NGHIÊN cứu PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN nấm BỆNH aspergillus flavus SINH độc tố AFLATOXIN BẰNG KỸ THUẬT PCR

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


    -

LÊ THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ðOÁN

NẤM BỆNH Aspergillus flavus SINH ðỘC TỐ AFLATOXIN

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ

rõ nguồn gốc

Tác giả

Lê Thị Thu Hằng

LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS Phạm

Xuân Hội, người ñã tận tình dạy bảo, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá

trình làm việc cũng như thực hiện nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các cán bộ trong Bộ môn Bệnh Cây ñã tận tình dạy dỗ và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Bộ môn Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô trong Khoa Nông học, Viện ñào tạo Sau ñại học – Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã dạy dỗ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Bộ môn trong thời gian vừa qua

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã nhiệt tình ñộng viên giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn!

Hà N ội, ngày 15 tháng 9 năm 2009

Lê Thị Thu Hằng

2.1 Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp và độc tố

2.4 Các biện pháp chẩn đốn nấm A flavus sinh độc tố Aflatoxin 21

4.1 Kết quả thu thập và phân lập nấm bệnh Aspergillus flavus từ một

4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của nấm bệnh

Aspergillus flavus được phân lập từ một số nơng sản của Việt Nam 42

4.4 Kết quả phân tích bằng phản ứng PCR đặc hiệu với 4 cặp mồi

ver-1, omt-1, nor – 1 và apa-2 49

4.5 Kết quả phân tích bằng phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi

4.6 Các phương pháp khác dùng để chẩn đốn nấm Aspergillus

flavus sinh độc tố Aflatoxin 58

4.6.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng ((Thin layer chromatography) -

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A candidus Aspergillus candidus

A glacus Aspergillus glacus

A flavus Aspergillus flavus

A paraciticus Aspergillus paraciticus

A nomius Aspergillus nomius

A fumigatu s Aspergillus fumigatus

A ochraceus Aspergillus ochraceus

A oryzae Aspergillus oryzae

DANH MỤC BẢNG

2.1 Sự có mặt của A flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ 1967-1983

2.3 Mối quan hệ giữa tỷ lệ ung thư gan với sự hấp thu Aflatoxin vào

2.4 Những quy ñịnh tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và

2.5 Hàm lượng cho phép tối ña của Aflatoxin trong thực phẩm và

3.1 Các chủng nấm A flavus thuần ñược phần lập trên các nông sản

4.1 Số lượng các chủng nấm A flavus thuần thu ñược trên các nông

4.2 So sánh tốc ñộ phát triển (cm) của các chủng nấm A flavus tại

các nông sản khác nhau ở nhiệt ñộ 200C, 280C và 300C 42

4.3 Tốc ñộ phát triển (cm) của các chủng nấm A flavus trên các mẫu

nông sản ñược nuôi cấy trên môi trường PDA, ở nhiệt ñộ 280C 45 4.4 Kết quả kiểm tra chất lượng ADN tổng số sử dụng phương pháp

4.5 Kết quả phản ứng PCR ñặc hiệu với các mẫu nấm A flavus 51 4.6 Tần số bắt cặp của các cặp mồi trong phản ứng PCR ñặc hiệu 52 4.7 Tổng hợp kết quả phản ứng Multiplex PCR với các mẫu nấm

Aspergillus flavus sử dụng cả 4 cặp mồi: Ver - 1 , Omt - 1, Nor – 1

4.8 Tần số bắt cặp của các cặp mồi trong phản ứng Multiplex PCR 56

4.9 So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp dựa

vào màu sắc chủng nấm trên môi trường CAM ñể phát hiện chủng

4.10 So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp sắc

ký lớp mỏng ñể phát hiện chủng nấm A flavus sinh ñộc tố

DANH MỤC HÌNH

2.2 Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link – Cơ quan sinh

sản gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi) 112.3 Mối quan hệ di truyền của một số loài nấm Aspergillus spp 122.4 Hình thái cuống sinh bào tử của nấm A flavus và nấm A oryzae 122.5 Màu sắc khuẩn lạc của các loài nấm Aspergillus spp trên môi

2.8 Sơ ñồ minh hoạ con ñường sinh tổng hợp ñộc tố Aflatoxin B1 ở

4.1A Thu nhận mẫu nấm A flavus từ các mẫu A: Lạc; B: Gạo trên môi

trường PDA ñặc 39

4.1B Thu nhận mẫu nấm A flavus từ các mẫu, A: Ngô; B: ðậu tương

4.2 Hình ảnh thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A flavus quan

4.3 Hình ảnh nấm A flavus ñược phân lập từ các mẫu gạo tại Hà Nội

phát triển trên môi trường PDA (trái) và môi trường Czapek (phải) 414.4 Các chủng nấm ñược bảo quản trong dung dịch glycerol 50%,

4.5 Tốc ñộ phát triển của nấm A flavus tại các ngưỡng nhiệt ñộ

200C, 280C, 300C trên các nông sản sau, A: 4 ngày; B: 6 ngày

4.6 Hình ảnh phát triển của nấm A flavus ñược phân lập từ các mẫu

Ngô tại Thanh Hóa; A: sau 2 ngày ; B: sau 4 ngày nuôi cấy; C:

4.8 Sợi nấm A flavus ñã làm khô dùng làm nguyên liệu cho quá trình

4.9 Hình ảnh ñiện di ADN tổng số trên gel Agarose 1% của các mẫu

nấm A flavus phân lập từ các mẫu nông sản A: ðậu tương; B:

4.10 Sản phẩm PCR ñược nhân lên từ ADN tổng số các chủng

A flavus ñược phân lập từ các mẫu Gạo, phân tích trên gel

Agarose 1% với các cặp mồi: A: mồi ver-1; B: mồi omt-1; C:

4.11 Mật ñộ xuất hiện của ba, hai và một gen trong phản ứng PCR

ñặc hiệu với các cặp mồi riêng rẽ, sử dụng khuôn là các mẫu

4.12 Hình ảnh ñiện di sản phẩm khuyếch ñại Multiplex PCR của các

mẫu nấm A flavus phân lập từ các mẫu ðậu tương trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 4: A flavus Hà Nội ; 4 – 8: A flavus

4.13 Hình ảnh ñiện di sản phẩm khuyếch ñại Multiplex PCR của các

mẫu nấm A flavus phân lập từ các mẫu Ngô trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 11: A flavus Thanh Hoá ; 12 – 15: A flavus Hà

4.14 Hình ảnh ñiện di sản phẩm khuyếch ñại Multiplex PCR của các

mẫu nấm A flavus phân lập từ các mẫu Gạo trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 5: A flavus Sơn La ; 6 – 11 : A flavus Hà Nội ;

4.15 Hình ảnh ñiện di sản phẩm khuyếch ñại Multiplex PCR của các

mẫu nấm A flavus phân lập từ các mẫu Lạc trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 5: A flavus Nghệ An ; 6 – 10: A flavus Hà Nội ;

11 – 14: A flavus Hải Dương; 16: ñối chứng A niger chuẩn 54 4.16 Tần số xuất hiện các tổ hợp gen ñược nhân lên trong phản ứng

