Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm phân lập ở vùng ven biển khánh hòa

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm phân lập ở vùng ven biển Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp

enzyme protease của các chủng vi nấm phân lập ở vùng ven biển Khánh Hòa” là

công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, và chƣa từng đƣợc công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Kết quả này là một phần của đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du ở vùng ven biển Khánh Hoà dựa trên cách tiếp cận phụ thuộc và độc lập nuôi cấy” (mã số 106-NN.02-2016.70) do TS Phạm Thu Thuỷ là chủ nhiệm đề tài và Quỹ NAFOSTED tài trợ kinh phí

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã đƣợc cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều chính xác và đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Khánh Hòa, ngày 10 tháng 10 năm 2019

Tác giả luận văn

Đinh Thị Út

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm o n các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Tru ờng Đại học Nha Trang giảng dạy và tạo điểu kiện thuận lợi cho tôi viẹ c thực hiẹ n luạ n va n này

Tôi đạ c biẹ t cảm o n TS Phạm Thu Thủy và PGS.TS Nguyễn Văn Duy đã tạ n tình hu ớng dẫn, chỉ bảo để tôi c thể hoàn thành luạ n va n cao học

Tôi xin cảm ơn Quý thầy cô và cán bộ viên chức trong Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công việc nghiên cứu thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học lớp CHSH16-1 Trường Đại học Nha Trang và các thành viên của đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du

ở vùng ven biển Khánh Hòa dựa trên cách tiếp cận phụ thuộc và độc lập nuôi cấy” (mã số106-NN.02-2016.70) do TS Phạm Thu Thủy là chủ nhiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm Đặc biệt cảm ơn em Trần Thị Châu Loan

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu và các đồng nghiệp Trường THCS& THPT Đống Đa, Lâm Đồng nơi tôi đang công tác đã luôn tạo điều kiện và ủng hộ tôi vượt qua những kh khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, anh chị, … đã luôn yêu thương, động viên và ủng hộ tôi vượt qua những kh khăn trong quá trình học tập

và thực hiện luận văn

Khánh Hòa, ngày 18 tháng 10 năm 2019

Tác giả luận văn

Đinh Thị Út

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH x

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về vi nấm biển 3

1.2 Protease 6

1.2.1 Khái niệm protease 6

1.2.2 Phân loại protease 6

1.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ protease 7

1.2.4.1 Nguồn động vật 10

1.2.4.2 Nguồn từ thực vật 10

1.2.4.3 Nguồn từ vi sinh vật 10

1.2.5 Ứng dụng của protease 11

1.2.5.1 Công nghiệp thực phẩm 11

1.2.5.2 Công nghiệp nhẹ 12

1.2.5.3 Nông nghiệp 13

1.2.5.4 Y học 13

1.3 Protease từ vi nấm 13

1.3.1 Protease từ vi nấm 13

1.3.2 Cơ chế sinh enzyme protease 14

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme protease của vi nấm 15

1.4.1 Nhiệt độ 15

1.4.2 pH 15

1.4.3 Nguồn dinh dưỡng 16

1.4.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 17

1.5 Tình hình nghiên cứu enzyme protease từ vi nấm biển trên thế giới và Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng, phạm vi, thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 21

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Vật liệu nghiên cứu 21

2.2.1 Chủng vi nấm biển 21

2.2.2 H a chất 21

2.2.2.1 Oligonucleotide 21

2.2.2.2 Môi trường nuôi vi nấm 22

2.2.2.3 Thiết bị chuyên dụng 24

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát và bố trí thí nghiệm 24

2.3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc sơ bộ khả năng sinh enzyme ngoại bào bằng phương pháp đo đường kính phân giải protease 24

2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp để sinh tổng hợp protease của chủng DW15M 27

2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ 27

2.3.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH 27

2.3.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon 28

2.3.2.4 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nguồn ni tơ hữu cơ 29

2.3.2.5 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ casein 29

2.3.2.6 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ 30

2.3.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu 31

2.4.1 Nuôi cấy các chủng vi nấm 31

2.4.2 Bảo quản chủng vi nấm 32

2.4.3 Xác định hoạt tính sinh enzyme protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải cơ chất protein 33

2.4.4 Xác định hoạt độ enzyme protease theo phương pháp Anson cải tiến 34

2.4.5 Nhuộm đơn tế bào nấm mốc 36

2.4.6 Tách chiết DNA từ vi nấm biển 37

2.4.7 Khuếch đại đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 bằng kỹ thuật PCR 38

2.4.8 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose 39

2.4.9 Giải và phân tích trình tự gen 39

2.4.10 Phương pháp xử lí số liệu 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Tuyển chọn sơ bộ các chủng vi nấm biển phân lập ở vùng ven biển Khánh Hòa 40

3.2 Tuyển chọn các chủng vi nấm c hoạt độ protease cao nhất 42

3.3 Định danh chủng nấm DW15M dựa trên trình tự gen ITS và đặc điểm hình thái 43

3.3.1 Đặc điểm hình thái của chủng DW15M 43

3.3.2 Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5,8S – ITS2 45

3.3.3 Trình tự đoạn gen ITS của chủng DW15M 45

3.4 Điều kiện thích hợp sinh tổng hợp protease ngoại bào của chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M 47

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào 47

3.4.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào 48

3.4.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào 50

3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào 51

3.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào 53

3.4.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào 54

3.4.7 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thông tin cặp mồi ITS1F KYO2/ITS4 22

Bảng 2.2 Tỷ lệ thành phần phản ứng để dựng đường chuẩn tyrosine 34

Bảng 2.3 Tỷ lệ thành phần các dung dịch để xác định hoạt độ enzyme protease 35

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 38

Bảng 3.1 Kích thước vòng phân giải protein của 10 chủng nấm mốc c hoạt tính protease mạnh nhất 40

Bảng 3.2 Hoạt độ protease của 4 chủng 43

Bảng 3.3 So sánh trình tự đoạn gen ITS của chủng DW15M với các trình tự tương đồng nhất trên Genbank 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tỉ lệ phần trăm vi nấm biển thể hiện khả năng sản xuất enzyme (Smitha et al., 2014) 5 Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn phản ứng thủy phân protein của protease 6 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu 25 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sàng lọc các chủng vi nấm c khả năng sinh protease ngoại bào 26 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi nấm c khả năng sinh protease ngoại bào 26 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng nấm mốc nghiên cứu 27 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu 28 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu 28 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu 29 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng enzyme protease của các chủng nấm mốc nghiên cứu 30 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến khả năng enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu 30 Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu 31 Hình 3.1 Vòng phân giải protein của 10 chủng nấm mốc c hoạt tính protease mạnh nhất 41 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm mốc DW15M (1,3) so với loài

Simplicillium obclavatum (2,4) 44

Hình 3.3 Hình thái tế bào của chủng nấm mốc DW15M so với loài Simplicillium

obclavatum 44

Hình 3.4 Sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 của chủng DW15M 45 Hình 3.5 Giải trình tự đoạn gen ITS1-5.8S-ITS2 của chủng DW15M 45

Hình 3.6 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp của chủng Simplicillium obclavatum

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Protease là các enzyme đa chức năng chiếm gần 60% toàn bộ thị trường enzyme thương mại và thường được sử dụng trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, da, dược phẩm, thực phẩm, công nghệ sinh học và các ngành công nghiệp (Ramakrishna et al., 2010; Yin et al., 2013) Chúng c thể được thu nhận từ thực vật, động vật và vi sinh vật Trong đ các vi sinh vật là nguồn sản xuất protease do sự đa dạng lớn về đặc điểm sinh h a lớn của chúng và khả năng cải biến di truyền dễ dàng Đặc biệt, nhiều loài nấm sợi đã được khai thác ở quy mô công nghiệp để sản xuất các chất chuyển h a và các enzyme công nghiệp trong đ c protease

Nghiên cứu sinh tổng hợp protease từ vi sinh vật biển ở Việt Nam vẫn đang được tiến hành hơn thập niên qua, tuy nhiên những kết quả đạt được trong lĩnh vực này vẫn chưa đáp ứng được việc mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng của nh m enzyme này trong đời sống Vì vậy, việc tuyển chọn được chủng vi nấm biển c khả năng tổng hợp enzyme protease mạnh đ ng vai trò rất quan trọng, là cơ sở bước đầu cho việc xác định tính chất và nghiên cứu khả năng ứng dụng của protease vào thực tế Từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm ở vùng ven biển Khánh Hòa”

Mục tiêu của đề tài nhằm sàng lọc các chủng vi nấm biển c khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào, đã phân lập từ nước biển ven bờ thuộc tỉnh Khánh Hòa và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease của các chủng này, nhằm định hướng ứng dụng trong công nghiệp

Các phương pháp nghiên cứu chính đã thực hiện bao gồm: Sàng lọc các chủng vi nấm biển c khả năng sinh enzyme protease ngoại bào sử dụng môi trường Czapeck- Dox cải tiến c bổ sung cơ chất sữa gầy (Skim milk) 1% Tuyển chọn được 10 chủng

vi nấm c đường kính phân giải cơ chất protein mạnh Sau đ , xác định hoạt độ enzyme protease của các chủng này sử dụng phương pháp Anson cải tiến để tuyển chọn ra một chủng vi nấm biển c hoạt tính protease cao nhất trong các chủng nghiên cứu Định danh chủng vi nấm biển bằng phương pháp quan sát hình thái, khuẩn lạc tế bào và giải trình tự đoạn gen ITS- 5,8S- ITS2 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu

về nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ, thời gian nuôi cấy để chủng vi nấm biển cho hoạt tính protease cao nhất Các khảo sát dựa trên tính kế thừa các điều kiện nuôi

cấy thích hợp nhất của thí nghiệm trước đ Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, sau đ tính toán giá trị trung bình Các số liệu thí nghiệm được xử lý và giá trị trung bình được so sánh dựa vào phân tích ANOVA và kiểm định Duncan (Duncan’s Multiple - Comparison Test) trên phần mềm SPSS 16 (SPSS Inc., Chicago, IL) Khác biệt c ý nghĩa tại giá trị p < 0,05

