Nghiên cứu kỹ thuật tạo giống dưa chuột đơn bội nuôi cấy in vitro bao phấn

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

ðặng Thị Mai

- Tập thể cán bộ bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Rau Quả ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt ñề tài tốt nghiệp

- Cảm ơn gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tác giả luận văn

ðặng Thị Mai

2.3 Cây ñơn bội và vị trí của cây ñơn bội trong chọn tạo giống cây trồng 152.4 Những nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây ñơn bội

4.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo callus từ nuôi cấy invitro bao phấn dưa chuột 354.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng cơ bản

ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 354.1.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ở 4oC ñến hiệu quả tạo callus

4.1.3 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi

4.1.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ auxin ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi

4.1.5 Ảnh hưởng của của tổ hợp auxin và cytokinin ñến hiệu quả tạo

4.2 Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 654.2.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ Thidiazuron (TDZ) ñến khả năng tái

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến sự tái sinh từ callus của bao

4.2.5 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường tạo

4.2.6 Kết quả phân tích ñộ bội của cây dưa chuột thu ñược bằng

phương pháp xác ñịnh gián tiếp hàm lượng ADN bằng máy Flow

4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men ñến khả

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

4.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến hiệu quả tạo

4.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến ñộng thái tăng

4.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến hiệu quả tạo callus từ

4.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến ñộng thái tăng trưởng

4.5 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến hiệu quả tạo callus bao

4.6 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến ñộng thái tăng trưởng

4.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ αNAA ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi

4.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ αNAA ñến ñến ñộng thái tăng trưởng

4.9 Ảnh hưởng của nồng ñộ IAA ñến ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi

4.10 Ảnh hưởng của nồng ñộ IAA ñến ñộng thái tăng trưởng callus

4.11 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy

4.12 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến ñộng thái tăng trưởng callus 55 4.13 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + KI ñến hiệu quả tạo callus bao phấn

4.14 Ảnh hưởng của 2,4D + KI ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua

4.15 Ảnh hưởng của 2,4D + BAP ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in

4.16 Ảnh hưởng của 2,4D + BAP ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua

4.17 Ảnh hưởng của nồng ñộ TDZ ñến sự tái sinh từ callus bao phấn

4.18 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến sự tái sinh từ callus bao phấn

4.19 Ảnh hưởng của TDZ + BAP ñến khả năng tái sinh cây từ callus

4.20 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường tạo

4.22 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men ñến khả năng nhân

4.23 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng nhân nhanh cây dưa

4.24 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA ñến khả năng nhân nhanh cây

4.4 Ảnh hưởng của chiều dài nụ hoa ñến ñộng thái tăng trưởng của

4.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến ñộng thái tăng trưởng của

4.10 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D+ BAP ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus 62

4.14 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường tạo

callus ñến tỷ lệ mẫu tái sinh của callus bao phấn dưa chuột 73

4.16 Kết quả phân tích ñộ bội của cây dưa chuột thu ñược bằng máy

4.17 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men ñến khả năng nhân

1 MỞ đẦU

1.1 đặt vấn ựề

Cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) là loại cây rất quen thuộc ở nước ta

Quả có thể dùng ăn tươi hoặc chế biến ựược nhiều món ăn ngon Ngoài ra, dưa chuột còn có giá trị như một vị thuốc quý, trong quả dưa chuột có chứa hàm lượng vitamin C khá cao và một số men có lợi cho kắch thắch tiêu hoá rất tốt cho sức khỏe đặc biệt, quả dưa chuột ựã ựược chế biến thành nhiều mặt hàng

ựa dạng như: ựóng lọ, thái lát, muối mặn xuất khẩu sang một số nước châu

Âu, châu Mỹ, châu Á: Hoa Kỳ, Hàn Quốc, đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Singapo [10]

Trong những năm gần ựây mặc dù ựã có nhiều có gắng trong công tác chọn, tạo giống nhưng bộ giống dưa chuột ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế Các giống dưa chuột dùng cho ăn tươi, tiêu thụ nội ựịa thì năng suất, hiệu qủa kinh tế thấp Các giống dùng cho chế biến công nghiệp, xuất khẩu còn quá ắt không ựủ ựáp ứng cho nhu cầu sản xuất Trước yêu cầu của thực tế sản xuất, việc chọn tạo những giống dưa chuột có năng suất cao, phẩm chất tốt phục vụ cho nhu cầu ăn tươi và chế biến là rất cần thiết

Ở hầu hết các nước việc chọn tạo các giống dưa mới ựều theo hướng tạo

ra các giống dưa F1 có ưu thế lai cao từ các dòng bố mẹ thuần chủng Nhưng dưa chuột có ựặc ựiểm là cây ựơn tắnh cùng gốc, giao phấn chủ yếu nhờ côn trùng nên việc tạo ra các dòng thuần bằng phương pháp truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian và công sức Dòng thuần ựược tạo ra bằng cách tự thụ phấn và chọn lọc qua nhiều thế hệ (7 - 8 thế hệ) Mặc dù vậy phương pháp này nhiều khi vẫn không ựạt ựược dòng bố mẹ ựồng hợp tử ở tất cả các cặp alen Chắnh vì vậy, việc rút ngắn thời gian chọn tạo dòng thuần là một yêu cầu rất quan trọng trong công tác chọn tạo giống mới nói chung và chon tạo giống dưa chuột nói riêng

Bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn dưa chuột sẽ khắc phục nhược ñiểm của phương pháp trên Cây ñơn bội kép tạo ra từ nuôi cấy bao phấn có ñộ ñồng hợp tử tuyệt ñối, hoàn toàn không phân ly trong các thế hệ sau và có thể tạo ra ñược trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết kiệm ñược rất nhiều công sức, tiền của và ñặc biệt rút ngắn thời gian cho công tác chọn tạo giống Kỹ thuật tạo cây ñơn bội invitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây khi nuôi cấy bao phấn cho phép nhanh chóng tạo ra cơ thể ñơn bội và thông qua sự ña bội hoá tạo ra cơ thể ñồng hợp tử[16] ðây là nguồn vật liệu quan trọng cho việc tạo ra giống dưa chuột có ưu thế lai cao Do ñó, ñể nâng cao hiệu quả trong việc tạo ra dòng thuần bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn thì việc tìm ra các ñiều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy là rất cần thiết

Hiện nay, trên thế giới kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây ñơn bội invitro

ñã ñược nhiều nước nghiên cứu và ñã thu ñược thành công trên nhiều ñối tượng cây trồng khác nhau như: Lúa, ngô, ớt, thuốc lá, dưa hấu, bầu bí Những nước

ñi ñầu trong lĩnh vực này là Pháp, Mỹ, Trung Quốc và Nhật Bản

Ở Việt Nam, Việc nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây ñơn bội invitro ñã thu ñược một số thành công nhất ñịnh Tuy nhiên, công tác này mới chỉ tập trung chủ yếu trên lúa và ngô Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột còn rất hạn chế, cho ñến nay chưa có quy trình hoàn thiện về nuôi cấy bao phấn tạo cây dưa chuột ñơn bội invitro Trước yêu cầu của thực tế của sản xuất cùng với việc kế thừa các kết quả

nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi tiến hành ñề tài: "Nghiên cứu kỹ thuật tạo cây dưa chuột ñơn bội từ nuôi cấy in vitro bao phấn’’ Trên ñây cũng chính là một phần của ñề tài nghiên cứu cấp bộ: “Nghiên cứu tạo dòng ñơn bội kép (dưa chuột, ớt) phục vụ chọn tạo giống ưu thế lai” Thuộc chương trình công nghệ sinh học nông nghiệp giai ñoạn 2006 – 2010