Multiplex PCR với 4 cặp mồi ñặc hiệu nor-1, ver-1, omt-1 và

4.17 Mầu sắc biểu hiện của nấm Aspergillus flavus trên môi trường

CAM (nước dừa) theo thứ tự: vàng sậm, vàng nhạt và trắng 61 4.18 Hình ảnh quan sát ñộc tố Aflatoxin ñược sinh ra bởi các chủng

4.19 Hình ảnh quan sát ñộc tố Aflatoxin trên bản sắc ký lớp mỏng

1 MỞ ðẦU

Nấm bệnh là một trong những tác nhân gây bệnh chính làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm nơng sản Ngồi ra, nhiều loại nấm cịn sinh ra độc tố mycotoxin làm ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và vật nuơi

Nhĩm nấm sinh độc tố phổ biến nhất là Aspergillus (A flavus, A parasiticus

và A nomius) sản sinh ra Aflatoxin, là độc tố nguy hiểm nhất trong nhĩm độc

tố mycotoxin và là hợp chất cĩ tiềm năng gây ung thư cao nhất [29, 52]

Nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin cĩ phổ hoạt động rất rộng, lây

nhiễm trên nhiều loại nơng sản đặc biệt là ngơ, lạc, bơng, đậu tương, ở hầu hết các nước trên thế giới đặc biệt là các nước cĩ khí hậu nhiệt đới [52]

Phương pháp truyền thống phát hiện nấm Aspergillus sinh độc tố

Aflatoxin chủ yếu dựa vào đặc điểm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang

để lại trên mơi trường đã được cơng bố từ thập kỷ 80 [26] Tuy vậy, phương pháp này cĩ nhược điểm là tốn cơng sức độ chính xác và độ nhạy khơng cao Tiếp theo, phương pháp sắc ký được sử dụng để phát hiện mức độ nhiễm Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) [43]

Ưu điểm của phương pháp này là cĩ thể định lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này lại cĩ nhược điểm là cần phịng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt tiền Gần đây, các phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR và kỹ thuật kháng thể đơn dịng đang được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi do cĩ ưu điểm là phát

hiện nhanh, nhậy, chính xác nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin Ngồi ra, phương pháp PCR cịn cĩ thể phát hiện được chủng nấm Aspergillus lây

nhiễm [40]

Phương pháp chẩn đốn sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết quả

nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin và con đường sinh

tổng hợp Aflatoxin Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất cĩ 20 gen tham gia vào

con đường sinh tổng hợp Aflatoxin, bốn gen quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1

và apa-2 đã được cơng bố trình tự nucleotide và chức năng gen Trình tự

nucleotide của các gen này là cơ sở để sinh tổng hợp các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR sử dụng sợi khuơn là ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc các mẫu xét nghiệm

ðiều kiện thời tiết Việt nam được xem là mơi trường lý tưởng cho sự

sinh trưởng và phát triển của nấm Aspergillus ðiều này dẫn đến hàm lượng

và tỷ lệ nhiễm Aflatoxin trên nơng sản Việt Nam là ở mức cao trong khu vực

và đây là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến giá trị nơng sản xuất khẩu của Việt nam rất thấp Thực tế thì đã cĩ nhiều lơ hàng nơng sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển

các phương pháp chẩn đốn sớm nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin cĩ ý

nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của

nấm Phương pháp phát hiện mầm bệnh nấm Aspergillus sinh độc tố

Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR chưa được nghiên cứu ở Việt nam Với mục tiêu xây dựng phương pháp chẩn đốn sớm, nhanh và nhạy gĩp phần làm giảm

thiểu tác hại của nấm Aspergillus trong sản xuất nơng nghiệp và tăng giá trị

nơng sản xuất khẩu của Việt nam trên thị trường thế giới, chúng tơi tiến hành

nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đốn nấm bệnh

Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR" với các mục

tiêu chính như sau:

- Thu thập và phân lập các chủng nấm A flavus trên một số nơng

sản (lạc, ngơ, đậu tương, gạo)

- Nghiên cứu phương pháp chẩn đốn nấm bệnh A flavus sinh độc tố

Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR để phát hiện tình trạng nhiễm Aflatoxin trên nơng sản

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp và ñộc tố

Aflatoxin trên lương thực, thực phẩm

Trong lịch sử ñã từng xảy ra nhiều vụ ngộ ñộc thức ăn gây tử vong cho hàng loạt người và gia súc mà nguyên nhân chính là do ñộc tố của một số chủng vi nấm mà chúng ta gọi là nấm mốc Năm 1924 Shofield và cộng tác ñã phát hiện một loại ñộc tố ñược sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh không tăng bạch cầu (Aleusemic) ở một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc [61]

ðến năm 1960 có một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần ñảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương Tây tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra nguyên nhân gà chết là do sưng to gan, sau xét nghiệm và phân tích ñã xác ñịnh tác nhân gây chết là ñộc tố Aflatoxin

do nấm A flavus tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên thức ăn

xơ gan và trong sữa của những bà mẹ có con bị xơ gan Như vậy, theo ông giữa xơ gan và Aflatoxin có một mối quan hệ khá chặt chẽ với nhau [3]

Ở Thái lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50 – 60% số mẫu ñó có Aflatoxin ðồng thời nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia ñình (lấy mẫu lương thực thực phẩm tại các gia ñình) cũng thấy có 30 – 50% số mẫu có ñộc tố Aflatoxin Payet và cs (1966) cho biết ở Xênêgan nhiều trẻ em dưới 1 năm tuổi ñược ăn 70-140 g lạc/ngày trong 10 tháng liền ñể ñiều trị bệnh Kwashuovkov Những mẫu lạc này sau ñó phát hiện có chứa 500 – 1000 ppb Aflatoxin B1 Như vậy trung bình một ngày một trẻ em ñã phải ăn từ 35 – 140 ppb Hai ñứa trẻ trong số này mắc bệnh gan sau 4 – 6 năm Những người công nhân làm việc trong dây chuyền chế biến lạc có thể nhiễm Aflatoxin qua hô hấp Một kỹ sư hóa chất phụ trách khâu hấp tiệt trùng bột lạc bị chết và ñã phát hiện ñược Aflatoxin B1 trong tế bào phổi [22]

Ở Hà Lan, những công nhân làm việc ở nhà máy ép dầu lạc có thể tiếp nhận từ 0,039 ppb tới 2,5 ppb Aflatoxin trong một tuần lễ làm việc (Van Nieweenhuize, 1973) Theo Baxter và cs (1981) có sự nguy hiểm khi tiếp xúc với bụi lạc hay các sản phẩm nông nghiệp khác có chứa Aflatoxin, tuy mức

ñộ nguy hiểm chưa ñược xác nhận [1]

Theo thống báo của tổ chức nông lương thế giới (FAO), tổn thất hàng năm ước tính khoảng 12 – 15 % trên toàn thế giới, trong ñó 25% nông sản của toàn thế giới bị nhiễm các ñộc tố nấm mốc Vì vậy, phòng chống ñộc tố nấm mốc là vấn ñề hết sức quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và ñược các nước trên thế giới ñặc biệt quan tâm [3, 4]

