Nghiên cứu quy trình nhân giống cây xuyên khung (ligusticum wallichii frach) từ nuôi cấy mô

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


 -

CAO THỊ THUỶ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY

XUYÊN KHUNG (Ligusticum wallichii Frach) TỪ NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT

Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS VŨ QUANG SÁNG

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ cho bất kỳ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Cao Thị Thuỷ

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành bản luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi còn nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của nhiều cá nhân và tập thể

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS Vũ Quang Sáng, người

ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Thuận – Giám ñốc trung tâm,Thạc sĩ Tạ Như Thục Anh, Thạc sĩ Trần Thị Liên – Trung tâm nghiên cứu cây thuốc, Viện Dược liệu - Bộ Y Tế ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực tập

Xin cảm ơn gia ñình, ban bè và ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2009

Tác giả

Cao Thị Thuỷ

2.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất xuyên khung 24

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ HgCl2 và thời gian khử trùng

tới hiệu quả khử trùng mẫu xuyên khung ñưa vào nuôi cấy 37

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA ñến hệ số nhân chồi của xuyên

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA ñến hệ số nhân

4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ kinetin tới hệ số nhân chồi

4.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và αNAA tới hệ số

4.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa tới hệ số nhân chồi của

4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA tới sự tạo rễ của xuyên khung

4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp αNAA và than hoạt tính tới sự

4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA tới sự ra rễ của xuyên khung

4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp IBA + than hoạt tính tới sự tạo

4.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng tới sinh trưởng phát

4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới tỷ lệ sống và sự

sinh trưởng, phát triển của cây xuyên khung trong vườn ươm 73 4.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chế ñộ chăm sóc cây xuyên khung in

DANH MỤC BẢNG

4.1: Ảnh hưởng của nồng ñộ HgCl2 và thời gian khử trùng khác nhau

tới hiệu quả khử trùng mẫu xuyên khung ñưa vào nuôi cấy 384.2: Ảnh hưởng của nồng ñộ BA tới hệ số nhân chồi của cây xuyên

4.3: Ảnh hưởng của BA và αNAA ñến hệ số nhân chồi của mẫu xuyên

4.4: Ảnh hưởng của nồng ñộ kinetin tới hệ số nhân chồi của xuyên

4.5: Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin + αNAA tới hệ số nhân chồi của

4.6: Ảnh hưởng của nước dừa tới hệ số nhân chồi của xuyên khung

4.7: Ảnh hưởng của αNAA tới sự ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần

4.8: Ảnh hưởng của αNAA và than hoạt tính ñến sự ra rễ của xuyên

4.9: Ảnh hưởng của nồng ñộ IBA tới khả năng ra rễ của xuyên khung

4.10: Ảnh hưởng của tổ hợp IBA + than hoạt tính ñến sự tạo rễ của

4.12: Ảnh hưởng của giá thể ra cây tới tỷ lệ sống và tình hình sinh

trưởng của xuyên khung ngoài vườn ươm 45 ngày sau trồng 704.13: Ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới tỷ lệ sống và sự sinh trưởng của

4.14: Ảnh hưởng của chế ñộ chăm sóc cây xuyên khung in vitro ngoài

DANH MỤC HÌNH

2.1 Một số hình ảnh về cây xuyên khung ngoài thực ñịa 44.1 Ảnh hưởng của HgCl2 0,07% tới hiệu quả khử trùng mẫu cấy

4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ HgCl2 0,1% tới hiệu quả khử trùng

4.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ HgCl2 0,15% tới hiệu quả khử trùng

4.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ BA tới hệ số nhân chồi của mẫu xuyên

4.5 Ảnh hưởng của nồng ñộ BA tới hệ số nhân chồi của cây xuyên

4.6 Ảnh hưởng của BA và αNAA ñến hệ số nhân chồi sau 6 tuần

4.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ BA+ αNAA tới hệ số nhân chồi của

4.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ kinetin tới hệ số nhân chồi của mẫu

4.9 Ảnh hưởng của kinetin tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung

4.10 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin + αNAA hệ số nhân chồi của cây

4.11 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin + αNAA tới khả năng nhân chồi

4.12 Ảnh hưởng của nước dừa tới hệ số nhân chồi của cây xuyên

4.13 Ảnh hưởng nước dừa tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung

4.14 Ảnh hưởng của αNAA tới tỷ lệ ra rễ của xuyên khung sau 6

4.15 Ảnh hưởng của αNAA tới kích thước và số lượng rễ của xuyên

4.16 Ảnh hưởng của NAA tới sự ra rễ của mẫu sau 6 tuần nuôi cấy 584.17 Ảnh hưởng của αNAA + than hoạt tính tới tỷ lệ ra rễ của xuyên

4.18 Ảnh hưởng của αNAA + than hoạt tính tới số lượng rễ và kích

4.19 Ảnh hưởng của αNAA và than hoạt tính ñến sự ra rễ của xuyên

4.20 Ảnh hưởng của IBA tới tỷ lệ ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần

4.21 Ảnh hưởng của IBA tới số lượng và chiều kích thước rễ của

4.22 Ảnh hưởng của IBA + than hoạt tính tới tỷ lệ ra rễ của xuyên

4.23 Ảnh hưởng của IBA + than hoạt tính tới số lượng và kích thước

4.24 Ảnh hưởng của IBA+ than hoạt tính ñến sự ra rễ của xuyên

4.25 Ảnh hưởng của giá thể ra cây tới tỷ lệ sống xuyên khung ngoài

4.26 Ảnh hưởng của giá thể ra cây tới sự sinh trưởng, phát triển của

4.27 Ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới tỷ lệ sống của cây xuyên

4.28 Ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới sự sinh trưởng của xuyên

4.29 Ảnh hưởng của chế ñộ phun dinh dưỡng tới sinh trưởng cây

4.30 Ảnh hưởng của chế ñộ phun dinh dưỡng tới sinh trưởng cây

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Xuyên khung (Ligusticum wallihii Franch) có nguồn gốc từ Tứ Xuyên -

