Nghiên cứu quy trình nhân gíông in vitro cây hoa huệ hương (POLIANTHES TUBEROSA l )

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Thị Y Thanh

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, bạn bè, người thân và các cơ quan ñơn vị

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo ñã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến các thầy giáo, cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học – Sinh học phân tử và công nghệ vi sinh ñã chân thành ñóng góp ý kiến quý báu giúp cho luận văn của tôi ñược hoàn thiện hơn

ðặc biệt tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến GS.TS Nguyễn Quang Thạch ñã tận tình hướng dẫn giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Phòng Công nghệ sinh học, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình ðịnh ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến tất cả người thân, bạn bè, những người luôn bên cạnh ñộng viên giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện ñề tài

Tác giả

Nguyễn Thị Y Thanh

2.3 Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào 112.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa huệ trong nước và trên thế giới 23

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

4.3.2 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy protocorm trong nhân nhanh 68

4.6 So sánh và thảo luận với các kết quả nghiên cứu khác trên cây hoa huệ 83

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MS : Murashige and Skoog, 1962

BA : benzyl adenin

IBA : indol butyric acid

α-NAA : α-naphtyl acetic acid

2,4-D : 2,4 diclorophenoxy acetic acid

IAA : indol acetic acid

ðC : ðối chứng

PSHT : Phát sinh hình thái

CT : Công thức

DANH MỤC BẢNG

4.1 Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau ñến hiệu quả

4.2 Ảnh hưởng kết hợp của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15%

ở các mức thời gian khác nhau ñến hiệu quả khử trùng mẫu (sau 4

4.3 Ảnh hưởng của kinetin ở các nồng ñộ khác nhau ñến khả năng phát

sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy) 43 4.4 Ảnh hưởng của BA ở các nồng ñộ khác nhau ñến khả năng phát sinh

hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy) 454.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin ñến khả năng phát sinh hình

4.6 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA ñến hệ số nhân chồi và chiều

4.7 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA ñến hệ số nhân chồi và chiều cao

4.8 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và α-NAA ñến hệ số nhân và chiều cao

4.9 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IAA ñến hệ số nhân chồi và chiều

4.10 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường ñến hệ

4.11 Ảnh hưởng của BA ñến hệ số nhân và chiều cao chồi khi nhân nhanh

bằng phương pháp nuôi cấy protocorm (sau 6 tuần nuôi cấy) 694.12 Ảnh hưởng của BA và α-NAA ñến hệ số nhân và chiều cao chồi khi

nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm (sau 6 tuần) 724.13 Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến khả năng ra rễ và chất lượng rễ

4.14 Ảnh hưởng của α-NAA ñến khả năng ra rễ và chất lượng rễ (sau 5 tuần) 79 4.15 Ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây huệ (sau

DANH MỤC HÌNH

4.1 Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau 39 4.2 Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% ở

4.3 Ảnh hưởng của Kinetin ở các nồng ñộ khác nhau ñến khả năng phát

4.4 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5

4.5 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5

4.6 Ảnh hưởng của BA ở các nồng ñộ khác nhau ñến khả năng phát sinh

4.7 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin ñến khả năng phát sinh hình

4.8 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5

4.16 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA ñến hệ số nhân chồi 57 4.17 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA ñến chiều cao chồi tạo thành 58 4.18 Kết quả nhân nhanh trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar

4.19 Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và α-NAA ñến hệ số nhân chồi 61 4.20 Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và α-NAA ñến chiều cao chồi tạo

4.21 Kết quả nhân nhanh chồi trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l

4.22 Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và IAA ñến hệ số nhân chồi 64 4.23 Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và IAA ñến chiều cao chồi tạo thành 64 4.24 Kết quả nhân nhanh chồi trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5

g/l agar + 2mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA +150ml/l nước dừa 67 4.25 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường ñến hệ

4.26 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường ñến

4.27 Kết quả nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm trên môi

trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 3mg/l BA 70 4.28 Ảnh hưởng của BA ñến hệ số nhân khi nhân nhanh bằng phương pháp

4.29 Ảnh hưởng của BA ñến chiều cao chồi tạo thành khi nhân nhanh bằng

4.30 Kết quả nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm trên môi

trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 3mg/l BA + 0,5mg/l

4.31 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA ñến hệ số nhân khi nhân nhanh

4.32 Ảnh hưởng của BA và α-NAA ñến chiều cao chồi tạo thành khi nhân

4.33 Chồi ñủ tiêu chuẩn ñưa vào môi trường tạo cây hoàn chỉnh 75 4.34 Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến số rễ trung bình /chồi 77 4.35 Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến chiều dài trung bình của rễ 78 4.36 Cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l

4.37 Cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l

4.38 Ảnh hưởng của α-NAA ñến số rễ trung bình của chồi 81 4.39 Ảnh hưởng của α-NAA ñến chiều dài trung bình của rễ 81

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân

thảo, thích cường ñộ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm Hoa huệ ñược nhập vào nước ta từ rất lâu Cây hoa huệ ñược trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộ ñem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xoá ñói giảm nghèo cho vùng chuyên canh loài cây này

Hiện nay, việc canh tác cây huệ thường chủ yếu ñược nhân giống bằng kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng Với phương pháp nhân giống này dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, ñặc biệt là bệnh virus làm giảm năng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa ngày càng thoái hoá

Trong những năm gần ñây, bệnh hại trên cây hoa huệ xuất hiện nhiều, ñặc biệt trong ñó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông Tác nhân gây bệnh hiện vẫn chưa xác ñịnh ñược Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng ñến năng suất và phẩm chất hoa Bệnh không làm cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ và hoa kém phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nông dân Các triệu chứng bệnh do virus ñược mô tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu hiện của cây huệ ở Nam Trung Bộ Vấn ñề ñặt ra là làm thế nào ñể tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho nhân dân?

Sự phát triển của công nghệ sinh học trong lĩnh vực chọn giống ñã giúp các nhà chọn giống rất nhiều trong việc giải quyết vấn ñề trên Phương pháp nhân giống

in vitro với rất nhiều ưu ñiểm, tạo ñược cây con trẻ hoá và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục ñược nhược ñiểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại các phẩm chất vốn có của giống ðồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao ñáp ứng ñược nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn ñịnh ñáp ứng nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng Cho ñến nay kĩ thuật nuôi cấy mô ñã ñược nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong việc nhân giống hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất

Cây hoa huệ là ñối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta, cho ñến nay chưa có công trình nghiên cứu nào ñược công bố, chỉ

có một thông báo khoa học của các tác giả trường ðại học Cần Thơ Năm 2007, xuất phát từ yêu cầu bức xúc của thực tiễn, nhằm khắc phục hiện tượng chai bông trên cây hoa huệ và yêu cầu nhân nhanh giống huệ hương, một giống huệ quý mang lại hiệu quả cao cho nông dân, tỉnh Bình ðịnh ñã có chủ trương xây dựng quy trình nhân giống cây hoa huệ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào Trên cơ sở ñó, Bộ Khoa học và Công nghệ giao cho tỉnh Bình ðịnh dự án xây dựng quy trình nhân giống cây hoa huệ, ñặc biệt là cây huệ hương Chính vì thế, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình ðịnh (Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình ðịnh) ñã bước ñầu tiến hành nghiên cứu thử nghiệm nhân nhanh giống huệ này bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Có thể nói, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây huệ là một yêu cầu bức xúc của thực tiễn, ñề tài ñược nghiên cứu sẽ có nhiều phát hiện

mới về khoa học Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Nghiên cứu xây

dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương (Polianthes tuberosa L.)”

1.2 Mục ñích, yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Xác ñịnh ñược những khâu cơ bản trong quy trình nhân giống cây hoa huệ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương, góp phần giải quyết những bức xúc của thực tiễn sản xuất hoa tỉnh Bình ðịnh

1.2.2 Yêu cầu

Xác ñịnh ñược phương pháp khử trùng mẫu thích hợp

• Xác ñịnh ñược môi trường nuôi cấy phù hợp nhất cho các giai ñoạn khởi ñộng mẫu, nhân nhanh, tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro

• Xác ñịnh ñược giá thể ra cây nuôi cấy thích hợp

• Bước ñầu ñề xuất quy trình nhân giống cây huệ hương in vitro

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của ñề tài ñã cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về nhân giống vô tính cây hoa huệ hương bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa

ðề tài ñã ñưa ra ñược các minh chứng về tác ñộng của phương pháp khử trùng ñến tỷ lệ sống của mẫu cấy, tác ñộng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả năng phát sinh hình thái, hệ số nhân nhanh chồi, nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm, tác ñộng của chất ñiều tiết sinh trưởng và than hoạt tính ñến khả năng tạo cây hoàn chỉnh, tác ñộng của giá thể ñến khả năng sống và sinh trưởng của cây

Kết quả nghiên cứu ñược ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần phục tráng giống

và nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoa huệ

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây hoa huệ

2.1.1 Nguồn gốc

Cây hoa huệ có tên khoa học là Polianthes tuberosa L ðây là loài hoa cắt

cành, thuộc nhóm cây thân thảo, cho hoa quanh năm, nở hoa vào ban ñêm có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và hiện ñã có mặt ở nhiều nước trên thế giới như: Singapore, Indonexia, Iran, Hawaii [51]

Loài cây này ñã ñược du nhập vào nước ta từ rất lâu và ñược trồng phổ biến tại một số tỉnh thuộc vùng Nam Trung Bộ và Nam Bộ như: Bình ðịnh, Khánh Hòa, Tiền Giang, Cần Thơ… Hiện nay nó ñang là cây trồng chính của người dân nơi ñây [18]

- Họ: Thủy tiên (Amaryllidaceae)

Theo kết quả thống kê trên thế giới thì hiện tại ở Mexico có khoảng 12 loài tuberosa [51]

Riêng ở Việt Nam hiện nay, dựa vào ñặc ñiểm của hoa thì chia thành 2 giống, chủ yếu là huệ ñơn và huệ kép:

- Huệ ñơn hay còn gọi là huệ xẻ: cây thấp, mảnh khảnh, cánh hoa nhỏ, bông chỉ có một lớp cánh nhưng hương thơm rất ñậm

- Huệ kép còn gọi là huệ tứ diện: cây cao, hoa dày và bông dài hơn huệ ñơn nhưng hương thơm kém hơn [52]

2.1.3 ðặc ñiểm thực vật học

2.1.3.1 Thân

Huệ thuộc cây thân thảo, thân hành hay còn gọi là thân giả ñược kết bởi các

bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp phủ lên bẹ lá sau Thân thẳng ñứng không

phân nhánh vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,8 -1m [9]

2.1.3.2 Lá

Cây hoa huệ có lá ñơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá góc rộng và to thành hình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ ràng Chiều dài lá khoảng 20-30cm, bề rộng của lá từ 0,5-1cm [9]

ô [5], [53]

2.1.3.4 Củ và rễ

Cây huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp ñất mặt 0-15cm Có 2 loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban ñầu (củ mẹ), gọi là rễ sơ cấp và rễ mọc từ củ con do củ mẹ ñẻ ra gọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây huệ [9]

2.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa huệ

2.1.4.1 Nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ là yếu tố vật lý có ảnh hưởng lớn ñến thời gian sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng phân hóa hoa của cây hoa huệ

Cây hoa huệ là cây ưa nhiệt ñộ mát mẻ (20-250C), nhưng chịu nóng tốt, phân

bố chủ yếu ở vùng nhiệt ñới và á nhiệt ñới, cho hoa tốt vào mùa hè Tuy vậy, khi nhiệt ñộ mùa hè quá cao kéo dài sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới khả năng sinh trưởng của cây, chất lượng hoa và nhất là sâu bệnh phá hại mạnh

Trước khi phân hóa hoa và lúc cây có 5-6 lá cần nhiệt ñộ mát mẻ (15-220C) nếu không tỷ lệ nở hoa sẽ rất thấp và chất lượng hoa kém [9]

2.1.4.2 Ánh sáng

Cây huệ là cây ưa ánh sáng mạnh Giai ñoạn ñầu sau khi trồng, cây sống chủ yếu nhờ vào nguồn dinh dưỡng từ củ Khi cây ra lá, cây sử dụng chất dinh dưỡng từ quá trình quang hợp Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa nếu không cung cấp ñủ ánh

sáng thì tỷ lệ ra hoa thấp, hoa nhỏ…

Ngoài ra nếu thiếu ánh sáng cây hoa huệ rất dễ bị nhiễm bệnh Trong ñiều kiện ngày ngắn, ánh sáng yếu thì ảnh hưởng mạnh ñến sự sinh trưởng phát triển của cây Cường ñộ ánh sáng cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phân hóa mầm hoa Nếu cường ñộ chiếu sáng dưới 3500lux thì cường ñộ quang hợp và sự thoát hơi nước giảm, cây mọc vống, cành lá yếu Do ñó khi trồng ở vụ ñông cần ñảm bảo chế ñộ chiếu sáng phù hợp ñể tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự phân hóa mầm hoa, hoa tự dài ñồng thời tăng chất lượng hoa Số giờ chiếu sáng thích hợp cho cây hoa huệ sinh trưởng và phát triển tốt từ 12-16 giờ và cường ñộ ánh sáng khoảng 6000lux [9]

2.1.4.3 Nước

Cây hoa huệ là cây rễ củ nên khi nảy mầm cũng như quá trình sinh trưởng cần phải có ñủ nước Các giai ñoạn sinh trưởng khác nhau thì có nhu cầu về nước khác nhau Sau khi trồng vài ngày, rễ mầm nhú ra và phát triển thì yêu cầu ñất xung quanh củ phải ñủ ẩm, vì vậy trước khi trồng nên tưới nước Khi cây mọc nếu ñất quá khô thì phải tưới nước ngay Trong suốt thời kỳ sinh trưởng, cây hoa huệ cần rất nhiều nước, ñặc biệt là ở giai ñoạn có 3-7 lá, ñây là thời kỳ cây có nhu cầu về nước lớn, nếu thiếu nước cây sẽ sinh trưởng chậm ảnh hưởng ñến khả năng phân hóa của hoa

2.1.4.4 ðất

Cây hoa huệ có thể trồng trên bất cứ loại ñất nào, tuy vậy cây chỉ sinh trưởng tốt, cho hoa ñẹp trên loại ñất hơi kiềm (pH = 6 -7), có cấu trúc mịn, giữ ẩm tốt Tuy vậy, huệ không thích hợp nơi ñất quá trũng, chua hay cớm bóng [20]

Cây hoa huệ có thể trồng trên các loại ñất có thành phần cơ giới sau:

- ðất cát pha có ñộ tơi xốp cao, ñộ hổng lớn, thoáng khí, ngấm nước tốt nhưng

có ñộ phì kém Do ñó, khi trồng hoa huệ trên loại ñất này cần phải bón nhiều phân hữu cơ ñể bổ sung dinh dưỡng cho cây

- ðất thịt nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng là loại ñất trồng thích hợp ñối với cây hoa huệ Nếu ñất quá ẩm, rễ rất dễ bị thối, vì thế vào mùa mưa cần chống úng, tháo nước kịp thời không ñể ruộng bị ngập úng

Mặt khác hoa huệ cũng là cây rất mẫn cảm với các loại muối kim loại nặng

ðặc biệt là loại ñất có hàm lượng chì cao, rễ cây sinh trưởng kém, cây phát triển chậm và khả năng ra hoa kém Chính vì vậy trước khi trồng huệ cần chú ý ñến các biện pháp canh tác ñất [9]

- Không sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc lấy củ từ những ruộng ñã bị nhiễm bệnh trước ñó làm củ giống

- Phơi củ trong vòng 1-1,5 tháng trước khi ñem ra trồng

- Nên thay ñổi chân ñất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây huệ với một loại cây trồng khác

- Khi phát hiện thấy có triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi ruộng, phơi khô và ñốt bỏ Khi không có củ giống sạch bệnh, có thể chọn củ ở cây không

có triệu chứng bệnh và tiến hành phơi nắng kỹ từ 1-1,5 tháng, sau ñó xử lý củ với nước nóng khoảng 56-570C

Quy trình xử lý củ huệ bằng nước nóng ñể phòng trừ bệnh chai bông gồm các

bước sau:

- Bước 1: Chuẩn bị củ huệ ñể xử lý

Sau khi thu hoạch, ñem phơi củ trong 1-1,5 tháng, chọn những củ có ñường kính từ 3cm trở lên ñể xử lý

- Bước 2: Xử lý củ huệ bằng nước nóng

ðổ nước nóng và nước lạnh vào trong một thùng nhựa với tỷ lệ 6:5, rồi ñiều

chỉnh ñể nhiệt ñộ nước trong thùng khoảng 56-570C thì bắt ñầu cho củ vào nước Lượng nước xử lý cần gấp 6-7 lần lượng củ xử lý Sau ñó ñậy nắp thùng khoảng 15 phút và lại chỉnh cho nước trở lại nhiệt ñộ 56-570C bằng cách ñổ thêm một ít nước sôi từ từ khuấy ñều, và ngâm củ trong thùng ñậy kín trong 15 phút nữa

- Bước 3: Sau khi xử lý xong, củ ñược rải ñều và phơi khô trong 2 ngày sau rồi ñem trồng ra ruộng

2.1.5.2 Chuẩn bị ñất

Nên chọn nơi trảng nắng, luống trồng lên liếp rộng khoảng 1,2m và sâu 0,5m

ñể có thể giữ nước tốt Luống ñất nên bố trí dọc theo hướng mặt trời ñể cây nhận ánh sáng tốt và ñồng ñều Trước khi trồng nên bón phân lót và phun xịt các loại thuốc diệt nấm và mầm bệnh

2.1.5.3 Chăm sóc

Trong canh tác cây hoa huệ yêu cầu về nước là rất quan trọng, phải thường xuyên tưới nước ñồng thời phải xới ñất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát triển tốt Phân bón thường sử dụng ñể bón cho cây là hỗn hợp (Urea, lân và Kali), sau khi trồng ñược khoảng 2-3 năm cây huệ bắt ñầu bị thoái hóa: sinh trưởng chậm, cho hoa ít và kém chất lượng Do ñó phải nhổ lên phân loại củ và trồng lại trên một diện tích khác

Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới ñất, bón phân, tưới nước, phun thuốc , thường xuyên ñể tránh lây lan nguồn sâu bệnh hại

Khi trừ cỏ phải tiến hành theo nguyên tắc trừ sớm, trừ khi cỏ còn non và trừ sạch, có thể trừ cỏ bằng tay hoặc bằng thuốc

Trong quá trình trồng, nên bón phân với số lượng ít và chia thành nhiều ñợt như bón lót, bón thúc Ngoài cách bón vào ñất còn có thể phun lên lá ñể bổ sung dinh dưỡng, hỗ trợ cho quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa cần bón thêm phân ñạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bón thêm lân

và kali [9]

2.1.6 Vấn ñề sâu bệnh trên cây huệ

Trên cây hoa huệ, sâu thường gặp là rệp sáp, nhện ñỏ và nhất là tuyến trùng Bệnh gây hại trên cây huệ ñược chia thành hai nhóm:

- Nhóm bệnh không truyền nhiễm, do ngoại cảnh không phù hợp thường gặp nhất là thối xám, thối gốc, ñốm lá, gỉ sắt có thể phòng trị bằng các loại thuốc hóa học

- Nhóm bệnh truyền nhiễm chủ yếu do vi sinh vật ký sinh gây ra bao gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus thường rất khó trị, nhất là bệnh do virus gây ra do rất dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm trọng và truyền từ ñời này sang ñời khác, ñặc biệt là ở nhóm cây nhân giống vô tính (bằng củ) như cây huệ [8] Virus không thể phòng chống hay tiêu diệt bằng hóa chất như vi khuẩn, nấm và sâu bệnh, cách duy nhất ñể loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khỏe mạnh Vì vậy biện pháp làm sạch virus phải luôn ñược kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh [3]

Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa huệ thường bị nhện ñỏ phá hại nặng trên lá, từ 3-4 tháng trở ñi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể phòng trị bằng các loại thuốc sau: Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H Khoảng tháng 9-

10, khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì có thể khắc phục hiện tượng này bằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol [52]

2.1.7 Giá trị kinh tế và sử dụng của cây huệ

Với ñặc ñiểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt ñới như ở nước ta ñồng thời yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên huệ ñược trồng khá phổ biến và ñem lại thu nhập rất cao cho người dân

Trong những năm gần ñây, cây hoa huệ ñem lại thu nhập cao cho người dân các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, ðồng Tháp ðặc biệt, tại các tỉnh Nam Trung

Bộ như Bình ðịnh, Khánh Hòa, từ khi người dân mở rộng diện tích và nâng cao kỹ thuật canh tác, cây hoa huệ ñã trở thành cây trồng chính, ñem lại thu nhập cao và trở thành cây xóa ñói giảm nghèo Hiện nay, thu nhập từ cây hoa huệ ở ñồng bằng sông Cửu Long bình quân từ 150-200 triệu/ha và ở Nam Trung bộ là 80-150 triệu/ha Ngoài giá trị sử dụng thông thường như trên, gần ñây người ta còn sử dụng một số bộ phận của cây này làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm [54] Hiện nay, một số nghiên cứu về loài hoa này ñã tìm ra một số thành phần hoá học có liên quan ñến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý, ñược chiết xuất từ các bộ phận như hoa và sáp hoa trong ñó loại tinh dầu tuyệt ñối thu ñược

khi chiết xuất từ hoa như alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metil (4,5%), antranilat metil (8,0%), metilisoeugenol (10%), benzoat benzil (24%) Ngoài ra, n-alkan chiếm tỷ lệ không nhỏ tới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hoá học quan trọng trong việc chế xuất các loại nước hoa, dầu thơm [54]

Bên cạnh ñó, cây hoa huệ còn có công dụng trong y học, bộ phận ñược sử dụng là củ huệ Trong tinh dầu củ huệ có chứa thành phần sapogenin, sapogenin bao gồm hecogenin và tigogenin là loại hợp chất ñược chiết xuất ñể bào chế ra một số loại thuốc quý Từ lâu trong dân gian người dân ñã biết sử dụng cây hoa huệ ñể làm thuốc chữa một số bệnh ñơn giản Ở Ấn ðộ người ta ñã dùng củ phơi khô, tán thành bột ñể làm thuốc trị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi ñây ñã dùng củ huệ ñể chữa bệnh sốt rét

Ở một số nơi, dân gian còn dùng củ huệ ñể chữa bệnh hóc xương bằng cách ñem giã nát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hóc xương sau 1-2 phút sẽ khỏi [54]

2.2 Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước

Du nhập vào nước ta từ lâu và ñược trồng rộng rãi trong cả nước, nhưng cây huệ ñược trồng phổ biến hơn cả ở Miền Nam và Nam Trung Bộ Trong những năm gần ñây, diện tích canh tác cây hoa huệ ngày càng ñược mở rộng và ñem lại thu nhập cao cho người trồng

Theo thống kê hiện nay, trên ñịa bàn các tỉnh ðồng bằng sông Cửu Long có diện tích trồng huệ lớn hơn cả Trung bình các tỉnh có khoảng 500-1000 ha canh tác cây hoa huệ, khi thu hoạch có thể cho thu nhập từ 150-200 triệu ñồng/ha [55]

Do cây này dễ trồng, chi phí ñầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thời tiết và ñặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong ñiều kiện thuận lợi thường cho thu nhập cao

Trong những năm gần ñây, trên ñịa bàn các tỉnh vùng Nam Trung bộ bắt ñầu ñẩy mạnh canh tác cây hoa huệ, ñặc biệt là ở Bình ðịnh và Khánh Hòa Ở Bình ðịnh, cây hoa huệ dần trở thành cây trồng chính Theo ñánh giá của người dân nơi ñây, trong ñiều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80-120 triệu ñồng [53]

Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ ñang gặp nhiều khó khăn, do bị sâu bệnh hại phá hoại nhiều, trong ñó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông

Hiện nay, bệnh phá hoại rất mạnh, có thể làm giảm ñến 60% năng suất cây trồng Chính vì vậy, năng suất huệ trên nhiều vùng có xu hướng không ổn ñịnh và chất lượng hoa thì giảm ñáng kể

Hiện nay, bệnh chai bông ñang là nguyên nhân chính làm giảm năng suất và phẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, ñặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ Triệu chứng bệnh thể hiện:

- Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện các ñường gân sọc màu nâu ñỏ kéo dài từ bẹ lá ñến chóp lá, lá có thể bị xoắn

- Trên bông: nếu bị nhiễm nặng, bông sẽ bị chai không trỗ ñược hoặc bông bị ñen thui và khô, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu ñỏ

- Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân có những gai sần dày ñặc Tác nhân gây bệnh hiện nay vẫn chưa ñược làm rõ, tuy nhiên các triệu chứng bệnh thể hiện giống với những mô tả các triệu chứng bệnh do virus của Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) [28], [32]

Theo phương pháp nhân giống truyền thống, ñối với huệ, nguồn vật liệu ban ñầu ñể sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống ñóng vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của hoa sau này

Củ huệ tái sinh theo phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung là ở phía trong các nách lá có một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp ñiều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành chồi bên

Nhìn chung, phương pháp này ñơn giản, dễ làm và chi phí ñầu tư không cao nhưng có rất nhiều nhược ñiểm như: hệ số nhân thấp, thường làm thoái hóa giống, gây nhiễm bệnh hàng loạt ảnh hưởng lớn ñến năng suất và chất lượng hoa

2.3 Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào

Là phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong ñiều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con

Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào là phương pháp mới bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể khắc phục ñược những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống

2.3.1 Lịch sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu ñộc lập, hai nhà bác học người ðức là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào Học thuyết này cho rằng tế bào là ñơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật,

vì vậy có khả năng tồn tại ñộc lập

Gottlibe Haberlandt là người ñầu tiên ñề xuất phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1902 ñể chứng minh học thuyết về tính toàn năng của

tế bào Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào ñều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và ñầy ñủ thông tin của sinh vật ñó, khi gặp ñiều kiện thích hợp, mỗi tế bào ñều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào ñã ñược biệt hoá về chức năng khác nhưng không thành công ðiều ñó ñã giảm sự tin t-ưởng của các nhà khoa học ñối với phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong thời gian dài

ðến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss

ñã làm lại thí nghiệm của ông Họ ñã lấy ñỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa thảo nuôi cấy trong môi trường có khoáng, ñường, ñầu rễ ñã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại trong một thời gian mặc dù chuyển sang môi trường mới

Năm 1934, bắt ñầu giai ñoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật khi White ñã nuôi cấy thành công ñầu tiên rễ cà chua trên môi trường lỏng có chứa ñường, muối khoáng, dịch chiết nấm men Các thí nghiệm tiếp theo ông thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin nhóm B: thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6) Sau ñó ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng ñầu tiên là IAA

Năm năm sau Gautheret ñã thông báo về sự tái sinh của cà rốt, ñây cũng là lần ñầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn Bằng cách thêm IAA vào môi trường nuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của

mô ñã biệt hoá trên vết cắt của bề mặt mẫu cấy vô trùng Sau này người ta mới thấy rằng callus có thể trực tiếp nuôi cấy vô thời hạn ðến năm 1948,

Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt Trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin ựược tổng hợp như naphthylacetic acid (NAA), 2,4 Ờ Diclophenoxyacetic acid (2,4D) Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D ựã giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công ở nhiều ựối tượng thực vật trước ựó khó nuôi cấy Năm 1955, Miller và Skoog ựã xác ựịnh vai trò của chất kắch thắch sinh trưởng là

6 Ờ Furfuryl aminopurin (kinein) Việc phát hiện ra chất kắch thắch sinh trưởng, vitamin

và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai ựoạn thứ hai

Năm 1957, Miller và Skoog công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy ựối với sự hình thành cơ quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ

lệ auxin/kinetin tăng, mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ Hiện nay, những kết quả này cũng ựược quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và ựóng góp nhiều vào việc ựiều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh các cơ quan của mô, tế bào trong nuôi cấy Thành công của Miller và Skoog ựã mở ựầu cho giai ựoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật

Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy

mô, tế bào thực vật trong sản xuất Morel và Martin ựã phát triển kỷ thuật nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng ựể tạo giống sạch bệnh ở khoai tây và hoa lan Chắnh hai nhà khoa học này ựã mở ựầu cho một hướng mới của nuôi cấy tế bào thực vật, ựó là vi nhân giống

Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào ựơn và tế bào trần ựược phát triển mạnh Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen ựược phát triển

và thu ựược những thành tựu ựáng kể

Chúng ta ựang bước vào giai ựoạn thứ 4 của nuôi cấy mô, tế bào thực vật đó là giai ựoạn nuôi cấy mô, tế bào ựược ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tắnh sinh học

và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao

2.3.2 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vật người ðức, tất cả các tế bào của cây ñều mang toàn bộ lượng thông tin

di truyền của cơ thể, khi gặp ñiều kiện thích hợp, mỗi tế bào ñều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [24] Thực tế ñã chứng minh ñược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng ñã ñược nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980) [41]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất

là kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa Tất cả các tế bào trong các

cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành ñều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa ñể ñảm nhiệm các chức năng khác nhau ñược gọi là sự phân hóa tế bào Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là tế bào ñã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất ñi khả năng phân chia mà ở ñiều kiện thích hợp chúng

có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia

Các quá trình trên có thể tóm tắt như sau:

Ví dụ như khi nuôi cấy mảnh lá hay ñốt thân cây thuốc lá, ở ñiều kiện môi trường thích hợp, các tế bào ñã phân hóa của lá, ñốt thân sẽ phản phân hóa, phân chia trở lại thành mô sẹo, không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá, ñốt thân nữa Nếu chuyển sang môi trường khác thì tùy theo thành

Tế bào dãn Phân hóa tế bào

Phản phân hóa

tế bào

phần mơi trường mà các tế bào mơ sẹo cĩ thể phân hĩa theo các hướng khác nhau (hình thành rễ, chồi hay cây hồn chỉnh )

Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hĩa, ức chế các gen Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều cĩ một số gen nhất định được hoạt hĩa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động ðiều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hĩa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luơn được hài hịa Mặt khác, khi nằm trong khối

mơ bình thường, tế bào luơn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh khơng cịn nữa thì các gen được hoạt hĩa và quá trình phân hĩa sẽ xảy ra theo một chương trình định sẵn [16]

2.3.3 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro cĩ khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp Sau đây là những

- Tạo được dịng thuần của các cây tạp giao

- Tạo được cây cĩ genotip mới (đa bội, đơn bội)

- Bảo quản và lưu giữ tập đồn gen

- Cĩ khả năng sản xuất quanh năm

- Cĩ thể nhân nhanh nhiều cây khơng kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém

- Hệ số nhân giống cực kỳ cao (thường đạt được ở lồi cây khác nhau trong phạm vi từ 36-1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà [3]

Trong cơng tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất

lượng và số lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng, người ta ñã tạo ra ñược những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel (1945) [36] ñã chứng minh ñược rằng, nồng ñộ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần ñỉnh sinh trưởng, riêng ñỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952) [37] Nguyên nhân của hiện tượng này là:

- ðỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng thâm nhập

- ðỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus

- Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở ñỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus

Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không

gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt Chỉ tính riêng lĩnh vực true-to-type, nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc ñại cách mạng

về hệ số nhân Thí dụ: sử dụng chồi nách ñể nhân có thể tạo ra hàng chục

vạn cây D.fLoribunda trong vòng một năm (Chaturvedi, Sinha, 1979) [27],

(Phạm Văn Hiển và cs, 1988) [7] hay 26 vạn cây cam thảo trong 5 tháng (Shah, Dalal, 1980) [43] từ một lát cắt ban ñầu Thông thường một cây

D.foLoribunda chỉ tạo ra 8-10 cây trong một năm, và cam thảo chỉ cho 5-7 cây nếu nhân giống bằng cành Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự ñã ñạt ñược hệ số nhân 532 trong vòng một năm ñối với cây khoai tây bằng phương pháp này [13] ðặc biệt, cây cọ dầu thường phải mất 10-15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh ñược một giống mới rất khó khăn [23] Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp ñược

500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staricky, 1970) [49] Nhược ñiểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là ñòi hỏi trang thiết bị ñắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả ñối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973) [44] Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi sau:

- Mặc dù số lượng cây giống thu được cĩ thể rất cao nhưng cây con cĩ kích thước nhỏ, địi hỏi phải cĩ chế độ chăm sĩc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm

- Cây cĩ thể cĩ những đặc tính khơng mong muốn

- Khả năng tạo đột biến tăng

- Khả năng tái sinh cĩ thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù

tế bào nhiều lần

- Cây giống cĩ thể bị nhiễm bệnh đồng loạt

Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ những mục đích sau:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho cơng tác chọn giống

- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dịng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực cĩ củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhĩm cây thân thảo

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhĩm thân gỗ

- Nhân nhanh ở điều kiện vơ trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

- Bảo quản và lưu giữ các tập đồn giống nhân giống vơ tính và các lồi giao phấn trong ngân hàng gen

2.3.4 Kỹ thuật nuơi cấy in vitro

Kỹ thuật nuơi cấy in vitro cĩ thể chia thành các bước sau:

+ Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp

Nguyên liệu sử dụng cho nuơi cấy mơ, tế bào thực vật cĩ thể là bất cứ

bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá ), các cấu trúc của phơi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, nỗn thậm chí cả mẩu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành ) cũng được dùng cho nuơi cấy [23]