1.2 Mục ñích, yêu cầu của ñề tài

1.2.1 Mục ñích của ñề tài

Xây dựng quy trình kỹ thuật tạo cây dưa chuột ñơn bội bằng nuôi cấy

bao phấn nhằm cung cấp nguồn vật liệu khởi ñầu cho công tác tạo giống dưa

chuột ưu thế lai bằng công nghệ ñơn bội kép

1.2.2 Yêu cầu của ñề tài

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng tạo callus từ nuôi cấy

invitro bao phấn dưa chuột (thời gian xử lý lạnh, kích thước nụ hoa, môi trường dinh dưỡng cơ bản, chất ñiều tiết sinh trưởng )

- Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung một số chất ñiều tiết sinh

trưởng vào môi trường nuôi cấy ñến khả năng tái sinh chồi từ callus

- Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung một số chất ñiều tiết sinh

trưởng và dịch chiết hữu cơ vào môi trường nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh in vitro cây dưa chuột ñơn bội

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

ðề tài góp phần cung cấp dẫn liệu khoa học về: Tác ñộng của các yếu tố như thời gian xử lý lạnh, kích thước nụ hoa, nền môi trường dinh dưỡng cơ bản, chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả năng phát sinh callus từ bao phấn, khả năng tái sinh chồi từ callus, khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột ñơn bội in vitro Từ ñó ñề xuất quy trình nuôi cấy in vitro bao phấn tạo cây ñơn bội Sản phẩm của ñề tài sẽ ñược dùng làm nguồn vật liệu khởi ñầu cho công tác chọn tạo giống dưa chuột ưu thế lai

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây dưa chuột

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Cây dưa chuột thuộc họ bầu bắ, có nguồn gốc ở vùng rừng nhiệt ựới ẩm thuộc Nam Châu Á (ven đông Ấn độ, Malaca, Nam Trung Quốc), thuộc nhóm cây ưa nhiệt Trong họ bầu bắ, dưa chuột là cây ựược trồng nhiều hơn Dưa chuột có mặt ở Trung Quốc rất sớm, hơn 100 năm trước công nguyên, tuy nhiên hầu hết các loại dưa chuột có ở Châu Phi Nhiều tài liệu cho rằng dưa chuột có nguồn gốc từ dãy núi Hymalaya nơi có những loài dưa chuột

hoang dại có quan hệ chặt chẽ với loài cucumis Hardi wichil Royle và ựược

ựưa ựến một số vùng Tây Châu Á, Bắc Phi, Nam Châu Âu Dưa chuột ựược gieo trồng ở Ấn độ cách ựây 3000 năm Từ ựó ựược lan truyền khắp các nước trên thế giới, ựặc biệt các vùng nhiệt ựới Vì vậy, dưa chuột là loại rau ưa nhiệt ựộ ấm áp và những vùng nhiệt ựới mát mẻ Nhiệt ựộ thắch hợp ựể trồng dưa chuột là 18 Ờ 30oC[3]

Ở nước ta, cây dưa chuột có thể trồng ựược ở tất cả các vùng trong cả nước nhưng thắch hợp nhất chủ yếu ở ựồng bằng và trung du, miền núi phắa bắc Một số tỉnh trồng nhiều dưa chuột như Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Nam định, Hà Nội, Phú Thọ [10]

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế

* Giá trị dinh dưỡng

Dưa chuột là loại rau truyền thống, ựược trồng lâu ựời trên thế giới và

ựã trở thành một trong các thực phẩm thông dụng của nhiều dân tộc Dưa chuột có thể ăn tươi, dùng ựể giải khát rất tốt, hoặc cũng có thể dùng ựể trộn xalát, muối chua, muối mặn hoặc ựóng hộp Quả dưa chuột có hàm lượng

nước thấp hơn các loại quả khác trong họ bầu bí nhưng lại có hàm lượng protêin cao Dưa chuột có nhiều loại ñường, và một số loại axit amin, bêta - caroten, Vitamin B1, C, Canxi, phốt pho, sắt và kali Do ñặc ñiểm giàu các nguyên tố khoáng như kali và ít Natri, dưa chuột kích thích sự lưu thông nước trong cơ thể, có tác dụng lợi tiểu và tái tạo khoáng Ngoài ra, dưa chuột có công dụng thanh nhiệt, chống khát, giải ñộc, tốt cho người tiểu tiện khó, rôm sảy Dưa chuột có tác dụng ức chế sự hình thành mỡ trong cơ thể, ñồng thời làm giảm cholesterol và chống khối u Bên cạnh ñó dưa chuột còn có tác dụng làm ñẹp, ñắp mặt nạ bằng dưa chuột có tác dụng bảo vệ da và chống lại các nếp nhăn Theo “Bảng thành phần hoá học thức ăn Việt Nam - 1972”: Trong 100g dưa leo ăn ñược có chứa 95% nước, Protein 0,8 mg; Gluco 3,0 mg; Canxi 23 mg; Photpho 27 mg; tiền Vitamin A 0,3 mg; vitamin B1 0,04 mg; vitamin PP 0,1 mg và Vitamin C 5mg [1],[4]

Ngoài những giá trị về dinh dưỡng như trên thì dưa chuột còn có giá trị như một vị thuốc quý Ở Trung Quốc người ta dùng làm thuốc thanh nhiệt, lợi niệu, giải ñộc, dùng trị tiểu tiện bất lợi, hầu họng sưng ñau, ñau mắt do nóng

và vết thương bỏng lửa[9]

* Giá trị kinh tế

Dưa chuột là loại rau ăn quả có thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao Trong vụ thu - ñông có thời gian chiếm ñất 70 - 85 ngày, mỗi ha có thể thu ñược 15 - 20 tấn quả xanh, trong vụ xuân - hè khả năng cho năng suất còn cao hơn nữa Vì vậy, trong những năm gần ñây, dưa chuột là loại cây trồng ñã ñược một số ñịa phương mạnh dạn ñưa vào sản xuất và thu ñược hiệu quả kinh tế cao[10]

Một thí dụ ñiển hình là hợp tác xã Minh Tân, huyện Vụ Bản, Nam ðịnh Các xã viên thu hoạch dưa chuột vụ xuân ñược hơn 1,8 tấn/sào, giá bán

700 ñồng/kg, thu về khoảng 1,3 triệu ñồng Như vậy, chỉ tính riêng trồng dưa

chuột xanh xuất khẩu vụ ựông và vụ xuân ựã cho thu nhập gần 70 triệu ựồng; thêm một vụ lúa mùa nữa thì thu nhập cả năm không dừng lại ở con số 80 triệu ựồng/năm Theo số liệu ựiều tra của viện Kinh tế Nông nghiệp Năm

2005 tại 4 tỉnh phắa bắc gồm Hà Nội, Hà Tây, Nam định, Thái Bình cho thấy hiệu quả thu ựược từ việc trồng dưa chuột gấp 1,6 - 7,0 lần so với các loại cây trồng khác như lúa, ngô, bắp cải, cà chua [10]

Ngoài ra, dưa chuột còn là nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến và là mặt hàng xuất khẩu có giá trị thu ngoại tệ lớn Hiện nay các loại rau xuất khẩu chắnh của nước ta là: Dưa chuột, cà chua, cà rốt, hành, ngô rauẦTrong ựó dưa chuột, cà chua có nhiều triển vọng và chúng có thị trường xuất khẩu tương ựối ổn ựịnh ựó là: Trung Quốc, đài Loan, Nhật Bản, Tiệp Khắc, đức, Mỹ, Nga và SigaporeẦ[15] Theo số liệu của tổng cục thống kê

về xuất khẩu rau quả Việt Nam, dưa chuột ựược chế biến chẻ thanh ựã xuất khẩu sang thị trường Châu Âu từ năm năm trở lại ựây trung bình 2.309 tấn mỗi năm[37]

ổn ựịnh mà còn tăng về chủng loại và khối lượng Việc tổ chức sản xuất tốt cùng việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật mới về giống, thâm canh và công nghệ chế biến sẽ còn mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn [15]

2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dưa chuột

Dưa chuột là loại rau ăn quả có thể ựược sử dụng ựể ăn tươi, dầm dấm hay muối mặnẦQuả dưa chuột có thể chế biến thành nhiều mặt hàng khác nhau Do

ựó loại cây này ựang là nguồn thu của nhiều quốc gia Trong những năm gần ựây

ựã có nhiều nước trên thế giới xuất, nhập khẩu loại quả này dưới dạng ăn tươi hay chế biến Dưới ựây là bảng số liệu thống kê tình hình sản xuất dưa chuột của một số nước trên thế giới năm 2005

Bảng 2.1: Diện tích, năng suất, sản lượng dưa chuột một số nước

trên thế giới năm 2005

(ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (1000 tấn)

Bảng 2.2: Tình hình xuất nhập khẩu dưa chuột một số nước

trên thế giới năm 2005

Như vậy, nhiều quốc gia vừa xuất khẩu vừa nhập khẩu dưa chuột điều

ựó cho thấy rằng công nghệ chế biến ựồ hộp chỉ ựang tập trung vào một số nước phát triển như Hoa kỳ, CanadaẦ Những nước này, ngoài lượng dưa chuột sản xuất trong nước ựã nhập khẩu một lượng lớn dưa chuột ở dạng quả tươi, sau quá trình chế biến, xuất khẩu dưa chuột dưới dạng ựồ hộp[10]

Nước ta, dưa chuột ựược xuất khẩu chủ yếu ở một số tỉnh phắa Bắc, một

số công ty rau qủa Hà Nội, công ty rau quả Thanh Hoá, Hải DươngẦ thu lợi nhuận cao Các mặt hàng dưa chuột xuất khẩu chủ yếu dưới dạng quả tươi, dưa bao tử, dưa chuột muối dưa, dầm giấmẦ sang một số nước châu Âu, châu Mỹ, châu Á: Hoa Kỳ, Hàn Quốc, Trung Quốc, đài Loan, Nhật Bản Ầ[15]

Hải Dương và Hưng Yên là 2 tỉnh ựứng ựầu về diện tắch và sản lượng dưa chuột Theo số liệu thống kê cho thấy năm 2003 Hưng Yên có 559 ha trồng dưa chuột, sản lượng 94,58 ngàn tấn, năng suất 16,91 tấn/ha, năm 2004

diện tích ñạt 725 ha, sản lượng 423,9 ngàn tấn, năng suất 19,64 tấn/ha Năm

2000, tỉnh Hải Dương xuất khẩu ñược 8.000 tấn, năm 2004 ñạt 15.000 tấn, tỉnh Thái Bình xuất khẩu ñạt 62,5 tấn, năm 2001 ñạt 72 tấn, dự kiến ñến năm

2010 xuất khẩu ñạt 20.000 tấn Như vậy, dưa chuột là cây trồng quan trọng mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nông nghiệp nước ta và góp phần thực hiện thắng lợi chương trình 1 tỷ ñô la Mỹ xuất khẩu rau quả ñến năm 2010.[15]

2.2 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn

2.2.1 Giới thiệu chung

Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy invitro bao phấn trong có chứa các tiểu bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong môi trường dinh dưỡng tạo ra cây ñơn bội, là một lối thoát kỳ diệu ñối với lĩnh vực ứng dụng cây ñơn bội vào công tác chọn giống cây trồng Thông qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khó khăn trong lai xa Các dòng thuần có thể nhanh chóng ñược tạo ra từ nuôi cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất Sơ ñồ tạo cây ñơn bội từ nuôi cấy bao phấn như sau [13],[36]:

Phôi hoá

Cây ñơn bội

Tạo callus

Cây ñơn bội

Nuôi cấy bao phấn trên môi

trường dinh dưỡng ñặc hiệu

Một số ưu ñiểm của phương pháp này như sau: Kỹ thuật khá ñơn giản,

ở một số loài sự phân chia tế bào dễ dàng ngay cả khi những tế bào hạt phấn chưa thực sự chín Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với môi trường nuôi cấy cao (tần suất cảm ứng môi trường cao) và có thể sản xuất thể ñơn bội với số lượng lớn trong thời gian ngắn

Một số nhược ñiểm chính của tạo thể ñơn bội bằng nuôi cấy bao phấn là: ðối với một số loài nhiều cây tạo ra không phải là ñơn bội Ở cây ngũ cốc, thu ñược cây xanh rất ít; nhiều cây bạch tạng hoặc bị thể khảm[36]

Nuôi cấy bao phấn là một phương pháp ñể tạo ra các dòng ñồng hợp tử, trong một quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng phương pháp truyền thống[25], [45], [51] Cây ñơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của nuôi cấy bao phấn, chúng có ñặc ñiểm là ñồng hợp tử tuyệt ñối và ñược coi là nguồn vật liệu ña dạng phong phú cho chọn tạo giống [41], [44], [22] Thông qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khó khăn trong lai xa

Các dòng thuần có thể nhanh chóng ñược tạo ra từ nuôi cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất

Như vậy, phương pháp nuôi cấy bao phấn ñã góp phần rút ngắn rất nhiều thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc và giúp giải quyết vấn ñề trong lai xa Chính vì vậy mà phương pháp này ñang ñược áp dụng rộng rãi trong chọn tạo giống cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu quả nuôi cấy bao phấn

Nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn cho chúng ta thấy hiệu quả của nuôi cấy bao phấn nói chung và bao phấn dưa chuột nói riêng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: ðiều kiện sinh lý của cây mẹ, giai ñoạn phát triển của hạt phấn, biện pháp xử lý nhiệt, ñặc biệt là kiểu gen của cây cho

phấn và thành phần của môi trường dinh dưỡng [20], [26] [31], [35]

* Ảnh hưởng của cây cho bao phấn

Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn ñến kết quả nuôi cấy không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong một loài Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một ñặc ñiểm có khả năng di truyền [43], [47], [55]

Tác giả N.A.Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua ñến hiệu quả nuôi cấy bao phấn cho thấy: trong số 85 kiểu gen của các giống ñược ñưa vào nuôi cấy, callus chỉ ñược tạo ra từ bao phấn của 53 giống

Sự tái sinh cây chỉ có ñược từ callus của 15 giống Số liệu thu ñược ch thấy kiểu gen ảnh hưởng ñáng kể ñến hiệu quả nuôi cấy bao phấn [46]

Kiểu gen là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết ñịnh ảnh hưởng ñến

sự hình thành callus và tái sinh cây khi nuôi cấy bao phấn Niizeki (1983) và Haberlebos (1985) ñã chỉ ra tác ñộng có ý nghĩa của kiểu gen và mối tương tác giữa kiểu gen, môi trường ñến sự hình thành callus và tái sinh cây Ngoài

ra theo một số nhà khoa học thì ngoài kiểu gen ra còn có các nhân tố tế bào chất cũng ảnh hưởng ñến nuôi cấy bao phấn (Heberlebor, 1985) [35] Tuy nhiên trong thời gian gần ñây, Quimio & Zapata cho rằng: “sự hình thành callus và tái sinh cây bị ñiều khiển bởi các gen lặn mà không liên can gì ñến các nhân tố tế bào chất”[47]

ðiều kiện sinh trưởng và tình trạng sinh lý học của cây cho bao phấn cũng như mối tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường bên ngoài ñều ảnh hưởng ñến phản ứng của bao phấn trong nuôi cấy invitro (Chaleff, 1982) cho rằng: “Nhiệt ñộ tới hạn của cây cho bao phấn là 18oC” Hơn nữa, nếu cây sống trong ñiều kiện nhà lưới có nhiệt ñộ cao thì sự hình thành callus và tái sinh cây giảm, tỷ lệ bạch tạng sẽ tăng[24]

* Ảnh hưởng của giai ñoạn phát triển của bao phấn

Các giai ñoạn phát triển của bao phấn nuôi cấy cũng có ảnh hưởng rất quan trọng ñến kết quả nuôi cấy Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp, ñồng thời tỷ lệ cây bạch tạng tăng Tuy nhiên không phải bất cứ loài cây trồng nào cũng có hiệu suất tối ưu ở giai ñoạn trước hoặc sau một nhân, các loại hoà thảo có nhiều ñiểm khác nhau Theo Nizeki và Oono (1968) thì giai ñoạn ñơn nhân muộn là tốt nhất cho nuôi cấy bao phấn lúa, còn theo Claphm (1971) lại cho rằng ñại mạch có hiệu suất tạo cây cao nhất ở giai ñoạn ñơn nhân sớm Một số yếu tố khác hỗ trợ có thể gây nên sự thay ñổi về giai ñoạn phản ứng tối ưu, ví dụ ñối với lúa giai ñoạn phản ứng tối ưu là trước và giữa giai ñoạn hạt phấn một nhân trong ñiều kiện nồng ñộ ñường trong môi trường nuôi cấy tăng từ 6 ñến 9% (Chaleff R.S,1982) [24]

ðể ñạt ñược hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn và tạo cây ñơn bội, giai ñoạn phát triển của phát triển của hạt phấn có ý nghĩa quan trọng Chẳng hạn ñối với lúa các nhà khoa học ở Viện lúa quốc tế (IRRI) ñã nghiên cứu 500 bao phấn chọn từ nhiều giống chứa hạt phấn ở các giai ñoạn khác nhau, kết quả cho thấy hạt phấn ở giai ñoạn từ ñơn nhân giữa ñến ñơn nhân muộn là tốt nhất (Guzman et al, 2000), có nghĩa là cần lấy hoa khi khoảng cách giữa tai lá cờ

và lá ñối diện là 2- 4cm (Zapata, 1983)[59]

Trên cây thuốc lá Sandra M Reed ñã xác ñịnh ñược giai ñoạn phát triển của bao phấn tốt nhất khi ñài và tràng hoa có chiều dài tương ñương nhau[48]

* Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy

phấn trước khi nuôi cấy ñều có tác ñộng ñối với sự hình thành callus và tái sinh cây, nhiệt ñộ tối thích phụ thuộc vào từng giống

ðiều kiện lạnh ñã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng tái sinh cây cao, callus hình thành từ bao phấn ñược xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây ñơn

bội và ít cây lưỡng bội hơn từ bao phấn không xử lý Các giống khác nhau ñòi hỏi ñiều kiện xử lý có khác nhau, trạng thái sinh lý và giai ñoạn phát triển của hạt phấn cũng có ảnh hưởng ñến hiệu quả xử lý Tác giả khẳng ñịnh khả năng hình thành callus tăng lên gấp ñôi khi xử lý lạnh các bao phấn chứa các bào tử

ở giai ñoạn giữa và cuối một nhân trong 7 -14 ngày, quá 14 ngày tỷ lệ hình thành cây xanh giảm [16]

Năm 1983 Ying ñã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh sớm lên hiệu quả nuôi cấy bao phấn ñã cho thấy: Xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo ñược chứng minh ở nhiều loài như thuốc lá, cà ñộc dược, lúa mạch và lúa nước Tapia

và cs cũng cho là xử lý lạnh làm chậm sự lão hoá của hạt phấn, làm tăng sự phân chia của hạt phấn và giúp giải phóng những chất cần cho sự sinh sản ñơn tính ñực (Tapia, 2000) Sugimoto lại cho rằng xử lý lạnh làm tăng lượng axít amin tự

do và làm thay ñổi tương quan giữa các axit amin tự do dẫn ñến tăng tần số tái sinh cây ñơn bội [49],[58]

Yamaguchi và cs (1999) nhận xét: thời gian tối ưu ñể xử lý lạnh tuỳ từng các giống cây trồng khác nhau Nếu xử lý ở thời gian dài thì khả năng tạo mô sẹo giảm dần, có thể do hạt phấn bị giảm sức sống do giữ lâu trong tủ lạnh ðối với lúa, Gooal và cs (1996) cho biết khi xử lý lạnh ở nhiệt ñộ ôn hoà

10oC lên bao phấn trong 11 ngày ñã nâng tỷ lệ tạo mô sẹo từ 12,5% lên 32,8% Ngoài ra Tang và cs cũng cho thấy, tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ tái sinh cây

và tỷ lệ cây xanh phụ thuộc nhiều bởi kiểu gen của cây cho phấn (Tang et al,1998)[53]

Như vậy việc xử lý lạnh ñóng vai trò rất có ý nghĩa trong phản ứng của bao phấn Một số phương pháp xử lý khác như xử lý ly tâm, chiếu tia gamma,

xử lý trong ñều kiện yếm khí tạo ra bởi nitơ phân tử hoặc áp suất nước bão hoà và với khí cacbonic ở 8oC trong 6 ngày ñều có lợi cho sự hình thành callus [28]

* Ảnh hưởng của ñiều kiện sau khi nuôi cấy

Nhiệt ñộ trong phòng nuôi có ảnh hưởng ñến khả năng hình thành callus và tái sinh cây Nhiệt ñộ tối thích cho sự hình thành callus là 250C với biên ñộ là 25 - 280C và cho tái sinh cây là 20 - 250C Nhiệt ñộ cao hơn nhiệt

ñộ tối thích chính là nguyên nhân làm tăng cây bạch tạng Chen (1983) cho rằng nếu nhiệt ñộ phòng nuôi cao hơn 300C thì hầu như chỉ tái sinh cây bạch tạng Wang và cộng sự (1974) kết luận: việc hình thành cây xanh hay cây bạch tạng chủ yếu do nhiệt ñộ tại thời ñiểm bắt ñầu phát triển bào tử chứ không phải ở pha phân hoá callus, tuy nhiên quan ñiểm này vẫn cần phải làm sáng tỏ thêm[56]

* Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng lớn ñến hiệu quả của nuôi cấy bao phấn, nhiều môi trường ñã ñược xây dựng và sử dụng như môi trường White (1953), môi trường Miashige và Skoog (1962), môi trường Nitsch (1969), môi trường Gamborg (1968) Tuỳ theo từng ñối tượng nuôi cấy khác nhau những môi trường cơ bản này sẽ ñược cải tiến thành nhiều môi trường khác cho phù hợp Tuy nhiên cũng có một số quy luật chung: Các cây hoà thảo cần nhiều auxin, ñặc biệt là 2,4D ở nồng ñộ cao ñể khởi ñộng sự phân chia ñầu tiên Hàm lượng ñường có thay ñổi tuỳ ñối tượng: Lúa mì 60-120g saccaroza/l, cây họ cà chỉ cần 20- 40g/l Dịch chiết khoai tây, nấm men, nước dừa, dịch thuỷ phân tỏ ra có tác dụng tốt trong nhiều môi trường nuôi cấy bao phấn [2], [48]

Mặc dù trong các bao phấn rất giàu các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật như auxin và giberillin nhưng số lượng và chất lượng của các hooc môn

và sự cân bằng giữa auxin – cytokinin ñựơc xem là rất quan trọng ñể xác ñịnh phản ứng giữa bao phấn với môi trường và thay ñổi sự biểu hiện di truyền Auxin cao và cytokinin thấp sẽ xúc tiến cho quá trình tăng sinh callus, ngựơc

lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con Trong một vài trường hợp lại không cần thiết ñến sự có mặt của auxin (Evan, 1981) [33]

Những auxin ñược sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy bao phấn là: αNAA(naphthalene acetic acid), IAA (indone acetic acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) và CPA (p-chlorophenoxy acetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid) αNAA ở nồng ñộ 1 – 2 mg/l ñược coi là có hiệu quả hơn so với các auxin ñơn lẻ hay kết hợp khác[24], [29]

Theo Phan Hữu Tôn (2004) [16] ñể tạo mô sẹo ñối với cây lúa trong các auxin 2,4D ở nồng ñộ 2mg/l là thích hợp nhất Nhưng Nguyễn Văn Uyển lại cho rằng phối hợp cả 2,4D, αNAA và Kinetin sẽ cho hiệu quả cao nhất, tỷ

lệ và các loại hoóc môn còn phụ thuộc vào từng kiểu gen[17]

