Nghiên cứu quy trình chuyeenrrrr gen vào cây hoa loa kèn “lilium longiflorum” bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


     -

LƯƠNG HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN

VÀO CÂY HOA LOA KÈN “Lilium longiflorum”

BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT

Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI - 2009

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào Mọi

sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñều ñã ñược cảm ơn Các thông tin, tài liệu trong luận văn này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Lương Hồng Hạnh

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦii

LỜI CẢM ƠN

Sau một quá trình thực hiện ựề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội, ựược sự giúp ựỡ tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ của Viện cùng với sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, ựến nay tôi ựã hoàn thành xong ựề tài tốt nghiệp của mình

- Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh - Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội, người ựã trực tiếp hướng dẫn và giúp ựỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện ựề tài tốt nghiệp, cũng như thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này

- Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn CNSH Thực vật - SHPT và CN Vi sinh ựã ựóng góp nhiều ý kiến giúp tôi thực hiện ựề tài

- Tôi xin chân thành cảm ơn Ks Nguyễn Thị Thanh Phương, Ks Hồ Thị Thu Thanh và toàn thể các cán bộ của Viện Sinh học Nông nghiệp Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã luôn giúp ựỡ tôi khi tôi thực hiện ựề tài tại Viện Nhân ựây tôi xin trân trọng cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Nông học, Viện đào tạo Sau ựại học cùng tất cả các thầy cô giáo, gia ựình và bạn bè ựã giúp tôi hoàn thành ựề tài này

Hà Nội, tháng 09 năm 2009

Tác giả

Lương Hồng Hạnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………iii

2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi

2.5 Một số thành tựu và xu hướng phát triển của cây trồng biến ñổi gen 19

3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 31

4.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến

khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 41 4.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy

ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens 45

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦiv

4.3 Thắ nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp lây

nhiễm mẫu ựến khả năng chuyển gen của vi khuẩn

Agrobacterium tumefasciens 50 4.4 Thắ nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi

cấy ựến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium

4.5 Thắ nghiệm 5: đánh giá tác ựộng tổ hợp của các công thức tối ưu

tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

CT Công thức 2,4 D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

BA 6-Benzyllamino purine

AS Acetosyringone TNC Tiền nuôi cấy ðNC ðồng nuôi cấy

MS Murashige & Skoog, 1962 PPT DL - Phosphinotricine

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦvi

DANH MỤC BẢNG

4.1 đánh giá ảnh hưởng của nguồn mẫu ựến khả năng chuyển gen của

vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của gen Gus (sau 3 tuần) 41 4.2 đánh giá ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ựến khả năng chuyển gen

của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar (sau 8 tuần ) 44 4.3 đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ựến khả năng

chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện gen Gus

4.4 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ựến khả năng chuyển gen

của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar (sau 8 tuần) 48

4.5 đánh giá ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu ựến khả năng

chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của gen Gus (sau 3

4.6 đánh giá ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu tới khả năng

chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar (sau 8

4.7 đánh giá ảnh hưởng của thời gian đNC ựến khả năng chuyển gen

của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện gen Gus (sau 3 tuần) 56 4.8 đánh giá ảnh hưởng của thời gian đNC ựến khả năng chuyển gen

của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar (sau 8

4.9 đánh giá tác ựộng của tổ hợp các công thức tối ưu tới khả năng chuyển

gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua sự biểu hiện của gen Gus (sau 3 tuần) 60

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………vii

DANH MỤC HÌNH

2.3 Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra trên

thân cây hoa hồng (A) và trên thân cây nho (B) 9

4.1 Ảnh hưởng của nguồn mẫu ñến khả năng chuyển gen của vi

4.2 Ảnh hưởng của nguồn mẫu ñến khả năng chuyển gen của vi

4.4 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen

4.6 Mẫu sống trong MT chọn lọc có 2.5mg/l PPT 50 4.7 Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu ñến khả năng

4.8 Ảnh hưởng của PP lây nhiễm mẫu tới khả năng chuyển gen của

4.9 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen

của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 58 4.10 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦviii

4.11 đánh giá tác ựộng của tổ hợp các công thức tối ưu tới khả năng

chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua sự biểu hiện của

4.10 đánh giá tác ựộng của tổ hợp các công thức tối ưu tới khả năng

chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua sự biểu hiện của gen

4.12 Kết quả ựiện di sản phẩm PCR của các dòng loa kèn chuyển gen 63 4.13 Sơ ựồ thể hiện quy trình chuyển gen cho hoa loa kèn

L.longiflorum nhờ vi khuẩn A.tumefacens 66

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………1

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Nói ñến vẻ ñẹp của thiên nhiên không thể không nói ñến các loài hoa Mỗi loài hoa ẩn chứa một vẻ ñẹp, một sức quyến rũ và giá trị kinh tế riêng Với màu trắng pha thêm chút xanh, mùi hương thơm dịu, hoa loa kèn trắng

(Lilium longiflorum) ñã rất ñược ưa chuộng và có giá trị kinh tế cao trên thị

trường hoa thế giới và Việt Nam

Tuy nhiên, cây hoa loa kèn trắng có thời gian sinh trưởng khá dài nên người trồng phải chi phí cao cho phòng trừ cỏ dại và sâu bệnh, ñặc biệt là vào mùa Xuân ẩm ướt, gây ra những khó khăn cho người sản xuất hoa loa kèn ở miền Bắc nước ta Việc chọn tạo ra các giống cây hoa bằng tất cả những phương pháp chọn tạo giống hiệu quả luôn là mong muốn của các nhà chọn tạo giống với mục tiêu không ngừng nâng cao giá trị thu nhập trên một ñơn vị diện tích canh tác cho người nông dân Do ñó, việc tạo ra các giống cây hoa loa kèn mới chống chịu ñiều kiện bất lợi của thời tiết, chống chịu sâu bệnh, kháng thuốc trừ cỏ là nhu cầu của thực tiễn sản xuất và mong muốn của các nhà chọn tạo giống

Ngày nay với sự phát triển của công nghệ gen ñã cho phép các nhà chọn tạo giống ñưa ñược những tính trạng mong muốn vào cây trồng chỉ trong thời gian ngắn (chỉ sau một thế hệ), tạo ñược nhiều giống mới có nhiều ñặc tính mới Với phương pháp này, người ta có thể ñưa ñược những gen quy ñịnh những tính trạng mới, kể cả những tính trạng của những loài có quan hệ rất

xa, cũng có thể từ vi sinh vật, ñộng vật… ñiều mà các phương pháp truyền thống không thể thực hiện ñược Trong các kỹ thuật chuyển gen, thì phương

pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens tỏ ra có nhiều ưu

ñiểm hơn các phương pháp khác và ñược sử dụng phổ biến nhất Chính vì vậy

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………2

chúng tôi thực hiện ñề tài:“Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào cây hoa loa kèn (Lilium longiflorum) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”

1.2 Mục ñích và yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Xác ñịnh ñược các thông số kĩ thuật cho các bước trong quy trình

chuyển gen mục tiêu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, làm cơ sở cho

việc tạo cây chuyển gen mang các ñặc tính mong muốn

1.2.2 Yêu cầu

1 Xác ñịnh ñược vật liệu lây nhiễm phù hợp

2 Xác ñịnh ñược phương pháp lây nhiễm vi khuẩn phù hợp

3 Xác ñịnh ñược thời gian tiền nuôi cấy phù hợp

4 Xác ñịnh ñược thời gian ñồng nuôi cấy phù hợp

5 Xác ñịnh ñược sự có mặt của gen chuyển nạp trong mẫu ñã

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của ñề tài làm tiền ñề và thúc ñẩy việc ứng dụng một phương pháp mới là tạo giống cây trồng chuyển gen mang ñặc tính mong muốn trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa loa kèn nói riêng ở Việt Nam

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về hoa loa kèn

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại

a) Nguồn gốc

Lily là tên gọi chung của tất cả các loài Lilium, họ Liliaceae ựược tìm

thấy ở các nước thuộc khu vực đông Á như: Nhật Bản, Trung Quốc, các vùng dọc theo dãy núi Himalaya Ngày nay, lily ựược trồng phổ biến khắp nơi trên thế giới, chẳng hạn: Mỹ, Hà Lan, Nhật Bản, Ý, Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam Trong ựó Trung Quốc ựược xem là nước trồng cây hoa lily ựầu tiên

Trong sản xuất có thể phân chia Lilium thành ba nhóm chắnh sau: Asiatic lily,

Oriental lily, Longiflorum lily

Hiện nay ở Việt Nam trong sản xuất chủ yếu trồng hoa loa kèn Lilium

longiflorum Thunb (hay còn gọi là Huệ Tây) [21], là giống ựược nhập nội vào Việt Nam từ rất lâu do người Pháp du nhập vào, gần ựây có một số giống nhập nội ựang ựược trồng thử nghiệm ở Sapa, đà Lạt, Hải Phòng và một số nơi khác

b) Phân loại khoa học

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………4

Loài: L Longiflorum

Danh pháp khoa học Lilium longiflorum Thunb

(Dương ðức Tiến, Võ Văn Chi, 1978)

* Thân vảy là phần phình to của các vảy củ tạo thành, trên ñĩa thân vảy

có vài chục vảy hợp lại, phía ngoài không có màng bao bọc nên gọi là thân vảy trần Màu sắc, kích thước của thân vảy tùy thuộc vào loài, giống khác nhau ðây là phần thương phẩm có thể dùng ñể nhân giống

* Rễ hoa loa kèn trắng gồm hai phần rễ thân và rễ gốc Rễ thân do phần

thân mọc dưới mặt ñất sinh ra, có nhiệm vụ nâng ñỡ thân, hút nước và dinh dưỡng, rễ gốc sinh trưởng khỏe, là cơ quan chủ yếu hút nước và dinh dưỡng của loa kèn

* Lá hoa loa kèn trắng mọc chéo nhau, hình dài, hình trứng… không có

cuống hoặc cuống rất ngắn, mọc xung quanh thân Một số ít giống ở nách có

lá mầm, có thể dùng ñể nhân giống

* Hoa loa kèn trắng mọc ñơn lẻ hoặc cụm gồm nhiều hoa thường có

1-6 hoa Hoa to mọc riêng rẽ thành chùm hoặc thành cụm trên ñỉnh ngọn thân, hoa thường có 6 cánh và 6 nhị, nếu muốn hoa tươi lâu thì khi cắm hoa ta nên cắt 6 bao phấn của hoa sẽ ñể ñược hoa tươi lâu hơn và ngăn chặn sự già hoá

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………5

Mỗi củ chỉ có một cành hoa, mầm thân của nó bị rụng ñi, hoặc sau khi ngắt ngọn không thể mọc ra thân mới, cũng không thể hình thành cành hoa khác Hoa có hình dạng như hình loa kèn…( Flower favourite), màu trắng, hương thơm dễ chịu [8]

2.1.3 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế

Hoa loa kèn to, có ñộ bền cao, hoa có màu trắng tinh khiết tượng trưng cho một vẻ ñẹp quý phái Hoa ñược sử dụng trong những ngày hội lớn, ngày lễ tết, trang trí trong hội trường, công viên, trong văn phòng Không những thế, hoa còn ñược cắm trong phòng khách của mỗi gia ñình tạo nên một cảm giác thoả mái và ấm cúng Ngoài ra hoa loa kèn còn ñược

sử dụng làm quà tặng nhân các dịp lễ Với Hà Nội, hoa loa kèn ñược coi là một thứ hoa sang trọng, quyền quý, trong sáng, nhẹ nhàng, ñặc trưng của

Hà Nội khi tháng tư về [37]

Ở Châu Âu, Lilium longiflorum ñược gọi là Easter lily _ hoa Phục Sinh

vì hoa nở vào mùa Phục Sinh [37] Hoa loa kèn tượng trưng cho niềm hân hoan vui mừng trước vẻ ñẹp và niềm hy vọng vào cuộc sống, cũng như ñạt ñược sự ưa chuộng và phát triển mạnh ở khắp nơi trên thế giới

Bên cạnh giá trị về tinh thần, hoa loa kèn còn có giá trị kinh tế ñáng kể Năm 2002, diện tích trồng hoa loa kèn tiếp tục tăng lên với tổng diện tích là 4523ha, ñứng thứ hai trong tổng diện tích hoa cắt trồng bằng củ, chỉ xếp sau diện tích trồng hoa tulip Bên cạnh Hà Lan còn một số nơi trồng nhiều hoa loa kèn như: Nhật, Mỹ, Nam Hemisphere, e.g Australia, Chile và Nam Phi Tại Mỹ, 60% nguồn củ ñược nhập khẩu từ Hà Lan với hơn 1 tỷ củ hoa, 8% nhập khẩu từ nước Anh, 6% nhập khẩu từ các nước khác, 25% hàng nội ñịa (do Mỹ tự sản xuất) [8] Năm 2003, Hàn Quốc xuất khẩu hoa loa kèn cắt cành sang thị trường Nhật Bản thu về hơn 10 triệu USD, và nhập khẩu 4 triệu USD củ loa kèn giống

từ Hà Lan [8]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………6

Ở Việt Nam, cây hoa loa kèn ñang trở thành một trong những xu hướng chuyển dịch cơ cấu cây trồng của rất nhiều hộ nông dân Hoa chính vụ thu hoạch giá từ 700 - 1000 ñồng/cành, vào những ngày lễ tết giá hoa có thể lên tới 15000 – 20000ñ/cành Theo tính toán của một hộ nông dân ở Mê Linh Vĩnh Phúc trồng 1 sào hoa loa kèn trái vụ, nở ñúng dịp Tết, thu ñược gần 20 triệu ñồng, lãi khoảng 10 triệu ñồng [34]

Tuy nhiên, trồng hoa loa kèn gặp không ít khó khăn về giống, sâu bệnh

và ñiều kiện tự nhiên không thuận lợi Chủng loại, chất lượng, kích thước hoa không ñồng ñều, ít phong phú nên giá trị xuất khẩu hoa còn nhỏ Vì vậy, việc liên tục chọn tạo ra các giống cây hoa loa kèn mới nâng cao hiệu quả kinh tế

là một trong những nhiệm vụ cần thiết ñối với các nhà chọn tạo giống Việt Nam trong xu thế hội nhập

