịch cloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong một thời gian là phản ứng dương tính

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan

và lọc qua giấy lọc Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin

Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1 Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính

Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin