Nghiên cứu tạo dòng bưởi diển và cam xã đoài đa bội bàng xữ lý colchicine trong điều kiện in vitro

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

 -LÃ THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BƯỞI DIỄN VÀ CAM XÃ ðOÀI ðA BỘI

BẰNG XỬ LÝ COLCHICINE TRONG ðIỀU KIỆN IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

MÃ SỐ: 60 62 05

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI - 2008

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Lã Thị Nguyệt

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñược bản luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự chia sẻ và giúp ñỡ Qua ñây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới:

- PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn

- Tập thể các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học- trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong quá trình thực tập

- Tập thể cán bộ bộ môn Công nghệ sinh học- Viện nghiên cứu Rau Quả ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt ñề tài tốt nghiệp

- Cảm ơn gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tác giả luận văn

Lã Thị Nguyệt

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

PHẦN 1: MỞ ðẦU 1

1.1 ðẶT VẤN ðỀ 1

1.2 MỤC ðÍCH YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI 3

1.2.1 MỤC ðÍCH CỦA ðỀ TÀI 3

1.2.2 YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI 3

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI 3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CÓ MÚI 4

2.1.1 SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CÓ MÚI TRÊN THẾ GIỚI .4

2.1.2 SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CÓ MÚI TRONG NƯỚC 5

2.1.3 TẦM QUAN TRỌNG CỦA SẢN XUẤT CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI .7

2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY BƯỞI DIỄN VÀ CÂY CAM XÃ ðOÀI .9

2.3 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI 11

2.3.1 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY CÓ MÚI TRÊN THẾ GIỚI 11

2.3.2 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY CÓ MÚI Ở VIỆT NAM 13

2.4 NGHIÊN CỨU XỬ LÝ ðA BỘI THỰC NGHIỆM TRONG CHỌN TẠO GIỐNG 14

2.4.1 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA GÂY TẠO ðA BỘI THỰC NHIỆM 14

2.4.3 NGUYÊN TẮC VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ ðA BỘI THỂ 16

2.4.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ ðA BỘI THỂ BẰNG COLCHICINE 17

PHẦN III:VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 VẬT LIỆU, ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 22

3.1.1 VẬT LIỆU 22

3.1.2 ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 22

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.3.1.BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 23

3.3.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 26

3.3.3.CÁCH TÍNH CÁC CHỈ TIÊU 29

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

4.1.HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO Ở BƯỞI DIỄN VÀ CAM XÃ ðOÀI 31

4.1.1 NGHIÊN CỨU ẢNH HUỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG TỚI KHẢ NĂNG TẠO CHỒI Ở HAI GIỐNG BƯỞI DIỄN VÀ CAM XÃ ðOÀI .31

4.1.2 NGHIÊN CỨU ẢNH HUỞNG CỦA VẬT LIỆU NUÔI CẤY BAN ðẦU TỚI KHẢ NĂNG TẠO CHỒI CỦA HAI GIỐNG BƯỞI DIỄN VÀ CAM XÃ ðOÀI 35

4.1.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ðIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG ðẾN KHẢ NĂNG TẠO CỤM CHỒI IN VITRO CỦA GIỐNG BƯỞI DIỄN VÀ CAM XÃ ðOÀI .38

4.1.4 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ðIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG ðẾN KHẢ NĂNG TẠO CÂY IN VITRO CỦA GIỐNG BƯỞI DIỄN VÀ CAM XÃ ðOÀI 47

4.2 NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ðA BỘI BẰNG XỬ LÝ COLCHICINE IN VITRO 54

4.2.1 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ðỘ VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ COLCHICINE ðẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TỶ LỆ BIẾN DỊ CỦA CHỒI BƯỞI DIỄN, CAM XÃ ðOÀI .55

4.2.2 KHẢ NĂNG PHỤC HỒI CỦA CÁC CHỒI IN VITRO SAU XỬ LÝ

COLCHICINE 62

4.2.3 PHÂN LOẠI CÁC CHỒI THU ðƯỢC SAU XỬ LÝ COLCHICINE 67 4.2.4 PHÂN TÍCH ðỘ BỘI CỦA CÁC DẠNG CHỒI SAU XỬ LÝ COLCHICINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ðỊNH GIÁN TIẾP HÀM LƯỢNG ADN 72

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 78

5.1 KẾT LUẬN 78

5.2 ðỀ NGHỊ 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

PHỤ LỤC 85

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA 1-Naphthaleneacetic acid

BAP Benzyl adenin tetrahydropyranyl

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng một số quả có múi 5

2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng một số cây ăn quả chủ lực 6

4.1 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng tạo chồi từ

chồi đỉnh trên hai giống bưởi Diễn và cam X Đoài 32

4.2 ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy ban đầu đến khả năng tạo chồi in vitro

của hai giống bưởi Diễn và cam X Đoài trên môi trường MT 37

4.3 ảnh hưởng của BAP đến sự hình thành cụm chồi in vitro của hai

giống bưởi Diễn và cam X Đoài 40

4.4 ảnh hưởng của Adenin đến khả năng hình thành cụm chồi in vitro

của hai giống bưởi Diễn và cam X Đoài 42

4.5a ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Adenin đến khả năng hình thành

cụm chồi in vitro của giống bưởi Diễn 44

4.5b ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Adenin đến khả năng hình thành

cụm chồi in vitro của giống cam X Đoài 44

4.6 ảnh hưởng của α- NAA đến khả năng ra rễ in vitro của chồi

bưởi Diễn và cam X Đoài 49

4.7 ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ in vitro của chồi bưởi Diễn

và cam X Đoài 51

4.8a ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và IBA đến sự hình thành rễ in vitro của chồi bưởi Diễn 52

4.8b ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và IBA đến sự hình thành rễ in vitro của chồi cam X Đoài 54

4.9a ảnh hưởng của xử lý Colchicine in vitro bưởi Diễn 57

4.9b ảnh hưởng của xử lý Colchicine in vitro cam X Đoài .59

4.10a Sự phục hồi của chồi bưởi Diễn sau xử lý Colchicne in vitro 62

4.10b Sự phục hồi của chồi cam X Đoài sau xử lý Colchicine in vitro 63

4.11 Đặc điểm hình thái của các dạng chồi sau xử lý Colchicine 67

4.12a Tỷ lệ các dạng chồi bưởi Diễn sau xử lý Colchicine 69

4.12b Tỷ lệ các dạng chồi cam X Đoài sau xử lý Colchicine .71

4.13 Hiệu quả xử lý Colchicine in vitro đến sự tạo chồi đa bội 76

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

4.1 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới chiều cao chồi và số chồi

TB của giống Bưởi Diễn 33

4.2 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới chiều cao chồi và số chồi

TB của giống cam Xã ðoài 33

4.3 ảnh hưởng của môi trường tới khả năng tạo chồi từ chồi ñỉnh của

hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài 34

4.4 ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy tới ñộng thái ra chồi của giống

Bưởi Diễn 36

4.5 ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy tới ñộng thái ra chồi của giống

cam Xã ðoài 36

4.6 ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Adenin tới khả năng hình thành

chồi in vitro ở giống cam Xã ðoài 47

4.7 ảnh hưởng của xử lý Colchicine ñến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ chồi

biến dị ở giống bưởi Diễn 58

4.8 ảnh hưởng của xử lý Colchicine ñến tỷ lệ chồi sống và tỷ lệ biến dị

ở giống cam Xã ðoài 58

4.9 ảnh hưởng của xử lý Colchicine in vitro ñối với hai giống bưởi Diễn

và cam Xã ðoài61 4.10 Khả năng phục hồi của chồi Bưởi Diễn và cam Xã ðoài sau xử lý Colchicine in vitro 64

4.11 Khả năng phục hồi của chồi Bưởi Diễn và cam Xã ðoài sau xử lý Colchicine in vitro 66

4.12 Các dạng chồi bưởi Diễn và cam Xã ðoài thu ñược sau xử lý Colchicine in vitro 69

PHẦN 1: MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề

Phát triển trồng cây ăn quả ở Việt Nam ñang ñược xem là một hướng quan trọng ñể phát triển một nền nông nghiệp hàng hoá, nhất là hiện nay vấn

ñề an ninh lương thực cơ bản ñã ñược giải quyết Nhiều loài cây ăn quả có giá trị kinh tế cao như chuối, dứa, quả có múi ñã ñược trồng với diện tích lớn và trở thành những cây chủ ñạo của nhiều vùng Tuy có sự phong phú về chủng loại nhưng rất ít giống có năng suất cao, chất lượng tốt ñáp ứng ñược yêu cầu thị trường, ñặc biệt là yêu cầu về ăn tươi và xuất khẩu

Tính trạng không hạt có vai trò rất quan trọng ñối với sản xuất quả có múi chất lượng cao Nhiều hạt trong quả làm giảm giá trị thương phẩm của công nghiệp chế biến nước quả cũng như gây nên sự kém ngon khi ăn tươi Vì thế, việc tạo giống cây ăn quả có múi không hạt là một trong những mục tiêu quan trọng hàng ñầu của công tác chọn tạo giống ðồng thời ñó cũng là hướng ñi ñầy triển vọng vì không hạt là tiêu chuẩn chính ñối với thị trường quả có múi hiện nay