Sự kết hợp khác nhau của auxin và cytokinin trên các môi trường ñã ñược nghiên cứu rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần phải ñược thiết lập cho từng kiểu gen bởi vì không có môi trường ñơn lẻ nào biểu hiện tốt nhất cho nhiều kiểu gen (Karim et al, 1987) [40]

Các chất chuyển hoá và các chất sinh trưởng khác nhau như DDT, Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose cũng ñược nghiên cứu, ABA và DDT ñược coi là ngăn cản sự phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi xanh trong nuôi cấy bao phấn lúa Trong khi ñó, Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose lại tăng cường sự hình thành callus ở lúa mì và lúa nước ABA làm tăng sự tái sinh cây xanh nhưng mức tối thích lại tuỳ theo kiểu gen (Torrizo và Zapata, 1986)[54]

2.3 Cây ñơn bội và vị trí của cây ñơn bội trong chọn tạo giống cây trồng

2.3.1 Cây ñơn bội và ñặc ñiểm di truyền của cây ñơn bội

Cây ñơn bội là cây có số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào dinh dưỡng chỉ có một nửa (n) so với cây bình thường 2n Như vậy trong cây ñơn bội, mỗi chiếc nhiễm sắc thể tương ñồng chỉ tồn tại 1 chiếc, hay mỗi một locus

gen ñơn chỉ tồn tại một alen Trường hợp cây bình thường 2n không phải là 2x ( x là bộ nhiễm sắc thể cơ bản) mà là 4x, 6x thì mỗi nhiễm sắc thể tương ñồng còn có thể có một vài chiếc gần tương ñồng khác cùng tồn tại Khi phân bào giảm nhiễm có thể xuất hiện ghép cặp, trao ñổi chéo và có thể sinh ra ñược giao tử dẫn ñến mức ñộ bất dục giảm ñi Chính do cơ sở tế bào này mà cây ñơn bội có những ñặc ñiểm sau[16]:

- Cây ñơn bội thường có nhiều tình trạng giống với cây lưỡng bội nguồn bình thường nhưng bé nhỏ hơn từ kích thước tế bào ñến bộ phận cơ quan do

số gen và liều lượng sản phẩm gen giảm nhiều Chúng có sức sống yếu và có những nét ñặc thù riêng vì các gen lặn ở trạng thái ñơn bội ñược thể hiện ra kiểu hình Cây ñơn bội có nguồn gốc từ cây giao phấn chéo thường có sức sống yếu hơn từ cây tự thụ Các cây ñơn bội bất dục mạnh do phân chia giảm nhiễm xảy ra không bình thường cá biệt tạo ra các giao tử không phân chia mang n nhiễm sắc thể

- Cây ñơn bội nếu ñược lưỡng bội hoá sẽ tạo thành cây có kiểu gen ñồng hợp tử ở tất cả các gen dẫn ñến các tính trạng thuần chủng, ñiều này có ý nghĩa to lớn trong việc rút ngắn quá trình tạo dòng thuần

- Nếu tác ñộng ñột biến vào cây ñơn bội sẽ phát hiện ñược ngay ñột biến, sau ñó nếu lưỡng bội hoá sẽ ñược dạng ñồng hợp tử về gen ñột biến và dễ dàng duy trì thông qua sinh sản hữu tính

Chọn lọc cây ñơn bội: Không phải tất cả các cây tái sinh trong quá trình nuôi cấy bao phấn ñều là cây ñơn bội Khi nuôi cấy bao phấn có một số trường hợp xảy ra như: Mô giao tử có thể tự lưỡng bội hoá khi ñó mô hoặc cây tạo ra từ mô này sẽ là cây lưỡng bội Callus hoặc phôi lưỡng bội cũng có thể ñược tạo ra từ tế bào vỏ bao phấn lưỡng bội nên sau này cây tái sinh từ mô này sẽ cho ra cây lưỡng bội nhưng giống hệt với cây mẹ Có thể xác ñịnh cây ñơn bội bằng phương pháp như: ñếm trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể, ño gián

tiếp hàm lượng DNA của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước và khả năng sinh trưởng, phát triển [16]

2.3.2 Vị trí của cây ñơn bội trong chọn tạo giống cây trồng

Ở thực vật, cây ñơn bội ñược hình thành bằng nhiều hướng khác nhau như: Xử lý ñột biến, cứu phôi sau lai xa, thụ tinh giả, nuôi cấy noãn chưa thụ tinh, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tách rời Tuy nhiên hướng tạo cây ñơn bội

từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tách rời hiện nay ñược coi là phương pháp ñược áp dụng rộng rãi và cho nhiều thành công nhất Nhờ những ñặc ñiểm riêng biệt của cây ñơn bội nên chúng ñược xem là những nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn tạo giống cây trồng Từ lâu các nhà chọn tạo giống

ñã biết sử dụng dạng ñơn bội và thông qua sự ña bội hoá ñể thu ñược các dạng ñồng hợp tử tuyệt ñối phục vụ công tác chọn tạo[18]

Năm 1924, Blakeslee và cộng sự ñã chứng minh rằng có thể thu ñược các dòng nhị bội thuần ñồng hợp tử bằng cách lưỡng bội hoá các thể ñơn bội Năm 1964, hai nhà khoa học người Ấn ðộ Guha và Maheswavi là những người ñầu tiên thành công trong việc tạo cây ñơn bội từ nuôi cấy invitro bao phấn cây

cà ñộc dược Datura innoxia Từ ñó kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ñã phát triển và

ngày càng ñược ứng dụng trên nhiều loại cây trồng khác nhau Các tác giả cho rằng bình quân nhà tạo giống có thể tiết kiệm ñược ñến 5 năm khi sử dụng kỹ thuật ñơn bội vào việc tạo giống mới Việc ñưa cây ñơn bội vào chương trình tạo giống ñã trở thành phổ biến trên thế giới[18]

Tại Trung Quốc, công nghệ ñơn bội ñã ñược triển khai có hệ thống trên quy mô lớn và có ñịnh hướng chiến lược rõ ràng trong tạo giống mới Hơn một nghìn cơ sở nuôi cấy bao phấn ñã hoạt ñộng trên toàn quốc từ những năm

1970 Kết quả ñã tạo ñược trên 100 giống lúa mới trong một thời gian ngắn, những giống lúa tạo ra từ kỹ thuật ñơn bội ñã mở rộng sản xuất trên diện tích vài triệu ha Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ngô ñể thu nhận các dòng ñơn bội

kép cũng ñược ứng dụng thành công, hơn 100 dòng thuần ñã thu ñược từ 30

tổ hợp khác nhau (Wu và cs 1983), một số giống ñược áp dụng trong tạo giống lai và ñã ñược sử dụng trong sản xuất như AC 4115, Elite DK 524 (Genovesi,1987) Trên cây ớt hơn 500 cây ớt ñơn bội kép ñạt ñược hàng năm sống và chuyển ra cánh ñồng Giống mới có thể phát triển trực tiếp từ con lai và từ các giống loài Cho tới nay 6 giống từ nuôi cấy bao phấn và 6 con lai cùng với dòng bố mẹ của chúng từ nuôi cấy bao phấn ñã ñược trồng phổ biến ở Trung Quốc với diện tích trên 38400 ha[18]

Ở Việt Nam kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa kết hợp với chọn dòng tế bào ñã tạo ra 50 dòng bất dục cảm ứng nhiệt ñộ (TGMS) mới ðối với cây ngô việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn cùng ñem lại nhiều thành công Viện Di truyền nông nghiệp ñã hoàn thiện quy trình nuôi cấy bao phấn của 2 giống ngô CM2, CM8 với tần số tái sinh cao (30 - 80 %) Với quy trình này, thời gian tạo dòng thuần rút ngắn từ 5 - 8 thế hệ ngoài ñồng ruộng xuống còn 8 tháng trong phòng thí nghiệm (ðỗ Năng Vịnh, 2005)[18]