+ Khử trùng mẫu và tiến hành nuơi cấy

Nguyên liệu để nuơi cấy in vitro được lựa chọn từ những cá thể ưu tú

của loài, khỏe và sạch bệnh, nhưng ít nhiều ñều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc vào sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh Có một số

bộ phận như phôi trong hạt, mô trong quả, dòng lúa non ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt ñất như rễ,

củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao Phương pháp thông dụng nhất hiện nay ñể loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuôi cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm [24]

Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng ñộ, thời gian xử lý và mức ñộ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy ðể làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70-80% trong 30 giây, sau ñó mới xử lý bằng dụng dịch diệt khuẩn ðối với những mẫu có bề mặt ñược bao phủ lớp sáp, muốn ñạt ñược kết quả tốt nhất cần cho thêm vào dung dịch khử trùng một vài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol vì các chất này làm tăng tính bám dính của hóa chất khử trùng Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹ bằng nước xà phòng và ñể dưới vòi nước chảy từ 20 ñến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm ñáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy (Narayanswamy S., 1997) [42]

Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng ñến

mô cấy vì vậy việc lựa chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức ñộ nhiễm khuẩn và ñộ mẫn cảm của từng mẫu Trong số các hóa chất hay ñược sử dụng ñể khử trùng thì canxi hypoclorit và natri hypoclorit là hay ñược sử dụng hơn cả vì có ñộc tính thấp ñối với mô ñược xử lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt Nồng ñộ của canxi hypoclorit và natri hypoclorit tương ứng thường là 5-15% và 0,5-2% trong thời gian 15-30 phút Tuy nhiên, những chất này không bền nên trong thực tế HgCl2 cũng hay ñược dùng ñể thay thế

+ Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt ñộ, ánh sáng) ñể ñiều khiển quá trình phát triển mô nuôi cấy theo ñịnh hướng

Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào ñiều kiện nuôi cấy Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối

ưu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều khác nhau (Murashige và Skoog, 1962) [39] Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy bao gồm cả chất lượng và số lượng hóa chất sử dụng ñóng vai trò quyết ñịnh ñối với bản thân sự phân hóa và chiều hướng phân hóa của tế bào

Cho ñến nay, ñã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng ñược tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmaer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974) ðây là những môi trường cơ bản và sẽ ñược cải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau phù hợp với mỗi ñối tượng nghiên cứu và mục ñích thí nghiệm Trong số ñó, môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) ñược ñánh giá là phù hợp nhất cho

ña số các loài thực vật và chính Murashige (1974) ñã dùng môi trường này

ñể nuôi cấy nhiều loài cây trồng [40]

Thành phần chủ yếu của tất cả các loại môi trường gồm những nhóm chất sau: muối khoáng ña lượng và vi lượng (muối chlorid, nitral, sulphat, chất tham gia ñiều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi (Bhojwani and Razdan, 1983) [26]

Các auxin ñều có hiệu quả sinh lý ở nồng ñộ thấp, thường ñược sử dụng với nồng ñộ từ 10-1M ñến 10-6M tùy theo từng chất, mục ñích và ñối tượng nghiên cứu Auxin ñược thêm vào môi trường nuôi cấy sẽ kết hợp với auxin nội sinh ñể ñiều khiển chiều hướng và cường ñộ các quá trình sinh trưởng Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát ñộng sự tạo mô sẹo

Các auxin thường ñược sử dụng trong nuôi cấy mô là IBA (indol butyric acid), α-NAA (α-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (indol acetic acid)

Cytokinin là nhóm phytohormon dẫn xuất của adenin, có vai trò sinh lý tương tự nhau Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảm ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy Nồng ñộ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của

ñể ñiều khiển quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Các mô khác nhau có phản ứng không giống nhau Vì vậy, với từng loại mô và từng giai ñoạn sinh trưởng khác nhau, việc tìm ñược tổ hợp nồng ñộ auxin-cytokinin thích hợp có ý nghĩa rất quan trọng

+ ðưa những cây tái sinh ñược trở lại ñiều kiện tự nhiên

ðây là giai ñoạn quan trọng bao gồm việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với ñiều kiện thay ñổi nhiệt ñộ, ñộ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Quá trình thích nghi

ở ñây ñược hiểu là quá trình thay ñổi ñặc ñiểm sinh lý và giải phẫu của cây

in vitro Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần

2.3.5 Các ñường hướng nhân giống vô tính in vitro

Khả năng thành công của nuôi cấy mô, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu, khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu Như vậy tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi ñến tế bào các ñỉnh sinh trưởng ñang ở trạng thái hoạt ñộng (ñỉnh ngọn, chóp rễ) và sau ñó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách)

Trong nhân giống in vitro, cây con có thể ñược tái sinh từ các ñiểm sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, ñỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành ñiểm sinh trưởng phụ Có hai phương pháp tái sinh cây con: + Tái sinh trực tiếp từ ñỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn, chồi hay chồi nách + Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai ñoạn hình thành mô sẹo

Tái sinh trực tiếp (direct regeneration) từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát ñộng những ñiểm sinh trưởng ñã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây Các ñiểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể ñặc trưng cho loài Cây con tạo ra theo con ñường này hoàn toàn ñồng nhất về mặt di truyền và duy trì ñược những tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983) [33]

Trong ñường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus) Có thể thấy ngay là

hệ số nhân của con ñường này vô cùng lớn Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thông qua kỹ thuật tạo phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền Nguyên nhân của hiện tượng này là

do trong quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào ñột biến mang số nhiễm sắc thể không giống với tế bào ban ñầu hoặc chứa những ñột biến gen do hiện tượng nội nguyên phân (endomitosis hay endoreduplication) Nội nguyên phân là hiện tượng nhân ñôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào trong thực tế và là một hiện tượng tự nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của các thành phần của môi trường dinh dưỡng và ñiều kiện cũng như phương pháp nuôi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều lần (D’Amato, 1977) [30] ðột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng những ñặc tính di truyền (trueness-to-type) trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là ñối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống Ngoài việc cung cấp những ñột biến tự nhiên, mô sẹo còn là ñối tượng lý tưởng ñể tạo ra những ñột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây ñột biến hoặc công nghệ gen

Vì vậy, trong nhân giống in vitro, ñể nhân nhanh những cá thể ñã chọn lọc người ta thường tái sinh cây theo ñường hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị ñể phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng

2.3.6 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Debergh (1991) [31] thì quy trình nhân giống ñược chia làm 5 giai ñoạn:

2.3.6.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu

ðây là giai ñoạn quan trọng quyết ñịnh vi nhân giống Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu trong ñiều kiện khử trùng Mỗi cây ñều có ngưỡng nhiệt ñộ và ñộ ẩm phù hợp khi bảo quản

và xử lý mẫu Với cây nhiệt ñới và á nhiệt ñới thì nhiệt ñộ 250C, ñộ ẩm 75%

là ñiều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Debergh và Zimmerman, 1991) [31]