2.2 Chuyển gen ở thực vật

2.2.1 Khái niệm chuyển gen

Chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật, ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen [18]

Chuyển gen ở thực vật ñã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc và ñiều khiển hoạt ñộng của gen, mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng

Các bước chính ñể tạo một thực vật chuyển gen gồm có: Chọn lọc và phân lập gen; chuyển gen vào tế bào thực vật; nuôi tế bào thực vật mang gen

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………7

lạ thành cây hoàn chỉnh

Hình 2.2 Chuyển gen cây trồng

2.2.2 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen gián tiếp Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen ñược chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất ñịnh mà không cần phải nhờ các sinh vật trung gian Phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen ñược chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian thường là vi sinh vật hoặc virus [12], [13]

Vi khuẩn ñất nhuộm gram âm Agrobacterium tumefaciens là một vi

khuẩn gây bệnh, mà một phần bình thường trong vòng ñời của nó là biến nạp

di truyền các tế bào thực vật ðược nghiên cứu từ những năm 1960 – 1970, việc phát hiện ra vi khuẩn này có khả năng chuyển gen vào thực vật vào ñầu những năm 1980 ñã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của Công nghệ sinh học thực vật với những ưu ñiểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1-2 gen, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do vậy, giảm tối thiểu sự

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………8

không biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao; tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ thuật ñơn giản, dễ thực hiện; không ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền [17]

Phương pháp này ñã khắc phục ñược những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận ñược cây trồng có nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu ñược những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây

Chuyển gen bằng Agrobacterium ñã thực hiện có kết quả trên nhiều

loài cây hai lá mầm như: thuốc lá, cà chua, khoai tây, ñậu tương, ngô, bông và ñặc biệt là trên cây một lá mầm thì ñã làm cho phương pháp chuyển gen này trở nên hấp dẫn và củng cố ñược vị trí của nó ngay từ ñầu [19]

* ðặc ñiểm chung của vi khuẩn Agrobacterim tumefaciens

Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương, tạo ra các u sần ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng bình thường của cây bị xâm nhiễm [5], [7]

Trong chi Agrobacterium thì A.tumefaciens ñược sử dụng nhiều nhất

cho việc chuyển gen

Phân loại khoa học:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………9

Loài: A tumefaciens

Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens

Hình 2.3 Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra

trên thân cây hoa hồng (A) và trên thân cây nho (B)

Quy trình chung ñể chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens như sau:

Bước 1: Thiết kế vector mang gen

Bước 2: Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli

Bước: Chuyển vector mang biến nạp từ E.coli sang A.tumefaciens

Bước 4: Lây nhiễm A.tumefaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô thực

vật ñể tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào ñích

Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào ñược biến nạp thành công

Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh

Sau ñó, từ những cây chuyển gen thu ñược cần ñánh giá sự ổn ñịnh di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính ñể thu ñược con cái mang gen mong muốn ðồng thời ñánh giá tác ñộng của cây chuyển gen ñể ñưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường [18]

Vì vậy với mỗi loại cây, mỗi loại vector mang gen khác nhau sử dụng

cho quá trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cần có

quy trình riêng với các thông số kỹ thuật cụ thể cần ñược nghiên cứu

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………10

2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi

khuẩn A tumefaciens

2.3.1 Cơ sở về khả năng tái sinh ở thực vật

Trong kỹ thuật chuyển gen vào thực vật thì những ñối tượng thường ñược sử dụng ñể chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẩu callus hay những tế bào tách rời những vật liệu này sau khi ñã ñược biến nạp thành công các tế bào ñã dung hợp các gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho các tế bào này tái sinh ñược thành một cơ thể hoàn chỉnh bằng cách ñặt vào nó một môi trường tái sinh thích hợp Nếu như sự tái sinh thành cây hoàn chỉnh không thành công thì tất cả những vật liệu ñã ñược biến nạp ñó sẽ trở lên vô nghĩa Chính vì vậy, sự thành công của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc vào sự tái sinh của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào Về cơ bản thì quá trình phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá, ức chế các gen Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể có một số gen ñược hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) ñể cho ta tính trạng mới còn một số gen khác thì lại bị ñình chỉ hoạt ñộng ðiều này xảy ra theo một chương trình

ñã ñược mã hoá trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn ñược hài hoà Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh, khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào [18]

Do vậy, việc lựa chọn và ñiều chỉnh môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñóng vai trò quan trọng góp phần quyết ñịnh sự thành công hay thất bại của thí nghiệm biến nạp Yêu cầu cơ bản ñối với hệ thống tái sinh:

* Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………11

phân chia in vitro nhanh

* Các mô, tế bào này phải có khả năng tiếp nhận gen mới

* Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen

* Cây tái sinh phải có tỷ lệ sống cao (khi ñưa ra ngoài ñất trồng), tần số biến

dị thấp và khả năng hữu thụ cao ñể có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban ñầu ñể tiếp tục tiến hành chuyển gen trong ñiều kiện in vivo sau này

Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp không thành công Vì vậy, giai ñoạn biến nạp và giai ñoạn tái sinh cây ñều có ý nghĩa quan trọng trong thành công của thí nghiệm chuyển gen

2.3.2 Cơ chế chuyển gen của Agrobacterim tumefaciens

A.tumefaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau ñó sử dụng bộ máy thực vật ñể biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng

cho chúng A.tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần ñiểm tiếp nối giữa

rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi

ñó các tế bào khối u ở thực vật có gắn một ñoạn DNA từ vi khuẩn Khi phân tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octopine gọi chung là opine Các chất này không hề có trước ñó và không hề có ở cây trồng thông thường

Như vậy vi khuẩn ñã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhân này có bản chất là vật chất di truyền

Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là

Ti-plasmid có trong vi khuẩn A.tumefaciens Ti-Ti-plasmid này có ñặc ñiểm chung

như sau:

Ti-plasmid là một plasmid ñược cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………12

vòng tròn lớn có kích thước: 200kb, có khả năng tái bản ñộc lập với sự tái bản của DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn

Hình 2.4 Cấu trúc Ti- Plasmid

(nguồn : http://www.biotech.ubc)

Trên Ti-plasmid có ñoạn T-DNA ñược giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotid tương tự nhau T-DNA là ñoạn nucleotid có kích thước 25kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gene), loại này mã hoá cho một enzym liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên quan tới tổng hợp opine ðoạn này ñược gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì ñây là ñoạn sẽ ñược chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh u

Trên Ti-plasmid còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt

ñộng lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hoá opine

Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………13

ñầu hoạt ñộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u Opine ñược vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hoá opine trên Ti-plasmid

Hình 2.5 Mô hình chuyển gen nhờ Agrobacterium

(1)_Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2)_Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật ñặc trưng;(3)_Sự hoạt hoá của vùng gen vir; (4)_ T-DNA ñược tách ra khỏi Ti- plasmid nhờ phức hợp protein VirD 1 /D 2; (5)_Sự tạo thành phức hợp VirD 2 - DNA (phức hợp-T chưa thành thục), cùng với một vài protein Vir khác, ñi vào