ðặc biệt Việt Nam ñã sản xuất ñược các dòng lúa thuần mang gen quý như gen bất dục ñực tế bào chất, bất dục ñực nhân, gen kết hợp rộng, gen kháng sâu bệnh ñể phục vụ chon tạo giống ưu thế lai [11]

2.4 Những nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây ñơn bội In

vitro trên thế giới và trong nước

2.4.1 Trên thế giới

Trong nuôi cấy bao phấn tuỳ theo mỗi loại cây trồng mà thu ñựơc tỷ lệ cây ñơn bội và nhị bội khác nhau, trong một vài trường hợp có thể thu ñược cây có mức ñộ bội thể cao hơn (Chu & Cs, 1982) [27] Các bao phấn dùng ñể nuôi cấy thường ñược lấy từ các cây của quần thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự

ña dạng di truyền tối ña trong quần thể những cây ñơn bội ñược tạo thành Nhiễm sắc thể của cây ñơn bội thông qua nuôi cấy hạt phấn F1, sau khi lưỡng

bội hoá sẽ trở thành cây lưỡng bội thuần chủng, từ các cây này sẽ tạo thành quần thể các dòng thuần, qua ñánh giá chọn lọc và cho ra giống mới (Singsit

và CS, 1990)[50]

Tác giả Brasiluro và cộng sự (1999) ñã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu giai ñoạn phát triển của bao phấn và ảnh hưởng của xử lý tia gamma trên bao phấn cà chua ñến sự hình thành callus Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt phấn trong tế bào phân chia tiền kỳ I sinh ra nhiều calus nhất Bao phấn và chiều dài nụ hoa ñều có ý nghĩa quan trọng liên quan ñến giai ñoạn phát triển bao phấn Trong thí nghiệm xử lý tia gamma, các tác giả ñã xử lý hạt và nụ hoa cà chua của con lai IPA 5x Rotam4 (F2), IPA6x Rotam4 (F2) và ñem cấy trên môi trường Gresshoff và Doy (1972) có bổ sung các chất ñiều hoà sinh trưởng khác nhau Tuy nhiên, các tác giả không tìm thấy sự sai khác có ý nghĩa ñến sự hình thành callus [23]

ðối với các cây trong họ bầu bí kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ñể tạo cây ñơn bội cũng ñược nhiều nhà khoa học ñã tập trung nghiên cứu và ñã thu ñược những thành công nhất ñịnh Tuy nhiên, dòng ñơn bội kép ñược tạo ra thông qua nuôi cấy bao phấn còn nhiều hạn chế [34], [19], [30] Những yếu tố như ñặc tính di truyền, ñiều kiện trồng của cây mẹ, giai ñoạn phát triển của tiểu bào tử, xử lý nụ hoa trước khi nuôi cấy, môi trường và ñiều kiện nuôi cấy

có ảnh hưởng ñến kết quả của quá trình nuôi cấy bao phấn [21]

Với cây dưa hấu tác giả Xue và cộng sự (1989) cho rằng tiến hành lấy hoa khi bao phấn ở giai ñoạn một nhân, có kích thước 5 mm và nụ hoa có tràng hoa nhìn rõ sẽ cho hiệu quả nuôi cấy tốt nhất Callus phát sinh trên môi trường MS muối có bổ sung 2ppm BA + 2ppm Ki + 3 succarose + 6-7% agar

ở pH 5,8 Sự phát sinh cơ quan thu ñược bằng nuôi cấy callus trên môi trường MS muối có bổ sung agar + 5-10 ppm GA3 + 4ppm BA + 30-40 ppm adenine + 500ppm lactalbumin hydrolysate Sự phát sinh cơ quan chuyên hoá

và sự phát triển chồi thu ñược trên môi trường nuôi cấy MS + 2ppm Triaconital Rễ phát sinh trên môi trường agar + ½ MS + 0,2ppm IBA + 1ppm IAA + 1,5% succarose + pH 5,7 Mặc dù tần suất rất thấp nhưng họ vẫn thu ñược cây ñơn bội và ñơn bôi kép qua quá trình nuôi cấy [57]

Các nghiên cứu khác trên cây bí ngô E.I Metwall cho thấy rằng khi nuôi cấy bao phấn cây ở giai ñoạn giữa và cuối của giai ñoạn hạt phấn một nhân ñược thu vào buổi sáng và xử lý ở nhiệt ñộ 40C trong 4 ngày, khử trùng

nụ hoa bằng ethanol 70% trong 2 phút và trong Clorox 20% (5,2% sodium hypochlorite) trong 20 phút cấy trên môi trường MS + 150g succarose + 5mg/l 2,4D cho tỷ lệ tạo cây cao nhất Rễ của 20 cây tạo ra ñược soi ở dưới

kính hiển vi cho thấy 50% số cây là lưỡng bội và 50% số cây là ñơn bội [32]

Các tác giả Gemes Juhasz, G Venczel, P Balogh ñã tạo cây ñơn bội thông qua quá trình nuôi cấy noãn chưa thụ tinh của cây dưa chuột và cây bí xanh Hoa cái ñược thu từ cây mẹ trồng trong nhà lưới có chiều dài 2–3 cm ñối với cây bí xanh và 0,5 – 1 cm ñối với cây dưa chuột Cắt thành từng lát cấy vào môi trường có bổ sung 0,02 mg/1 TDZ, môi trường phát sinh phôi có chứa NAA và BA ñều có kết quả ñối với cả dưa chuột và bí xanh [34]

Năm 1974 Eun J S và cộng sự khi nuôi cấy bao phấn dưa chuột ñã phát hiện calus phát triển từ bao phấn sau khi nuôi cấy 7 ngày trên môi trường

có bổ sung 2,4 D Sau 30 ngày rễ và chồi sẽ xuất hiện[39]

Theo Lazarte, J E và Sasser, C.C (1982) bao phấn dưa chuột ñược trên nuôi cấy môi trường Nitsch và Nitsch cải tiến sau ñó tạo callus trên môi trường cơ bản MS Phôi phát triển thành cây con trên môi trường Nitsch and Nitsch ñặc có chứa 20 g/lit raffinos [42]

Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến kết quả nuôi cấy bao phấn dưa chuột Tác giả T.Suprunova và N.Shmykova ñã nuôi cấy 10 giống (Hiziz, Gordion, Hana, Melen, Kedet, Asak, Reisa, Tristan, Tarantutka và Rostovchanin)

Kết quả chỉ có giống Gordion có thể tạo cây ñơn bội từ nuôi cấy bao phấn Trong

số những chất ñiều tiết sinh trưởng ñược nghiên cứu, thidiazuron (TDZ) là tốt nhất cho sự cảm ứng của bao phấn với nồng ñộ tối ưu nhất là 0,02 mg/l Dựa vào kết quả nghiên cứu các tác giả khẳng ñịnh giai ñoạn phát triển tốt nhất của bao phấn

ñể tạo cây ñơn bội là tiểu bào tử ñơn nhân muộn và sớm [52]