Ở Philippin các sản phẩm công nghiệp dùng làm thức ăn như lạc, gạo, ñậu tương và cà phê cũng ñược xác ñịnh là nhiễm A flavus và ñộc tố Aflatoxin ở các mức ñộ khác nhau và ñược thể hiện ở Bảng 2.1 [1]

Bảng 2.1 Sự có mặt của A flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ

Lạc ở trại, bảo quản

trong các chum, kho

Có nhiều chủng nấm mốc tiết ra ñộc tố này (nấm A flavus,

A parasiticus, A nomius ), nhưng A flavus là loài nấm mốc cung cấp những

lượng Aflatoxin lớn nhất, nguy hiểm nhất Ở khắp các vùng Nam Phi, nơi

người ta ăn nhiều lạc có mốc A flavus, tỷ lệ bệnh nhân bị ung thư gan rất cao

A flavus gặp nhiều ở các lương thực, thực phẩm khác nhau, nhưng các loại hạt có dầu (ñặc biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát triển [29, 51] Tác giả (Hiscocks) ñã nghiên cứu hơn 1000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất ñộc – 1kg chứa trên 0,25mg Aflatoxin B1 (ñộc tố chủ yếu

của A flavus) và 21,7% số củ ñộc vừa, 75% số củ không ñộc Còn trên lạc

khô: 42% số mẫu là rất ñộc; 49,3% ñộc vừa và chỉ có 8,7% là không ñộc [3, 4]

Loài nấm sản sinh Aflatoxin là A flavus ñược phân lập từ 13-21% trong các mẫu gạo Những nghiên cứu ở Thái Lan cũng cho thấy A flavus có

mặt trong nhiều loại thực phẩm bán trên thị trường Các chủng sinh Aflatoxin

cũng có trong ñất trồng trọt A flavus ñược phân lập từ 15 trong 50 mẫu ñất ở

Malaysia và 29 trong 106 mẫu ñất ở Thái lan, 16 chủng trong số 44 chủng

phân lập sản sinh Aflatoxin [1, 60] Các trường hợp nhiễm ñộc ở người do ăn phải Aflatoxin có trong thực phẩm, ñặc biệt là ngô nhiễm hàm lượng cao ñáng ñược quan tâm hơn lạc Mặc dù lạc nhiễm Aflatoxin nhiều hơn ngô, nhưng người ta chỉ ăn lạc với lượng nhỏ, trừ một số nước ăn lạc khá phổ biến như Môdambic, Xênêgan, Xuñăng [1, 3]

Những nghiên cứu của Ablas K và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm

Aflatoxin trên ngô do nấm A flavus gây nên là một vấn ñề quan trọng ở các

vùng trồng ngô của ñồng bằng Missisipi của Mỹ Trong 3 năm nghiên cứu từ

2000 ñến 2002, các tác giả ñã nghiên cứu mức nhiễm A flavus trong ñất và

ñã xác ñịnh rằng mức nhiễm A flavus trong ñất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi

các vụ canh tác trước Mật ñộ A flavus cao nhất là 794 CFU/g, trong ñất trồng

ngô vụ 2001 so với 251 CFU/g trong ñất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457

CFU/g ñất trồng lúa mì gối vụ năm 2002 Sự nhiễm A flavus trên ngô hạt

năm 2000 dao ñộng từ 0% ñến 100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng Aflatoxin trong ngô dao ñộng từ 0 ñến 1590 ppb (trung bình là 57ppb) Mức nhiễm Aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ở ngoài ñồng

không tương quan tới sự nhiễm A flavus: 43 ñến 59% có khả năng tạo các chủng A flavus phân lập trong ñất Aflatoxin Với sự nhiễm cao nhất ở quần thể ñất của ngô gối vụ năm 2001 Kết quả cũng cho thấy 84% A flavus phân

lập từ các hạt ngô có khả năng tạo Aflatoxin [24]

Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm Aflatoxin B1 (mức trung bình 400µg/kg), trong khi 40% nhiễm Aflatoxin B1 (mức trung bình 133µg/kg) ñã ñược tìm thấy ở Uganda và 97% ở ñảo Cebu, Philippin trung bình là 213 µg/kg Hàm lượng Aflatoxin ở các mẫu ngô ở gia ñình ñã liên quan tới sự bùng nổ của bệnh gan ñộc tố cấp tính ở tây bắc Ấn ðộ Theo Goto và cộng sự

80 – 85% số mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 –

1985 ở Thái lan ñã nhiễm Aflatoxin B1 với lượng 6,30 – 1310 ppb và 0,6 –

767 ppb theo thứ tự Trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở Mỹ cho thấy 15% của 361 mẫu có Aflatoxin giới hạn từ vết ñến 50 µg/kg Stoloff, Krof và Hald ñã tìm thấy Aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạc nhập vào ðan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465 µg/kg Các Aflatoxin ñã tìm thấy ở 41% của 173 số mẫu lạc ở Sudan, 16 mẫu có trên 250 µg/kg và 9% số mẫu có trên 1000 µg/kg Ở Philippin, tất cả các mẫu lạc ñược kiểm tra năm 1967 – 1969, có Aflatoxin với giá trị 155 µg/kg và giá trị trung bình 500 µg/kg [3, 4]

ðiều kiện thời tiết ở Việt Nam ñược xem là môi trường lý tưởng cho sinh

trưởng và phát triển của nấm mốc nói chung và nấm Aspergillus spp nói riêng Nấm mốc có mặt khắp mọi nơi và thường phát sinh, phát triển trên các

sản phẩm lương thực, thực phẩm…và cả trên hoa quả Bên cạnh việc nấm mốc gây hư hỏng, thối rữa, làm hỏng, giảm chất lượng và giá trị sử dụng còn

có rất nhiều loài nấm mốc tiết ra ñộc tố gây bệnh cho con người Chính vì tác

hại của ñộc tố này gây nên với con người nên nhiều nước phát triển trên thế giới như: Mỹ, Nhật Bản, các nước EU,…khi nhập lương thực, thực phẩm như: ngô, lạc, cà phê, chè,…ñã ñưa ra khung giới hạn về hàm lượng về Aflatoxin phải ở dưới mức cho phép Thực tế thì ñã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, ñậu tương ñã bị trả lại do phát hiện ñộ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện

sớm và nhanh nấm Aspergillus spp sinh ñộc tố Aflatoxin ñang ñược ñặc biệt

quan tâm nghiên cứu Mức ñộ nhiễm Aflatoxin trên ngô và một số tỉnh miền Nam và Bắc Việt nam cho thấy tần xuất nhiễm Aflatoxin giao ñộng từ 73,3% ñến 95,8% trong ñó hàm lượng Aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm lượng Aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25 ppb ñối với các tỉnh khác nhau [3, 4 ]