Trung Quốc, ñược du nhập sang trồng ở Việt Nam từ những năm 60 của thế kỷ

XX [6] Trong y học cổ truyền, xuyên khung là vị thuốc thiết yếu của rất nhiều các toa thuốc, có tác dụng hành huyết, ñiều kinh, trừ phong, giảm ñau Các công trình nghiên cứu gần ñây của y học hiện ñại ñã xác ñịnh thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của xuyên khung như: ức chế sự co bóp tử cung, chống loạn nhịp tim, gây dãn ñộng mạch vành, cải thiện tuần hoàn não, giảm cholesterol máu…[8,9 ] nên việc cung cấp nguyên liệu với số lượng lớn chất lượng ổn ñịnh cho ngành sản xuất thuốc ngày càng tăng Trước những năm 60 ñến ñầu những năm 90 của thế kỷ XX, xuyên khung ñược trồng rộng rãi ở hầu hết các huyện vùng núi cao thuộc tỉnh Lào Cai như: SaPa, Bát Sát, Bắc Hà, Mường Khương, tỉnh Lai Châu trồng ở các huyện Sìn Hồ, Phong Thổ, Than Uyên và một số tỉnh miền núi phía bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Cạn, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa…Sản lượng thỏa mãn nhu cầu dược liệu trong nước, chủ yếu dùng trong thuốc cổ truyền Tuy nhiên, năng suất dược liệu giảm dần, những năm 60 - 70 năng suất cây trồng ñạt khoảng 2 - 3 tấn/ha, ñến nay chỉ ñạt 1,5 - 1,7 tấn/ha [10 ] Nguyên nhân của hiện trạng này là do hậu quả của một số yếu tố như ñiều kiện tự nhiên, kỹ thuật canh tác nhưng cơ bản nhất vẫn là giống kém phẩm chất, thoái hóa và không ñược phục hồi chất lượng Mặt khác phương thức trồng trọt là trồng bằng ñốt thân ñược tách từ cây mẹ, mỗi cây mẹ chỉ chọn ñược từ 3 - 5 mầm ñạt tiêu chuẩn Vì vậy hệ số nhân của cây xuyên khung ngoài tự nhiên rất thấp Hơn nữa cây giống không trồng ngay mà phải bảo quản sau 2 - 3 tháng mới trồng [10], việc bảo

quản giống làm cho chi phí giống tăng lên ñáng kể chưa kể ñến hao hụt giống trong thời gian bảo quản dẫn tới hiệu quả kinh tế trong sản xuất xuyên khung thấp, diện tích trồng trọt có xu hướng ngày càng thu hẹp ðiều này dẫn tới một thực trạng tất yếuñó là ngành dược Việt Nam sẽ phải nhập khẩu nguyên liệu xuyên khung với số lượng lớn phục vụ cho việc sản xuất thuốc

Do ñó, việc thiết lập hệ thống sản xuất cây giống xuyên khung có chất lượng cao là một nhu cầu bức thiết, cho ñến nay vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu ñể giải quyết vấn ñề này một cách triệt ñể ñể ứng dụng vào sản xuất Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên Viện Dược Liệu tiến hành ñề tài nghiên cứu phục tráng và xây dựng hệ thống sản xuất giống xuyên khung có

chất lượng cao lượng cao bắt nguồn từ nuôi cấy in vitro.Trên cơ sở ñó chúng

tôi tiến hành ñề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây xuyên

khung (Ligusticum wallichii Franch) từ nuôi cấy mô ” ñể phục vụ cho công

tác phục tráng giống sau này

1.2 Mục ñích, yêu cầu của ñề tài

1.2.1 Mục ñích

Nghiên cứu quy luật tác ñộng của các chất ñiều hòa sinh trưởng và một

số yếu tố hữu cơ khác tới sinh trưởng, phát triển của cây xuyên khung in vitro

ðề xuất quy trình nhân giống in vitro cây xuyên khung (Ligusticum

wallichii Franch)

1.2.2 Yêu cầu

Xác ñịnh ñược các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng nhân giống của

xuyên khung trong in vitro và in vivo:

- Phương pháp khử trùng mẫu cấy

- Các chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả năng tạo cụm chồi

- Các chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

- Các hợp chất hữu cơ (than hoạt tính, ñường saccharose, nước dừa) tới sinh trưởng phát triển của mẫu xuyên khung trong nuôi cấy

Kết quả nghiên cứu của ñề tài cung cấp tài liệu tham khảo phục vụ công tác giảng dạy và nghiên cứu về cây xuyên khung nói riêng cây thuốc nói chung

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Cung cấp giống chất lượng cao và quy trình nhân giống in vitro cây

xuyên khung, phục vụ sản xuất giống, nâng cao hiệu quả kinh tế của khâu trồng trọt và thúc ñẩy sản xuất xuyên khung thành cây trồng có tính chất hàng hóa mới, góp phần cho việc phòng chống bệnh tật của cộng ñồng và xuất khẩu

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây xuyên khung

2.1.1 ðặc ñiểm thực vật học

Xuyên khung có tên khoa học là Ligusticum wallichii Franch, thuộc họ hoa tán (Apiaceae) Xuyên khung là cây thân thảo, sống lâu năm Rễ phình

lên thành củ rất thơm Thân mềm, có khía dọc, rỗng giữa Lá xẻ lông chim,

2-3 lần, mọc so le, có cuống dài và bẹ to, các thuỳ mọc ñối, hình mác, gốc tròn hoặc men theo cuống, ñầu nhọn thuỳ lớn, chia thành những thuỳ nhỏ, nông và khía răng không ñều, hai mặt nhẵn, mặt trên màu lục bóng Cụm hoa mọc thành tán kép, hoa nhỏ màu trắng Qủa bế, hình trống Toàn cây, nhất là rễ củ

có tinh dầu [6]

Hình 2.1: Một số hình ảnh về cây xuyên khung ngoài thực ñịa

2.1.2 ðặc ñiểm sinh thái và phân bố

Xuyên khung là cây của vùng ôn ñớí ấm Nhiệt ñộ thích hợp cho cây sinh trưởng: 13 - 160C; tối cao tuyệt ñối là 300C và tối thấp tuyệt ñối có khi xuống tới 00C Lượng mưa 2600 - 2865 mm/năm ðộ ẩm không khí 85%

Xuyên khung thắch ứng ựặc biệt với các loại ựất mùn tơi xốp, dễ thấm nước ở chân núi ựá vôi, pH của ựất là 6 - 7 Cây sinh trưởng mạnh trong mùa xuân Ờ

hè, ựến mùa thu bắt ựầu có hoa quả Tuy nhiên hạt không ựược sử dụng ựể nhân giống mà là các ựốt của gốc thân, sau khi ựã thu hoạch củ [10]

Xuyên khung có nguồn gốc từ vùng đông Bắc Trung Quốc Cây ựã ựược trồng từ lâu ựời, hiện nay không còn thấy trong hoang dại Chúng cũng ựược trồng nhiều ở đài Loan, Nhật Bản và Triều Tiên và một số tỉnh miền núi phắa Bắc Việt Nam [48,49]

2.1.3 Thành phần hoá học và công dụng [50]

Bộ phận làm thuốc của xuyên khung là thân rễ (rhizoma) Theo y học

cổ truyền, xuyên khung có vị cay, tắnh ấm, quy vào ba kinh can, ựởm, tâm bào, có tác dụng hành khắ, hoạt huyết, ựiều kinh, trừ phong, giảm ựau