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………14

nguyên sinh chất tế bào chủ; (6)_Sự kết hợp của VirE 2 với sợi-T tạo thành phức hợp-T thành thục ñi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ; (7)_Phức hợp-T thành thục chủ ñộng ñi vào nhân tế bào chủ; (8)_T-DNA bị hấp dẫn tới

vị trí hợp nhất; (9)_T-DNA tách khỏi các protein bảo vệ; (10)_T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ

Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A.tumefaciens sang tế bào cây chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir A, B, C, D, E, G,

F, trong ñó vir C và vir E có tác dụng làm tăng tần số biến nạp [19] Các

gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây

thông qua tín hiệu hoá học acetosyringone (AS) Tín hiệu hoá học ñược nhận biết ñầu tiên bởi vir A Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein

nằm trong màng tế bào ñể ñáp ứng sự trao ñổi chất của vết thương trên

cây Protein vir A tự photphoryl hoá ñồng thời làm cho protein vir G ñược photphoryl hoá và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G

Tiếp ñó các protein ñược mã hoá bởi vir D, vir E thực hiện chức năng

giải phóng sợi T-DNA Protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5’ của bờ phải và 3’ của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA Protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzym nuclease trong cây ðồng thời thực hiện chức năng này có các

protein vir C1, vir C 2 có tác dụng tăng cường việc giải phóng T-DNA

Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B ñảm nhiệm Vir B có

chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi ñơn T-DNA vào

nhân tế bào ðồng thời protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp

năng lượng cho vận chuyển T-DNA

Như vậy, thực chất ñã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn ñất vào cây trồng tồn tại trong tự nhiên

* Thiết kế vector chuyển gen

Các nghiên cứu về Agrobacterium và khả năng tự nhiên của chúng trong

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………15

việc biến ñổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm ñã giúp các nhà khoa học thiết kế ñược những phân tử giúp chuyển gen mong muốn vào

tế bào thực vật: T-DNA ñược giới hạn hai ñầu bởi vùng biên (T-DNA borders), phần còn lại trong vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong hai ñầu vùng biên bằng các gen mong muốn Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho cây hữu thụ Quá trình tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây làm ảnh hưởng ñến năng suất cuối cùng nên trong quá trình thiết kế cũng loại bỏ các gen tổng hợp opine Ti-plasmid có kích thước lớn (200-800kb) nên những ñoạn DNA không cần thiết cũng phải ñược cắt bỏ ñể chèn vào ñoạn DNA

mục tiêu Ngoài ra, Ti-plasmid không tự tái bản trong E.coli nên cần ñược bổ sung thêm gốc tái bản của E.coli Cuối cùng, cần bổ sung các gen chỉ thị ñể

chọn lọc cây và vi khuẩn

Như vậy, cấu trúc của một vector chuyển gen bao gồm:

* Có gốc tái bản (ORI) có nguồn gốc từ vi khuẩn

* Vùng khởi ñộng (promoter) có nguồn gốc từ thực vật

* Vùng kết thúc (terminator)

* Vùng gắn gen chuyển vào (MCS)

* Vùng chứa gen chọn lọc (ñể tách các tế bào chuyển gen)

* Vùng chứa các gen báo cáo ñể biết ñược các gen chuyển vào có thành

công không (Gus, GFP - gen phát huỳnh quang)

Người ta ñã tạo ra các dạng vector mới ñể chuyển gen là những vector liên hợp (cointegrate vector) và vector nhị thể (binary vector) [4]

Hệ thống vector liên hợp (cointegrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmid: Ti-plasmid ñã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………16

hợp chất opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải Thay vào

những gen bị cắt bỏ là ñoạn tương ñồng với một ñoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) ñể phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid Plasmid

trung gian là một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh ñược

ở Agrobacterium Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt ñoạn tương ñồng Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao ñổi chéo giữa hai ñoạn tương ñồng và hình thành nên vector liên hợp Vector liên hợp này nằm

trong vi khuẩn A tumefaciens và hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn ñất Do tần số ñưa plasmid trung gian từ E.coli sang

Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5) nên vector này ít ñược sử dụng

Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector

(plasmid) cùng có mặt và hoạt ñộng trong Agrobacterium Một plasmid tách dòng từ E.coli trong ñó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là

các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại

vùng vir, plasmid này ñược gọi là plasmid hỗ trợ Hệ thống vector này cũng hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn ñất Agrobacterium một cách

rất hữu hiệu [18]

2.3.3 ðặc ñiểm ưu việt của phương pháp biến nạp gen ở thực vật so với

các phương pháp chọn tạo giống truyền thống

Từ xưa ñến nay con người ñã can thiệp vào các ñặc tính di truyền của thực vật bằng chọn giống kinh ñiển Theo phương pháp truyền thống này, nhà tạo giống tìm cách tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật nhằm tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn Phương pháp này ñược thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhuỵ hoa của cây khác

Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………17

ñược giữa các cá thể cùng loài hoặc có họ hàng gần Phải mất nhiều thời gian mới thu ñược những kết quả mong muốn và thường là những ñặc tính quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần

Quá trình biến nạp gen thực hiện trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc nhiều vào thời gian, không gian mùa vụ, thời tiết Các gen ñược chuyển có tính trạng ñặc thù cao hơn Các gen tương ứng chính xác với các tính trạng mong muốn ñược lựa chọn dùng cho quá trình biến nạp, loại bỏ ñược các tính trạng không mong muốn Quá trình chuyển một gen mong muốn vào một cá thể diễn

ra nhanh hơn nhiều Chỉ cần sau một thế hệ, tính trạng mong muốn ñược thể hiện

và thu nhận, trong khi các phương pháp truyền thống cần nhiều thế hệ

Mức ñộ “linh ñộng” của các gen ñược chuyển lớn hơn nhiều Nhiều gen của loài này có thể ñược chuyển vào loài khác và biểu hiện thành các tính trạng hoàn toàn mới ðiều này không thể thực hiện ñược khi sử dụng các phương pháp tạo giống truyền thống

Trước ñây muốn lai tạo ñược một giống mới thì phải mất rất nhiều năm ðầu tiên người ta phải tìm ra giống cây dại có mang những ñặc tính mong muốn rồi lấy phấn hoa của cây dại này phết lên nhụy hoa của cây họ ñang trồng Nếu thụ phấn thành công thì cây trồng từ hạt của cây này sẽ chứa những gen hữu ích Nhưng bằng cách này ñồng thời cây này cũng mang những gen bất lợi khác Người ta có thể loại bỏ dần dần những gen xấu ñi nhưng phải mất một thời gian dài, có khi hàng 20 – 30 năm mới có một giống cây như ý muốn [3]

Ngày nay với công nghệ chuyển gen ñã giúp cho việc chuyển ñược gen

ưu việt vào cây trồng tạo giống mới ñược thực hiện một cách dễ dàng và nhanh chóng hơn nhiều Gen ñược chuyển không phải chỉ từ những gen trên cùng một loài mà có thể lấy gen từ loài có quan hệ rất xa, cũng có thể gen lấy

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………18

từ ñộng vật, sinh vật khác Do ñó có thể thu nhận ñược những cây có các tính trạng hoàn toàn mới, ñiều này không thể thực hiện ñược ở các phương pháp truyền thống