Ở Việt Nam, ðậu Ngọc Hào và các cộng sự ñã nghiên cứu mức ñộ

nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa Kết quả phân tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này ñã

bị nhiễm A flavus với tần số cao, từ 50 - 80 % Các loài khác như A glacus,

A fumigatus và A candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao Loài A ochraceus

ñã ñược phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp Các loài thuộc chi Fusarium ñã nhiễm với tần suất 15% Kết quả nghiên cứu mức nhiễm Aflatoxin những mẫu ngô trên ñã cho thấy 33% số mẫu ngô hạt ñã bị nhiễm Aflatoxin B1 từ 10 - 40 ppb,

83 % số mẫu bị nhiễm Aflatoxin B2 từ 10 - 20 ppb, 72% mẫu ngô bột ñã bị nhiễm Aflatoxin B1 từ 25 - 250 ppb ; 9,5% số mẫu ngô bị nhiễm Aflatoxin B2

từ 10 - 20 ppb [1, 3]

2.2 Sơ lược về các loài nấm Aspergillus spp

A flavus, A.parasiticus, A nomius là ba loài nấm trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển tiết ra ñộc tố Aflatoxin cả trên môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy nhân tạo, ba loài nấm này thuộc họ nấm cúc ðây là các loài nấm khá phổ biến, có thể tìm thấy trên khắp ñịa cầu, ñặc biệt

là các nước nhiệt ñới Bào tử của nấm A flavus có khả năng phát tán trong

không khí, trong nước, trong ñất ðặc biệt khi gặp ñiều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn

nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn Nấm A flavus có thể ký sinh,

gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn Trên một số loại hạt làm thực phẩm như: lạc, ñậu, vừng, vv… Trên thực phẩm như: các sản phẩm chế biến

từ ngũ cốc, lạc, vừng, ñậu ñỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị bầm dập như: thanh long, nhãn, xoài, vải,….[12, 57]

Hình 2.1 cho thấy chu kỳ của nấm A flavus trên ngô vàng Các loài

nấm sống qua mùa ñông thường hoặc là hệ sợi nấm hoặc là có cấu trúc kháng như hạch nấm (sclerotia) Hạch nấm hoặc là sinh thêm các bào tử sợi nấm

(hyphae) hoặc sinh ra bào tử ñính (conidia) hay bào tử thể vô tính, chính ñiều này sẽ phát tán ra ngoài môi trường, ra ñất và không khí Các bào tử mang ñến các cây ngô nhờ côn trùng hoặc nhờ gió, rồi từ ñó nhiễm nấm trên ngô và gây hại [63]

Hình 2.1 Chu kỳ của nấm A flavus trên ngô vàng [63]

2.2.1 Hình thái học nấm A flavus và nấm A paraciticus

Trong tự nhiên, có thể dễ dàng phân biệt ñược loài nấm này do chúng

có màu sắc dễ nhận Màu vàng lục hay màu xanh lục của ñám bào tử khi chín bám trên các mầm của hạt hoặc phát triển trên các kẽ giữa hai phiến của hạt, khi tách ra có thể nhìn thấy rất rõ Ở các khe giữa hạt lạc hay lớp mầm của hạt ngô bị mốc có thể quan sát thấy bào tử Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, trên thạch Sabouraud hay Czapek Doc hình thành khuẩn lạc sau 24 giờ, khu vực trung tâm có màu vàng nhạt, rìa mép màu trắng mịn Sau 48 giờ hình

thành nhiều bào tử miền trung tâm, xuất hiện các khối bào tử chin, màu vàng nhạt ựã chuyển sang màu vàng lục Từ 72 Ờ 96 giờ, khuẩn lạc phát triển mạnh

và ựạt cực ựại ở ngày thứ 6 Ờ 7 khi nuôi cấy ở nhiệt ựộ phòng Khuẩn lạc có kắch thước tới 4 Ờ 5 cm, hình thành nhiều vòng tròn ựồng tâm ựều ựặn, thường có 5 Ờ 6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc, rất dễ phân biệt với nhiều loại nấm mốc khác Quan sát ựặc ựiểm vi thể dưới kắnh hiển vi

ở bội số thấp (X16) cũng có thể phân biệt ựược do cơ quan sinh sản của loại nấm này rất phong phú Cơ quan sinh sản có hình hoa cúc Bọng tròn có kắch thước từ 25 Ờ 45 ộm, giá conidi (conidiophores) (cuống sinh bào tử) mọc thẳng từ sợi xù xì có kắch thước từ 400 Ờ 1000 ộm; rộng 5 Ờ 15 ộm Bào tử trần (conidi) hình tròn hoặc hình ovan, có ựường kắnh từ 2 Ờ 4 ộm Thể bình

có hai lớp, kắch thước từ 10 Ờ 15 ộm và 3 Ờ 5 ộm, ựôi khi chỉ có 1 lớp [1, 12]

2.2.2 Phân biệt A flavus trong nhóm A flavus oryzae

Trong nhóm A flavus oryzae có 5 loài gồm A oryzae Cohn, A flavus Link, A parasiticus Speare, A micro virido citrinus Constantin Lucet, và A

effuses Tiraboschi Cả 5 loài này rất dễ nhầm lẫn với nhau về hình thái học, về

màu sắc ựiển hình trên môi trường nuôi cấy: loài A oryzae Cohn ựược sử

dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men ựậu tương, trong công nghiệp sản xuất các men (enzym) phục vụ cho công nghiệp lên men rượu bia, sản xuất thức ăn chăn nuôi, do vậy cần phải ựược phân biệt ựể tránh nhầm lẫn với hai

loài A flavus và A parasiticus sản sinh ựộc tố Aflatoxin Cả 5 loài này rất phổ biến trên phạm vi toàn thế giới và chiếm phần ựông trong họ Aspergillus

Chúng ựược biết ựến do sự có mặt ở nhiều loại cơ chất khác nhau Trong công nghiệp lên men của các nước phương đông: ngũ cốc, sản phẩm chế biến từ lương thực như bánh mì, mì sợi, hàng hoá làm bằng da, thịt, sản phẩm từ trứng, sữa, ựậu tương, nước hoa quả, rau quả, hàng dệt, giấy, từ côn trùng, phân rác, từ phổi của chim, từ ruột của bệnh nhânẦ Chúng còn có thể tìm

thấy trong ựất, ựặc biệt vùng ựất ẩm, nóng ở các vùng nhiệt ựới và á nhiệt ựới Các loài này rất khác nhau về hình thái, màu sắc, trên môi trường nuôi cấy và quan sát trên kắnh hiển vi về cơ quan sinh bào tử Sự khác nhau liên quan tới nguồn gốc thu thập mẫu phân lập chúng Mẫu phân lập từ ựất cho thấy các bọng bào tử có màu xanh vàng và có cuống bào tử ngắn Các chủng phân lập

từ gạo ở vùng phương đông thấy bọng có màu vàng nhạt, giá bào tử dài (cuống sinh bào tử), vách mỏng [1, 12] Tuy nhiên, nhóm này cũng có những ựặc ựiểm chung là:

- Màu sắc khuẩn lạc khác nhau từ màu xanh lục tới màu xanh vàng ựậm

- Cuống bào tử thô ráp không màu sắc

- đầu hình bán cầu, hình cột hay gần hình cầu

- Thể bình một lớp hay hai lớp, thường khác nhau ngay trên một bọng

- Bọng khác nhau về hình dạng từ bán cầu tới hình vòm trên các ựầu nhỏ

và hình cầu trên các ựầu lớn

- Bào tử thô khác nhau về màu sắc

- Hạch nấm có trong nhiều chủng, màu nâu xám tới màu ựen

Hình 2.2 Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link Ờ Cơ quan sinh sản gồm:

bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi)

Hình 2.3 Mối quan hệ di truyền của một số loài nấm Aspergillus spp

Hình 2.4 Hình thái cuống sinh bào tử của nấm A flavus và nấm A oryzae

Aspergillus flavus Aspergillus Oryzae Aspergillus fumigatus Aspergillus niger

Hình 2.5 Màu sắc khuẩn lạc của các loài nấm Aspergillus spp trên môi trường nuôi cấy

(PDA)

A flavus

B

Nấm A flavus, A parasiticus thường nhầm lẫn với loài A oryzae trong

sử dụng (chúng có hình thái, cấu tạo và mối quan hệ di truyền rất gần nhau), như có mầu khuẩn lạc xanh nhạt, cuống sinh bào tử không mầu, lớn như nhau, ñầu thể bình lưỡng tính hoặc ñơn tính, bào tử hình cầu nhỏ Vì vậy, chúng ta cần phải kết hợp cả việc quan sát mầu sắc khuẩn lạc trong quá trình phân lập, nuôi cấy và hình ảnh cuống sinh bào tử khi soi kính hiển vi ñể tránh nhầm lẫn

khi phát hiện các loại nấm này (A flavus có kích thước cuống sinh bào tử

(0,4 – 1mm) trong khi ñó A oryzae là (1 – 2 mm))

2.3 Những ñặc tính của ñộc tố Aflatoxin

2.3.1 Tính chất vật lý, hoá học của Aflatoxin

Aflatoxin là ñộc tố chính ñược tiết ra chủ yếu bởi một số loài nấm

Aspergillus spp Các Aflatoxin ñược cấu tạo gồm bốn hợp chất của nhóm

bis-furanocouramin, là sản phẩm trao ñổi chất tạo bởi nấm A flavus và A

parasiticus Hiện có khoảng trên 16 loại ñộc tố Aflatoxin ñã ñược tìm thấy, có

kí hiệu B1, B2, G1, G2, M1, M2, P1, Q1, ñược phân biệt trên ñặc tính lý hóa và ñộc tính của chúng [1]

Các Aflatoxin B1, B2 và G1, G2 ñã ñược nhiều phòng nghiên cứu xác ñịnh cấu trúc hoá học Thoạt ñầu các nhà hoá học ñã xác ñịnh có hai Aflatoxin có công thức C17H12O6 và C17H12O7 với trọng lượng phân tử tương ứng là 312 và 328 Hiện nay hai ñộc tố ñược biết là Aflatoxin B1 và G1 Trong cấu trúc phân tử có các nhóm lacton và metoxyl, không có nhóm hydroxyl tự

do Các hợp chất trên ñược phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng B

là viết tắt của chữ Blue (xanh lam) và G là viết tắt của chữ Green (xanh lá cây) Aflatoxin G1 có chứa 2 vòng lacton, Aflatoxin B1 – 1 vòng lacton Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử Aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm, ñặc tính này giữ vai trò quan trọng trong mọi quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng

Aflatoxin của các sản phẩm, mặc dầu sự có mặt của protein, pH, và thời gian

xử lý có thể làm thay ñổi các kết quả Tuy nhiên, nếu chỉ xử lý kiềm nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng diễn ra theo chiều ngược lại ñể tạo Aflatoxin ban ñầu [1, 2]

Hình 2.6 Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977)

Sau ñó, hai Aflatoxin B2 và G2 cũng ñược phát hiện Chúng có công thức hoá học hoàn toàn giống với Aflatoxin B1 và G1, chỉ khác là nối ñôi trong vòng hydrofuran ñã bị khử Sự khác biệt về cấu trúc hóa học giữa các ñộc tố này là không lớn nhưng ñộc tính của chúng thì khác nhau rất lớn Ví dụ như ñộc tố B1 và G1 có ñộc tính cao nhất và cao hơn nhiều lần so với B2 và G2 Trong các loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường ñược tìm thấy ở nồng ñộ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi ñó B2 và G2 tồn tại ở nồng ñộ thấp hơn

Năm 1966 Dutton và Heathcote ñã phát hiện thấy trong môi trường nuôi cấy hai dẫn xuất hydroxi – 2 của Aflatoxin B2 và Aflatoxin G2 là Aflatoxin B2a và Aflatoxin G2a Allcroft và Carnaghan ñã nhận thấy trong sữa

và thịt bò cũng có các dẫn chất của Aflatoxin B1 và B2 ñược ñặt tên là Aflatoxin M1 và M2 (Milk) Cả hai chất này ñều bắt màu huỳnh quang màu xanh tím Ở gan, thận và nước tiểu của cừu cũng tìm ñược hợp chất như vậy Theo Dalezios và Wogan, trong nước tiểu của khỉ có Aflatoxin P1, dẫn chất của Aflatoxin B1 Các ñộc tố Aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím, sóng dài ðiều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng ñộ cực kỳ thấp (0,5 ng hay thấp hơn trên một vết ở sắc ký bản mỏng) Nó cung cấp cơ

sở quan trọng về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp hóa lý về phát hiện và ñịnh lượng ñộc tố này [17]

Các Aflatoxin hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như chloroform và metanol và ñặc biệt ở dimetyl sulfoit (dung môi thường ñược

sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các Aflatoxin vào ñộng vật thực nghiệm) Tính tan của Aflatoxin trong nước giao ñộng từ 10 - 20 mg/l

Mặt khác, Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt ñộ cao, khi ñược làm nóng trong không khí Với mẫu lạc nhiễm nấm bệnh, khi rang ñến

1500C tuy các bào tử nấm ñã bị tiêu diệt nhưng không hoàn toàn loại bỏ

ñược ñộc tố Các Aflatoxin trong các dung môi chloroform và benzen bền vững trong nhiều năm nếu ñược giữ trong chỗ tối và lạnh Các Aflatoxin ít hoặc không bị phá hủy dưới ñiều kiện nấu bình thường và làm nóng khí thanh trùng

Bảng 2.2 Tính chất lý hóa của các Aflatoxin Aflatoxin Công thức ðiểm nóng chảy Huỳnh quang