Các công trình nghiên cứu của y học hiện ựại ựã xác ựịnh thành phần hóa học trong dược liệu là 1% tinh dầu, axit ferulic, các phthalid: butylphthalid, butylidephthalid, ligustilid và các hợp chất có nitơ như adenin, adenosin, ligustazin

Nghiên cứu dược lý chứng minh nhóm phthalid như ligustilis có tác dụng ức chế sự co bóp tử cung, chống loạn nhịp tim, gây dãn ựộng mạch vành Nhóm hợp chất chứa N như ligustazin có tác dụng ức chế sự kết tập tiểu cầu nên có khả năng dự phòng chống ựông máu ở ựộng mạch; làm dãn mao mạch

trên in vitro nên có tác dụng tốt trong ựiều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu não;

axắt ferulic trong xuyên khung có tác dụng ức chế co bóp cơ trơn tử cung

Trong ựiều trị huyết khối não, xuyên khung có tác dụng làm giảm ựộ nhớt của máu, ựộ nhớt của huyết thanh, tăng tốc ựộ ựiện di hồng cầu, giảm tỷ

lệ kết tập tiểu cầu Cao nước sắc xuyên khung có tác dụng làm tăng khả năng biến dạng, tăng sức bền của hồng cầu, có tác dụng chống ựông máu chung, ức

chế các giai ñoạn ñông máu nội sinh và ngoại sinh, sự tạo fibrin Xuyên khung còn có tác dụng giảm cholesterol máu trong mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh trên chuột nhắt và chuột cống trắng

Tinh dầu xuyên khung có tác dụng kháng khuẩn với một số chủng như phế cầu, liên cầu, tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh

Xuyên khung có tác dụng chống phóng xạ, trị chứng thiếu vitamin E Việc sử dụng xuyên khung cùng các vị thuốc khác dùng ñể hoạt huyết cũng ñược sử dụng trong công nghệ dược mỹ phẩm [15]

2.1.4 Một số bài thuốc hay có sử dụng xuyên khung [47]

- Trị ñau nửa ñầu: ðộc vị xuyên khung tán nhỏ Ngày uống 2 lần mỗi lần từ 4 - 6g với nước chè

* Trị bệnh mạch vành ñau thắt ngực: Dùng xuyên khung chiết xuất axit ferulic 20mg cho vào glucose 5% - 250ml, nhỏ tĩnh mạch ngày 1 lần liên tục trong 10 ngày, làm hết cơn ñau thắt ngực, mỡ trong máu giảm ở mức

ñộ khác nhau

* Trị viêm cột sống phì ñại và gai xương gót chân: Dùng bột xuyên khung ñựng vào bọc ñắp ở chỗ ñau hoặc lót vào giầy, mỗi tuần thay một lần, nếu sau 2 tháng tái phát lại ñắp tiếp

* Trị nhồi máu não và tắc mạch máu não: Dùng dịch tiêm phức hợp xuyên khung, xích thược, ñan sâm, xuyên quy làm lưu lượng huyết dịch ñều

* Trị ñau các khớp, mình mẩy: Xuyên khung 6g, bạc hà 6g, tế tân 3g, khương hoạt 8g, bạch chỉ 12g, phòng phong 12g, kinh giới 12g, cam thảo vài lát sắc uống hoặc tán thành bột 4 g/lần pha với nước trà

* Dùng trong ngoại khoa

- Trường hợp chấn thương té ngã, dùng phối hợp xuyên khung với ñương quy, xích thược, hoa hồng ñể hoạt huyết chỉ thống

- Trường hợp mụn nhọt làm mủ lâu mới khỏi xuyên khung phối hợp với ñương quy, tạo giác thích ñể bổ khí huyết, hoạt huyết tiêu sưng

Liều lượng và cách dùng: dùng với lượng từ 3 - 10g, tán bột mịn mỗi lần 1 - 1,5g

2.2 Cơ sở khoa học của ñề tài

2.2.1 Cơ sở lý luận của phương pháp nhân giống in vitro

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học

thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào Theo Haberland.G, nhà thực vật học người ðức, tất cả các tế bào của cây ñều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp ñiều kiện thích hợp, mỗi tế bào ñó ñều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [32]

Thực tế ñã chứng minh ñược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn

trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [42] Morel là người ñầu tiên ñã thành công trong việc tái sinh và nhân nhanh giống

lan quý Cymbidium bằng phương pháp này [38] Trong một thời gian ngắn người ta có thể thu ñược hàng triệu cá thể, nhờ vậy mà hoa Cymbidium vốn

ñắt tiền ñã có giá thành hạ hơn và ñáp ứng ñược nhu cầu tiêu dùng của nhiều người Ở Thái Lan 90% lan thương mại ñược nhân bằng phương pháp nuôi

cấy in vitro Thành công ñối với họ Orchidaceae không những chỉ là bằng

chứng mà còn mở ñường cho việc ứng dụng kỹ thuật này ñối với các loài cây khác như cây ăn quả, cây lương thực, cây lâm nghiệp, cây thuốc, cây cảnh ,

ở nhiều nước trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, ñặc biệt ở Hà Lan sử dụng phương pháp này ñể nhân giống cúc cho hệ số nhân giống cao từ 410-

1010/năm [11] Các lĩnh vực ứng dụng khác kỹ thuật in vitro cũng mang lại

nhiều kết quả trong việc cải tạo và phục tráng giống cây trồng

Qúa trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là

kết quả của các qúa trình phân hoá và phản phân hoá Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành ñều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá ñể ñảm nhiệm các chức năng khác nhau ñược gọi là sự phân hoá tế bào Còn quá trình phản phân hoá thì ngược lại với qúa trình phân hoá, có nghĩa là tế bào ñã phân hoá thành mô chức năng không hoàn toàn mất ñi khả năng phân chia mà ở ñiều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia [32]

2.2.2 Ứng dụng của nhân giống in vitro trong nhân giống cây thuốc và

một số loại cây trồng khác

Khi lĩnh vực sản xuất giống cây trồng ñược thực hiện trên quy mô công

nghiệp thì phương pháp nhân giống invitro ngày càng ñược khai thác và sử

dụng một cách triệt ñể Có rất nhiều loại cây trồng nói chung và cây thuốc nói

riêng ñược nhân nhanh bằng phương pháp này Thí dụ: sử dụng chồi nách ñể

nhân có thể tạo ra hàng chục vạn cây D.floribunda trong vòng một năm [37]

hay 26 vạn cây cam thảo trong năm tháng [35], chỉ từ một lát cắt ban ñầu mà

thông thường từ một cây D.floribunda chỉ tạo ra 8 - 10 cây trong một năm, và

cam thảo chỉ cho 5 - 7 cây nếu nhân giống bằng cành [37] Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự ñã ñạt ñược hệ số nhân 532 trong vòng 1 năm ñối với khoai tây [25], hệ số nhân giống của cây hà thủ ô ñỏ là 105/ năm, cây trinh

nữ hoàng cung, hệ số nhân giống vô tính truyền thống là 6 - 7 cây/năm

nhưng khi nhân bằng phương pháp in vitro hệ số này có thể lên tới 2 x 35

cây từ một lát cắt của củ giống [1], ñặc biệt cây cọ dầu thường phải mất 10

- 15 năm mới cho quả thu hoạch và nhân giống từ hạt Ứng dụng nhân

nhanh in vitro cho ñối tựơng này, người ta có thể cung cấp ñược 500.000

cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [46] Mai Xuân Lương, Nguyễn Văn Kết dự tính hàng năm có thể thu ñược 76 cây giống khi nuôi cấy chồi của cây cẩm chướng [16]