Kết quả bước đầu cho thấy, sau khi sàng lọc hoạt tính protease của 160 chủng vi nấm biển từ bộ sưu tập vi nấm biển của Nh m Nghiên cứu Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, chúng tôi đã chọn được 24 chủng nấm mốc c hoạt tính phân giải cơ chất protein trên tổng số 38 chủng nấm mốc, chiếm tỉ lệ 63,16% Các chủng nấm men hầu như không c khả năng sinh hoạt tính protease Trong 24 chủng nấm mốc chọn ra 10 chủng c hoạt tính protease cao nhất (c đường kính >13 mm) để nghiên cứu tiếp theo Từ 10 chủng nấm mốc xác định hoạt

độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi đã tuyển chọn ra được một

chủng nấm mốc DW15M c khả năng sinh enzyme protease mạnh và ổn định nhất

Hoạt độ protease của chủng DW15M đạt 0,275 U/ml Chủng DW15M c trình tự gen

ITS1-5.8S-ITS2 tương đồng từ 98,5- 99,5% với các chủng gần nhất của loài

Simplicillium obclavatum và c các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hệ sợi nấm phù

hợp với loài Simplicillium obclavatum, nên c thể thuộc về loài này Điều kiện nuôi

cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất của chủng nấm mốc

Simplicillium obclavatum DW15M trên môi trường nuôi cấy lỏng là nhiệt độ 30C, pH

điều kiện này hoạt độ protease đạt là 1,472 U/ml, gấp gần 6 lần so với hoạt độ ban đầu Việc khảo sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của các chủng vi nấm phân lập được g p phần phát triển bộ sưu tập các chủng vi nấm biển c hoạt tính protease Từ đ , cung cấp dữ liệu khoa học về các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho

sinh tổng hợp protease của vi nấm biển ở Việt Nam, đặc biệt là loài Simplicillium

obclavatum Đồng thời g p phần nhằm định hướng ứng dụng trong công nghiệp

Từ khóa luận văn: protein, protease, vi nấm biển, Vịnh Nha Trang, Vịnh Vân Phong

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Protease là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO- NH-) của chuỗi polypeptide Protease chiếm khoảng 60% thị trường enzyme công nghiệp

(Rao et al., 1998), trong đ , protease từ vi sinh vật chiếm khoảng 40% tổng số enzyme

được bán trên toàn thế giới

Các chủng vi nấm biển được biết đến với khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, lipase, protease và phytase…, trong đ enzyme protease đã được chứng minh c nhiều ứng dụng trong các chất tẩy rửa, chế biến da, thu hồi bạc, các mục đích y tế, chế biến thực phẩm, thức ăn, công nghiệp h a chất cũng như xử lý chất thải…Các chủng vi nấm biển c khả năng chịu được điều kiện môi trường mặn tốt hơn so với các chủng vi nấm trên cạn và chúng đa dạng hơn, phong phú hơn

Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật ở Việt Nam vẫn đang được tiến hành hơn thập niên qua, tuy nhiên những kết quả đạt được trong lĩnh vực này vẫn chưa đáp ứng được việc mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng của nh m enzyme này trong đời sống

Vì vậy, việc tuyển chọn được chủng vi nấm biển c khả năng tổng hợp enzyme protease đ ng vai trò rất quan trọng, là cơ sở bước đầu cho việc xác định tính chất và nghiên cứu khả năng ứng dụng của protease vào thực tế Do đ , chúng tôi tiến hành đề

tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm ở

vùng ven biển Khánh Hòa”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài nhằm sàng lọc các chủng vi nấm biển đã được phân lập từ vùng nước ven biển thuộc tỉnh Khánh Hòa c khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào mạnh và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng này, nhằm định hướng ứng dụng trong công nghiệp

3 Nội dung nghiên cứu đề tài

- Nội dung 1: Sàng lọc các chủng vi nấm biển phân lập ở vùng ven biển Khánh Hòa c khả năng sinh enzyme protease ngoại bào

- Nội dung 2: Tuyển chọn các chủng vi nấm biển c hoạt độ protease cao nhất trong các chủng nghiên cứu

- Nội dung 3: Định danh chủng vi nấm biển bằng phương pháp quan sát hình thái, khuẩn lạc tế bào và giải trình tự đoạn gen ITS - 5,8S- ITS2

- Nội dung 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp về nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ, thời gian nuôi cấy để chủng vi nấm biển cho hoạt tính protease cao nhất

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Việc khảo sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của các chủng vi nấm phân lập được g p phần phát triển bộ sưu tập các chủng vi nấm biển c hoạt tính protease Từ đ , cung cấp dữ liệu khoa học về các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho

sinh tổng hợp protease của vi nấm biển ở Việt Nam, đặc biệt là loài Simplicillium

obclavatum

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài g p phần tuyển chọn chủng vi nấm biển c khả năng sinh enzyme protease mạnh và nhằm định hướng ứng dụng trong công nghiệp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi nấm biển

Vi nấm biển là những loài vi nấm c nguồn gốc từ biển, hay do quá trình trôi dạt từ