ðể có ñược cây tam bội không hạt người ta có thể thực hiện theo ba hướng chính: một là thu thể tam bội tự nhiên hình thành từ phôi hợp tử của các hạt nhỏ, hạt kém phát triển của các giống Hai là dung hợp tế bào trần của thể ñơn bội và thể nhị bội Ba là tạo thể tứ bội sau ñó lai với thể nhị bội ñể tạo tam bội thể

Một trong những ñường hướng tạo cây tam bội không hạt ñược các nhà khoa học Việt nam cũng như thế giới ñã và ñang rất quan tâm là tạo thể tứ bội sau ñó lai với thể nhị bội Nhiều nghiên cứu trước ñây ñã khẳng ñịnh trong quá trình tiến hoá, các loài trong chi Citrus ñã xuất hiện một số dạng ña bội hoá tự nhiên [15] Vì thế ta cũng có thể chọn tạo cây tứ bội tự nhiên Bên cạnh ñó, các dạng tứ bội (allotetraploid) cũng có thể ñược tạo ra hàng loạt

thông qua xử lý hoá chất Một trong số những chất có khả năng gây ựa bội hoá là colchicine

Một số nhược ựiểm của việc gây ựa bội hoá nhờ colchicine ựã ựược biết ựến là: Colchicine là một hoá chất có tắnh ựộc (ảnh hưởng ựến người sử dụng, ảnh hưởng ựến sự phát triển của cây, ở nồng ựộ xử lý cao có thể gây chết cây) để có hiệu quả xử lý cao cần phải xác ựịnh ựược giai ựoạn phân chia mạnh mẽ của mẫu xử lý vì colchicine không có tác dụng ựối với các tế bào ngủ nghỉ Khi sử dụng colchicine ựể tạo thể tứ bội cần phải xác ựịnh ựược chắnh xác nồng ựộ, thời gian xử lý và thời ựiểm thắch hợp trong chu kỳ phân chia của tế bào (Vũ đình Hoà)[8]

Tuy nhiên một số ưu ựiểm của colchicine ựược nêu sau ựây là không thể phủ nhận: làm tăng tần số và mức ựộ bội thể, dễ dàng chọn lọc thể ựa bội sau khi xử lý, phương pháp không quá phức tạp

Bưởi Diễn và Cam Xã đoài là hai giống thuộc chi Citrus hiện ựang ựược trồng khá phổ biến ở miền Bắc Việt Nam Nhược ựiểm lớn của các giống này là quả có rất nhiều hạt Cho ựến nay, các nghiên cứu tạo giống bưởi Diễn và cam Xã đoài ắt hạt, không hạt ựược công bố chưa nhiều

Phương pháp xử lý colchicine kết hợp với kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ựược ựánh giá là không yêu cầu nhiều trang thiết bị ựắt tiền, phương pháp khá ựơn giản và ắt tốn kém về mặt thời gian ựồng thời có hiệu quả tạo biến dị khá cao

Trước yêu cầu của thực tế sản xuất và ựiều kiện trang thiết bị hiện có của phòng thắ nghiệm Công nghệ sinh học - Viện Nghiên cứu Rau quả, cùng với việc kế thừa các kết quả nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học trong

và ngoài nước chúng tôi thực hiện ựề tài:

"Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro bưởi Phú Diễn

và cam Xã đoài làm vật liệu phục vụ xử lý ựa bội in vitro bằng colchicine"

1.2 Mục ñích yêu cầu của ñề tài

1.2.1 Mục ñích của ñề tài

- Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro ñối với cây bưởi Diễn và cam

Xã ðoài làm cơ sở cho tạo nguồn mẫu ban ñầu và nhân nhanh mẫu sau xử lý

colchicine in vitro

- Nghiên cứu tạo các dòng ña bội làm nguồn vật liệu khởi ñầu cho công tác chọn giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài theo hướng năng suất, chất lượng

cao (không hạt)

1.2.2 Yêu cầu của ñề tài

- Xác ñịnh môi trường tối ưu ñể tạo cụm chồi và nhân nhanh cụm chồi

bưởi Diễn và cam Xã ðoài trong ñiều kiện in vitro

- Xác ñịnh môi trường tối ưu ñể tạo cây in vitro hoàn chỉnh từ các chồi

sau nhân nhanh của bưởi Diễn và cam Xã ðoài

- Xác ñịnh ñược nồng ñộ và thời gian xử lý colchicine in vitro cho hiệu

quả ña bội hoá cao ñối với chồi ñang phát triển

- Chọn lọc, ñánh giá ñược ñộ bội của một số dòng triển vọng thu ñược

sau xử lý colchicine in vitro

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của ñề tài

ðề tài sẽ góp phần cung cấp một số dẫn liệu khoa học về:

Một là phương pháp, quy trình nuôi cấy và tái sinh cụm chồi in vitro từ

các vật liệu ban ñầu khác nhau ñối với cây bưởi Diễn và cam Xã ðoài

Hai là phương pháp tạo ña bội bằng xử lý colchicine in vitro ñối với

cây bưởi Diễn và cam Xã ðoài

Ba là phương pháp phát hiện ña bội bằng quan sát hình thái, xác ñịnh gián tiếp hàm lượng ADN bằng máy ño ñộ bội

Bốn là ñề tài ñưa ra quy trình nuôi cấy in vitro hoàn chỉnh cho cây bưởi

Diễn, quy trình này hiện chưa ñược công bố ở Việt Nam ðồng thời sản phẩm của ñề tài sẽ ñược dùng làm nguồn vật liệu khởi ñầu cho công tác chọn tạo giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài theo hướng cải thiện chất lượng quả

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi

2.1.1 Sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới

Cây có múi là một trong những loại cây trồng ựược xếp hàng ựầu trong các loại cây ăn quả, với sản lượng hàng năm ước tắnh khoảng 85 triệu tấn và trị giá khoảng 5 tỷ USD Gần 90 nước trong vùng nhiệt ựới và á nhiệt ựới ựang phát triển cây ăn quả có múi và có khoảng gần một nửa các nước này ựã

có thu nhập cao từ loài cây này Ngày nay, tình hình sản xuất hàng hoá quốc

tế ựang có xu hướng có lợi cho sản xuất cây có múi trong vùng nhiệt ựới[9]

Theo thống kê của FAO, tổng sản lượng cam trên thế giới năm 2006 tăng khoảng 2 lần trong 10 năm gần ựây Các nước trồng cam nhiều nhất là Braxin, Mỹ, Mêxico và Trung quốc Các nước trồng nhiều bưởi phải kể ựến là Cuba, Trung Quốc, Mỹ, Philippin Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 4

- 5 triệu tấn bưởi, chiếm 5,4 - 5,6% tổng sản lượng cây có múi Cây có múi chủ yếu ựược trồng và sản xuất ở các nước đông Nam Á, Châu Á và tập trung nhiều ở một số nước như Trung Quốc, Ấn độ, PhilippinẦ.[ 35]

Mới ựây, theo thống kê của FAO: Diện tắch, sản lượng bưởi, cam và một số quả có múi khác ở một số nước vùng đông Nam Á và châu Á ựược phản ánh trong bảng dưới ựây Số liệu trong bảng chưa phản ánh ựầy ựủ thực

tế sản xuất cây có múi, vì diện tắch trồng có thể cao hơn nhiều so với diện tắch thu hoạch Tuy nhiên qua ựó cũng cho thấy Trung Quốc là nước có diện tắch trồng lớn nhất vùng đông Nam Á và châu Á, với 55.000 ha cho thu hoạch, sau ựó là Thái Lan 12.000 ha Về sản lượng Ấn độ lại là nước ựứng thứ hai sau Trung Quốc.[9]

Bảng 2.1 Diện tớch, năng suất và sản lượng một số quả cú mỳi

hoạch Năng suất lượng Sản

DT thu hoạch Năng suất lượng Sản

Nguồn: FAOSTAT FAO Statistics Division 2007 May 18

Như vậy việc sản xuất và tiêu thụ quả có múi nói chung, cam và bưởi nói riêng trên thế giới hàng năm đều tăng đáng kể, đặc biệt là phục vụ nhu cầu

ăn tươi Vì vậy, bên cạnh việc đầu tư nghiên cứu nhằm nâng cao năng suất và sản lượng quả các nhà sản xuất và nhà khoa học cũng cần chú trọng đến công tác nghiên cứu để cải thiện và nâng cao chất lượng quả phục vụ cho chế biến

và ăn tươi

2.1.2 Sản xuất và tiêu thụ quả có múi trong nước

Theo thống kê năm 2005 của tổng cục thống kê, cây ăn quả có múi là một trong những loại quả quan trọng được xếp vào nhóm các cây ăn quả chủ lực ở nước ta, gồm: cây ăn quả có múi, dứa, xoài, nhn, vải, với diện tích

441.068ha, chiếm 57,5% trong tổng số 766.100ha cây ăn quả của cả nước, trong đó diện tích cây ăn quả có múi là 111.299ha, chiếm 14,8%