Tăng năng suất nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất ðiều này ñặc biệt ñúng khi các gen ñược dùng cho biến nạp vào thực vật thường là các gen làm tăng năng suất, giảm thời gian trồng trọt, tăng khả năng trao ñổi chất, kháng các loại sâu bệnh Nhờ vậy, thời gian, công lao ñộng, vật tư hoá chất dùng cho quá trình sản xuất nông nghiệp sẽ ñược giảm ñi nhiều lần dẫn ñến

sự giảm chi phí sản xuất và hạn chế ô nhiễm môi trường [18]

2.4 Phương pháp PCR

Thực tế là một cây sau khi biến nạp sinh trưởng trên môi trường chọn lọc thì chưa ñủ cơ sở ñể nói là một biến nạp thành công vì có thể tính kháng xuất hiện tự nhiên do một ñột biến trong vật chất di truyền của thực vật Sau khi chuyển gen cần theo dõi gen chuyển vào cây sẽ ñược tế bào, ñặc biệt là bộ genome của tế bào chủ tiếp nhận như thế nào Bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern Blot, Western Blot và các thí nghiệm khác ñược thực hiện ñể tìm ra chính xác những cây biến ñổi gen ðể chứng minh DNA ñược biến nạp vào thực vật thì phương pháp Southern và PCR ñược sử dụng vì hai phương pháp này rất nhạy cảm Khi có nhiều mẫu khác nhau và có một lượng rất ít DNA thì khuyếch ñại PCR là phương pháp ñược lựa chọn Phương pháp này ñặc biệt phù hợp cho mục ñích kiểm tra và xác ñịnh những thay ñổi gen ở cây trồng Phương pháp PCR ñược Karry Mullis phát minh vào năm

1985 và tiếp tục ñược hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzym tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và

sự thiết kế thành công các máy chu kỳ nhiệt cho phép thay ñổi nhanh chóng và chính xác nhiệt ñộ cho từng giai ñoạn phản ứng Với kỹ thuật này, các ñoạn DNA ñược nhân bội hàng triệu lần với tốc ñộ nhanh và ñộ chính xác cao với

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………19

cặp mồi ñặc hiệu Mẫu không mang gen ñược chuyển vào thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình nhân DNA không xảy ra Mẫu có mang gen chuyển vào thì cặp mồi bắt cặp và quá trình nhân DNA diễn ra mạnh mẽ Sau phản ứng trên máy PCR, thu mẫu và ñem mẫu ñi ñiện di, ñánh giá kết quả

Ngày nay, kỹ thuật PCR ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực và ñược xem như một trong những phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện ñại

Một gen lạ có thể biểu hiện trong tất cả tế bào (DNA lạ biến nạp vào nhiều vị trí khác nhau trong hệ gen) hoặc chỉ trong một số loại tế bào hoặc mô nhất ñịnh Người ta sử dụng những trình tự khởi ñộng phiên mã ñược gọi là promoter Mỗi một gen ñược một promoter ñiều khiển sự biểu hiện của gen Một số promoter hoạt ñộng trong phần lớn các tế bào, một số khác có tính chuyên hoá rất cao ñối với những loại tế bào nhất ñịnh Trong thực tế phần lớn promoter 35S ñược sử dụng cho sự biểu hiện của gen biến nạp trong tất cả các loại mô và tế bào Promoter có nguồn gốc virus nên có hiệu quả phiên mã gen sau khởi ñộng Promoter CaMV 35S ñặc biệt phù hợp cho sự biểu hiện của gen chọn lọc và gen chỉ thị

2.5 Một số thành tựu và xu hướng phát triển của cây trồng biến

ñổi gen

2.5.1 Lợi ích của cây chuyển gen

Với những lợi ích to lớn và lâu dài cho môi trường, kinh tế và phúc lợi

xã hội, không làm ảnh hưởng ñến nguồn tài nguyên cho các thế hệ sau, cây trồng chuyển gen tiếp tục ñược ñưa vào canh tác rộng rãi trên thế giới:

- Góp phần ñảm bảo an ninh lương thực trong tương lai dựa trên quỹ ñất hiện có, làm giảm giá lương thực trên thế giới, góp phần xoá ñói giảm nghèo

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………20

- Bảo tồn ña dạng sinh học

- Cây chuyển gen có lợi tiềm tàng ñối với môi trường Chúng góp phần giảm sói mòn ñất, cải thiện chất lượng nước, rừng và nơi cư ngụ của ñộng vật hoang dại

- Tăng hiệu quả quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học

- Góp phần ổn ñịnh lợi ích kinh tế

Trong 11 năm từ 1996 ñến 2006 cây trồng chuyển gen ñã tăng thêm thu nhập tới 33,8 tỷ USD (trong ñó Hoa Kỳ- 15,8 tỷ; Trung Quốc- 5,8 tỷ; Brazil- 1,9 tỷ; Ấn ðộ- 1,3 tỷ; Canada- 1,2 tỷ; Paraguay- 349 triệu; Australia-184 triệu; Nam Phi- 156 triệu; Mexico- 71 triệu; Philippin- 18 triệu; Argentina- 6,6 triệu…) Nhờ dùng cây chuyển gen mà các nước này ñã giảm ñược 286 triệu kg thuốc trừ sâu, cũng có nghĩa là giảm ñược 15,4% về tác ñộng tổng hợp ñối với môi trường Do sử dụng cây chuyển gen mà giảm nhiên liệu dùng

ñể làm ñất, phun thuốc, do ñó ñã giảm trong năm 2006 ñược 14,76 tỷ kg khí nhà kính CO2 (tương ñương với 6,56 triệu ô tô không tham gia giao thông trong năm này) Gần ñây một số thực vật chuyển gen còn ñược dùng ñể thu hút kim loại nặng trong ñất và làm giải tỏa tình trạng ô nhiễm môi trường bởi kim loại nặng [39]

2.5.2 Tình hình phát triển cây trồng chuyển gen trên thế giới

Sau một thập niên (1985-1995) phát triển công nghệ sinh học cây trồng,

ñã có 34 nước thông báo về thử nghiệm ñồng ruộng ñối với cây chuyển gen Cây trồng ñã ñược chuyển gen bao gồm nhiều loại cây trồng khác nhau như: ngô, bông, ñậu tương, thuốc lá, khoai tây, cà chua, lúa gạo, dưa chuột, hoa cúc, bí ngô Năm 1980, những thí nghiệm chuyển gen ñầu tiên nhờ vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens vào cây trồng ñầu tiên ñược thực hiện Năm