Năm 2002 H G Ashok Kumar và cộng sự ñã tiến hành thí nghiệm trên hai giống dưa chuột Calypso và Green Long cho thấy bao phấn dưa chuột của cả hai giống ñều thích hợp cho sự tái sinh phôi trực tiếp và tái sinh phôi gián tiếp thông qua quá trình tạo callus trên môi trường cơ bản B5có bổ sung 0,25M saccarose và 2µM 2,4D hoặc kết hợp 2µM 2,4D + BAP 1µM Nụ hoa trước khi nuôi cấy ñựơc xử lý lạnh 4oC trong 2 ngày là mức xử lý lạnh tối ưu Callus hình thành sau hai tuần nuôi cấy và có màu vàng Callus sau khi hình thành ñược chuyển sang môi trường B5 muối và vitamin có chứa 0,09M saccarose + 0,05µM NAA + 0,05µM Ki Sau ñó lại ñược chuyển sang môi trường ñể phát sinh phôi là môi trường B5 muối và vitamin có chứa 0,09M saccarose và 5µM ABA Cuối cùng ñể phôi nảy mầm thành cây, callus lại ñược chuyển sang môi trường cơ bản B5 + 0,09M saccarose + 0,25 µM NAA + 0,25 µM KN Qua soi nhiễm sắc thể ở ñầu rễ của 24 cây tái sinh ở mỗi giống ñã phát hiện ñược 21 cây giống Calypso và 17 cây giống Green Long là ñơn bội [19]

Tại Trung Quốc năm 2007 Song et al cũng nghiên cứu 20 kiểu gen của cây dưa chuột chỉ có 16 kiểu gen tạo ñược callus Tác giả ñã khẳng ñịnh xử lý

nụ hoa trước khi nuôi cấy là chìa khoá của sự thành công trong nuôi cấy bao phấn Xử lý nhiệt phụ thuộc vào kiểu sinh thái, các loài dưa chuột từ vùng lạnh có phản ứng tốt khi xử lý sốc lạnh, các loài dưa chuột từ vùng nóng có phản ứng tốt khi xử lý sốc nhiệt Môi trường tốt nhất cho sự phát sinh callus

là môi trường MS có bổ sung 4,44M BA, 2,26M 2, 4-D, 4,64M KIN, 3%

sucrose và 0,8% agar Môi trường cho sự phát sinh phôi là MS có bổ sung 0,54M NAA, 13,32M BA, 3% sucrose và 0,8% agar Môi trường cho sự tái sinh cây là MS bổ sung 2,22M BA, 6% sucrose và 1,2% agar[ 38]

2.4.1 Trong nước

Kỹ thuật tạo cây ñơn bội invitro thông qua kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong nuôi cấy bao phấn cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây ñơn bội ñã là một lối thoát kỳ diệu ñối với lĩnh vực ứng dụng ñơn bội vào nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng [13]

Khác với tế bào ñộng vật, tế bào thực vật mang một tính chất ñặc biệt (tính toàn năng) nghĩa là một tế bào chuyên hoá khi ñưa vào ñiều kiện nhất ñịnh, có khả năng phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Trong trường hợp tế bào khởi ñầu là bào tử hay giao tử thì cây nhận ñược có thể là cây ñơn bội Phương pháp nuôi cấy noãn, bao phấn và bào tử nhằm thu ñược cây ñơn bội chính là dựa trên tính chất ñặc biệt này của tế bào thực vật Bình thường

sự phát triển của tế bào sinh dục ñực trong bao phấn ñi theo các giai ñoạn sau:

Từ tế bào mẹ thông qua quá trình phân bào giảm nhiễm hình thành các tiểu bào tử (tế bào ñơn bội) Sau ñó từ các tiểu bào tử hình thành các giao tử ñực (hạt phấn – cũng là tế bào ñơn bội) Nhưng khi ta ñưa bao phấn vào nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, sự phát triển của tiểu bào tử sẽ khác ñi Dưới tác ñộng của một loạt các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, ñặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng, trong các tế bào sẽ diễn ra quá trình phản phân hoá, từ

ñó các tiểu bào tử sẽ phân chia hình thành mô sẹo Các mô sẹo này lúc ñầu bao gồm các tế bào ñơn bội Sau ñó tuỳ ñiều kiện nuôi cấy chúng có thể là ñơn bội hoặc bị lưỡng bội hoá Khi chuyển mô sẹo vào môi trường tái sinh, ta

sẽ thu ñược cây ñơn bội hoặc cây lưỡng bội Tỷ lệ cây ñơn bội nhận ñược phụ thuộc vào các yếu tố như giai ñoạn phát triển của hạt phấn và thời gian duy trì

ở giai ñoạn mô sẹo (tuổi mô sẹo) Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt phấn ở

giai ñoạn mitos ñầu (giai ñoạn một nhân) sẽ cho tỷ lệ cây ñơn bội cao nhất ðối với tuổi mô sẹo thì mô sẹo nào phát sinh càng sớm và ñựơc cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây ngay thì thời gian tái sinh càng ngắn và tỷ lệ cây ñơn bội thu ñược càng cao ðể tạo ra những cây nhị bội từ mô sẹo hạt phấn hoặc cây ñơn bội, có hai phương pháp thường dùng là xử lý callus hạt phấn hoặc cây ñơn bội với colchicine (0,5%) trong 24 – 48 giờ sau ñó tái sinh cây Phương pháp thứ hai là tạo mô sẹo từ các cây ñơn bội rồi tái sinh cây Các thể nhị bội thu ñược ñều là ñồng hợp tử (hoàn toàn thuần về phương diện di truyền) do chúng có nguồn gốc từ một tế bào ñơn bội (Phan Phải, Vũ ðức Quang và cộng sự, 1990) [12]

Tại Viện di truyền nông nghiệp, bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa kết hợp với chọn tạo dòng tế bào ñã tạo ra 50 dòng bất dục ñực cảm ứng với nhiệt ñộ (TGMS), 12 dòng giống thuần có ưu thế lai gần tương ñương con lai F1 là DT26, DT29, J1, AC24 ðối với ngô, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn cũng ñem lại nhiều thành công Viện di truyền nông nghiệp

ñã hoàn thiện quy trình nuôi cấy bao phấn của 2 giống ngô CM2, CM8 với tần

số tái sinh cao (30 - 80%) Với quy trình này, thời gian tạo dòng thuần rút ngắn từ 5 - 8 thế hệ ngoài ñồng ruộng xuống còn 8 tháng trong phòng thí nghiệm [18] ðặc biệt chúng ta ñã sản xuất ñược những dòng lúa thuần mang gen bất dục ñực tế bào chất, bất dục ñực nhân, gen kết hợp rộng, gen kháng sâu bệnh…ñể phục vụ cho tạo giống ưu thế lai [11]

Việc nghiên cứu tối ưu hoá các ñiều kiện nuôi cấy là cần thiết ñối với chương trình nghiên cứu tạo giống Các nghiên cứu tiến hành tại Viện di truyền nông nghiệp cho thấy có thể nâng cao hiệu quả nuôi cấy bao phấn bằng các phương pháp sau: Nâng cao hiệu quả nuôi cấy bao phấn bằng cải tiến quy trình nuôi cấy như: xử lý nhiệt bao phấn trước và sau khi cấy xử lý mannitol trước khi nuôi cấy ở 14oC làm tăng ñáng kể số phôi tạo thành, bổ sung chất ñiều hoà sinh

trưởng như kinetine 1mg/l cho hiệu quả tái sinh cây từ phôi hình thành trong nuôi cấy bao phấn cao nhất (8,8%) (Lê Huy Hàm và cs, 2000)[6]

Khi nghiên cứu vật liệu ban ñầu cho nuôi cấy tạo cây ñơn bội, tác giả Nguyễn ðức Thành (2000) cho thấy vật liệu ban ñầu cho nuôi cấy có thể là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời Sử dụng bao phấn ñể nuôi cấy ñơn giản hơn

về mặt kỹ thuật và môi trường nuôi cấy nhưng mô và cây có thể tạo thành từ

mô soma của thành bao phấn và như vậy rất khó phân biệt với cây tự lưỡng bội bắt nguồn từ hạt phấn Tuy nhiên thành bao phấn lại có vai trò quan trọng trong sự phát triển của hạt phấn Hạt phấn ñược khởi ñầu phân chia trong bao phấn và chỉ những hạt phấn ñược khởi ñầu phân chia mới tiếp tục phát triển Thành bao phấn cung cấp một số chất dinh dưỡng chủ yếu cho tế bào hạt phấn và ñóng vai trò như bể chứa chất trao ñổi cho hạt phấn hấp thu, dự trữ và biến ñổi các chất từ môi trường nuôi cấy ðối với hạt phấn tách rời sẽ rất khó khăn ñể nuôi cấy và môi trường nuôi cấy cần giàu dinh dưỡng hơn Sự ổn ñịnh pH là yếu tố duy trì trao ñổi các chất trong tế bào vì vậy pH môi trường cũng cần ñược quan tâm Sự bền vững và hấp thu nhiều chất phụ thuộc vào

pH môi trường như αNAA, giberelin, vitamin, sắt, pH thường là 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng, pH mức cao hơn làm hầu hết các muối trong môi trường

có khuynh hướng kết tủa[14]