Mặc dù diện tích quả có múi ở nước ta khá lớn, song lại chưa có số liệu thống kê cụ thể nào về diện tích trồng các loại quả có múi Diện tích trồng và sản lượng cây có múi ở nước ta được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng một số cây ăn quả chủ lực Cây ăn

quả Phân bố

Diện tích trồng(ha)

Diện tích cho quả (ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (tấn)

Theo số liệu của tổng cục thống kê: năm 2004 sản lượng bưởi của nước

ta đạt 15,1 nghìn tấn với diện tích 3,1 nghìn ha và năng suất đạt 80,1tạ /ha Trong một số chủng loại cây ăn quả chính, bưởi đứng thứ tư sau dứa, xoài, cam, quýt về diện tích nhưng năng suất của bưởi khá cao, đứng thứ hai sau dứa

Theo Viện Nghiên cứu Cây ăn quả Miền Nam, chỉ riêng bưởi Năm Roi

ở đồng bằng sông Cửu Long diện tích đ khoảng 10.000ha, sản lượng đạt 60.000 tấn/năm, phân bố chính ở tỉnh Vĩnh Long với diện tích 4,5 nghìn ha cho sản lượng 31,3 nghìn tấn, chiếm 48,6% về diện tích và 54,3% về sản lượng Năm Roi của cả nước, trong đó tập trung ở huyện Bình Minh: 3,4 nghìn

ha với sản lượng gần 30 nghìn tấn Tiếp theo là tỉnh Hậu Giang: 1,3 nghìn ha Giống bưởi Da Xanh mới chọn lọc cách đây khoảng chục năm nhưng diện tích trồng giống bưởi này ở Bến Tre đ có 1.544ha Dự kiến đến năm 2010 tỉnh Bến Tre sẽ có 4.000ha [19]

Diện tích và sản lượng cây có múi cả nước ta tính đến năm 2005 là 87.200ha và 100,9 nghìn tấn, là một trong những cây ăn quả chủ đạo, có diện tích và sản lượng nhiều nhất so với các loại cây ăn quả khác như nhn, vải, xoài, dứa…[23]

Rất nhiều loài cây ăn quả có múi hiện đang được trồng, sản xuất tại Việt Nam, song chủ yếu tập trung vào các loài cam, quýt, bưởi và hình thành các vùng trồng tương đối riêng biệt, ví dụ như vùng bưởi Thanh Trà, vùng bưởi Phúc Trạch, vùng bưởi Đoan Hùng, vùng bưởi Diễn, vùng cam Phủ Quỳ, vùng cam X Đoài, vùng quýt Bắc Quang Các giống đặc sản này là một trong những thế mạnh của sản xuất cây ăn quả của Việt Nam hiện nay Cải thiện chất lượng quả đang là một trong những mục tiêu được ưu tiên nghiên cứu

2.1.3 Tầm quan trọng của sản xuất cây ăn quả có múi

Cây ăn quả có múi đ được trồng và sử dụng cách đây khoảng trên 4000 năm, hơn nữa chúng là những loài cây được trồng rất phổ biến ở hầu khắp các nước trên thế giới, từ vĩ độ 40 Bắc đến vĩ độ 40 Nam Sản lượng quả có múi hàng năm trên thế giới khoảng 85 triệu tấn, xếp vị trí thứ nhất trong 4 loại quả sản xuất nhiều nhất trên thế giới (cây ăn quả có múi, nho, táo tây và dứa) Trong số các loài cây có múi, cam có sản lượng lớn nhất (62 triệu tấn), sau đó

là quýt và các dạng lai (10 triệu tấn), chanh và bưởi mỗi loài khoảng 6 –7 triệu tấn [3]

Theo thống kê của tổ chức FAO, năm 2000, tiêu thụ quả có múi bình quân đầu người cho ăn tươi là 16kg, ở các nước EU là 39,7kg Các số liệu này cho thấy nhu cầu về quả có múi là rất lớn

Quả có múi, đặc biệt là bưởi và cam có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon, phù hợp với thị hiếu của nhiều người tiêu dùng Thành phần dinh dưỡng trong thịt quả tươi bao gồm đường saccaroza, lipit, protein, axit hữu cơ

và đặc biệt rất giàu vitamin C[9]

Ngoài giá trị dùng cho ăn tươi, bưởi và cam còn được dùng cho để chế biến Người ta có thể chế biến ra nhiều loaị sản phẩm như nước ép, nước giải khát, đồ hộp, mứt, rượu…từ loại quả này Vỏ quả, lá, hoa, hạt có thể được dùng để tách chiết tinh dầu trong công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm Trong

đông y, vỏ quả, lá, rễ có thể dùng làm thuốc trị ho, cảm cúm hoặc làm nguyên liệu trong nhiều bài thuốc dân gian…[1]

Cây ăn quả có múi là cây ăn quả lâu năm, chu kỳ kinh tế dài, ít bị sâu bệnh phá hại, tận dụng được đất đai và cho năng suất khá cao Theo tác giả Ngô Hồng Bình: Cây ăn quả có múi có giá trị kinh tế cao hơn một số cây ăn quả khác ở nước ta, hiệu quả của cây có múi ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long đối với cam là 59 triệu đồng/ ha, quýt là 46 triệu đồng/ ha, bưởi là 17 triệu đồng/ ha[2]

Theo Phan Thanh Hải: trên vùng gò đồi của huyện Lương Sơn- Hòa Bình, mỗi ha cam cho thu nhập 5 triệu đồng, còn mỗi ha bưởi cho thu nhập khoảng 6,5 triệu đồng.[5]

Trồng bưởi mang lại hiệu quả kinh tế cao Ở Thượng Mỗ Hà Tõy người

ta tớnh ủược hiệu quả kinh tế của trồng bưởi Diễn gấp 4 -5 lần so với trồng lỳa Giỏ trị thu nhập của 1 sào bưởi Diễn lờn khoảng trờn 10 triệu ủồng Cũn

ựối với bưởi đoan Hùng, thông thường những nhà trồng 30 cây bưởi cũng thu ựược mỗi năm 15 - 20 triệu ựồng/năm[9]

Ở ựồng bằng sông Cửu Long hiệu quả của trồng bưởi Năm Roi không

có gì phải bàn cãi vì giá mỗi chục bưởi (14 quả) loại 1 thấp nhất cũng 68 ngàn ựồng và lên ựến 120 ngàn ựồng trong thời ựiểm từ tết Nguyên đán ựến tháng

5 âm lịch, tắnh ra 1 công bưởi (1000 m2) thu ựược vài chục ựến cả trăm triệu ựồng mỗi năm Các hộ trồng bưởi Da Xanh ở tỉnh Bến Tre ựều thu nhập trên

150 triệu ựồng/ ha[30]

Bưởi và cam ở Việt Nam chủ yếu sử dụng ăn tươi và hiện tại sản xuất của nước ta vẫn chưa ựủ ựể cung cấp cho thị trường trong nước Một vài năm gần ựây ựã có một số công ty như Hoàng Gia, đông Nam ựã bắt ựầu những hoạt ựộng như ựầu tư sản xuất, áp dụng các biện pháp quản lý chất lượng theo GAP, ựăng ký thương hiệu một số giống quả có múi ngon, ựặc sản ở nước ta như Năm Roi, Da Xanh, Phúc Trạch vv với mục ựắch xuất khẩu ra thị trường nước ngoài

Tóm lại, cây có múi là loại cây ăn quả quan trọng không chỉ về giá trị dinh dưỡng mà cả về hiệu quả kinh tế, cao hơn nhiều lần so với cây trồng khác Việc phát triển trồng cây ăn quả có múi ở những vùng có ựiều kiện cũng như bảo tồn và phát triển mở rộng hơn nữa ở các vùng trồng truyền thống là ựịnh hướng chiến lược của nhiều ựịa phương trong cả nước trong ựó có vùng trồng bưởi Diễn và cam Xã đoài

2.2 Giới thiệu chung về cây bưởi Diễn và cây cam Xã đoài

Bưởi Diễn ựược trồng nhiều ở xã Phú Diễn, Phú Minh huyện Từ Liêm -

Hà Nội Bưởi Diễn có thể là một biến dị của bưởi đoan Hùng Quả tròn, vỏ quả nhẵn, khi chắn màu vàng cam, khối lượng quả trung bình từ 0,8 Ờ 1kg, tỷ

lệ phần ăn ựược từ 60 Ờ 65%, số hạt trung bình khoảng 50 hạt, múi và vách múi dễ tách rời nhau Thịt quả màu vàng xanh, ăn giòn, ngọt, ựộ brix từ 12 Ờ

14 Thời gian thu hoạch muộn hơn bưởi đoan Hùng, thường thu hoạch trước tết Nguyên đán khoảng 15 Ờ 20 ngày Bưởi Diễn rất ựược ưa chuộng, ựặc biệt trong dịp tết Nguyên đán [3]