Trong công tác giống cây trồng, vấn ñề ñược quan tâm hàng ñầu là chất lượng và số lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng, người

ta ñã tạo ra ñược những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel ñã chứng minh ñược rằng nồng ñộ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần ñỉnh sinh trưởng [37], riêng ñỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus [38] Nguyên nhân của hiện tượng này là: ðỉnh sinh trưởng không có hệ thống mô dẫn làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng xâm nhập ðỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus Qúa trình phân chia tế bào phôi sinh (ñỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus

Nuôi cấy mô tế bào chủ yếu ñược dùng ñể phục tráng và nhân nhanh

Qua nuôi cấy in vitro tế bào ñược trẻ hoá thông qua quá trình phản phân hoá

ñể trở về trạng thái phôi sinh, từ ñó cho ra ñời những cây con có tuổi sinh lý trẻ hơn, làm sức sống của cây trồng tăng lên, dẫn ñến tăng năng suất và chất lượng sản phẩm [42] Những kỹ thuật này ở nước ngoài ñã ñược áp dụng trên phần lớn cây trồng ðối với cây thuốc, giống ñịa hoàng, ở Trung Quốc, Hàn Quốc, bạch truật ở Nhật Bản… cũng ñã thành công theo phương pháp này

Tóm lại, phương pháp nhân giống in vitro với các ưu thế về hệ số nhân

giống cực kỳ lớn, tiềm năng công nghiệp hoá cao và tính khả thi rộng, ñã thực

sự trở thành công cụ cần thiết trong công tác giống cây trồng

2.2.3 Ý nghĩa, ưu nhược ñiểm của phương pháp nuôi cấy in vitro

* Ý nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống

vô tính, ñối với nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao gặp khó khăn trong vấn ñề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính

in vitro là công cụ vô cùng hữu ích Trên thực tế có nhiều loài thực vật nhân

giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô

tính in vitro là do các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho

hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ

cả về hình thái và thành phần hoá học [31] Sự không ñồng nhất này gây ra khó khăn trong việc ñưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp vì các cây có chất lượng sản phẩm không ñồng ñều, làm giảm giá trị thương phẩm ðặc biệt, ñối với cây thuốc thì việc không ñồng nhất về chất lượng (hàm lượng các chất hoạt tính) sẽ dẫn ñến hậu quả là nguyên liệu không ổn ñịnh, không ñáp ứng ñược nhu cầu sản xuất Ví dụ: ñối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không ñều về hàm lượng các

thành phần hoạt chất, cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu

ở cây con phân ly từ 0,5 ñến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 ñến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu [46]

ðối với nhiều cây dược liệu, việc nhân giống hữu tính gặp khó khăn như ô dầu, bạch thược có hạt nảy mầm chậm, hay với ñan sâm hạt chín không ñều và thời gian nảy mầm kéo dài, gây khó khăn cho việc sản xuất ñại trà Một số cây gỗ khác có thời gian sinh trưởng kéo dài như sơn thù, ñỗ trọng khi

di thực về trồng ở SaPa phải mất mười năm cây mới ra hoa, bộ phận làm thuốc của cây sơn thù là quả nhưng khi cây còn trẻ chỉ cho hoa ñực vì vậy không có quả Các cây tam thất, nhân sâm, hoàng liên phải sử dụng hạt tươi mới nảy mầm nên thu hoạch ñến ñâu cần gieo ngay ñến ñó gây nhiều khó khăn cho sản xuất…[4] Mặt khác phương pháp nhân giống truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược ñiểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: xuyên khung 2 – 5/cây mẹ [4], chuối là 2 – 3/cây mẹ [26], …hơn nữa, việc sử dụng chính các

bộ phận làm thuốc ñể nhân giống rất lãng phí, tốn kém

ðể khắc phục những nhược ñiểm trên, phương pháp nhân giống vô tính ñược áp dụng ñã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn lao, nhân giống vô tính tạo ra các cây con ñồng ñều về mặt di truyền do duy trì ñược các tính trạng của cây mẹ [3] nên có thể áp dụng sản xuất ñại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn ñịnh; rút ngắn thời gian từ khi trồng ñến khi thu hoạch tạo ñiều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng ñối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài…

* Ưu ñiểm

- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây Hệ số nhân giống thường ñạt ở các loại cây khác

nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào

- Chọn lọc được các cây ưu tú, sản phẩm đồng nhất và đưa ra sản phẩm nhanh hơn Theo lý thuyết, từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu tú nào đều cĩ thể đều cĩ thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng khơng hạn chế

- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm gây bệnh

- Nhân giống in vitro cĩ thể nhân nhanh cây khơng kết hạt hoặc kết hạt

kém trong những điều kiện sinh thái nhất định

- Cĩ tiềm năng cơng nghiệp hĩa, do chủ động về chế độ chăm sĩc và chiếu sáng, nhiệt độ,…nên cĩ thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục

- Tạo được cây cĩ kiểu gen mới bằng xử lý đa bội

- Bảo quản và lưu giữ được tập đồn gen

*Nhược điểm

Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn khơng tránh

khỏi một số nhược điểm như:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều lồi thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khĩ khăn liên quan tới lý thuyết nuơi cấy và tái sinh thực vật

- Chi phí sản xuất cao, vi nhân giống địi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động cĩ tay nghề

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình [39]

Sở dĩ nuơi cấy in vitro cĩ thể chủ động trong nhiều khâu trong sản xuất

là do cĩ những điểm khác biệt so với các phương pháp nhân giống truyền

thống ñó là, nhân giống in vitro ñược thực hiện trên một môi trường ñặc biệt,

cung cấp ñầy ñủ các ñiều kiện cho mô, tế bào nuôi cấy phát triển Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng quyết ñịnh ñến kết quả của nuôi cấy