Năm 2007 Nguyễn Thị Hiệp cho rằng các giống lúa thuộc loài phụ

ñòng ở nhịêt ñộ 7oC trong 7 ngày cho hiệu quả tạo callus cao nhất và môi trường tái sinh cây thích hợp cho nhiều kiểu gen là MS + 1mg/l Kinetin + 1mg/l αNAA + 1mg/l BAP [8]

Khi nuôi cấy bao phấn của các dòng bất dục ñực di truyền nhân cảm ứng với môi trường tác giả Nguyễn Thị Hồng Hạnh kết luận ñiều kiện ngoại cảnh của cây cho bao phấn ( ánh sáng, nhiệt ñộ, chế ñộ dinh dưỡng ) và ñặc biệt

là yếu tố mùa vụ có ảnh hưởng rất lớn ñến tỷ lệ tạo callus và tái sinh cây của các dòng EGMS Nuôi cấy các dòng lúa EGMS khi hạt phấn ở trạng thái hữu dục sẽ ñem lại hiệu quả cao hơn nhiều so với nuôi cấy ở thời ñiểm hạt phấn bất dục [7]

Trên cây dưa hấu Nguyễn Thị Thanh Dung khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến kết quả nuôi cấy bao phấn của các giống dưa hấu (Hắc Mỹ Nhân, Siêu Nhân 0110, SG 221) cho biết xử lý nụ hoa ở nhiệt ñộ 7oC trong 1 ngày và cấy trên môi trường B5 có bổ sung 1mg/l Ki + 1mg/l 2,4D + 3% Saccarose cho tỷ lệ tái sinh callus cao nhất [5]

Trong chọn tạo giống dưa chuột bằng phương pháp truyền thống, ñể tạo ñược dòng thuần cho việc thử khả năng kết hợp chung và kết hợp riêng phải mất từ 7- 8 thế hệ (3- 4 năm), mất rất nhiều thời gian và kinh phí, ñồng thời kéo dài thời gian cho công tác chọn tạo giống Bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn dưa chuột sẽ khắc phục nhược ñiểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống Cây ñơn bội kép tạo ra từ nuôi cấy hạt phấn có ñộ ñồng hợp tử tuyệt ñối, hoàn toàn không phân ly trong các thế hệ sau và có thể tạo ra ñược trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết kiệm ñược rất nhiều kinh phí và ñặc biệt rút ngắn thời gian cho công tác chọn tạo giống dưa chuột

Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật ñơn bội phục vụ công tác tạo dòng thuần trong chọn tạo giống cây trồng vẫn còn nhiều hạn chế Hiện nay, kỹ thuật này mới chỉ ứng dụng ñược một phần rất nhỏ trong chọn tạo lúa, ngô còn các ñối tượng cây trồng khác chưa ñược nghiên cứu nhiều Vì vậy, việc nghiên cứu nuôi cây bao phấn ñối với nhiều loại cây trồng nhằm rút ngắn thời gian tạo giống là rất cần thiết ðặc biệt là trong công cuộc chuyển ñổi cơ cấu cây trồng, ñể phát triển ngành nông nghiệp cần phát triển ngành công nghiệp chế biến, ñẩy mạnh xuất khẩu, vấn ñề rút ngắn thời gian tạo dòng thuần phục

vụ công tác chọn tạo giống cần ñược quan tâm nhiều hơn nữa

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Giống dưa chuột: ñề tài ñược tiến hành trên 2 giống dưa chuột bao tử lai F1: Marinda có nguồn gốc từ Hà Lan và Valaspik có nguồn gốc từ Mỹ ðây là những giống cho 100% hoa cái (gynoecious), hoa mọc chùm, tạo quả không qua thụ phấn (partenocarpic) Vật liệu thí nghiệm là các nụ hoa có kích thước khác nhau tuỳ theo từng thí nghiệm

- Hoá chất: ñề tài tiến hành với các hoá chất trong thành phần môi trường cơ bản MS (Muashige Skoog, 1962 ), N6(Chu và Cs, 1975), B5 (Gamborg, 1968) và các chất kích thích sinh trưởng như BAP (6 - Benzylamino purine), αNAA (α - Naphthaleneacetic acid), IAA (Indole -3- aceticacid), KI (Kinetin), 2,4D (2,4 - dichlorophenoxi aceticacid), TDZ (Thidiazuron) và dịch chiết cao nấm men

3.1.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

- ðịa ñiểm: ðề tài ñược tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn

Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Rau Quả, phân tích ñộ bội của cây ñược tiến hành tại Viện Di truyền nông nghiệp

- Thời gian thực hiện ñề tài: Từ 6/2008 ñến 8/2009

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu: Bao gồm 3 nội dung chính

3.2.1 Nghiên c ứu kỹ thuật tạo callus từ nuôi cấy invitro bao phấn dưa chuột

Thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức ñược lặp

lại 3 lần, mỗi lần nhắc 30 ñĩa petri và mỗi ñĩa cấy 20 bao phấn

* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột

CTTN Môi trường Ký hiệu

Nụ hoa thu với các kích thước ñược xử lý lạnh ở 40C trong 48 giờ, cấy trên các môi trường cơ bản có bổ sung 1ppm BAP; 2ppm 2,4D; 15% CW; 5g agar/l Sau thí nghiệm 1 tìm ra nền môi trường cơ bản tốt nhất ñể sử dụng cho các thí nghiệm tạo callus tiếp theo

* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh nụ hoa ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột

nụ hoa) Sau thí nghiệm 3 xác ñịnh ñược kích thước nụ hoa thích hợp nhất cho sự tái callus ñể sử dụng cho các thí nghiệm tạo callus tiếp theo

* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ auxin trong môi trường nuôi cấy ñến hiệu quả callus từ nuôi cấy invitro bao phấn dưa chuột

Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành trên 3 nhóm chất auxin ñó là: αNAA, IAA và 2,4D so sánh với ñối chứng không bổ sung auxin Thí nghiệm ñược bố trí như sau:

3.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột

Sau khi tạo ñược callus từ bao phấn dưa chuột, chúng tôi sử dụng các callus ñủ tiêu chuẩn ñể tiến hành thí nghiệm tái sinh cây Các callus ñủ tiêu chuẩn là callus có kính thước từ 8,0 mm trở lên có màu vàng Các thí nghiệm ñược tiến hành trên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có bổ sung 15% CW; 5g agar/l và các chất ñiều tiết sinh trưởng tuỳ theo từng thí nghiệm

Thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi công thức ñược lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc 10 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 callus

* Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ TDZ trong môi trường nuôi cấy ñến khả năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột

* Thí nghiệm 8 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và TDZ ñến khả

3.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi dưa chuột ñơn bội invitro

Chồi dưa chuột tái sinh từ callus bao phấn ñược ñưa ñi xác ñịnh ñộ bội Sau ñó chúng tôi sử dụng những chồi ñã ñược xác ñịnh là ñơn bội ñể nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có bổ sung 15% CW; 5g agar/l; cao nấm men và chất ñiều tiết sinh trưởng tuỳ theo các thí nghiệm

Thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi công thức ñược lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc 2 bình tam giác, cấy mỗi bình 5 chồi

năng nhân nhanh chồi dưa chuột ñơn bội in vitro