Xã đoài là giống cam nhập nội ựược người Pháp ựưa vào từ rất lâu và trồng ựầu tiên ở thôn đoài xã Nghi Diên Ờ Nghi Lộc Ờ Nghệ An Cây cao trung bình 3,5 Ờ 4m, tán rộng 4 Ờ 4,5m Cây phân cành tương ựối thấp, ắt gai

và gai ngắn Lá to, chiều dài lá 8 Ờ 9cm, rộng 5 Ờ 6cm và có cánh lá rộng Khung cành thưa hơn các giống khác Quả nặng trung bình 200 Ờ 250g, ựường kắnh quả trung bình 6,8 - 7,8cm, vỏ mỏng, dầy chừng 3mm, màu vàng tươi rất hấp dẫn Quả có trung bình 10 -12 múi, màng múi mỏng, tép nhỏ, nhiều nước, vị ngọt và có mùi thơm ựặc biệt Cam Xã đoài có 2 dạng quả, một là dạng quả hơi dẹt, và một dạng quả hơi thuôn Người dân ựánh giá dạng quả thuôn ngon hơn dạng quả dẹt Cam Xã đoài có khả năng thắch ứng rộng, ựặc biệt khi trồng ở những vùng núi cao có khắ hậu mát như Mộc Châu Ờ Sơn

La hoặc vùng núi các huyện Hương Sơn, Hương Khê - Hà Tĩnh mã quả rất ựẹp và chất lượng ngon đây là giống cam ựược người tiêu dùng rất ưa chuộng do mã quả ựẹp và ựặc biệt là ựộ brix rất cao Ngày nay giống cam này

ựã ựược trồng khá phổ biến trên cả nước ựặc biệt là ở miền Bắc Việt Nam[3]

Cam Xã đoài và bưởi Diễn là những cây ưa khắ hậu á nhiệt ựới, bởi vậy tất cả các vùng trồng có ựiều kiện khắ hậu tương tự như khắ hậu vùng á nhiệt ựới ựều trồng ựược hai giống này Bưởi Diễn ựược trồng khá nhiều ở Hà Nội

và các vùng lân cận Riêng xã Phú Diễn có khoảng 53ha với 600 hộ trồng, xã Thượng Mỗ huyện Hoài đức - Hà Tây diện tắch bưởi Diễn khoảng 125ha Cam

Xã đoài lại ựược trồng nhiều ở Nghệ An và các tỉnh miền Trung [4]

Nhược ựiểm lớn nhất của hai giống bưởi Diễn và cam Xã đoài là quả có rất nhiều hạt, ựây là một trong những rào cản trong thương mại hoá và xuất khẩu

2.3 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây ăn quả có múi

2.3.1 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây có múi trên thế giới

Kỹ thuật nuôi cấy mô cây thân gỗ, trong ñó có nhóm cây ăn quả có múi tuy có khó khăn hơn nhiều so với các cây thân thảo nhưng ñã có nhiều công trình nghiên cứu thành công ở nhiều lĩnh vực khác nhau

Theo tác giả Saunt, xu hướng phát triển cây ăn quả có múi trên thế giới

là sử dụng nhiều phương pháp ñể phát triển các giống mới Phương pháp lai tạo và ứng dụng công nghệ sinh học là các phương pháp quan trọng nhằm phát triển sản xuất theo hướng hàng hoá và xuất khẩu [24], [28]

Năm 1989, hai nhà bác học Issarel là Ben Hayyn và Gofffer ñã tạo ñược cây quýt chịu mặn bằng phương pháp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng có hàm lượng muối cao.[20]

Tại trường ñại học Assan, Ấn ðộ, Suwanapong- S và cộng sự ñã thành

công với kỹ thuật nhân giống trong ống nghiệm các cây Citrus retcullata và

Citrus limon burms[31]

Năm 1993, ba nhà khoa học người Nhật là Iwanami, Hidaka, Omora ñã nuôi cấy chồi ñỉnh cây có múi ñược lây nhiễm virus CTLV trên môi trường

MS có bổ sung BAP, NAA và GA3 Kết quả ñã tạo ra những cây hầu như không có virus CTLV [38], [27]

Với ñối tượng cây ăn quả có múi, người ta ñã rất thành công khi nuôi cấy

mô thân, mô rễ, mô lá và lá mầm trên môi trường MT có bổ sung α-NAA, BAP

Công nghệ sinh học ñã và ñang ñược coi là một công cụ vô cùng quan trọng trong việc phát triển sản xuất và nghiên cứu nông nghiệp hiện nay

Ngoài ứng dụng trong công tác nhân giống, công tác bảo tồn nguồn gen in

vitro, công cụ này còn hỗ trợ ñắc lực cho các nhà khoa học nghiên cứu và

chọn tạo thành công các giống mới theo xu hướng của thị trường Một trong các mục tiêu ñối với các nhà chọn giống cây có múi là tạo ra các giống cây có múi không hạt

Các ñường hướng tạo thể tam bội ñược quan tâm là: chọn lọc tự nhiên, chọn lọc biến dị dòng tế bào soma, lai soma hoặc hữu tính giữa thể tứ bội và nhị bội hoặc tái sinh cây từ nội nhũ 3n

Cây có múi là loại cây ăn quả ñầu tiên ñược các nhà khoa học tạo ra thể tam bội bằng phương pháp dung hợp tế bào trần [15] Các nhà khoa học thuộc trung tâm hợp tác quốc tế về nghiên cứu và phát triển nông nghiệp (CIRAD, Pháp) ñã rất thành công khi sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần ñể tạo các dòng cam không hạt

Kobayashi và cộng sự, ñã chứng minh ñược rằng các tế bào tam bội ñã xuất hiện từ sự dung hợp giữa thể nhị bội và thể ñơn bội khi họ làm thí nghiệm lai soma giữa giống Clementine (ñơn bội) và giống Satsuma, Navel, Trovita (nhị bội)[40]

Theo Soot và Cameron, 1975, thực hiện phép lai giữa giống nhị bội và

tứ bội ñể tạo thể tam bội là một chiến lược tạo giống không hạt rất quan trọng Năm 1980, 1985 hai ông ñã thành công khi tạo ra 2 thể tam bội là bưởi chùm Oroblanco và Melogold [29],[30]

Bưởi Pomelo là giống 2n ñơn phôi ñược dùng làm cây mẹ lai với cây

bố là cam hoặc bưởi chùm tứ bội( 4n) Kết quả ñã tạo ra ñược một số giống không hạt triển vọng như : DTE3, DTE4 [15]

Nuôi cấy nội nhũ là một phương pháp có nhiều triển vọng nhằm thu ñược cây tam bội trực tiếp Wang và Chang, 1978 ñã thu ñược cây tam bội từ nuôi cấy các mô sẹo phôi hoá có nguồn gốc nội nhũ[33]

Tachikawa và cộng sự ñã sử dụng Colchicine kết hợp với công nghệ sinh học ñể tạo ra cây quýt tứ bội Năm 1995, cũng theo phương pháp này các

nhà khoa học thuộc CIRAD đã thành cơng khi tạo ra một số dịng cam, bưởi

tứ bội[32]

2.3.2 Ứng dụng cơng nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây cĩ múi ở Việt Nam

Cơng nghệ nuơi cấy mơ tế bào đã được đưa vào nước ta từ khá lâu nhưng chỉ từ năm 1975 trở lại đây nĩ mới thực sự phát triển và ngày càng mở rộng Tuy nhiên việc áp dụng kỹ thuật này cho mục đích nhân nhanh một số giống cây ăn quả cĩ múi chưa được rộng rãi vì nhĩm cây này cĩ khả năng cho

hệ số nhân giống khá cao khi sử dụng các phương pháp nhân giống truyền thống như ghép, chiết, giâm cành

Tại viện Di truyền nơng nghiệp, từ năm 1995, đã được chương trình Cơng nghệ sinh học quốc gia đầu tư nghiên cứu sưu tập tập đồn giống cây cĩ múi ưu việt và tạo giống sạch bệnh bằng kỹ thuật vi ghép Kết quả là một số lượng lớn giống, dịng đã được thu thập, bảo quản trong nhà lưới, trong ống

nghiệm (in vitro)[15]

Năm 1998, tại Viện Di truyền nơng nghiệp, TS ðỗ Năng Vịnh và cộng

sự đã nghiên cứu và đưa ra quy trình nuơi cấy mơ nhằm bảo quản và tạo

nguồn gen cây ăn quả cĩ múi sạch bệnh trong điều kiện in vitro[18]

Viện nghiên cứu Cây ăn quả Miền Nam cũng đã thành cơng khi nghiên

cứu nhân giống gốc ghép lồi Carrizo Citrange và Volkamer bằng kỹ thuật

nuơi cấy mơ để phục vụ cho mục đích sản xuất thử một số loại gốc ghép cho cây cĩ múi phục vụ cho nhu cầu sản xuất cũng như làm tiền đề nghiên cứu nuơi cấy mơ cho cây cĩ múi, một kỹ thuật cơng nghệ sinh học khơng thể thiếu trong cải thiện giống cây ăn quả quan trọng này[11]