đất liền, nước ngọt, qua quá trình thích nghi trở thành vi nấm biển (Jones et al., 2015)

Vi nấm biển hiện nay c khoảng 1112 loài, 472 chi Uớc tính ngành Ascomycota

c 805 loài, 352 chi; ngành Basidiomycota c 21 loài, 17 chi; ngành Chytridiomycota c

26 loài, 13 chi; ngành Zygomycota c 3 loài, 2 chi; ngành Blastocladiomycota c 1 loài,

1 chi; nấm sợi sinh sản vô tính c 43 loài, 26 chi Riêng đối với nấm men biển, ngành Ascomycota c 138 loài, 35 chi; ngành Basidiomycota 75 loài, 26 chi (Jone et al., 2015) Theo Jone và cs (2011), hiện nay gần 100000 loài nấm đã được mô tả, dự báo số lượng nấm biển c thể tăng lên đến 11000 – 12500 loài, và ước tính khoảng 1000 loài mới được miêu tả mỗi năm Theo Andreakis (2015), Thư viện Tài nguyên Sinh học của Viện Khoa học Hàng hải Úc (AIMS Bieresources Library) tổ chức một bộ sưu tập hơn

7000 vi sinh vật, bao gồm 1781 nấm biển c nguồn gốc từ các nguồn khác nhau như

động vật không xương sống, trầm tích và nước biển Một số các công trình nghiên cứu ở

thời điểm hiện tại cho thấy, vi nấm biển xuất hiện ở khắp mọi nơi trong đại dương, từ cộng sinh với thực vật biển, sống ký sinh trên hải quỳ, san hô, bọt biển đến các mẫu trầm tích lẫn sống trôi nổi trên biển (vi nấm biển phù du) (Gao et al., 2010; Kaul et al., 2013; Lili et al., 2014; Blunt et al., 2014)

Vi nấm biển được chứng minh là c vai trò quan trọng trong các chu trình sinh địa h a ở đại dương, g p phần quan trọng trong xử lý ô nhiễm nguồn nước biển và cung cấp chất khoáng cho các sinh vật khác, đồng thời c khả năng sinh enzyme ngoại bào c khả năng phân giải tốt các nguồn cơ chất khác nhau như protein, cellulose, chitin…, và nhiều ứng dụng khác trong công nghiệp, nông nghiệp như sản xuất cồn, baking và các nhiên liệu sinh học khác (Pang and Mitchell 2005; Hill et al., 2006; Matsushika et al., 2008; Gutiérrez et al.,, 2010; Kaul et al., 2013; Lili et al., 2014)

Vi nấm biển được biết đến nhiều nhất với vai trò phân hủy các chất hữu cơ và

đ ng vai trò quan trọng trong việc tái tạo chất dinh dưỡng trong các hệ sinh thái Các nấm sợi phù du c thể làm tăng đáng kể hàm lượng khoáng trong nước bằng việc phân hủy các hợp chất hữu cơ (Tisdall and Oades, 1982; Damare and Raghukumar, 2008)

và do đ đem lại lợi ích cho sự phát triển của các cộng đồng vi sinh vật phù du

(Kirowboe and Jackson, 2001; Gutiérrez et al., 2010) Theo Kaul và cs (2013), vi nấm biển c khả năng sản xuất các hợp chất c hoạt tính sinh học như terpenoid, steroid, quinon, phenol và coumarin c tiềm năng trong chống ung thư, chống oxy h a, các hợp chất kháng virus và côn trùng cho ngành công nghiệp dược phẩm và hoá chất nông nghiệp Một nghiên cứu khác của Lili và cs (2014), vi nấm biển cũng c khả năng sinh enzyme ngoại bào khác nhau như laccase, lipase, cellulaza và đ ng vai trò tích cực của chúng trong chu trình sinh thái của các hệ sinh thái ven biển

Hơn 60% trong số 456 sản phẩm tự nhiên mới của vi sinh vật biển được báo cáo trong 2012, đã được tìm thấy sản sinh bởi nấm (Blunt et al., 2014) Nấm cũng chiếm số lượng cao nhất trong số các hợp chất mới được báo cáo từ các vi sinh vật liên quan đến bọt biển trong những thập kỷ qua (Thomas et al., 2010; Blunt et al., 2014)

Nấm biển phù du bao gồm nấm sợi, nấm men và các sinh vật đơn bào giống nấm, là một bộ phận quan trọng của sinh quyển (Wang and Johnson 2009; Gao et al., 2010) và c một hệ sinh thái riêng biệt với vi khuẩn (Kaul et al., 2013)

Đại dương được coi như một “hồ lớn” của đa dạng sinh học Hệ vi sinh vật trong môi trường biển c mối quan hệ chặt chẽ với nhau, đ ng vai trò quan trọng trong các chu kỳ tuần hoàn vật chất Vi sinh vật phân hủy xác chết và phân hủy chất hữu cơ