2.3.6.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục ñích của giai ñoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Mẫu thường là chồi ñỉnh, chồi nách hay lát cắt ñốt thân tùy thuộc ñối tượng

và mục ñích nghiên cứu Quan trọng nhất là cần chú ý ñến trạng thái sinh lý của mẫu Khả năng thành công của nuôi cấy mô, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào, càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu thì nuôi cấy càng có khả năng thành công bấy nhiêu Như vậy, tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi ñến tế bào ñỉnh sinh trưởng ñang hoạt ñộng (ñỉnh ngọn, ñầu rễ), sau ñó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách)

2.3.6.3 Nhân nhanh chồi

ðây là giai ñoạn ñánh giá tính ưu việt của phương pháp vi nhân giống (liên quan ñến hệ số nhân chồi) Môi trường ở giai ñoạn này ñược bổ sung hormon sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường ñộ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux Ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hóa mạnh, nhiệt ñộ thích hợp từ 20-300C

2.3.6.4 Tái sinh rễ

Khi chồi ñạt ñến một kích thước nhất ñịnh, mẫu ñược chuyển sang môi trường tạo rễ Môi trường này thường ñược bổ sung auxin (IBA, α-NAA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp Tuy nhiên, ở một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng (Bhojwani và

Razdan, 1983) [26]

2.3.6.5 ðưa cây in vitro ra ñất

Ở giai ñoạn này, cây ñược chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vì vậy cần phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến ñổi của môi trường, ñồng thời thay ñổi những ñặc ñiểm sinh lý và giải phẫu của cây con

2.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa huệ trong nước và trên thế giới

2.4.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa huệ ở Việt Nam

Hoa huệ khi nhân giống bằng củ thường cho hệ số nhân thấp Mặt khác, nếu

nhân giống theo phương pháp truyền thống liên tục trong nhiều năm sẽ làm lây lan các mầm bệnh sẵn có trong củ, tăng lượng virus tích lũy trong củ, và có thể truyền

từ thế hệ này sang thế hệ khác làm cây sinh trưởng kém, hoa nhỏ và ra ít ðể khắc phục nhược ñiểm trên người ta ñã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào

Cây hoa huệ là một ñối tượng mới của phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta Hiện nay, mới chỉ có một vài nghiên cứu bước ñầu ñược thực hiện và cho kết quả Năm 2006, trước tình hình diễn biến bệnh chai bông gây hậu quả nghiêm trọng ñến năng suất và phẩm chất hoa huệ tại ðồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn

Lê Trâm Anh dưới sự hướng dẫn của T.S Nguyễn Bảo Toàn và các cộng sự ở Bộ môn Sinh lý Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường ðại học Cần Thơ ñã tiến hành nuôi cấy phân sinh mô chồi cây huệ Từ cây huệ bị nhiễm bệnh ngoài ñồng, các tác giả ñã phân lập phân sinh mô chồi Phân sinh mô chồi (còn gọi là ñỉnh sinh trưởng) là nơi tận cùng của chồi hoặc rễ Khi phân sinh mô chồi phát triển, nó có thể phát sinh chồi, lá non hoặc hoa ðể phân lập phân sinh mô chồi, các tác giả ñã dùng 2 biện pháp: phân lập trực tiếp từ chồi ngọn ñược lấy ngoài ñồng và phân lập gián tiếp từ nuôi cấy mầm trong ống nghiệm Các phân sinh

mô chồi sau khi phân lập, ñược nuôi cấy trong ống nghiệm với các chất ñiều hòa sinh trưởng và các chất dinh dưỡng ñể tạo ra cây con Các tác giả ñã nhận thấy môi trường MS bổ sung 0,25 mg/l 2,4-D là môi trường tốt nhất kích thích mẫu tạo chồi Cũng theo kết quả này, trên nền môi trường MS bổ sung các loại auxin khác nhau thì sự gia tăng kích thước ñỉnh sinh trưởng, số chồi tạo thành và chiều cao chồi tái sinh khác biệt không ý nghĩa Môi trường nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh là MS + 3g/l

than hoạt tính + 500 ml nước dừa + 0,125 mg/l 2,4-D [2]

Sau ñó, khi nghiên cứu môi trường nhân nhanh cây hoa huệ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, Huỳnh Thị Huế Trang ñã sử dụng chồi cây huệ ñược tái sinh

từ ñỉnh sinh trưởng của nghiên cứu trên ñể làm vật liệu nghiên cứu, ñã xác ñịnh môi trường nhân nhanh tốt ñối với cây hoa huệ là môi trường MS bổ sung 1mg/l BA ñạt

hệ số nhân chồi 6,3 Môi trường tốt nhất cho quá trình tạo cây hoàn chỉnh là MS + 3 g/l than hoạt tính + Atonik 10 ml Thuần dưỡng cây huệ trên giá thể Xơ dừa và phủ bằng khay mủ có lỗ thoáng khí cho tỷ lệ sống cao nhất [18]

2.4.2 Những nghiên cứu nuôi cấy mô cây hoa huệ trên thế giới

Nuôi cấy mô cây hoa huệ trên thế giới ñã ñạt ñược nhiều thành công trong

khoảng hơn 10 năm trở lại ñây Theo các nguồn tài liệu, các nghiên cứu về nuôi cấy

mô cây hoa huệ ñược các nhà khoa học trên thế giới bắt ñầu tiến hành từ năm 1998

và ñã thu ñược nhiều thành công

Khi nuôi cấy các chồi ngủ của cây hoa huệ trên môi trường MS có bổ sung IAA, BA với các nồng ñộ khác nhau, Sangavai C và Chellapandi P (1998) ñã ñưa ra kết luận rằng khi nồng ñộ BA là 0,5 mg/l thì khả năng tái sinh của các chồi ngủ là cao nhất (98%) với tỷ lệ hình thành chồi trung bình là 2,2 ± 1,2 chồi/ mẫu Sau khi các chồi ngủ ñược tái sinh trên môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l BA thì ông tiến hành lấy nguồn mẫu lá trên chồi huệ tái sinh ñể tiến hành thí nghiệm phân tích một

số chất và các thành phần hóa học quan trọng của cây hoa huệ [46]

Cũng trong thí nghiệm này, Chellapand P (1998) ñã tiến hành các nghiên cứu về ảnh hưởng tổ hợp của IAA và BA ñến sự hình thành callus và tạo chồi từ các chồi ngủ cây hoa huệ Khi cảm ứng ñể tạo callus trên các môi trường có bổ sung các nồng ñộ IAA khác nhau từ 0,5-3,5mg/l tổ hợp với BA nồng ñộ 0,5mg/l thì kết quả cho thấy ở môi trường có bổ sung 3,0mg/l IAA và 0,5mg/l BA cho tỷ lệ tạo callus trung bình nhiều nhất là 37,8 ± 1,2 Sau ñó, các callus tạo thành ñược cấy chuyển sang môi trường