Hấp thụ tia

UV trong EtOH

ðộ quay

cực quang học

Aflatoxin B1 C17H12O6 268 – 269 Xanh lam 223,265 và 362 -5580C Aflatoxin B2 C17H14O6 286 – 289 Xanh

tím

226,265

và 357 -2800C Aflatoxin M2 C17H14O7 293 Xanh tím 221,264 và 357 -

2.3.2 Tính gây ñộc của Aflatoxin

Thông thường, ngộ ñộc Aflatoxin cấp tính ít khi gây chết người Song trường hợp ăn phải Aflatoxin trực tiếp từ lạc, ngô hay gián tiếp qua thực phẩm rất ñáng ñược quan tâm, vì nhiễm Aflatoxin có thể gây bệnh ung thư gan ở người Báo cáo của Saito (1976) về sự có mặt của ñộc tố nấm mốc trong thực phẩm có liên quan ñến bệnh ung thư gan ở Malaysia và Thái Lan cho biết, các trường hợp ung thư gan ở Thái Lan cao hơn ở Nhật Khả năng gây ung thư của Aflatoxin ñã ñược Wogan nghiên cứu và ñược IARC ñánh giá Ở mức ñộ

tế bào, việc cho uống Aflatoxin với liều khác nhau ñã nhanh chóng ức chế rõ ràng enzym ADN polymeraza và ARN polymeraza ở gan, các ñáp ứng tương

tự ựã ựược quan sát ở việc nuôi cấy tế bào người và ựộng vật Khi cho các Aflatoxin uống qua ựường miệng, chủ yếu là B1 ựã gây ung thư ở tất cả các loài ựộng vật nghiên cứu [3, 24]

Tắnh gây quái thai: Elis và Dipaolo ựã chứng minh rằng việc tiêm

Aflatoxin B1 vào chuột theo ựường vào bụng với liều 4ộg/kg thể trọng, ựã gây cho thai chuột bị tật hoặc chết

Tắnh gây ựột biến: Aflatoxin B1 gây ra sự khác thường ở nhiễm sắc

thể như các ựoạn nhiễm sắc thể có cầu nối ở ựôi chỗ, các cầu nhiễm sắc tử, sự ựứt ựoạn ADN ở các tế bào ựộng vật và thực vật Aflatoxin cũng gây ựột biến gen ở các vi khuẩn nghiên cứu, khi hoạt hoá các chế phẩm microsom từ gan chuột và gan người

Các tác dụng ở người: Aflatoxin ựã ựược tìm thấy trên các loại nông

sản như ngô, lạc, cà phê, lúa mì, ựại mạch, gạo, chè, ca cao, các loại thức ăn gia súc ở hầu hết các nước Châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Nepan, Philipin, Indonesia, Ấn độ, một số nước ở châu Mỹ như Hoa Kỳ, Braxin và các nước châu Phi [3, 4]

Các số liệu nghiên cứu về các vùng dân cư khác nhau ở các nước khác nhau trên thế giới cho thấy nồng ựộ Aflatoxin thực tế ở thức ăn ựã liên quan tới tai biến ung thư gan ở vùng ựó Tỷ lệ này dao ựộng từ 3,5 Ờ 22,1 ộg/kg trọng lượng cơ thể trong 1 ngày và gây tai biến gây ung thư dao ựộng từ 1,2 Ờ

13 triệu trên 105 dân trong 1 năm Bệnh Aflatoxin cấp tắnh ắt ựược thông báo,

có lẽ không ựược thường xuyên theo dõi có thể kể ựến trường hợp 3 trẻ em ở đài Loan và một trẻ em ở Uganda bị hoại tử gan cấp tắnh liên quan tới việc ăn phải gạo và sắn nhiễm Aflatoxin ở liều 200 ộg/kg và 1700 ộg/kg là bằng chứng có tắnh thuyết phục nhất về sự liên quan giữa Aflatoxin với bệnh gan cấp tắnh Ở vùng Tây Bắc Ấn độ năm 1994, trong 1 vụ dịch, vài trăm dân

làng ñã ăn ngô bị nhiễm Aflatoxin ở mức 15 µg/kg có dấu hiệu bị ngộ ñộc và

trên 100 người bị chết

Nhóm nghiên cứu về các vùng dân cư ở các nước khác nhau trên thế giới cho thấy các nồng ñộ Aflatoxin gặp trong thức ăn có liên quan ñến hiện tượng tai biến ung thư gan (Bảng 2.3)

Bảng 2.3 Mối quan hệ giữa tỷ lệ ung thư gan với sự hấp thu Aflatoxin

vào cơ thể

Vùng Tỷ lệ ung thư gan (tỷ lệ

người chết / 10 5 người)

Aflatoxin nhận vào (mg/kg/người/ngày)

Nói chung, các chất này tác ñộng lên gan theo trình tự như sau: ñầu tiên

là hoại tử nhu mô gan, tăng sinh biểu mô, sau ñó là xâm nhiễm tế bào lympho nhằm chống ñỡ tạm thời, rồi tiến ñến xơ gan, nếu thời gian kéo dài sẽ dẫn ñến ung thư gan Nhưng thực chất Aflatoxin không gây ung thư mà do nó gắn vào một enzym dẫn ñến ung thư, khả năng này phụ thuộc vào sự tồn tại của nhân

dihydrouran và phần 5’-lacton chứa nó, do ñó nó ñổi phần tận cùng difuran quan trọng trong tính ñộc và tính gây ñộc Chính vì vậy mà Aflatoxin B1 bao giờ cũng gây ung thư mạnh hơn B2 và G2 (do B2 không có nối ñôi giữa vị trí

C13 và C14 nên kém ñộc hơn)

Mặt khác, ñộc tố Aflatoxin còn ñược coi là nguyên nhân gây dị ứng (một trong những vấn ñề ñược chú ý rất nhiều trong lĩnh vực xã hội học và y

tế ngày nay), gây dị tật thai ñối với người phụ nữ ñang mang thai [1,2]

Hình 2.7 Tỷ lệ ung thư gan trên 100.000 dân, (2002) [64]

2.3.3 Giới hạn hàm lượng Aflatoxin cho phép sử dụng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Các tổ chức quốc tế như: Tổ chức Nông nghiệp và thực phẩm Thế giới (FAO), Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO), khối thị trường chung Châu Âu (EU), các nước trên phạm vi thế giới ñều ñưa ra những giới hạn cho phép sự có mặt của Aflatoxin trong lương thực, thực phẩm dùng cho người và gia súc

Người ta quan tâm ñến nhiễm ñộc Aflatoxin trong chăn nuôi không chỉ

vì Aflatoxin làm thiệt hại vì kinh tế cho người chăn nuôi ñơn thuần mà còn do

sự tồn dư của chất ñộc này trong sản phẩm vật nuôi, ñặc biệt ñược chú ý ñối với bò sữa Nếu trong sữa có Aflatoxin thì rất nguy hại cho trẻ em vì cơ thể chưa trưởng thành, kể cả gia súc non và trẻ em ñều rất mẫn cảm với Aflatoxin ðể ñảm bảo ñược an toàn cho vật nuôi và sức khỏe người tiêu dùng, các nhà khoa học ñã tìm cách xác ñịnh giới hạn an toàn hay an toàn tối thiểu [1, 2]

Bảng 2.4 Những quy ñịnh tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và

nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam

Nguyên liệu Lượng Aflatoxin B 1 tối ña

(ppb)

Tổng số Aflatoxin B 1 + B 2 + G 1 + G 2 (ppb)