Ở nước ta, các cơng trình nghiên cứu về chọn tạo giống cây ăn quả cĩ múi chưa nhiều Một số cơng trình nghiên cứu tạo giống cây cĩ múi bằng cơng nghệ sinh học cũng đã được một số tác giả thực hiện ở nước ngồi nhưng khi về Việt Nam lại khơng cĩ điều kiện tiếp tục [15] Gần đây nhất,

năm 2005 trong luận án tiến sỹ của tác giả Hà Thị Thuý có báo cáo về kết quả

nghiên cứu phương pháp tạo dòng ña bội thể in vitro và in vivo của một số

giống cây ăn quả có múi như bưởi ðỏ, cam Vân Du, quýt Chum Kết quả ñã thu ñược một số dòng bưởi ðỏ, cam Xã ðoài, cam Vân Du ña bội [15]

2.4 Nghiên cứu xử lý ña bội thực nghiệm trong chọn tạo giống

2.4.1 Cơ sở khoa học của gây tạo ña bội thực nghiệm

2.4.1.1 ðịnh nghĩa và các dạng ña bội thể

ða bội thể là hiện tượng những sinh vật trong tế bào sinh dưỡng có số lượng nhiễm sắc thể tăng theo bội số nguyên lần của bộ nhiễm sắc thể ñơn bội (từ 3n trở lên) ða bội thể là hiện tượng phổ biến ở thực vật, ñặc biệt là cây hạt kín, 30- 70% cây hạt kín ở trạng thái ña bội Phần lớn sản phẩm cây trồng nuôi sống con người là những cây ña bội, ví dụ như lúa mỳ, mía, khoai tây, khoai lang…[4]

2.4.1.2 Ý nghĩa của ña bội thể

Ý nghĩa của ña bội không chỉ do sự làm giàu gen mà còn do sự biến ñộng di truyền nhờ tăng khả năng tái tổ hợp của các thể ña bội Quá trình tiến hoá của loài là quá trình chuyển từ lưỡng bội sang ña bội thể

ða bội thể nhân tạo có nhiều giá trị quý như tăng năng suất và phẩm chất Phần lớn các giống cây trồng không hạt như dưa hấu, cà chua, cam quýt… ñều do phương pháp ña bội thể tạo ra [15]

2.4.1.3 Các dạng ña bội thể

- ða bội thể khác nguồn (Allopolyploidy): Là ña bội ñược hình thành do

sự tăng 2 hay nhiều bộ nhiễm sắc thể khác nhau ða bội thể khác nguồn ñược tạo thành do lai giữa các loài khác nhau rồi sau ñó số nhiễm sắc thể ñược nhân ñôi

- ða bội thể cùng nguồn (Autopolyploid): Là ña bội thể ñược tạo nên

bởi những nhiễm sắc thể giống nhau của cùng một loài Hiện tượng này xảy

ra có thể do sự tăng ñôi số lượng nhiễm sắc thể trong hợp tử khi số lượng nhiễm sắc thể tương ñồng không bắt cặp hay sự hợp nhất các giao tử làm cho giao tử lưỡng bội Thể ña bội này thường bất thụ do quá trình phân bào giảm

nhiễm diễn ra khó khăn [10]

2.4.1.4 Cơ chế hình thành ña bội thể

Trong quá trình phân chia của tế bào có xảy ra một số rối loạn làm cho quá trình này diễn ra không bình thường, hình thành nên các tế bào ña bội Nguyên nhân là do các nhiễm sắc thể, sau khi nhân ñôi nhưng lại không phân chia về hai cực của tế bào do không hình thành thoi vô sắc hoặc có sự phân ly

về hai cực nhưng không ñồng ñều Cũng có thể sau khi nhiễm sắc thể phân ly

về hai cực của tế bào thì chỉ xảy ra sự phân chia nhân của tế bào mà không hình thành eo thắt (ñối với tế bào ñộng vật), hoặc vách ngăn (ñối với tế bào thực vật) Sự rối loạn phân bào có thể diễn ra ở tế bào soma hoặc ở lần phân chia thứ nhất của hợp tử

Dạng tự ña bội (Autopolyploid) ñược hình thành do quá trình nội phân

(endomitosis), xảy ra trong tế bào sống khi bộ nhiễm sắc thể nhân ñôi nhưng không kèm theo phân bào, do ñó số lượng nhiễm sắc thể ñược tăng gấp ñôi, tức là có sự ña bội hoá và từ ñó dẫn tới hình thành các mô ña bội hoặc cơ thể

ña bội do sinh sản sinh dưỡng

Dạng dị ña bội (Allopolyploidy) ñược hình thành qua quá trình tạo các

giao tử và hợp tử ña bội, nghĩa là các hợp tử ñược hình thành từ các giao tử của các cơ thể khác nhau (hiện tượng lai) hoặc hình thành từ sự giao phối giữa những cây khác loài, những cây có họ hàng xa về mặt di truyền (lai xa)

2.4.2 ðặc ñiểm chung của cây ña bội thể cùng nguồn

Trong sản xuất hiện nay, những cây trồng ñược tạo ra ở dạng ña bội thể cùng nguồn tỏ ra rất có hiệu quả thực tế: Ví dụ như:

+ Dưa hấu tam bội không hạt cho năng suất và chất lượng cao hơn dưa hấu lưỡng bội

+ Củ cải ñường tam bội củ dài hơn, hàm lượng ñường và năng suất cao hơn + Nho tứ bội quả to hơn và ít hạt hơn

+ Cây thức ăn gia súc, năng suất cỏ khô ở cỏ 3 lá tam bội cao hơn lưỡng bội + Cây cảnh có dạng hoa mới, hoa lớn hơn, thời gian ra hoa kéo dài, hoa tươi lâu + Cây ăn quả có múi tam bội thường cho quả không hạt, năng suất cao hơn cây nhị bội

ðặc ñiểm chung của ña bội thể cùng nguồn so sánh với thế hệ tiền thân lưỡng bội có những khác biệt sau:

+ Về hình thái: cây ña bội thường có thân to, lá dày hơn với tỷ lệ dài/rộng nhỏ hơn Bộ lá thường xanh ñậm và giòn hơn, tế bào lớn hơn, hoa quả to hơn, tế bào biểu bì và khí khổng lớn hơn, tế bào bảo vệ chứa số lượng sắc lạp nhiều hơn, hạt phấn lớn hơn với nhiều lỗ mầm hơn

+ Về sinh lý: cây ña bội thể sinh trưởng chậm hơn ở tất cả các giai ñoạn, chín muộn hơn, thời gian ra hoa ngắn và ít hoa hơn, ống phấn của cây sinh trưởng chậm hơn Cường ñộ hô hấp, áp suất thẩm thấu của tế bào nhỏ hơn; khả năng chống chịu (chống hạn, chống bệnh) cao hơn

+ Về sinh hoá: Có hàm lượng các chất như ñường protein, lipit, vitamin, sắc tố… cao hơn

+ Về tính chất bất dục và các ñặc tính di truyền: Cây ña bội thể cùng nguồn có tính bất dục cao do quá trình phân bào không bình thường Cây ña bội có những ưu thế lai duy trì ñược lâu hơn và khi tự phối ít thoái hoá hơn cây nhị bội, cây ña bội ít phân ly hơn cây nhị bội…[8 ], [12]

2.4.3 Nguyên tắc và các phương pháp xử lý ña bội thể

2.4.3.1 Nguyên tắc xử lý ña bội

Xử lý ña bội là dùng các tác nhân lý, hoá tác ñộng vào cơ thể sinh vật lúc chúng ñang ở giai ñoạn phân chia tế bào mạnh nhất nhằm làm cho quá trình ñó diễn ra không bình thường và hình thành lên thể ña bội Khi xử lý ña bội cần tuân thủ 3 nguyên tắc sau:

Một là xử lý lúc tế bào phân chia mạnh nhất (mô phân sinh ñầu rễ, thân,

hạt nẩy mầm, cây phân cành…)

Hai là tác ñộng vào lúc tế bào phân chia ở giai ñoạn hậu kỳ nhằm làm ñứt thoi dây tơ vô sắc giúp số lượng nhiễm sắc thể nhân ñôi mà không phân ly ñược

Ba là tác ñộng vào giai ñoạn mạt kỳ lúc tế bào chưa phân chia, kìm hãm sự phân chia sinh ra tế bào có 2 nhân

2.4.3.2 Các phương pháp xử lý ña bội

Xét về tác nhân gây ña bội thì có 2 tác nhân chính ñó là:

Tác nhân vật lý bao gồm gây chấn thương cơ giới, ly tâm, thay ñổi nhiệt ñộ ñột ngột

Tác nhân hoá học bao gồm các chất có tác ñộng gây ña bội như: Oryzalin, Indol acetic axit, Colchicine…

Các tác nhân gây ra ña bội lý, hoá học, thường ñược áp dụng trong 3 phương pháp chính:

+ Phương pháp gây chấn thương: Hiệu quả với cây họ cà, tạo ra ñược nhiều cây ña bội có giá trị cao như cà chua