2.2.4 Môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro, cả hai nhóm yếu tố hóa học và vật lý trong các

bình nuôi ñều phải ñược cung cấp ñầy ñủ Ngoài ra môi trường dinh dưỡng ñể nuôi cây phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết [41], nguồn chất hữu cơ

bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố ñịnh và một thành phần cần cho sự sống khác cũng phải ñược cung cấp ñó là nước Các nhân tố vật lý như nhiệt ñộ, pH, môi trường khí, ánh sáng (chất lượng và thời gian chiếu sáng) và áp lực thẩm thấu, cũng phải ñược duy trì trong giới hạn chấp nhận

Nguồn dinh dưỡng trong một môi trường nuôi cấy thông thường phải ñảm bảo các thành phần hoá học sau:

• Nguyên tố ña lượng: Các nhân tố này thường chiếm 0,1% khối lượng khô của thực vật Trong ñó nitơ, phốt pho, kali, magiê, can xi và lưu huỳnh là các nguyên tố ña lượng Các nguyên tố này thường ñược sử dụng ở dạng các muối vô cơ Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục, protein, acid nucleic, acid amin ), tham gia vào các quá trình như ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…

• Nguyên tố vi lượng: ðược cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau Các nguyên tố vi lượng ñược sử dụng thông dụng là Mn, I, Cu, Co, B, Mo, Fe và Zn là các nguyên tố

vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng ñược tìm thấy trong một số công thức Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin tham gia vào các phản ứng trao ñổi ñiện tử, sinh tổng hợp diệp lục,…

• Chất hữu cơ bổ sung: Gồm có vitamin và amino acid Các vitamin

là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor của nhiều phản ứng sinh hoá [32] Chỉ có 2 loại vitamin B1 và myoinositol là cần

thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro Tuy nhiên vì lý do lịch sử các

loại vitamin khác cũng ñược thêm vào ñể nuôi cấy Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid thường ñược sử dụng là glysine ngoài ra arginine, asparagine, aspartic acid, alanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng ñược sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết

• Nguồn cacbon: Các mô tế bào thực vật nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và nhiều ñiều kiện khác…do ñó phải bổ sung thêm cacbon Saccharose thường ñược sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy do có những ñặc tính như rẻ, dễ kiếm, ñồng hoá triệt ñể và tương ñối ổn ñịnh Ngoài ra, các loại ñường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể ñược

sử dụng và trong những trường hợp ñặc biệt có thể cung cấp tốt hơn ñường saccharose

• Tác nhân làm ñặc môi trường: Tuỳ thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần ñược sử dụng ở dạng lỏng hoặc ñặc, nhiều loại nuôi cấy ñòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải sinh trưởng trên bề mặt nên agar là tác nhân ñược sử dụng phổ biến nhất khi tiến hành làm môi trường Agar ñược sản xuất từ tảo biển, ở dạng tinh khiết hay dạng agarose có thể cũng ñược sử dụng nhưng có thể khác nhau về ñộ ñặc

• Chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác ñịnh con ñường phát triển của tế bào thực vật Các chất ñiều tiết sinh trưởng ñược sử dụng thông thường là các hormone thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin, cytokinin, gibberellin,

abscisic acid, ethylene

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường ñược sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong ñó môi trường MS ñược ñánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm [30]

Trên môi trường dinh dưỡng, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa ñể cho ra cây hoàn chỉnh Mỗi ñối tượng thực vật có ñặc tính khác nhau do ñó có những cách thức biến ñổi khác nhau, mặc

dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một con ñường chung cho tất cả các thực vật

2.2.5 Các ñường hướng trong nhân giống in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro sẽ tạo ra các dòng vô tính, theo

khái niệm chung về dòng vô tính trong chọn giống thì dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng ñược nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ ñược tạo ra theo các ñường hướng sau:

- Tái sinh cây trực tiếp từ ñỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách

- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai ñoạn hình thành mô sẹo

• Tái sinh cây trực tiếp

Tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy: Là quá trình phát ñộng những ñiểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây Xét về nguồn gốc các cây này có thể phát sinh từ chồi ñỉnh, chồi nách phá ngủ hoặc từ chồi mới phát sinh [32] Các cây con này ñược phát sinh từ các ñỉnh sinh trưởng có

bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn ñồng nhất về mặt di truyền và duy trì ñược các tính trạng của cây mẹ Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên ñỉnh sinh trưởng ñó là các ñoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa….Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không

hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các ñiểm sinh trưởng phụ sau ñó tái sinh thành cây con Sác xuất biến dị và ñột biến thường cao hơn so với tái sinh từ ở trường hợp nói trên [29]

• Con ñường tái sinh gián tiếp

Mẫu cấy khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp có chứa auxin và cytokinin có thể ñem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức ñó chính là các tế bào mô sẹo Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể ñược duy trì nhiều hay ít là không hạn ñịnh, chỉ cần mô sẹo ñược cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn ñịnh về mặt di truyền ðể tránh tình trạng này nên sử dụng các mô sẹo các loại

mô sẹo vừa mới phát sinh Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma từ ñó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh [19] Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể ñược sử dụng ñể mở ñầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù hay tạo ra hạt nhân tạo [13]

ðể có thể thực hiện nuôi cấy có kết quả tốt, dù bằng con ñường nào ñi chăng nữa cũng cần chú ý tới các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy vì chính các yếu tố này quyết ñịnh ñường hướng vô tính cũng như chất lượng của cây giống thu ñược

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến nuôi cấy

2.2.6.1 Ảnh hưởng của ñiều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi ñưa vào nuôi cấy là một vấn ñề cần thiết

vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… tuy nhiên, mức ñộ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và ñặc ñiểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu ñược lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nguyên liệu ban ñầu

Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng ñộ, thời gian xử lý và mức ñộ xâm nhập của chất khử trùng vào các kẽ, những phần gồ

gề trên bề mặt của mô cấy ðể làm tăng hiệu quả người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70% trong 30 giây ñể làm tăng sức căng bề mặt mẫu rồi sau ñó mới khử trùng bằng dung dịch khử trùng Các dung dịch khử trùng thường ñược sử dụng

Một số hoá chất khử trùng thông dụng Chất khử trùng Nồng ñộ

Nguồn:Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, ðại học Quóc Gia thành phố Hồ Chí Minh

ðối với các mẫu quá bẩn, việc rửa kỹ bằng nước xà phòng và ñể dưới vòi nước chảy từ 20 ñến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm ñáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy [32]

Thời gian khử trùng là một ñiều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và ñặc ñiểm của từng loại mẫu cấy Với hypochlorit, người ta thường khử trùng trong thời gian 15 - 30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể

gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu bị nhiễm khuẩn

ðể ñạt hiệu quả cao trong khử trùng cho một số mẫu nuôi cấy người ta không chỉ sử dụng một loại hoá chất mà còn sử dụng kết hợp nhiều loại ñã cho kết quả rất khả quan như ở cây kiwi, cây lát hoa côn ñảo…, khử trùng hypo-Na sau ñó mới khử trùng bằng HgCl2 [18, 27]