Vi nấm biển c thể được coi là một nguồn enzyme c lợi cho công nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường Các chủng vi nấm phân lập từ các nguồn khác nhau, chẳng hạn như động vật không xương sống, gỗ mục nát, nước biển, trầm tích và rừng ngập mặn, là một tiềm năng lớn để sản xuất enzyme thủy phân và các hợp chất oxy h a Các loại enzyme được tổng hợp từ vi nấm biển như alginate lyase, amylase, cellulase, chitinase, glucosidase, inulinase, keratinase, ligninase, lipase, nuclease, phytase, protease và

và pH từ 3.0 đến 11.0 Enzyme từ vi nấm biển được sản xuất bằng cách lên men ở trạng thái nuôi lỏng Trong quá trình sàng lọc đã thu được một số chủng vi nấm biển

c khả năng sinh hoạt tính enzyme chịu kiềm và chịu lạnh và độ mặn Khả năng sinh tổng hợp của vi nấm biến được coi là một chiến lược tiềm năng trong lĩnh vực công nghệ sinh học biển (Rafaella, 2015)

Smitha và cs (2013) đã thực hiện một công trình nhằm nghiên cứu tiềm năng của nấm biển như một nguồn enzyme và kháng sinh Nấm biển (181 loài) được phân lập từ trầm tích lục địa của biển Ả Rập trong chuyến thám hiểm biển của FORV Sagar

Sampada đã đƣợc sử dụng cho nghiên cứu này đƣợc thể hiện trong hình 1.1 Trong

181 chủng này c 60,2% nấm cho thấy hoạt tính lipase, 67,22% cho thấy hoạt tính amylase, 61,11% thể hiện hoạt tính gelatinase, 40,22% cho thấy hoạt tính chitinase và 43,33% cho thấy hoạt tính cellulase Trong số 181 chủng biểu hiện hoạt tính enzyme, 12,2% sản sinh tất cả 5 loại enzyme đƣợc khảo sát Hầu hết nấm biển thể hiện hoạt tính các enzyme protease, amylase và lipase Những chủng phân lập sản xuất lipase

nhiều hơn cả là Penicillium (37%), Aspergillus (32,5%) và Scopulariopsis (14,5%) Sản sinh amylase nhiều hơn cả với Penicilium (39,8%), Aspergillus (22,6%) và

Scopulariopsis (22,4%) Penicillium (30,4%) và Aspergillus (26%) chiếm ƣu thế trong

sản xuất gelatinase

Hình 1.1 Tỉ lệ phần trăm vi nấm biển thể hiện khả năng sản xuất enzyme (Smitha

et al., 2014)

Theo thống kê c khoảng 90% nhiên liệu sinh học bắt nguồn từ vi sinh vật biển

Và vi nấm biển đƣợc xem nhƣ là nguồn sản xuất ra những sản phẩm mới tự nhiên nhƣ các sản phẩm từ sự lên men, sự lọc sinh học và hợp chất điều trị bệnh Hơn 60% của

456 sản phẩm tự nhiên của vi sinh vật biển đƣợc ghi nhận vào năm 2012 thì đƣợc sản xuất bởi vi nấm (Nikos et al,, 2015)

1.2 Protease

1.2.1 Khái niệm protease

Protease là enzyme xúc tác cho sự thuỷ phân liên kết peptide (-CO-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide Sản phẩm của quá trình thuỷ phân này c thể là các axit amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn Nhiều protease còn c thể xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết ester, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc axit amin (Võ Thị Bích Vân, 2010) Phản ứng theo sơ đồ hình 1.2

Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn phản ứng thủy phân protein của protease

Protease rất đa dạng về chức năng và đặc biệt rất cần thiết cho các sinh vật sống nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đến thực vật (đu đủ, sung, dứa ) và động vật từ (gan, tụy, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật c những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau

về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất kh tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật

thường c tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

1.2.2 Phân loại protease

Protease được chia ra làm một số loại dựa trên những đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải ph ng ra một amino axit, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải ph ng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nh m: + Serin protease: là những protease chứa nh m –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và c vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine protease: Các protease chứa nh m –SH trong trung tâm hoạt động Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, c tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nh m pepsin Các aspartic protease c chứa nh m carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo protease: Metallo protease là nh m protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nh m:

- Protease axít : pH 2-4

- Protease trung tính : pH 7-8

- Protease kiềm : pH 9-11

1.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ protease

a) Nguyên lý chung của phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Phát hiện và phân tích một enzyme nào đ gắn liền với việc xác định phản ứng do enzyme xúc tác Các phản ứng do enzyme xúc tác c thể được khái quát và đơn giản

h a bằng phương trình phản ứng chung dưới đây:

Trong đ : E là enzyme, S là cơ chất, ES là phức chất hình thành giữa enzyme và cơ

là phức chất giữa enzyme với cơ chất mà trong đ cơ chất đã được biến đổi thành dạng gần như sản phẩm của phản ứng, P là sản phẩm phản ứng

Hoạt độ enzyme c thể được xác định bằng cách phân tích cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành của phản ứng trong một đơn vị thời gian, hoặc kết hợp cả hai Tùy

theo các đặc trưng của phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp phân tích, yêu cầu về độ chính xác của phép đo cúng như điều kiện của phòng thí nghiệm mà c thể chọn cách xác định nào là thích hợp nhất