+ Phương pháp thay ñổi nhiệt ñộ: áp dụng cho lúa khi hình thành tế bào

mẹ hạt phấn, tiến hành nâng nhiệt ñộ từ 20-300C lên trên 400C

+ Phương pháp xử lý bằng hoá chất với hoá chất thường sử dụng như Colchicine: Khi xử dụng phương pháp này cần chú ý nồng ñộ, thời gian xử lý,

bộ phận xử lý (hạt, ñỉnh sinh trưởng, ñầu rễ…) cho từng ñối tượng Có thể xử

lý in vitro hoặc in vivo Phương pháp xử lý ñột biến in vitro là một hướng tạo

giống mới nhanh chóng và hiệu quả hơn các phương pháp truyền thống Vật liệu xử lý là các cơ quan trong các giai ñoạn sinh trưởng, phát triển mạnh như

chồi ñỉnh, callus…, sau xử lý các mẫu này ñược nuôi cấy trong ñiều kiện in

vitro, ñảm bảo vô trùng và tăng khả năng sống sót

2.4.4 Phương pháp xử lý ña bội thể bằng colchicine

2.4.4.1 Tác ñộng của colchicine

Colchicine (acetyltrimethylcolchicine acid), có công thức hoá học là

C22H25O6N, trọng lượng phân tử là 399,43, là một ankaloid ñược chiết xuất từ cây nghệ tây, khá bền vững với nhiệt ñộ, dễ bị mất hoạt tính bởi ánh sáng, dễ hoà tan trong nước (Blakeslee và Avery, 1937)[8]

Theo tác giả Demen, 1938 cho rằng: colchicine ñã cản trở quá trình phân ly của các nhiễm sắc về hai cực của tế bào trong quá trình phân bào bằng cách ức chế sự hình thành thoi vô sắc Như vậy có thể sử dụng Colchicine với các tế bào ñã ñược nhân ñôi nhiễm sắc thể ñể trong quá trình phân chia của tế bào các nhiễm sắc thể của tế bào không ñược phân ly về hai cực, dẫn ñến hình thành các tế bào ña bội[22]

Colchicine là chất có khả năng gây ña bội hoá cao, trong dung dịch lỏng dễ dàng khuếch tán vào mô tế bào, có hiệu quả cao hơn với các tế bào ñang phân chia mạnh mẽ và không có tác dụng tới các tế bào ñang ngủ nghỉ

Về lý thuyết một phân sinh có thể chuyển từ nhị bội sang tứ bội nếu mô ñó ñược xử lý Colchicine với thời gian, liều lượng và thời ñiểm thích hợp trong chu kỳ phân chia tế bào của cây Việc gây ña bội hoá bằng phương pháp xử lý colchicine có thể ñược sử dụng ñể tạo cây bố mẹ có số lượng nhiễm sắc thể gấp ñôi bộ nhiễm sắc thể ban ñầu[15], [21]

Do tính chất và cơ chế tác ñộng của colchicine là tác ñộng lên sự hình thành và phá huỷ thoi vô sắc, người ta thường xử lý Colchicine lên các mô ñang có nhiều tế bào phân chia nhất hoặc xử lý các mô ở thời ñiểm có chỉ số phân bào cao nhất (Trần Duy Quý, 1997)[12]

Người ta thường dùng colchicine ñể xử lý cho các bộ phận:

- Xử lý hạt: Dùng nồng ñộ 0,1 – 0,5% với thời gian xử lý là 2 – 24 giờ

Có thể xử lý trước hoặc sau khi hạt nảy mầm ở nhiệt ñộ trên dưới 270C Các yếu tố này có thể áp dụng riêng lẻ hay kết hợp tuỳ theo loại cây trồng và giống

- Xử lý bộ phận sinh dưỡng: nhỏ giọt colchicine hoặc ñặt bông thấm

dung dịch lên ñỉnh sinh trưởng (hoặc mầm nách, mắt ngủ…) Cũng có thể xử

lý cành giâm trong thời gian 4-5 ngày sau ñó trồng hoặc ghép khi cần thiết

- Xử lý trên các mô tế bào ñang phân chia mạnh trong ñiều kiện in vitro

như mầm hạt, ñỉnh chồi, callus…ðiều quan trọng ở mọi trường hợp là chất ñộc ñối với sợi thoi vô sắc chỉ có hoạt lực ñối với các tế bào phân chia mạnh [8]

2.4.4.2 Nghiên cứu tạo dòng ña bội bằng xử lý Colchicine

Nhiều nghiên cứu khác nhau ñã khẳng ñịnh rằng tất cả các loài trong chi Citrus nhị bội với số lượng NST là 18 Tuy vậy trong quá trình tiến hoá ñã xuất hiện một số dạng ña bội hoá tự nhiên Các nghiên cứu tạo giống ña bội bằng thực nghiệm ñã ñược triển khai từ sau khi phát minh chất gây ña bội là colchicine

Tachikawa và cộng sự năm 1961, ñã sử dụng colchicine ñể tạo cây quýt tứ bội và sau ñó ñã lai cây tứ bội này với cây nhị bội ñể tạo giống quýt tam bội (không

hạt)

Người ta ñã sử dụng colchicine xử lý cho mô sẹo phôi hoá có nguồn gốc từ noãn non kém phát triển ñể tạo thể ña bội, xử lý cho các tế bào ñang phát triển mạnh như ñỉnh sinh trưởng, mầm, chồi ñang phát triển, hạt Ngoài

ra Colchicine còn ñược sử dụng ñể xử lý cho các cụm chồi, callus, mô sẹo in

vitro Khi xử lý colchicine phải tạo ñiều kiện thuận lợi cho tế bào phân chia nhiều ñể thu ñược hiệu quả cao nhất [23]

Gần ñây các dạng tứ bội ñã ñược tạo ra bằng xử lý colchicine in vitro

các mô sẹo phôi hoá có nguồn gốc từ noãn non kém phát triển của một số giống thuộc chi Citrus Theo Wu và Mooney, 2002 thì muốn nhận ñược hiệu quả cao khi gây ña bội dưới tác dụng của Colchicine cần phải tạo ñiều kiện cho các tế bào của mẫu xử lý phân chia mạnh mẽ Việc làm này không những nâng cao ñược hiệu quả gây ña bội mà còn làm giảm ñược tỷ lệ chồi khảm [51]

Các tác giả Wu và Mooney ñã khẳng ñịnh rằng có thể sử dụng Colchicine ñể xử lý cho mô sẹo phôi hoá có nguồn gốc từ noãn non kém phát

triển của giống Valencia và giống quýt Ordando Tangelo ñể tạo ra dạng tứ bội

mà không bị khảm [34]

Xử lý ña bội in vitro bằng colchicine ñồng thời kết hợp với nhân nhanh

in vitro ñã cho ra một cách nhanh chóng những dòng tứ bội, cung cấp nguồn nguyên liệu cho lai tạo giống tam bội không hạt ở một số giống cây trồng ñặc biệt là cây ăn quả như dưa hấu và cây cam quýt Phương pháp ñột biến nhân tạo không những rút ngắn thời gian chọn giống từ 3-4 thế hệ mà phương pháp làm còn ñơn giản hơn Phương pháp ñột biến nhân tạo có thể làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể rất có ý nghĩa trong tạo vật liệu khởi ñầu trong chọn tạo giống cây trồng [7]

Năm 1997, sau khi tiến hành thí nghiệm, tác giả Trần Duy Quý ñã kết luận: hiệu quả tạo ñột biến bằng colchicine phụ thuộc rất nhiều vào tốc ñộ sinh trưởng và phân bào của mẫu xử lý [12]

Hiện nay, trên thế giới, người ta ñã tạo ra thể tứ bội ở nhiều loài khác nhau như: dưa hấu, nho, củ cải, thuốc lá, lúa mì, cỏ gia súc [12]

Các nhà khoa học trong nước cũng ñã công bố một số kết quả nghiên cứu về việc sử dụng tác nhân hoá học là colchicine ñể xử lý ñột biến ña bội trên một số loại cây trồng như: vải, nhãn, cam, quýt, bưởi, dưa hấu, dâu tằm

trong ñiều kiện in vivo Các tác giả cũng cho rằng hiệu quả gây ña bội của

colchicine là khá cao

Năm 2002, tác giả Nguyễn Thu Hiền- Viện Nghiên cứu Rau quả ñã tạo ñược giống dưa hấu không hạt trên cơ sở xử lý ñột biến giống dưa hấu Sugar Baby ñã ñược làm thuần trong 3 năm bằng colchicine với nồng ñộ 0,3% , tần suất gây ñột biến là 7% [6]

Các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu dâu tằm tơ, Viện nghiên cứu Rau

quả, năm 2005 ñã ñưa ra một giống dâu tứ bội thông qua xử lý Colchicine in

vivo Giống tứ bội này ñược sử dụng trong phép lai với thể nhị bội ñể tạo cây dâu tam bội cho năng suất lá dâu rất cao

Khi xử lý colchicine ở nồng ñộ 0.1% trong 24 giờ trên cành in vivo của

các giống bưởi Phúc Trạch, cam Sành, quýt Chum, tác giả Hà Thị Thuý ñã thu ñược tỷ lệ cây tứ bội là 15,4% Với hạt ñã bóc vỏ lụa của bưởi ðỏ và cam Sành sau xử lý ở nồng ñộ 0,15% trong 24 giờ cũng thu ñược khá nhiều cây tứ bội [15]

Theo tác giả Hà Thị Thuý, 2005, các chồi in vitro và mô sẹo phôi hoá

của cam Vân Du khi xử lý colchicine ở nồng ñộ 0,2% trong 24 giờ ñã cho thể

tứ bội ñạt 19,8% [15]