Sau khi khử trùng thu ñược nguồn nguyên liệu vô trùng, các mẫu cấy ñược chuyển sang các môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng

ñể thực hiện công ñoạn nhân nhanh Năng suất nhân nhanh phụ thuộc vào quá trình tác ñộng của các chất ñiều tiết sinh trưởng

2.2.6.2 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng

Các chất ñiều tiết sinh trưởng ñược dùng phổ biến nhất hiện nay là auxin và cytokinin

• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử

Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc ñẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hoá sự phân

chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao ñổi chất, tham gia ñiều chỉnh sự phân hoá của rễ, chồi…[22]

Các auxin ñược sử dụng với nồng ñộ thấp từ 10-6 - 10-1 M tuỳ theo từng chất mục ñích và ñối tượng nghiên cứu Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hoá rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo

Auxin ñược chia thành hai nhóm do có nguồn gốc khác nhau Trong ñó, auxin tự nhiên quan trọng nhất là IAA, nhưng nó chỉ ñược dùng trong một số môi trường nuôi cấy vì IAA không ổn ñịnh với nhiệt ñộ và ánh sáng Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA ñược sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA, NAA, Dicamba, 2,4,5-T, MCPA, Picloram… [30].

• Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sinh trưởng của tế

bào, cảm ứng hình thành chồi cây và loại bỏ ưu thế ngọn [22]

Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin ñược dùng ñể kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng ñộ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ [23] Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm ñược sử dụng trong môi trường nuôi cấy ñó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenin) Nhưng chúng không ñược dùng phổ biến

vì rất ñắt (ñặc biệt là zeatin) và không ổn ñịnh [22] Các chất tổng hợp tương

tự như kinetin và BAP ñược sử dụng thông dụng hơn Các chất hoá học không có based purin nhưng thay thế bằng phenylureas, cũng ñược sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone [30] Do vậy khi sử dụng các chất ñiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần ñặc biệt lưu tâm tới vấn ñề này Nhiều tác giả ñã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc ñẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo [28]

Ngoài các chất kích thích sinh trưởng nguồn cacbon bổ sung cũng có tác ñộng ñến quá trình nuôi cấy, ảnh hưởng ñến chất lượng mẫu cấy và quá trình phát sinh hình thái mẫu

2.2.6.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ ñường

Ở mô và tế bào nuôi cấy sự quang hợp thường bị hạn chế do vậy, cần

bổ sung nguồn cacbon cho mô tăng trưởng ðường vừa là nguồn các bon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, ñồng thời còn tham gia ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường ðường ñóng góp khoảng 50 - 70% vào khả năng thẩm thấu của môi trường [13] Thông thường ñường saccharose ñược sử dụng ở nồng

ñộ 2 - 3%, nhưng nồng ñộ này có sự thay ñổi ở từng ñối tượng khác nhau và mục ñích nuôi cấy khác nhau có khi xuống tới 2% (tạo dòng), có khi tăng lên

ñến 12% (gây cảm ứng stress nước)

Sự hình thành rễ ñòi hỏi một lượng ñường ñược cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh vì thực chất sự ra rễ là một quá trình hô hấp Ở hầu hết các loài thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng ñường 20 - 30 g/lít [21]

Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro ñã phát triển tốt trên môi trường không có ñường và vitamin, ñộ thoáng

khí cao, tỷ lệ nhiễm nấm giảm ñáng kể, cây có diện tích lá lớn hơn và sự ñóng

mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp ñiều kiện thay ñổi của môi trường Trong khi ñó cây nuôi cấy theo ñiều kiện truyền thống (có ñường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều

giờ khi chuyển từ ñiều kiện in vitrro ra vườn ươm Tỷ lệ sống 95 - 100 % sau

một tháng ở vườn ươm ñối với cây nuôi cấy trên môi trường không có ñường, trái lại chỉ từ 70 - 80% theo phương pháp truyền thống [21]

Nghiên cứu nhằm tăng năng suất nhân nhanh cũng như chất lượng các

mô tế bào nuôi cấy in vitro, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhiều

thành phần khác Trong ñó, than hoạt tính là thành phần rất ñược quan tâm vì

có nhiều tác ñộng tích cực cho nuôi cấy

2.2.6.4 Ảnh hưởng của than hoạt tính

Than hoạt tính ban ñầu ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñể cố gắng

mô phỏng ñiều kiện trồng trọt sau ñó, nó ñược sử dụng rất rộng rãi trong nhiều

môi trường nuôi cấy Tác dụng của than hoạt tính với các mẫu cấy in vitro là tỷ

lệ cây sống cao, cây sinh trưởng tốt, cải thiện chất lượng và ñộ khoẻ của cây

Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật ñó là, sự hút thấm bề mặt của thành phần môi trường, hút thấm các thành phần không sạch của agar, hút thấm hoặc giải phóng chất ñiều hoà sinh trưởng, làm ñen môi trường, ảnh hưởng tới pH môi

trường, xúc tác bẻ gãy ñường saccharose trong khử trùng ðiều tra tác dụng của than hoạt tính trong khử trùng và sự thuỷ phân ñường trong môi trường nuôi cấy cho thấy Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose tỷ lệ ñường thuỷ phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 % còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20% [21] Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy Ngoài ra than hoạt tính còn ñược công nhận là có tác dụng kích thích sự

phát triển của mô in vitro như kích thích tạo củ của trinh nữ hoàng cung

[1], tác dụng hình thành rễ ở cây bạch ñàn, trầm hương [7]

Sau khi ñã tạo ñược cây hoàn chỉnh có chất lượng tốt, các cây in vitro

này ñược chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên, giai ñoạn này gặp nhiều khó khăn và có ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất nuôi cấy

2.2.6.5 Ảnh hưởng của ñiều kiện ra cây

ðây là giai ñoạn quan trọng nhằm ñưa cây nuôi cấy ra ngoài ñiều kiện

tự nhiên, huấn luyện cây thích nghi với các ñiều kiện nhiệt ñộ, ẩm ñộ, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế ñộ dị dưỡng sang chế ñộ tự dưỡng ðối với một số cây có thể chuyển chồi chưa có rễ ra ñất nhưng với ña số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi ñã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới ñược cấy chuyển

ra vườn ươm Quá trình thích nghi dần với ñiều kiện ngoài vườn ươm cây con cần ñược chăm sóc ñặc biệt

- Cây ñược trồng trong ñiều kiện ñược bảo vệ và ñược cung cấp ñủ ẩm bằng cách tưới phun sương