Hoạt độ xúc tác của enzyme được tính bằng đơn vị hoạt độ Một đơn vị hoạt độ enzyem được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển h a một micromole cơ chất thành sản phẩm trong thời gian một phút ở điều kiện phân tích (Phan Tuấn Nghĩa, 2012)

b) Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Để phân tích hoạt độ enzyme c thể tiến hành bằng một trong hai cách là phân tích liên tục và phân tích gián đoạn

Phân tích liên tục là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo

thành một cách liên tục theo thời gian Phương pháp liên tục thường hay áp dụng khi không c chất hay cách làm ngưng phản ứng thích hợp hoặc được áp dụng với một số enzyme dễ mất hoạt tính xúc tác ở điều kiện phân tích Ngoài ra, các phương pháp phân tích liên tục còn được dùng phổ biến với các nghiên cứu tác động học enzyme Tuy nhiên, yêu cấu đối với thiết bị đo là phải c bộ phận ổn nhiệt để phản ứng c thể được thực hiện ở các nhiệt độ mong muốn Đây cũng là một hạn chế của phương pháp Ngoài ra, do phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên kh thực hiện phân tích hoạt độ của nhiều mẫu enzyme trong cùng một lúc

Phương pháp phân tích gián đoạn là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ

chất ở điều kiện thich hợp và sau một khoảng thời gian nhất định thì làm ngưng phản ứng enzyme Để làm ngưng phản ứng enzyem, c thể dùng các tác nhân làm bất hoạt enzyme như nhiệt độ cao, thay đổi pH (bổ sung axít hoặc kiềm), dùng chất tạo phức hay khắc phục được những hạn chế của phương pháp đo liên tục, phản ứng c thể tiến hành trong tủ ấm hay bể ổn nhiệt, c thể tiến hành một lúc nhiều mẫu Tuy nhiên, không phải với enzyme nào cũng c cách làm ngừng phản ứng thích hợp, bởi vì chính cách làm ngưng phản ứng c thể ảnh hường đến việc xác định cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo ra hoặc cả hai

Cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành của phản ứng enzyme là hợp chất sinh học Ngoài ra người ta cũng c thể phân tích sự biến đổi của cơ chất hay sản phẩm phản ứng enzyme bằng một số phương pháp khác, ví dụ như phương pháp đo độ nhớt

với các phản ứng mà cơ chất c độ nhớt cao hơn hẳn so với sản phẩm, phương pháp đo

áp suất khí với các phản ứng enzyme c sự tiêu hao hay sinh khí

Trong một số trường hợp, cơ chất và phản ứng của enzyme không khác nhau nhiều về các tính chất để c thể dễ dàng đo được Khi đ , người ta bắt buộc phải thiết

kế những cơ chất phù hợp, đồng thời c thể phối hợp với các phương pháp khác để tách riêng cơ chất và sản phẩm

Ở mức cần khẳng định chắc chắn hơn bản chất của phản ứng c phải là do enzyme xúc tác hay không, người ta thường xử lý nhiệt (đun cách thủy trong 5- 10 phút) Phần lớn các enzyme đều bị mất hay giảm phần lớn hoạt tính xuacs tác sau khi

bị xử lý ở nhiệt độ cao trong khoảng thời gian ngắn, Trong một số trường hợp, c thể dùng các chất ức chế đặc hiệu để giúp khẳng định sự c mặt của enzyme cụ thể trong mẫu phân tích (Phan Tuấn Nghĩa, 2012)

c) Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến

Phương pháp này dựa vào sự thủy phân protein casein 1% bởi enzyme protease Sau đ bất hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng axit tricloroacetic 5-10% Sản phẩm phản ứng sau đ được đem đi lọc để loại bỏ kết tủa và cho phản ứng với dung dịch thuốc thử Folin Trong môi trường kiềm, các axit amin vòng thơm như tyrosin

và tryptophan sẽ phản ứng với thuốc thử Folin (màu vàng tươi) tạo phức màu xanh lơ, hấp

được tính dựa vào đường đường chuẩn tyrosine Hoạt độ enyzme được đánh giá dựa trên hàm lượng tyrosin được giải ph ng theo định nghĩa: 1 đơn vị hoạt độ enzyme là lượng

phương pháp khác nên vẫn được sử dụng phổ biến (Anson, 1938)

Bên cạnh đ , một số phương pháp xác định hoạt độ protease dựa trên nguyên lý

sử dụng các chất phát huỳnh quang cũng được sử dụng Ví dụ phương pháp xác định hoạt độ protein sử dụng cơ chất là casein được gắn với chất phát huỳnh quang là 5-isothiocyanate (FTIC) Khi gắn với casein, tín hiệu huỳnh quang bị dập tắt Enzyme protease xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ chất tạo thành sản phẩm là các peptit nhỏ và các axit amin, giải ph ng chất phát huỳnh quang Cơ chất không bị thuỷ phân được kết tủa bằng axit tricloaxetic (TCA), sau đ loại bỏ kết tủa bằng ly tâm Dịch thuỷ phân sau đ được thu nhận và cường độ huỳnh quang được xác định sử dụng máy đo quang

phổ huỳnh quang Sự gia tăng cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với hoạt động của protease Phương pháp này c ưu điểm là c độ nhạy cao, tuy nhiên đắt tiền và đòi hỏi thiết bị đo quang phổ huỳnh quang do vậy chưa được sử dụng phổ biến ở Việt Nam (Twining, 1984)