1986, các thử nghiệm ñầu tiên trồng cây biến ñổi gen trên ñồng ruộng ở một

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………21

số quốc gia Năm 1990, chuyển gen bất dục ñực cho ngô bằng súng bắn gen

và thực phẩm biến ñổi gen ñược chấp thuận ở Mỹ lần ñầu tiên Năm 1994,

giống cà chua Flavor Saver mang gen chín chậm, là sản phẩm cây trồng

chuyển gen ñầu tiên ñược thương mại hoá

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ22

Năm 2007, diện tắch trồng cây chuyển gen ựã tăng lên 114,3 triệu ha,

23 nước tham gia trồng cây chuyển gen [31] Năm 2008, số nước trồng cây chuyển gen ựã lên tới 25 nước, một mốc kỷ lục mới đặc biệt, trong số 25 nước trồng cây chuyển gen, có 15 nước là các nước ựang phát triển so với 10 nước là các nước công nghiệp Diện tắch ựất trồng cây chuyển gen ựạt 125 triệu ha, tăng so với năm 2007 [32] đáng chú ý năm 2008 tất cả 7 nước EU hiện ựang trồng giống ngô Bt ựã tăng diện tắch trồng, tăng 21%, với diện tắch canh tác vượt mức 107000 hec-ta Cây ựa tắnh trạng là nhóm cây trồng chuyển gen tăng số lượng nhanh nhất trong năm 2007 và 2008, với tỉ lệ tăng trưởng 23%, cao hơn nhiều so với cây ựơn tắnh trạng chịu thuốc diệt cỏ (tăng 9%) và kháng sâu bệnh (giảm 6%) Cây ựa tắnh trạng - giống cây trồng chuyển gen ngày càng giữ vị trắ quan trọng đã có 10 nước trên thế giới trồng những giống cây này trong năm 2008 Làn sóng ứng dụng giống cây trồng ựa tắnh trạng mới này nối tiếp với làn sóng trồng cây trồng chuyển gen ựầu tiên, tạo nên sự phát triển nhanh chóng của cây trồng chuyển gen trên toàn thế giới [32] đậu tương chuyển gen tiếp tục là giống cây chắnh ựược trồng trong năm

2008 với diện tắch 65,8 triệu ha, chiếm 53% diện tắch ựất trồng cây chuyển gen trên toàn cầu, tiếp theo là ngô chuyển gen (37,3 triệu ha, chiếm 30%), bông chuyển gen (15,5 triệu ha, chiếm 12%) và cải canola chuyển gen (5,9 triệu ha, chiếm 5% diện tắch ựất trồng cây chuyển gen trên toàn cầu) [35] Hiện nay ựã có 25 nước ựã cho phép trồng cây chuyển gen và 30 quốc gia khác ựã cho phép nhập khẩu các sản phẩm công nghệ sinh học sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, ựưa tổng số nước phê chuẩn cây trồng chuyển genlên 55 nước Năm 2008 giá trị của thị trường công nghệ sinh học toàn cầu ước tắnh khoảng 7,5 tỉ ựôla, tổng giá trị từ năm 1996 ựến 2007 ựạt trên 50 tỉ ựôla Dự ựoán, ựến năm 2015 diện tắch ựất trồng cây chuyển gentrên toàn cầu sẽ tăng gấp ựôi, ựạt mức 200 triệu ha [35]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………23

2.5.3 Tình hình nghiên cứu cây trồng biến ñổi gen trong nước

Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến ñổi gen và ñẩy

mạnh việc phát triển loại loại cây trồng này [41] Theo Quyết ñịnh số 11/2006/Qð-TTg của Chính phủ ngày 11-1-2006, kế hoạch phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam với 3 giai ñoạn: Giai ñoạn 2006 - 2010 thử nghiệm một số giống cây trồng chuyển gen trên ñồng ruộng; giai ñoạn 2011-

2015 ñưa một số giống cây trồng chuyển gen vào sản xuất; ñến năm 2020 tăng diện tích một số cây trồng chuyển gen như ngô, bông, ñậu tương sẽ có diện tích từ 30-50% trên toàn quốc [36] Như vậy, trong tương lai với lợi ích thu ñược từ cây trồng chuyển gen về mặt kinh tế và xã hội thì diện tích cây trồng chuyển gen của nước ta sẽ ñược tăng lên

Với chủ trương này, tại một số phòng thí nghiệm lớn ñã và ñang ñi sâu hơn vào công tác cải thiện giống cây trồng bằng kĩ thuật chuyển gen Hiện nhiều công trình nghiên cứu liên quan ñến cây trồng biến ñổi gen tại Việt Nam ñã ñược triển khai… trong phòng thí nghiệm Các nghiên cứu chuyển gen kháng virus ñốm vòng vào cây ñu ñủ, chuyển gen chịu hạn vào cây bông… ñã và ñang ñược triển khai hiệu quả, nhưng chỉ trồng thử nghiệm ở nhà kính [38], [41]

Tại Viện Sinh học Nhiệt ñới, sử dụng phương pháp chuyển gen thông

qua vi khuẩn A tumefaciens hoặc phương pháp bắn gen, các nhà khoa học ñã

tạo ñược các cây thuốc lá, lúa, ñậu xanh, cải bông, cải xanh và cây cà tím mang gen kháng côn trùng, kháng thuốc diệt cỏ [42]

Tại Viện Sinh học Nông nghiệp - ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã và ñang tiến hành các nghiên cứu về chuyển gen cho cây lương thực, cây hoa

(chuyển gen kháng sâu, kháng bệnh bạc lá cho cây lúa, chuyển gen Gus, Bar,

GFP cho các giống hoa lily, ñồng tiền, …) [1], [2], [9], [10], [11]

Tại Viện Công nghệ sinh học, hướng nghiên cứu các giống cây trồng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………24

chuyển gen ñã ñược ñẩy mạnh ngay từ cuối những năm 1990 Các cán bộ của viện ñã tiến hành thu thập và phân lập ñược nhiều nguồn gen quý có giá trị

nông nghiệp như gen chịu hạn, lạnh ở lúa (Cry), gen mã hóa protein bất hoạt hóa riboxom (RIP) ở cây mướp ñắng và gen mã hóa α-amylase của cây ñậu

cove có hoạt tính diệt côn trùng, gen kháng bọ hà khoai lang của vi khuẩn Bt, gen mã hoá protein vỏ của virus gây bệnh ñốm vòng ở ñu ñủ… Tại Bộ Nông

nghiệp và phát triển nông thôn, Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự ñã chuyển gen Gus

và gen kháng kanamycin vào cà chua [33] Phan Tố Phượng và cộng sự ñã thành công trong việc sử dụng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn

A.tumefaciens ñể chuyển gen vào cây Arabidopsis Gần ñây, nhóm nghiên cứu của ðặng Trọng Lương ñã tiến hành thiết kế vector và chuyển gen Cry vào cây cải bắp, chuyển gen Gus vào ñỉnh sinh trưởng phôi hạt chín giống

ñậu tương ðT12 thông qua vi khuẩn A.tumefaciens [16] Các nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng bệnh khô vằn vào giống lúa DT10, DT13; gen kháng bệnh bạc lá vào giống lúa VL902; gen kháng sâu tơ vào cải

bắp CB26; gen Cry, Gna, Xa21 và gen mã hoá β-caroten vào lúa Indica… ñã

và ñang ñược triển khai với những kết quả khả quan

Sở Khoa học và công nghệ TP.HCM vừa ñồng ý nghiệm thu ñề tài: Nghiên cứu chuyển gen tạo năng suất và kéo dài thời gian bảo quản ñối với cây bắp cải, ñồng thời yêu cầu sớm ñưa vào áp dụng trong thực tế Với mức kinh phí ñược cấp là 50 triệu ñồng, ñề tài nói trên ñược thực hiện với mục ñích kéo dài quá trình già hoá ở lá của cây ñược chuyển gen, giúp kéo dài thời gian bảo quản, tăng năng suất và chất lượng cây trồng Vật liệu dùng ñể

nghiên cứu chuyển gen là hạt giống bắp cải Brassica olera Var Capitata F1

TN5, do Công ty Trang Nông cung cấp [40]