- Giá thể trồng có thể là ñất mùn, ñất cát hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa ñất

- Các chất dinh dưỡng bón bổ sung thường ở dạng dung dịch phun qua lá Khi ñã xác ñịnh ñược toàn bộ cách thức và các yếu tố cần thiết cho

nuôi cấy thì có thể tạo ra ñược một quy trình sản xuất cây giống với quy mô công nghiệp hợp lý Mặc dù với mỗi ñối tượng có sai khác nhưng qua quá trình nghiên cứu và sản xuất cây giống từ cây nuôi cấy mô ñã tổng kết quá trình này cơ bản có những bước chung

2.2.7 Quá trình sản xuất cây nuôi cấy mô

2.2.7.1 Chuẩn bị mẫu làm vật liệu khởi ñầu

ðây là gia ñoạn rất quan trọng, cần ñặc biệt chú ý vì những ñặc tính của vật liệu khởi ñầu sẽ ñược duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này Giai ñoạn này bao gồm các khâu:

- Chọn lọc cây mẹ ñể lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao

- Chọn cơ quan ñể lấy mẫu, thường là chồi non, ñoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non và hạt

- Chọn mô ñể nuôi cấy, mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm sạch bệnh, giữ ñược các ñặc tính ưu việt của cây mẹ, ít có nguy cơ biến dị

2.2.7.2 Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

ðây là giai ñoạn ñưa các mẫu nuôi cây vào quá trình sản xuất vô trùng gồm các khâu sau:

ñược chuyển sang giai ñoạn tiếp theo

2.2.7.3 Nhân nhanh chồi

Khi mẫu cấy sạch ñã ñược tạo ra, từ ñó nhân lên thành các cụm chồi hoặc các phôi vô tính sinh trưởng tốt quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai ñoạn sản xuất Giai ñoạn này cần tạo ra tốc ñộ nhân nhanh cao nhất trong ñiều kiện nuôi cấy vì vậy, thành phần và ñiều kiện môi trường phải ñược tối ưu nhằm ñạt ñược mục tiêu nhân nhanh Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng từ một ñến hai tháng tháng tuỳ loại cây Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển ñạt khoảng 2- 8 lần/lần cấy chuyển Giai ñoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban ñầu không nên kéo dài quá lâu ñể tránh biến dị soma

Ví dụ: từ một chồi cây chuối chọn lọc ban ñầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 - 3000 chồi cây sau 7 - 8 lần cấy chuyển [26]

Các chồi nhân nhanh cần ñược chuyển sang môi trường tạo rễ ñể tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.2.7.4 Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng thông thường các chồi này phải ñược cấy chuyển sang một môi trường khác ñể kích thích tạo rễ Ở một số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ khi ñược chuyển trực tiếp ra ñất Giai ñoạn này trong vòng từ 2 - 8 tuần Sau khi cây ñã ñược tái sinh hoàn chỉnh sẽ ñược ñưa trở về ñiều kiện tự nhiên ñể sản xuất ñại trà

ðể cây thích ứng ñược với ñiều kiện tự nhiên vốn rất khác biệt so với ñiều kiện phòng nuôi cần rất lưu ý ñến quá trình chuyển cây ra vườn ươm

2.2.7.5 Chuyển cây ra vườn ươm

ðây là giai ñoạn ñầu tiên chuyển cây từ ñiều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ñiều kiện ngoài tự nhiên Cây cần ñược chăm sóc cẩn thận ñể ñạt tỷ lệ sống cao Giai ñoạn này ñòi hỏi từ 4 - 16 tuần tuỳ từng ñối tượng nghiên cứu

2.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất xuyên khung

Xuyên khung là loại cây có nguồn gốc ở khu vực miền núi của tỉnh Tứ Xuyên Trung Quốc, ñược người dân Trung Quốc ñưa vào trồng trọt ñến nay không còn thấy trong hoang dại

Xuyên khung ñược di thực vào Việt Nam từ năm 1964 tại trại thuốc Sapa, trại thuốc Tam ñảo thuộc Viện Dược Liệu Tại ñây những nghiên cứu

về xuyên khung ñược tiền hành

Nghiên cứu ñầu tiên trên ñối tượng này là việc tìm hiểu một số biện pháp kỹ thuật trồng trọt và nhân giống như: Biện pháp làm ñất, mật ñộ và khoảng cách trồng, phân bón và kỹ thuật bón, thời vụ trồng Từ ñó ñã ñưa xuyên khung vào sản xuất ñại trà ở một số vùng núi cao của các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La, Lào Cai, Thanh Hoá Sản lượng ñáp ứng nhu cầu

sử dụng trong nước, chủ yếu cung cấp cho thuốc y học cổ truyền và thuốc hạ nhiệt, giải cảm khung chỉ

Cuối những năm 60, Viện dược liệu ñã tổng kết kinh nghiệm trồng xuyên khung trong tài liệu “Kỹ thuật trồng cây thuốc”, ñề tài cấp bộ “Hồi cứu xây dựng qui trình trồng một số cây thuốc thiết yếu”, ñã nghiên cứu kỹ thuật nhân giống bằng hom thân với các thí nghiệm xử lý mầm qua ñông Kỹ thuật trồng xuyên khung ñược xuất bản trong tài liệu “Kỹ thuật trồng , sử dụng và chế biến cây thuốc ” xuất bản năm 2005

Trong quá trình trồng trọt ở Việt Nam, do yếu tố khí hậu, ñất ñai, sâu bệnh và một số yếu tố kỹ thuật không phù hợp ñã làm cho năng suất và chất lượng xuyên khung giảm sút, sản lượng không ñáp ứng ñủ nhu cầu tiêu dùng

trong nước Cho ñến nay vấn ñề thoái hoá xuyên khung chưa ñược quan tâm thích ñáng và chưa có nghiên cứu nào nhằm khôi phục chất lượng giống Cũng chính vì lý do trên nên hiện nay tổng diện tích trồng xuyên khung trong

cả nước bị thu hẹp, vùng trồng rải rác manh mún nên những số liệu thông kê chính xác về diện tích, sản lượng trồng cây thuốc này chưa ñược thống kê chính xác và cụ thể

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

- Nguồn vật liệu vật liệu cho khử trùng là chồi ñỉnh của xuyên khung ñược thu hái từ thực ñịa

- Nguồn vật liệu cho giai ñoạn nhân nhanh chồi là chồi ñơn ñược lựa chọn ở giai ñoạn tạo nguồn vật liệu ban ñầu

- Nguồn vật liệu cho giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh là các chồi ñơn ñủ tiêu chuẩn ( 4 lá/chồi, không bị biến dị ) ở giai ñoạn nhân nhanh