Bảng 2.5 Hàm lượng cho phép tối đa của Aflatoxin trong thực phẩm và

thức ăn chăn nuơi

Tên nước Thực phẩm và thức ăn chăn nuơi Hàm lượng

20bCác sản phẩm lạc cho người tiêu dùng 15b

Chú thích: a- Aflatoxin B 1 ; b- T ổng số 4 loại Aflatoxin

2.4 Các biện pháp chẩn đốn nấm A flavus sinh độc tố Aflatoxin

Việc phát hiện Aflatoxin trong nhiều loại nơng sản cả trên đồng ruộng lẫn trong bảo quản đã thúc đẩy các nỗ lực trên tồn Thế giới nhằm phát triển các phương pháp phát hiện hợp chất này

2.4.1 Phương pháp truyền thống

ðể phát hiện nấm Aspergillus spp sinh ñộc tố Aflatoxin dựa vào ñặc ñiểm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang ñể lại trên môi trường ñã ñược công bố từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước [26] Phương pháp này có nhược ñiểm

là tốn nhiều thời gian, công sức và ñộ nhạy không cao, thậm chí nhiều khi sự nhầm lẫn có thể rất nguy hiểm

Arseculeratne và cs (1969) sử dụng môi trường CAM (Coconut agar

media) – là môi trường rất tốt cho việc sản xuất Aflatoxin của nấm A flavus Chủng nấm A flavus sau khi ñược cấy lên môi trường CAM, ñể ở nhiệt ñộ

280 C, khoảng 30 – 40 ngày, kết hợp cả xem xét màu sắc chủng nấm lên môi trường và dưới ñèn UV ñể phát hiện chủng nấm sinh ñộc tố Tuy nhiên, phương pháp này rất mất thời gian [20, 45]

2.4.2 Phương pháp vật lý hóa học

Hiện nay, các phòng thí nghiệm ñang sử dụng các phương pháp sắc ký

ñể phát hiện nấm Aspergillus sinh ñộc tố Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) [43] Ưu ñiểm của phương pháp này

là có thể ñịnh lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này lại có nhược ñiểm là cần phòng thí nghiệm ñược trang bị các máy chuyên dụng ñắt tiền

* Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography-TLC)

Phương pháp sắc ký lớp mỏng ñược sử dụng rộng rãi ñể xác ñịnh, ñịnh lượng Aflatoxin lần ñầu tiên vào những năm 1960 (Coomes et al, 1964, 1965) Thủ tục phân tích sử dụng các bản ñược tráng bởi Silica gel Dung môi

sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là Chloroform: methanol và Chloroform: axeton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan Aflatoxin Hệ dung môi gồm: nước: axeton: chloroform (1,5: 12: 88) ñược ñánh giá là có khả năng hòa tan Aflatoxin tốt nhất Các bản mỏng ñã

ñược chảy qua các dung môi chạy, ñược ñưa vào chiếu bởi ñèn tử ngoại (UV) 365nm Các vết mẫu phân tích có màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây và có ñộ dài Rt ñược so sánh với các vết của Aflatoxin tiêu chuẩn Nhược ñiểm của phương pháp này là phụ thuộc vào người phân tích Khi so sánh giữa mẫu và các vết của ñộc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả tới 20 – 30% [1, 43]

* Phương pháp ño mật ñộ huỳnh quang trên máy fluorodensitometer

Fluorodensitometer có nhiều tiến bộ hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường (Dons, 1968) Tuy nhiên, ở nhiều phòng thí nghiệm hiện ñại vẫn

sử dụng phương pháp nhìn ñể so sánh trực tiếp các vết trên bản mỏng vì dễ hơn nhiều khi phải qua máy densitometer [1] Khẳng ñịnh sự có mặt của Aflatoxin của phương pháp này: một số chất ñược tách ra từ mẫu ñôi khi dễ nhẫm lẫn với Aflatoxin, dẫn ñến sự khẳng ñịnh sai lệch Phương pháp khẳng ñịnh sự có mặt của Aflatoxin trực tiếp thực hiện trên các bản sắc ký Dựa vào

sự biến ñổi của Aflatoxin thành các ñồng phân có mầu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban ñầu, cả Aflatoxin chuẩn và Aflatoxin có trong mẫu phân tích ñều chuyển sang có cùng một ñồng phân Thử nghiệm khẳng ñịnh sự có mặt của Aflatoxin trong mẫu phân tích ñược phát hiện bởi Przybylski (1975)

và Verhulsdonk (1977) và ñược hội phân tích hóa học Hoa Kỳ (A.O.A.C) công nhận Aflatoxin B1 ñược axit hóa ñể trở thành ñồng phân Aflatoxin B2 ðồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có ñộ dài Rf thấp hơn so với ñộ dài của Rf của Aflatoxin B1 Theo phương pháp của Przybylski, Aflatoxin B1 ñược chuyển thành Aflatoxin B2a nhờ axit trifloaxetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng Axit sulfuric 50% cũng ñược sử dụng ñể phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong các dung môi chạy Axit sulfuric làm thay ñổi màu huỳnh quang xanh da trời của Aflatoxin B1 thành màu vàng Thử nghiệm này nhằm khẳng ñịnh sự không có mặt của Aflatoxin

nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng [1]

* S ắc ký lớp mỏng hiệu suât cao (High performance thin layer

chromatography – HPTLC)

Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng ñơn thuần

ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: ðưa mẫu lên bản mỏng một cách tự ñộng; cải thiện sự ñồng nhất cả lớp hấp thụ; chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát

Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp ñịnh lượng Aflatoxin có hiệu quả nhất

* Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography

– HPLC)

Hệ thống phân tích Aflatoxin tự ñộng HPLC là hệ thống phân tích ñắt tiền, chọn lọc, dùng xác ñịnh ñịnh lượng Aflatoxin Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: pha bình thường và pha phản Hệ thống này dựa trên sự hấp thu tia tím (UV) và xác ñịnh cường ñộ huỳnh quang Trong pha bình thường, pha tĩnh là rắn, phân cực hơn pha ñộng Trong pha phản, pha bình thường là pha phản pha, pha tĩnh là lỏng và ít phân cực hơn pha ñộng Trong HPLC, pha phản ñược sử dụng ñể tách Aflatoxin nhiều hơn pha bình thường

2.4.3 Phương pháp hóa sinh học (Immunochemical methods)

Phương pháp hoá sinh miễn dịch mang tính ñặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể ñặc hiệu Hai phương pháp hiện dùng là: Aflatoxin ñánh dấu phóng xạ và Aflatoxin gắn men (Pestka, 1980, 1981) Do sự tiến bộ của kỹ thuật miễn dịch trong những năm qua, ñã phát triển nhiều hệ thống ELISA khác nhau ñể xác ñịnh Aflatoxin và kháng thể ñơn và ña dòng [1]

* Phương pháp ELISA (enzyme – linked immunoabsorbant assay)