Theo các tác giả Fred McCuistion và Todd C.Wehner, cây tứ bội có thể ñược xác ñịnh trực tiếp bằng phương pháp ñếm số lượng nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi, hoặc bằng cách so sánh với kích cỡ thân, lá, hoa, bao phấn của cây nhị bội ban ñầu Một phương pháp thông thường là ñếm số lượng lục lạp trong tế bào khí khổng bằng cách soi mẫu lá dưới kính hiển vi Ví dụ với cây dưa hấu tứ bội: có xấp xỉ 10-14 lục lạp ở mỗi một mặt của tế bào khí khổng (tổng số là 20-28), cây nhị bội chỉ có 5-6 lục lạp ở mỗi mặt tế bào (tổng số là 10-12) Biện pháp hiệu quả hơn cả là phân biệt cây tứ bội ở ngoài ñồng ruộng, cây tứ bội thường có

lá dày hơn, sinh trưởng chậm hơn và thân ngắn hơn so với cây nhị bội [36]

Ngoài ra, có thể xác ñịnh cây ña bội thông qua việc ño gián tiếp hàm lượng ADN nhờ máy Flow cytometry Kỹ thuật này ñược chứng minh là chính xác hơn và nhanh hơn so với các phương pháp truyền thống như là ñếm

số lượng nhiễm sắc thể hoặc ño chiều dài khí khổng [25]

Theo tác giả Hà Thị Thuý, việc nhận dạng cây có múi ña bội nhờ các ñặc ñiểm hình thái là rất khó khăn và thiếu chính xác Xác ñịnh mức bội thể bằng phương pháp ñếm số lượng nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi cho kết quả chính xác hơn nhưng rất tốn kếm thời gian Phương pháp xác ñịnh mức bội thể thông qua ño hàm lượng ADN trong nhân tế bào bằng máy Flow Cytometry ñã ñược sử dụng khá phổ biến Phương pháp này cho phép xác ñịnh nhanh mức bội thể của các vật liệu di truyền khác nhau Ngày nay, phương pháp này ñã trở nên vô cùng hữu hiệu trong chọn tạo giống cây có

múi ña bội [15]

Từ những kết quả nghiên cứu trên ñây, chúng tôi tiến hành hoàn thiện

một số kỹ thuật trong quá trình nuôi cấy in vitro cây cam Xã ðoài, cây bưởi Diễn và ứng dụng kỹ thuật xử lý colchicine in vitro nhằm nâng cao hiệu quả

của phương pháp nhân giống và bước ñầu nghiên cứu qui trình tạo dòng bưởi

Diễn và cam Xã ðoài ña bội trong ñiều kiện in vitro phục vụ yêu cầu của sản

xuất hiện nay

PHẦN III:VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

+ Các hoá chất sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào

3.1.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

- ðịa ñiểm: Các thí nghiệm ñược tiến hành tại phòng thí nghiệm thuộc

bộ môn Công nghệ sinh học- Viện nghiên cứu Rau Quả

Thí nghiệm phân tích ñộ bội của cây ñột biến ñược tiến hành tại Lab of Horticultural Science, Hanover University, German

- Thời gian thực hiện ñề tài:từ tháng 4/ 2006 ñến tháng 10/ 2008

3.2 Nội dung nghiên cứu: bao gồm 2 nội dung chính

- Nội dung 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro cây

bưởi Diễn và cam Xã ðoài

- Nội dung 2: Nghiên cứu xử lý colchicine in vitro ñể tạo dòng bưởi

Diễn và cam Xã ðoài ña bội

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1.Bố trí thí nghiệm

+ Thí nghiệm ñược thiết kế ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức ñược

bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 5 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 mẫu

+ Các thí nghiệm ñược tiến hành ñồng thời trên cả hai giống cam Xã ðoài và bưởi Diễn

+ Các thí nghiệm ñược tiến hành theo các bước sau:

* Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro cây bưởi

Diễn và cam Xã ðoài

+ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường (MS, 1/2MS,

MT, 1/2MT) ñến khả năng tạo cụm chồi in vitro từ chồi ñỉnh của bưởi Diễn

và cam Xã ðoài

Sau thí nghiệm 1 tìm ra công thức tối ưu (CT tối ưu 1) ñể sử dụng cho các thí nghiệm 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

+ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy ban ñầu

(VL1, VL2, VL3) tới khả năng tạo chồi in vitro của hai giống bưởi Diễn và

cam Xã ðoài

Sau thí nghiệm 2 tìm ra ñược vật liệu tối ưu nhất ñể sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

+ Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BAP ñến khả năng tạo cụm chồi in

vitro của hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài

ðối chứng: CT tối ưu 1 CT2: CT tối ưu1 + 0,5ppm BAP CT3: CT tối ưu 1 + 1,0ppm BAP CT4: CT tối ưu 1 + 1,5ppm BAP

+ Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của adenin ñến khả năng tạo cụm chồi in

vitro của hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài

ðối chứng: CT tối ưu1 CT2: CT tối ưu1+ 20ppm Adenin CT3: CT tối ưu1+ 40ppm Adenin CT4: CT tối ưu1+ 60ppm Adenin + Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, adenin ñến khả năng tạo

cụm chồi in vitro của hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài

ðối chứng: CT tối ưu1

Thí nghiệm 5a: CT tối ưu1 + 20ppm Adenin + (0,5; 1,0; 1,5 ppm) BAP Thí nghiệm 5b: CT tối ưu1 + 40ppm Adenin + (0,5; 1,0; 1,5 ppm) BAP Thí nghiệm 5c: CT tối ưu1 + 60ppm Adenin + (0,5; 1,0; 1,5 ppm) BAP

Sau thí nghiệm 5 tìm ra ñược công thức tối ưu nhất cho tạo cụm chồi in

vitro cho cả hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài

+ Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của α- NAA ñến khả năng ra rễ của chồi in

vitro ở hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài

ðối chưng: CT tối ưu1

CT2: CT tối ưu1 + 0,5ppm α- NAA

CT3: CT tối ưu 1 + 1,0ppm α- NAA

CT4: CT tối ưu 1 + 1,5ppm α- NAA

+ Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của IBA ñến khả năng ra rễ của chồi in

vitro ở hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài

ðối chứng: CT tối ưu 1

CT2: CT tối ưu1 + 0,5ppm IBA

CT3: CT tối ưu 1 + 1,0ppm IBA

CT4: CT tối ưu 1 + 1,5ppm IBA

+ Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, α- NAA ñến khả năng ra

rễ của chồi in vitro ở hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðoài

ðối chứng: CT tối ưu1

Thí nghiệm 8a: CT tối ưu1 + 0,5ppm α- NAA + (0,5; 1,0; 1,5 ppm) IBA Thí nghiệm 8b: CT tối ưu1 + 1,0ppm α- NAA + (0,5; 1,0; 1,5 ppm) IBA Thí nghiệm 8c: CT tối ưu1 + 1,5ppm α- NAA + (0,5; 1,0; 1,5 ppm) IBA

- Sau thí nghiệm 8 tìm ra công thức tối ưu cho ra rễ ñể tiến hành thí nghiệm ra rễ cho các chồi sau xử lý colchicine

* Nghiên cứu xử lý colchicine in vitro tạo ña bội thể

+ Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của nồng ñộ và thời gian xử lý colchicine

in vitro ñến khả năng tạo ña bội thể

Thí nghiệm 9a: Xử lý trong 6h ở các nồng ñộ: 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% Thí nghiệm 9b: Xử lý trong 12h ở các nồng ñộ: 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% Thí nghiệm 9c: Xử lý trong 18h ở các nồng ñộ: 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% Thí nghiệm 9d: Xử lý trong 24h ở các nồng ñộ: 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% + Phát hiện thể ña bội bằng các phương pháp: quan sát hình thái và xác ñịnh gián tiếp hàm lượng ADN bằng máy ño ñộ bội (Flow cytometry)

3.3.2 Phương pháp tiến hành

3.3.2.1 Các phương pháp tiến hành

+ Nội dung 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro

cho cây bưởi Diễn và cam Xã ðoài

Hạt ñược rửa sạch bằng nước cất 1-2 lần rồi tiến hành khử trùng trong buồng cấy vô trùng bằng cách ngâm ngập trong các dung dịch khử trùng Hạt ñược rửa lại bằng nước vô trùng 3- 4 lần rồi tiến hành cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MS Hạt mọc mầm sau 7- 14 ngày tiến hành cắt ñoạn thân và ñỉnh chồi cấy vào môi trường bật chồi Khi chồi ñủ tiêu chuẩn thì cắt thành từng ñoạn 0,5 ñến 1cm, cấy chuyển sang môi trường tạo cụm chồi

Cành bánh tẻ của cây bưởi Diễn và cam Xã ðoài ñược thu về và rửa sạch bằng nước 2- 3 lần, khử trùng bằng hoá chất khử trùng trong buồng cấy Sau ñó cắt lấy ñoạn chồi ñỉnh và chồi nách, cấy vào môi trường MT Sau 1- 2 tuần, các chồi mới sẽ xuất hiện Khi chồi ñạt khoảng 1-2 cm ñược cấy chuyển sang môi trường tạo cụm chồi phục vụ cho thí nghiệm 1 và 2