1.2.4 Nguồn thu nhận protease

Enzyme protease c thể thu nhận từ các nguồn sau:

C 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu từ

nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa, (Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa

trắng của bia khi làm lạnh do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu h a Ficin thu được từ

nhựa cây sung (Ficus carica) Enzyme thu được sử dụng thủy phân protein tự nhiên

1.2.4.3 Nguồn từ vi sinh vật

Các vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn c khả năng sinh tổng hợp được nhiều

protease, gồm nhiều loại thuộc Aspergillus, Baccillus, Penicillium, clotridium,

Streptomyces và một số loại nấm men

Trong các chủng vi khuẩn c khả năng tổng hợp mạnh protease là Baccillus

subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium

Trong đ , B subtilus c khả năng tổng hợp mạnh protease mạnh nhất (Nguyễn

Trọng Cẩn và cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

* Từ nấm

Nhiều loại nấm mốc c khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng

dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Asperigillus, A terricola, A

fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum)…Các loại nấm mốc này c khả năng

tổng hợp cả ba loại protease c khả năng chịu axit, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease c khả năng chịu axít, thủy phân protein ở pH 2,5-3 (Lương Đức Phẩm, 2004)

Một số nấm mốc khác như: A cadidatus, P cameberti, P roquefori…cũng c

khả năng tổng hợp protease làm đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát

* Xạ khuẩn

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn

và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng c khả năng tổng

hợp protease cao như: Streptomyces, S trerimosus…

C thể n i vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất enzyme ở quy

mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống

1.2.5 Ứng dụng của protease

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp

thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp

1.2.5.1 Công nghiệp thực phẩm

+ Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt

tính làm đông tụ sữa của chúng Ở Nhật Bản, từ canh trường bề mặt của Mucor, người

ta thu được chế phẩm protease dùng trong sản xuất phomat Một số nước cũng thu

được chế phẩm tương tự từ nấm mốc A candidus, hoặc từ B mensentericus

+ Trong sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn bột, giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ xốp

và nở tốt hơn

+ Trong công nghiệp chế biến thịt, đồ hộp, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt c một độ mềm thích hợp và c vị tốt hơn Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, …

+ Trong chế biến thuỷ sản, từ lâu người ta đã nghiên cứu và biết được tác dụng của các enzyme tiêu h a và các enzyme khác c sẵn trong nguyên liệu c tác động tới quá trình thủy phân cá trong sản xuất nước mắm

+ Bên cạnh đ , trong công nghiệp thực phẩm, protease được sử dụng để làm trong bia và nước hoa quả Ngoài ra, protease được sử dụng trong sản xuất rượu, giúp phân giải các protein c tác dụng làm kìm hãm amylase, do đ sẽ làm tăng nhanh quá

trình đường h a tinh bột

1.2.5.2 Công nghiệp nhẹ

+ Protease được sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa, nước lau kính, kem đánh răng

và đặc biệt là trong sản xuất bột giặt, nhằm làm tăng khả năng tẩy rửa các vết bẩn c bản chất protein

+ Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân

một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu h a

của động vật Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B

subtilis), nấm mốc (A oryzae, A flavus) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus ) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một

vị trí quan trọng

+ Trong công nghiêp dệt và sản xuất tơ tằm, protease được sử dụng để làm sạch

tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được xử lí bằng các dung dịch casein, gelatin)

để sợi được được b ng, dễ nhuộm

+ Ngoài ra, protease còn được ứng dụng trong sản xuất mĩ phẩm và hương phẩm

1.2.5.3 Nông nghiệp

Protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu h a và hệ số tiêu h a thức ăn C hai cách sử dụng trộn enzyme vào thức ăn trước khi dùng hoặc xử lý thức ăn với enzyme để chuyển thành dạng dễ tiêu h a rồi mới cho vật nuôi ăn

Kết hợp sử dụng protease với amylase, cellulase để xử lý các phế liệu nông nghiệp, cải tạo đất phục vụ nông nghiệp

Ngoài ra, protease còn được sử dụng để thủy phân trùn quế thành dịch axit amin làm thức ăn cho ấu trùng tôm

Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong các lĩnh vực như xử lý phim quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác, xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm …

X-1.3 Protease từ vi nấm

1.3.1 Protease từ vi nấm

Vi nấm c khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào, rất quan trọng trong công nghiệp sản xuất enzyme thương mại trên thế giới, chiếm khoảng 60% enzyme tổng enzyme bán trên thị trường (Novelli et al., 2016) Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzyme, trong đ phần lớn là enzyme từ thực vật và vi sinh vật Trong đ , nấm mốc c tiềm năng lớn sinh các loại enzyme ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển h a các hợp chất hữu cơ, vô cơ kh tan trong tự nhiên Nấm mốc

c khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào chịu được môi trường c pH rộng hơn

so với protease động vật và vi khuẩn, người ta chia protease nấm mốc thành ba nh m: protease axit, protease kiềm và protease trung tính Nấm mốc c khả năng phân giải

mạnh protein thường gặp thuộc các chi Penicillium, Aspergillus… Protease nấm mốc

thường được dùng nhiều trong sản xuất nước chấm, sản xuất bánh mì, bánh quy… Bùi Xuân Đồng (2000), Nguyễn Xuân Thành và cs (2005)