Phương pháp ELISA gồm ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp, ELISA trực tiếp sử dụng Aflatoxin cĩ gắn men, ELISA gián tiếp – Aflatoxin cĩ gắn prơtêin và một kháng thể thứ hai Cả hai phương pháp này đều sử dụng men peroxidaza và men photphataza kiềm để gắn

Phương pháp ELISA trực tiếp: dựa trên nguyên lý kháng thể đặc hiệu được phủ trên các đĩa chuẩn độ (microtites) Dung dịch tách từ mẫu hay Aflatoxin mẫu được ủ cùng nhau hay tách thành hai bước, sau đĩ được rửa bằng dung dịch thích hợp Lượng men gắn vào đĩa được xác định bằng dung dịch đặc biệt Phản ứng màu được đo bằng quang phổ hoặc so sánh trực tiếp bằng mắt thường với các đĩa chuẩn Phương pháp này chiếm nhiều thời gian

và sai số lớn trong cùng mẫu phân tích do sự xâm nhập của các chất ngoại lai

cĩ trong mẫu tách [1]

Phương pháp ELISA gián tiếp: Aflatoxin gắn vào protein được phủ các đĩa chuẩn độ (microtiter) Mẫu tách hay Aflatoxin chuẩn được đưa vào đĩa, tiếp theo là kháng thể thứ cấp (anti Aflatoxin antibody) Lượng kháng thể gắn vào đĩa được xác định do thêm kháng thể IgG (anti rabit IgG) gắn với photphataza kiềm (ALP) và phản ứng màu xảy ra với P-nitrophenyl photphat Lượng độc tố được xác định bằng cách so sánh với đường độc chuẩn Standard Curve Phương pháp này trải qua nhiều bước và cần một kháng thể thứ cấp nên sai số cao và chiếm nhiều thời gian [1]

2.4.4 Phương pháp PCR dùng chẩn đốn nấm sinh độc tố Aflatoxin

ðể tiện lợi hố việc phát hiện nấm Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin, gần đây phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR đang được nghiên cứu áp dụng rộng rãi [40] Ngồi tính tiện lợi và dễ sử dụng, phương pháp này cịn cĩ ưu điểm là phát hiện nhanh, nhạy, chính xác nấm Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin Phương pháp chẩn đốn sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết

quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus ssp sinh ñộc tố Aflatoxin và con

ñường sinh tổng hợp Aflatoxin [15, 28] Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có

20 gen tham gia vào con ñường sinh tổng hợp Aflatoxin, trong ñó có 4 gen

quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1 và apa-2 ñã ñược công bố trình tự

nucleotide và chức năng gen Trình tự nucleotide của các gen này là cơ sở ñể sinh tổng hợp các cặp mồi ñặc hiệu cho phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là

ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc các mẫu xét nghiệm

Chất ñầu tiên tham gia vào con ñường sinh tổng hợp Aflatoxin có nguồn gốc từ một polyketide, ngưng tụ các chất acetate ñể tạo thành axit norsoloric, tiếp ñó là sự biến ñổi norsolorinic axit (NOR)→ averantin (AVN)→ averufanin → averufin (AVF) → hydroxyversicolorone → versiconal hemiacetal acetate → versicolorin B → versicolorin A (VA)→ sterigmatocystin (ST) → O – methylsterigmatocystin (OMST) → Aflatoxin

B1 Trong mắt xích cuối của con ñường sinh tổng hợp enzym O – methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyển hoá (ST) → (OMST) có liên quan tới sự sản sinh Aflatoxin Gần ñây, chỉ mới một vài enzym trong con ñường sinh tổng hợp này ñược phân lập [33, 53] Cụ thể, ba gen cấu trúc

trong con ñường sinh tổng hợp Aflatoxin của nấm A paraciticus có liên quan

ñến sự biến ñổi của NOR và VA (nor-1 và ver-1), enzym O –

methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyển hoá (ST) → (OMST) (omt -1) ;

và một gen ñiều hoà của nấm A flavus (afl-2) ñã ñược nhân dòng Các gen này ñược chọn làm gen ñích cho phản ứng PCR Gen afl -2 ñược biết ñến như

một như một enzym bảo tồn hoạt ñộng của các enzym khác trong con ñường

sinh tổng hợp Aflatoxin Trong một số nghiên cứu cũng ñưa ra, gen apa-2 của chủng nấm A parasiticus trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin, có mức ñộ tương ñồng về ADN rất lớn với gen afl-2 của nấm A flavus [33, 34]

ðiều kiện thời tiết Việt nam ñược xem là môi trường lý tưởng cho sự sinh

trưởng và phát triển của nấm Aspergillus ðiều này dẫn đến hàm lượng và tỷ

lệ nhiễm Aflatoxin trên nơng sản Việt Nam là ở mức cao trong khu vực và đây là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến giá trị nơng sản xuất khẩu của Việt nam rất thấp Thực tế thì đã cĩ nhiều lơ hàng nơng sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các

phương pháp chẩn đốn sớm nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin cĩ ý

nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của nấm Hiện tại, ở Việt nam chúng ta vẫn đang sử dụng phương pháp truyền

thống để chẩn đốn nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin nên mới chỉ phát hiện được chủng nấm A flavus

Hình 2.8 Sơ đồ minh hoạ con đường sinh tổng hợp độc tố Aflatoxin B1 ở nấm A

flavus

Việc phát hiện mầm bệnh nấm A flavus sinh ựộc tố Aflatoxin bằng kỹ

thuật PCR chưa ựược nghiên cứu ở Việt nam Từ năm 2007, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp ựã tiến hành thu thập và

phân lập chủng nấm bệnh A flavus trên một số nông sản (ngô, lạc, ựậu tương,

gạo), nuôi cấy thu sinh khối và tối ưu hóa quy trình tách chiết ADN tổng số

của nấm A flavus đã xác ựịnh ựược các ựiều kiện cho phản ứng PCR ựặc hiệu sử dụng các cặp mồi riêng rẽ nor-1, omt-1, ver -1, apa -2 (do gen afl Ờ 2 của nấm A flavus có mức ựộ tương ựồng rất lớn với gen apa - 2 của nấm A

parasiticus), và phản ứng Multiplex PCR (dùng cả 4 cặp mồi), có thể nhận ra ựược chủng nấm có mang gen mã hóa trong quá trình tổng hợp ựộc tố Aflatoxin B1 [1]

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Hạt của các loại nông sản: ngô, lạc, ñậu tương, gạo ñược thu thập tại nhà dân, trên ñồng ruộng và trong kho bảo quản ở một số tỉnh: Thanh Hoá, Nghệ An,

Hải Dương, Sơn La, Hà Nội ñược sử dụng ñể phân lập nguồn nấm bệnh

Các mẫu nông sản thu về ñược bảo quản trong phòng lạnh ở ñiều kiện 4

- 80C tại Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp

Từ các mẫu nông sản ở các ñịa phương khác nhau chúng tôi ñã phân lập và

làm thuần ñược 50 chủng nấm A flavus làm nguyên liệu cho các thí nghiệm

tiếp theo

Bảng 3.1 Các chủng nấm A flavus thuần ñược phần lập trên các nông

sản và ñịa phương khác nhau