- Môi trường nuôi cấy cơ bản: Là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có cải tiến, pH môi trường ñược ñiều chỉnh tới 5,8 và hấp dưới áp suất 0,8 kg/cm2 ở nhiệt ñộ 1200C trong 25phút

- Thành phần môi trường MS cải tiến gồm:

+ Khoáng ña lượng, vi lượng

+ Vitamin: Vitamin B1 với nồng ñộ 1mg/l

Vitamin PP với nồng ñộ 1mg/l

+ Agar 7g/l

- Chất ñiều hoà sinh trưởng: BA, IBA, αNAA, Kinetin

- Các hợp chất hữu cơ (than hoạt tính, ñường saccharose, nước dừa)

- Chất khử trùng clorua thuỷ ngân (HgCl2)

- Giá thể ngoài vườn ươm:

+ ðất: ðất dùng trong thí nghiệm là ñất phù sa ñược lấy từ bãi sông, thường ñược dùng ñể ñóng bầu ươm nhiều loại cây con giống

+ Cát: là loại cát ñen cũng ñược hút từ sông sau ñó ñược phơi và sàng sạch lẫn tạp

+ Phân chuồng: Loại phân chuồng ñược dùng là phân ñược ủ hoai mục

- Dung dịch MS (chỉ gồm khoáng ña lượng và vi lượng): ðây là loại dung dịch ñược coi là tương ñối giàu và cân ñối phù hợp với nhiều loại cây trồng trong

ñó có cả cây một lá mầm và hai lá mầm

- Dung dịch dinh dưỡng AB [24]: Là một sản phẩm phân bón dạng lỏng do ông Lomarirton Pot người Australia nghiên cứu và sáng chế sau ñó ñược sử dụng rất rộng rãi Tới nay công nghệ sản xuất loại phân này ñã ñược chuyển giao và sản xuất tại Trung Quốc

+ Thành phần của phân gồm hai phần:

Loại dinh dưỡng A: chứa ñầy ñủ các chất ña, trung, vi lượng giúp cây trồng tăng cường khả năng tích luỹ phát triển rễ, củ, hoa, quả, hạt

Loại dinh dưỡng B: chứa nhiều nguyên tố ña lượng chủ yếu là ñạm, lân giúp cây phát triển về thân, lá, làm tăng chất xanh cho cây

+ Cách dùng phun qua lá:

Giai ñoạn cây non: Phối trộn với tỷ lệ: 2B - 1A pha với nồng ñộ 1% Giai ñoạn cây trưởng thành: Phối trộn với tỷ lệ: 1A - 1B pha với nồng

ñộ 1%

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu của ñề tài ñược tóm tắt bằng sơ ñồ thí nghiệm sau:

I Tạo nguồn vật liệu ban ñầu Ảnh hưởng của nồng ñộ khử trùng (0,07%; 0,1%; 0,15%) và thời gian khử trùng (5, 10, 15, 20 phút) tới hiệu quả khử trùng

II Giai ñoạn nhân nhanh

1 Ảnh hưởng của Kienin

2 Ảnh hưởng của Kinetin + αNAA

3 Ảnh hưởng của BA

4 Ảnh hưởng của BA + αNAA

5 Ảnh hưởng của nước dừa III.Tạo cây hoàn chỉnh

1 Ảnh hưởng của αNAA

2 Ảnh hưởng của αNAA + than hoạt tính

3 Ảnh hưởng của IBA

4 Ảnh hưởng của IBA + than hoạt tính

5 Ảnh hưởng ñường tới sự phát sinh hình thái

IV Giai ñoạn ngòai vườn ươm

1 Ảnh hưởng của giá thể trồng

2 Ảnh hưởng của thời vụ ra cây

3 Ảnh hưởng của chế ñộ chăm sóc

Chồi ñỉnh của

xuyên khung

Tạo nguồn vật liệu

ban ñầu

Nhân nhanh chồi

Tạo cây hoàn chỉnh

Vườn ươm

3.2.1 Nội dung 1: Tạo nguồn vật liệu ban ñầu

Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,07%, 0,1%, 0,15% trong

thời gian 5, 10, 15, 20 phút

3.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu giai ñoạn nhân nhanh

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ BA tới hệ số nhân

chồi của xuyên khung trong nuôi cấy

Công thức 1: Môi trường MS

Công thức 2: Môi trường MS + 0,5mg/l BA

Công thức 3: Môi trường MS + 0,75mg/l BA

Công thức 4: Môi trường MS + 1,0 mg/l BA

Công thức 5: Môi trường MS + 1,5 mg/l BA

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA tới hệ

số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy

Công thức 1: Môi trường MS

Công thức 2: Môi trường MS + C mg/lít BA + 0,1 mg/l αNAA

Công thức 3: Môi trường MS + C mg/lít BA + 0,2 mg/l αNAA

Công thức 4: Môi trường MS + C mg/lít BA + 0,3 mg/l αNAA

(Trong ñó C là nồng ñộ BA cho hệ số nhân chồi cao nhất)

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin tới hệ số nhân chồi

của cây xuyên khung trong nuôi cấy

Công thức 1: Môi trường MS

Công thức 2: Môi trường MS + 0,5mg/l kinetin

Công thức 3: Môi trường MS + 0,75mg/l kinetin

Công thức 4: Môi trường MS + 1,0 mg/l kinetin

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp kinetin + αNAA tới hệ số

nhân chồi của cây xuyên khung trong nuôi cấy

C ông thức 1: Môi trường MS

Công thức 2: Môi trường MS + D mg/lít BA + 0,1 mg/l αNAA

Công thức 3: Môi trường MS + D mg/lít BA + 0,2 mg/l αNAA

Công thức 4: Môi trường MS + D mg/lít BA + 0,3 mg/l αNAA

(Trong ñó D là nồng ñộ kinetin cho hệ số nhân chồi cao nhất)

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nước dừa tới hệ số nhân chồi của xuyên

khung trong nuôi cấy

Công thức 1: MS

Công thức 2: MS + 5% nước dừa

Công thức 3: MS + 10% nước dừa

Công thức 4: MS + 15% nước dừa

Công thức 5: MS + 20% nước dừa

3.2.3 N ội dung 3: Nghiên cứu giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của αNAA tới sự ra rễ của cây xuyên khung

trong nuôi cấy

Công thức 1: Môi trường MS

Công thức 2: Môi trường MS + 0,1mg/l αNAA

Công thức 3: Môi trường MS + 0,3mg/l αNAA

Công thức 4: Môi trường MS + 0,5mg/l αNAA

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA + than hoạt tính tới sự ra

rễ của cây xuyên khung trong nuôi cấy

Công thức 1: Môi trường MS

Công thức 2: Môi trường MS + E mg/l αNAA + 0,25g/l than hoạt tính