Cũng tại buổi hội thảo “Công nghệ sinh học cho cây trồng ở Việt Nam: Hướng phát triển cho tương lai”, các chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………25

sinh học Việt Nam cũng có những báo cáo về việc nghiên cứu chuyển gen như “Nghiên cứu chuyển nạp gen ở ñậu tương và tạo dòng ñậu tương biến ñổi gen kháng sâu” của TS Trần Thị Cúc Hoa (Viện lúa ðồng bằng Cửu Long);

“Nghiên cứu khả năng làm tăng tuổi thọ hoa cúc nhờ chuyển gen IPT tạo

cytokinin” của tác giả Nguyễn Hữu Hồ và cộng sự (Viện Sinh học nhiệt ñới)…[43]

2.5.4 Các nghiên cứu về cây hoa loa kèn L Longiflorum trên thế giới

2.5.4.1 Các nghiên cứu về sự tái sinh in vitro

Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho cây hoa loa kèn nhằm nhân nhanh các giống sạch bệnh ñã ñược nhiều nhà khoa nghiên cứu Trong các nghiên cứu cơ bản ban ñầu, hoa loa kèn có thể ñược tiến hành nuôi cấy trên rất nhiều bộ phận khác nhau như ñỉnh sinh trưởng, ñoạn thân, vảy củ,

mô lá, bầu hoa, cánh hoa, chỉ nhị, Asjes và cộng sự (1974) ñã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem ñể tạo ra các giống hoa loa kèn hoàn toàn sạch virus ở Hà Lan Năm 1979, Ramsay-J-L và cộng sự cũng tiến hành nuôi cấy bầu hoa của hoa loa kèn thành công trên môi trường MS + 5% ñường + 1ppm 2,4D + 2ppm BA Các nhà nghiên cứu người Mỹ Wickremesinhe-E và cộng sự (1995) ñã tạo ñược mô sẹo từ mô lá non của hoa loa kèn khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung B5, 20g/l saccazose, 1ppm 2,4D, 1ppm BA, và 2,0g/l Gelrite trong ñiều kiện bóng tối hoặc chiếu sáng 16h ở nhiệt ñộ 250C Sau 3 tuần cấy chuyển sang môi trường 0,1ppm 2,4D + 0-5ppm BA, các mô sẹo bắt ñầu phát sinh cơ quan [20]

Qua nhiều nghiên cứu của các tác giả như: W.P.Hackett (1969), Allen (1974), J.A.Simmondds & B.G.Cumming (1976) [20], Stimart & Ascher (1978) [28], S.M.Robb (1957), … ñã khẳng ñịnh vảy củ là nguyên liệu tốt nhất cho việc tái sinh chồi

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………26

Năm 1993, kết quả nghiên cứu của IIcheva-V và cộng sự tại Bungari cũng ñã khẳng ñịnh vảy củ là nguyên liệu tốt nhất cho việc tái sinh chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy mà không cần qua giai ñoạn mô sẹo khi ñược cấy trên môi trường Linsmaier và Skoog có bổ sung 0,5mg/l NAA và 0,1mg/l Kinetin

Các cây ñược hình thành ñều mang số nhiễm sắc thể của loài [23]

Vì vậy sử dụng vảy củ làm nguyên liệu chính cho nuôi cấy in vitro tạo

mô sẹo phục vụ trong công tác chuyển gen hay tạo chồi khi sản xuất cây giống rất tiện lợi, dễ thành công, có hiệu quả cao hơn nhiều so với việc sử dụng các bộ phận khác của cây hoa loa kèn

2.5.4.2 Các nghiên cứu về chuyển gen

Trong vấn ñề tạo giống hoa loa kèn mới sử dụng các phương pháp chuyển gen cũng ñược nhiều nhà khoa học nghiên cứu và ñã ñạt ñược các thành công nhất ñịnh

Năm 1998 Watad A.A và cộng sự ñã tạo thành công cây Lilium

longiflorum thông qua hệ thống bắn gen Biolicstics PDS 1000/He vào callus tái sinh từ vảy củ [30]

Năm 2002, tại Triều Tiên, In-Hae Park, Hee-Sung Park chuyển gen thành

công vào phấn hoa loa kèn L.longiflorum in vitro sử dụng Agrobacterium mang gen Gus Trong thí nghiệm sử dụng chủng vi khuẩn A tumefaciens pBI121 [24] Năm 2002, Lipsky A và cộng sự ñã tạo ñược cây L longiflorum Thunb

kháng virus (CMV) nhờ kỹ thuật bắn gen Callus xuất phát từ vảy củ có ñộ ñồng ñều thấp sau 6 tháng cấy chuyển Nghiên cứu chuyển gen ñã ñược thực hiện bằng sử dụng thiết bị bắn gen Finer – type bombardment trên callus 3 hoặc 10 tháng ñược duy trì trong môi trường lỏng ở ñiều kiện bóng tối Callus nuôi cấy trên môi trường lỏng cho phép thu ñược cây chuyển gen bền vững cao hơn 50- 70 lần so với môi trường ñặc [26]

Cùng năm 2002, tại Nhật Bản, Sakea Suzuki, Masaru Nakano chuyển gen

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………27

vào một số cây trồng thuộc họ Liliaceae gồm có: Lilium formosanum, Agapanthus

praecox spp orientalis và Muscari armeniacum Trong nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn chuyển gen A.tumefaciens mang các gen cần chuyển neomycin phosphotransferase II (nptII), hygromycin phosphotransferase (hpt), and intron- containing -glucuronidase (gus-intron) ñó là các chủng: EHA101/pIG121Hm,

LBA4404/pIG121Hm, và LBA4404/pIOK233 (Sakea Suzuki & Masaru Nakano, 2002) Kết quả nghiên cứu ñã không thu ñược mô chuyển gen trên giống

Lilium formosanum mặc dù có biểu hiện tạm thời của gen Gus ở callus trong

quá trình ñồng nuôi cấy Tuy nhiên, ñã thu ñược một số cụm tế bào có kháng

hygromycin của giống Agapanthus prarcox ssp orientalis và Muscarri

armeniacum trên môi trường có bổ sung hygromycin Callus kháng hygromycin ñã tái sinh tạo cây hoàn chỉnh qua phôi soma, hầu hết trong số

chúng ñược xác ñịnh là cây chuyển gen dựa trên phép thử Gus histochemical

assay và phân tích PCR Bằng lai Southrn Blot ñã phát hiện 1-5 bản sao của gen trong bộ gen của cây chuyển gen của hai giống, trong ñó hầu hết là có một hoặc hai bản sao Hệ thống chuyển gen này có thể là một công cụ ñể phát triển trong nghiên cứu về sinh học phân tử [28]