Các thí nghiệm tiếp theo sử dụng chồi cấp 1 bật lên từ ñoạn thân mọc

từ hạt Sau ñó cứ 3- 4 tuần cấy chuyển một lần

Sau 2 lần cấy chuyển, mỗi lần cấy chuyển 3 - 4 tuần, chồi có chất lượng

tốt thân mập, lá xanh tốt, có chiều dài 2 - 5cm ñược cắt với chiều dài 1,5 – 2,5cm cm ñể chuẩn bị cho các thí nghiệm ra rễ

+ Nội dung 2: Nghiên cứu xử lý colchicine in vitro ñể tạo ña bội

Các chồi sau khi nhân nhanh trong môi trường tối ưu, sau lần cấy chuyển thứ 2 (thời gian cho 1 lần cấy chuyển 3 - 4 tuần) ñược sử dụng cho thí nghiệm

Phương pháp tiến hành: các cụm chồi ñang trong giai ñoạn sinh trưởng mạnh nhất, thân mập ñược tách thành từng chồi riêng rẽ, cắt bỏ bớt lá to chỉ

ñể lại lá nhỏ trên ñỉnh chồi tạo chồi có chiều cao 1- 1,5cm

Dung dịch colchicine ñược khử trùng bằng màng lọc vô trùng (Millipore Sterivex GS, 0,22; 1atm) trong buồng cấy vô trùng, bổ sung trực tiếp vào bình chứa 20 ml môi trường MT lỏng vô trùng với lượng dung dịch tạo nồng ñộ Colchicine thí nghiệm là: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (khối lượng/thể tích môi trường) Chồi ñã chuẩn bị sẵn ñược cho vào ngâm trong dung dịch này trong ñiều kiện ñược lắc với tốc ñộ 100 vòng/phút và ñể chiếu sáng 12h/ 24h Mỗi công thức xử lý 60 chồi Sau khi xử lý xong, các chồi ñược rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 - 4 lần và cấy sang môi trường nhân nhanh và nuôi cấy ở ñiều kiện ổn ñịnh Sau 4 tuần nuôi cấy tiến hành kiểm tra sự thay ñổi hình thái của mẫu cấy

+ Phát hiện ña bội bằng các phương pháp: quan sát hình thái và xác ñịnh gián tiếp hàm lượng ADN bằng máy flow cytometry

- Quan sát hình thái: ðo các chỉ tiêu chiều rộng, chiều dài, ñộ dày lá

của các cây ñã xử lý và cây nhị bội cùng giống ñể xác ñịnh sự sai khác về

hình thái bên ngoài của các cây ña bội

- Xác ñịnh gián tiếp hàm lượng ADN bằng máy Flow cytometry : Quy trình ñược thực hiện theo Ollitrau và mMichaux- Ferriere (1992) và hướng

dẫn của hãng Partec, ðức Phương pháp này sử dụng giống cây có múi ñã biết trước mức bội thể làm ñối chứng so với mẫu cần ñánh giá

Lấy khoảng 1 cm2 lá thu từ các cây sau xử lý với colchicine cho vào ñĩa peptri ñường kính 55mm có chứa dung dịch HR-A (HR-A nuclei extraction solution-Partec High Resolution Staining Kit) Dùng lưỡi dao cạo băm nhỏ sau ñó lọc qua màng lọc tế bào kích thước 50-µm Dung dịch chứa nhân tế bào thu ñược ñược nhuộm mầu bằng dung dịch HR-B DAPI (HR-B DAPI staining solution-Partec High Resolution Staining Kit) Tỷ lệ giữa dung dịch HR-A và HR-B là 1:4 (v/v) Cuối cùng, mẫu ñược phân tích bằng máy PA Ploidy Analyzer, Partec ðỉnh chuẩn ñược xác ñịnh ở vị trí có cường ñộ huỳnh quang tương ñối gần 100 khi phân tích cây ñối chứng (không xử lý) Các mức bội thể 4x và 8x tương ứng với các ñỉnh 200 và 300

3.3.2.2 ðiều kiện tiến hành thí nghiệm

- Phòng nuôi cấy mô có các ñiều kiện sau:

+ Cường ñộ ánh sáng: 2.000 lux

+ ðộ ẩm 60%

+ Nhiệt ñộ 25 ± 20C

+ Chu kỳ chiếu sáng: (10-12h)/24h

- Môi trường nuôi cấy:

+ Sử dụng môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) và MT (Murashige và Tooker), pH môi trường chuẩn ñộ trước khi cho agar và khử trùng là 5,7

+ Lượng agar sử dụng là 5g/l (trừ môi trường MT lỏng không cho agar

ñể ngâm lắc chồi trong thí nghiệm xử lý colchicine)

+ Lượng sacarose sử dụng 30g/l

+ Môi trường ñược hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút

Sử dụng các môi trường MT, 1/2MT, MS, 1/2MS có bổ sung các chất khác nhau tùy theo từng thí nghiệm

Colchicine ñược khử trùng bằng màng lọc (Millipore Sterivex GS, 0,22; 1atm)

3.3.3.Cách tính các chỉ tiêu

3.3.3.1 Phương pháp theo dõi

- 5 - 7 ngày theo dõi thí nghiệm 1 lần tùy theo thí nghiệm

- ðo chiều cao cụm chồi: Từ gốc ñến búp lá dài nhất của chồi cao nhất

- ðếm số chồi: ðếm tổng số chồi và nhánh tạo ra trên một mẫu nuôi cấy ban ñầu

- ðếm số rễ: ñếm số rễ cấp 1

- ðo chiều dài rễ: ño chiều dài của rễ dài nhất của cây

- Theo dõi tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái khác nhau, theo dõi ño ñếm các chỉ tiêu sinh lý, tế bào học

3.3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi

Tổng số mẫu nảy chồi + Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) =

Tổng số mẫu cấy ban ñầu x 100

Tổng số mẫu sống + Tỷ lệ sống (%) =

Tổng số mẫu cấy ban ñầu x 100

Tổng số mẫu không phản ứng + Tỷ lệ mẫu không phản ứng (%) =

Tổng số mẫu cấy ban ñầu x 100

Tổng số mẫu biến dị + Tỷ lệ mẫu biến dị (%) =

Tổng số mẫu thu ñược x 100 + Tỷ lệ ra rễ (%) = Tổng số cây ra rễ x 100

Tổng số cây ñưa vào

Tổng số chồi tạo thành + Hệ số nhân chồi (lần/ thời gian) =

Tổng số mẫu ban ñầu x thời gian

Tổng chồi theo dõi + Tình trạng chồi: mô tả hình thái

+ ðộ bội của chồi ñược ño bằng máy ño ñộ bội (Flow cytometry)

3.3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu ñược ñều ñược xử lý bằng các phương pháp thống kê

sinh học phù hợp với từng thí nghiệm của các nội dung nghiên cứu

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1.Hồn thiện quy trình nhân nhanh in vitro ở bưởi Diễn và cam Xã

ðồi

Với mục đích tạo một số lượng chồi lớn phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo, dựa trên những nghiên cứu trước đây đối với một số đối tượng cây

cĩ múi khác như bưởi ðỏ, cam Sành, quýt Chum ở trong và ngồi nước,

chúng tơi tiến hành nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân nhanh in vitro cho

cây bưởi Diễn và cam Xã ðồi Chúng tơi đặc biệt quan tâm đến tác động của

một số yếu tố đến quá trình tạo cụm chồi in vitro như: ảnh hưởng của mơi

trường, vật liệu nuơi cấy, chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi

và khả năng ra rễ tạo cây hồn chỉnh

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường tới khả năng tạo chồi ở hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðồi

Mơi trường nuơi cấy là một yếu tố quan trọng trong quá trình nuơi cấy

in vitro Vì vậy, để xác định được mơi trường nuơi cấy thích hợp nhất cho hai giống bưởi Diễn và cam Xã ðồi chúng tơi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường tới khả năng tạo chồi và phát sinh chồi với đối tượng nghiên cứu là chồi đỉnh được lấy từ các cành bánh tẻ của cây 5 năm tuổi trồng tại vườn tập đồn - Viện nghiên cứu Rau Quả Chúng tơi chọn vật liệu là chồi đỉnh vì theo tác giả Hà Thị Thuý, ở một số giống cây cĩ múi, chồi đỉnh tỏ ra là vật liệu nuơi cấy in vitro tốt hơn chồi nách[22 ]

Các cành bánh tẻ được thu về, tách lấy chồi đỉnh, rửa nhiều lần bằng nước sạch sau đĩ được khử trùng bằng Hypoclorit Canxi (Ca(OCl)2 ) 10% trước khi cấy vào mơi trường Các chồi mới tái sinh được gọi là chồi cấp 1 Các chồi cấp 1 này được cấy chuyển sang các mơi trường thí nghiệm Các mơi trường sử dụng trong thí nghiệm là MS, 1/2MS, MT, 1/2MT cĩ bổ sung thêm 1,0ppm BAP