MS chứa 35g/l saccaroza có bổ sung tổ hợp BA với nồng ñộ thay ñổi từ 0,5-2mg/l và 0,5mg/l IAA ông ñã ñưa ra kết luận trên môi trường cho tỷ lệ callus tạo chồi ñạt cao nhất (87%) là MS có bổ sung 1,5mg/l BA và 0,5mg/l IAA Cũng trên môi trường này,

sự tái sinh chồi ñạt ñược trung bình là 2,3 ± 1,2 chồi/callus [46]

Một nghiên cứu khác cũng tiến hành nhằm cảm ứng tạo callus từ các chồi ngủ cây hoa huệ của Muhamdad (2003) Ông tiến hành thí nghiệm và ñã tạo callus từ các chồi ngủ hoa huệ từ trên môi trường MS có bổ sung α-NAA nồng ñộ 1mg/l Sau

ñó, các callus ñược cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,4mg/l 2,4-D thì hệ

số nhân chồi là 4 chồi/callus Các chồi tạo thành ñược tách ra và cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,1mg/l L-arginine thì số chồi tăng lên 10 chồi/callus sau

12 tuần nuôi cấy Khi các chồi tạo thành có chiều cao khoảng 2-3cm tiếp tục cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 2mg/l BA tổ hợp với 2,4-D nồng ñộ 0,4mg/l thì thấy các chồi mới mọc lên rất nhanh tại chính vị trí cắt [38]

Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ, BA, NAA và một số auxin khác ñến quá trình nhân giống in vitro cây hoa huệ Kết quả thí nghiệm của Hutchinson, M.J., Onamu, R., Obukosia, S (2004) cho thấy khi tổ hợp TDZ và BA với nồng ñộ thấp dưới 0,5mg/l thì có hiệu quả cao nhất, nó làm tăng nhanh chiều cao chồi trung bình

từ 0,7-1cm và chiều dài của lá/chồi trung bình ñạt từ 2,7-3,2cm sau 2 tuần nuôi cấy Tuy nhiên, khi nồng ñộ TDZ sử dụng cao hơn 0,5mg/l thì gây ñộc và có thể làm chồi bị chết Ngoài ra, khi kết hợp giữa NAA và TDZ hoặc với BA thì các chồi ngủ

có xu hướng tạo callus [34]

Ngoài các nghiên cứu trên, một số tác giả cũng ñã tiến hành các nghiên cứu trên ñối tượng cây hoa huệ Uthairatannakij A (2003) ñã nghiên cứu sự biến ñổi của hoa huệ sau khi cắt trên môi trường có bổ sung TDZ với nồng ñộ khác nhau Thí nghiệm tiến hành với môi trường chỉ chứa 20% saccaroza và môi trường có tổ hợp của 20% saccaroza và TDZ có nồng ñộ tương ứng là 1mg/l; 2mg/l; 5mg/l Các công thức thí nghiệm ñều ñặt ở nhiệt ñộ 200C trong 12 giờ Sau 5 phút theo dõi ông chỉ ra rằng với môi trường chỉ bổ sung 20% saccaroza thì hoa không có sự thay ñổi so với ban ñầu, nhưng trên môi trường có tổ hợp của 20% saccaroza và TDZ thì có hiện tượng các nụ hoa ñược bật ra khác so với ban ñầu, trong ñó ở nồng ñộ 5mg/l TDZ thì tỷ lệ bật nụ cao nhất (67%) và thấp nhất (23,1%) khi nồng ñộ TDZ là 1mg/l [50] Nagar (1995) sau khi nghiên cứu các củ huệ sau khi thu hoạch ông ñã phát hiện ra sự có mặt của acid abcisic (ABA) trong thời gian ngủ nghỉ của củ huệ, ñồng thời ông thấy một loạt các acid và một số dạng phenol liên kết cũng bị biến ñổi

trong pha ngủ nghỉ Ông ñã khẳng ñịnh, khi hàm lượng IAA trong củ càng thấp thì khả năng bật chồi của củ huệ càng diễn ra sớm [43]

Theo Phua R.S, Ghosh, S.K (2002) ñã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chỉ tiêu như kích thước củ, chất lượng bảo quản và xử lý củ bằng các hợp chất hóa học ñến khả năng sinh trưởng của cây và sự tăng chất lượng của hoa huệ Ông thấy với các củ có ñường kính từ 1,5-2,0cm, củ ñược bảo quản trong 10-30 ngày ở nhiệt ñộ từ 4 -100C và các củ này ñược ngâm trong GA3 (200mg/l) và thiourea (2000mg/l) trong 6 giờ thì những củ này ñược sử dụng ñể ñánh giá khả năng sinh trưởng của cây, tăng số lượng bông và chất lượng hoa Việc xử lý củ theo cách trên cũng liên quan ñến hiện tượng ra hoa sớm và làm tăng chất lượng hoa [45]

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng

Hình 3.1 Cây hoa huệ hương

ðề tài ñược tiến hành trên giống huệ hương, ñây là giống huệ quý ñược lưu giữ tại Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ thuộc sở Khoa học và Công nghệ Bình ðịnh

Vật liệu dùng ñể nuôi cấy là phần ñỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa huệ, có kích thước 1-2mm

ðề tài ñược thực hiện từ tháng 7/2008 ñến 08/2009

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Giai ñoạn khử trùng mẫu: Xác ñịnh phương pháp khử trùng tốt nhất ñối với mẫu nuôi cấy là phần ñỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa huệ

ðể tìm ra ñược hóa chất và phương pháp khử trùng có hiệu quả cao nhất, tiến hành các thí nghiệm sau:

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl 2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau ñến hiệu quả khử trùng mẫu

Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar + 2mg/l BA

Công thức Thời gian khử trùng (phút)

Ghi chú: 15 phút khử trùng HgCl2 0,1% là công thức tốt nhất của thí nghiệm 1

3.2.2 Giai ñoạn nuôi cấy khởi ñộng

Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng trên nền môi trường ñặc (có 6,5g/l agar) bổ sung 30 g/l saccaroza tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy

Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin ñến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy

Thí nghiệm 4 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA ñến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy

Ghi chú: 4mg/l BA là công thức tốt nhất của thí nghiệm 2

3.2.3 Giai ñoạn nhân nhanh

3.2.3.1 Nhân nhanh chồi

Thí nghiệm 6 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và αα-NAA ñến khả năng nhân nhanh chồi

Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar

Thí nghiệm 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA ñến khả năng nhân nhanh chồi

Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar

Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar

Công thức Nồng ñộ kinetin (mg/l) Nồng ñộ αα-NAA (mg/l)

Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar

Công thức Nồng ñộ kinetin (mg/l) Nồng ñộ IAA (mg/l)