Năm 2003, A.Mercuri và cộng sự (ðức) chuyển gen thành công vào chỉ

nhị và ñế hoa của Lilium longiflorum Thunb cultivar 'Snow Queen' sử dụng chủng vi khuẩn A.tumefaciens LBA4404 mang vector pBin18, vùng T-DNA

ñược tách dòng từ EcoRI15 mang ORFs 10, 11 và 12 tương ứng với torol A,

B và C, ñược cắt từ Agrobacterium rhizogenes pRi 1855 Callus phát sinh

phôi xuất phát từ vòi nhụy và cuống ñã ñược cấy và ñồng nuôi cấy trong 7

ngày với huyền phù của vi khuẩn Agrobacterium LBA4404, mang binary

vector pBin 19 bao gồm nptII gen ñược ñiều khiển bởi Nos promoter và các ñoạn giới hạn T – DNA EcoRI 15, bao gồm Os11 và 12 tương ứng với rol A,

B và C ñược cắt từ A rhizogenes pRI 1855 Các chồi chuyển gen ñã ñược tái

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………28

sinh trên môi trường chọn lọc và dễ dàng nhân nhanh, ra rễ và chuyển ra ñất

Có sự ña dạng về kiểu hình của các dòng chuyển gen [27]

Năm 2004, Y.Hoshi và cộng sự (Nhật Bản) ñã chuyển gen thành công

vào Oriental hybrid lily, Lilium cv Acapulco bằng chủng vi khuẩn

A.tumefaciens EHA101/pIG121Hm mang các gen nptII, hpt và gen Gus Kết

quả ñã thu ñược 6 dòng lily kháng Hyg từ hơn 200 callus bằng cách làm tổn thương callus với giấy giáp trước khi ñồng nuôi cấy Callus ñược nuôi cấy trên môi trường MS không có NH4NO3, sử dụng Hyg trong môi trường chọn lọc Các dòng tái sinh kháng Hyg tạo chồi sau ñó phát triển thành cây khi chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất ñiều tiết sinh trưỏng Tất cả các cây ñược kết luận chuyển gen nhờ Gus histochemical assay và phân tích PCR [22]

Năm 2004, các tác giả Byung Jooon Ahn và cộng sự ñã chuyển gen

bằng súng bắn gen cho huyền phù tế bào của hoa Easter lily (Lilium

longiflorum) Sự biểu hiện tạm thời của gen uidA xuất hiện ở 493 tế bào/ ñĩa petri ðể chuyển gen bền vững, huyền phù tế bào của lilium longflorum ñược bắn với plasmid bao gồm cucumber mosaic virus (CMV) replicase ñược ñiều khiển bởi Act, 1 promotor và gen Bar ñã ñược ñiều khiển bởi CaMV promotor, 10 cây tái sinh ñã ñược phân tích bởi PCR, 2 trong 10 cây

ñã ñược khẳng ñịnh chuyển gen nhờ lai Southern Blot Hai cây chuyển gen ñược chuyển ñộc lập trong ñó có một cây mang gen Bar, một cây mang cả

hai gen gồm CMV replicase và gen Bar Các cây này ñã ñược xác ñịnh là

có khả năng kháng PPT ở nồng ñộ 1000mg/l ở giai ñoạn nở hoa chứng tỏ

gen Bar ñã ñược biểu hiện ở toàn bộ là khi ñược ñiều khiển bởi CaMV 35S

promtor

Năm 2007, Kim Sung Su và cộng sự ñã chuyển gen thành công cho loài

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ29

hoa Lilium longiflorum L qua sự biểu hiện tạm thời của β-glucuronidase bằng

vi khuẩn Agrobacterium [25]

Trong những năm gần ựây ựã có nhiều nghiên cứu thành công về

phương pháp biến nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium trên một số loài

Lilium. đây cũng chắnh là những tiền ựề cho nghiên cứu chuyển gen vào mô

tế bào của loài Lilium longiflorum

2.5.5 Các nghiên cứu về cây hoa loa kèn L Longiflorum ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cũng ựã có những nghiên cứu về hoa loa kèn và ựạt ựược những thành công nhất ựịnh trong nhân nhanh, tái sinh và bước ựầu trong nghiên cứu chuyển gen cho cây hoa loa kèn

2.5.5.1 Các nghiên cứu về sự tái sinh in vitro

Dương Tấn Nhựt (1994) ựã công bố kết quả nghiên cứu phương pháp nuôi cấy in vitro vảy củ, một giải pháp hữu hiệu khắc phục hiện tượng thoái hoá giống hoa huệ tây trầm trọng tại đà Lạt Vảy củ ựược khử trùng bằng HgCl2 2% trong 5 phút, sau ựó cấy trên môi trường MS có bổ sung các thành phần vitamin, chất hữu cơ và saccazose Sau khi tạo ựược cây con trong ống nghiệm, có thể tiếp tục nhân bằng cách tách các vảy củ ựược tạo thành ựem cấy trên môi trường nhân [15]

Bùi Văn Lệ và cộng sự (1999) ựã nghiên cứu tái sinh chồi in vitro từ

lát cắt mỏng mô vảy củ Lilium longiflorum Cùng năm ông ựã nghiên cứu tái

sinh chồi thành cây hoàn chỉnh từ ựế hoa phục vụ cho việc nhân nhanh [10] Năm 2001, Dương Tấn Nhựt ựã nghiên cứu tái sinh callus, tái sinh tạo chồi thành cây hoàn chỉnh, nghiên cứu ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng

(NAA, BA, 2,4D ) tới khả năng tái sinh của mô vảy củ L.longiflorum [15]

Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Phương Thảo

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………30

(1999) ñã xây dựng quy trình nhân giống cây hoa loa kèn bằng kỹ thuật tạo củ trong ống nghiệm [14]

2.5.5.2 Các nghiên cứu về chuyển gen

Nghiên cứu chuyển gen cho cây hoa loa kèn L.longiflorum mới chỉ

ñược thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường ðại học Nông nghiệp

Hà Nội, nghiên cứu chuyển ñược gen GFP, gen Gus, gen Bar cho hoa loa kèn

L.longiflorum [1],[2]

ðề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào cây hoa loa

kèn “Lilium longiflorum” bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”góp phần

xây dựng ñược quy trình chuyển gen vào cây hoa loa kèn, làm cơ sở cho việc tiếp tục chuyển các gen mong muốn khác vào cây hoa loa kèn và cây hoa lily nói chung Kết quả của ñề tài sẽ làm tiền ñề và thúc ñẩy việc ứng dụng phương pháp chuyển gen trong công tác chọn tạo giống cây trồng ở Việt Nam

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………31

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

* ðối tượng: Giống hoa loa kèn “Lilium longiflorum”, giống ñịa

phương ñược trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam

* Vật liệu: Vẩy củ, callus, ñỉnh chồi Callus ñược tạo ra từ vảy củ

Hình 3.1 Callus loa kèn in vitro Hình 3.2.Lilium longiflorum thunb

- Vectơ sử dụng ñể chuyển các gen mục tiêu: chủng EHA 105 mang

vectơ ITB2c mang các gen Gus, Bar, CryIA(c) do Viện Sinh học Nhiệt ñới

TP HCM- VKHVN cung cấp

Hình 3.3 Sơ ñồ cấu trúc plasmid ITB2c