1.3.2 Cơ chế sinh enzyme protease

Trong quá trình sinh trưởng của vi nấm hấp thụ cơ chất protein và sản sinh ra enzyme protease để phân giải cơ chất Enzyme protease được sản sinh ngoại bào, khả năng sản xuất enzyme ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu trong một khoảng thời gian rất dài Kết quả cho thấy khả năng sinh enzyme của vi sinh vật là vô cùng ấn tượng và ngày càng đ ng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp enzyme trên toàn thế giới Các loại enzyme phổ biến và được ứng dụng rộng rãi như: amylase, protease, cellulase,… Trong đ , vi nấm biển cũng là một đối tượng được quan tâm nghiên cứu bởi tiềm năng ứng dụng của n trong việc sản xuất enzyme ngoại bào và các hợp chất sinh học khác

Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme protease của nấm sợi thì chủng giống vi nấm là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình thành và hàm lượng protease Không phải tất cả các chủng vi nấm đều c khả năng tổng hợp protease như nhau còn phụ thuộc vào quá trình hấp thụ cơ chất protein và tiết ra enzyme ngoại bào protease để phân giải cơ chất này

Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng nấm c khả năng sinh protease cao, cần phải đồng thời tiến hành nuôi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme cao nhất Sau đ , cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cẩn thận để giữ được hoạt tính ban đầu tránh tình trạng giống bị thoái h a do nhiều lần cấy truyền Các yếu tố trong thành phần môi trường ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và

sự tạo thành enzyme của vi nấm Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần đảm bảo đầy

đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại vi nấm (Lương Đức Phẩm, 2004)

Trong môi trường nuôi cấy vi nấm sinh protease nhất thiết phải c nguồn cacbon làm chất cảm ứng Vi nấm c khả năng đồng h a rất nhiều nguồn cacbon khác nhau Nồng độ các nguồn cacbon khác nhau cũng c ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các enzyme riêng biệt của hệ protease (Lương Đức phẩm, 2004)

Nấm sợi cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần đến nguồn nitơ để xây dựng

tế bào Tuy nhiên mỗi loại nấm sợi lại hấp thụ được những nguồn nitơ khác nhau Khi sử dụng nguồn nitơ phù hợp cho vào môi trường c thể kích thích tổng hợp protease

Ngoài ra các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Cu…c vai trò quan trọng tham gia vào thành phần cấu tạo enzyme Một số chất khoáng c vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp enzym protease như: Canxi là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo protease vì n cần cho quá trình tổng hợp và ổn định protease; Magie (Mg) ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của nấm sợi, khi bổ sung phospho hữu cơ vào môi trường sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng môi trường và làm tăng tổng hợp protease; Tuy nhiên, nếu trong môi trường c nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp protease (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Vì vậy trong môi trường nuôi cấy tối thiểu chỉ bao gồm các muối vô cơ và nguồn cacbon là chất cảm ứng (môi trường Czapeck- Dox) kích thích vi nấm phát triển tạo ra enzyme protease để phân giải cơ chất

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme protease của vi nấm

C nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme của vi nấm,

đ là: sự thay đổi nồng độ cơ chất, nhiệt độ, độ pH, chất ức chế, chất cảm ứng…

1.4.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và hoạt động xúc tác các phản ứng sinh h a trong mỗi tế bào vi sinh vật, các phản ứng này chỉ xảy ra ở nhiệt độ nhất định

C,

1.4.2 pH

pH ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng hoạt h a của vi nấm, mỗi loài vi nấm chỉ thích hợp ở một khoảng pH nhất định

N i chung, vi nấm c thể phát triển tốt ở môi trường axit (pH=6) nhưng pH tối

ưu là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9

pH của môi trường nuôi cấy c ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp Nếu giữ pH luôn c giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi nấm sẽ sản sinh ra được lượng lớn enzyme protease

1.4.3 Nguồn dinh dưỡng

Vi nấm không c diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nh m dị dưỡng), một số sống s t và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ Cũng c một

số nh m nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nh m thực vật nhất định

Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho vi nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Nếu các nguyên tố này c trong thành phần các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản thì sẽ được vi nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp vi nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme ngoại bào thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào

+Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon c vai trò quan trọng đối với vi nấm và là cơ chất cần thiết cho quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp

Vi nấm c khả năng đồng h a nhiều nguồn cacbon khác nhau: các hidrat cacbon, các axit hữu cơ, lipit…Nhiều loại vi nấm còn c khả năng đồng h a các chất hữu cơ rất bền hoặc chất độc đối với nhiều sinh vật khác

Các loài vi nấm thường không c những đòi hỏi nghiêm ngặt về các loại thức

ăn cacbon Tuy nhiên, c thể là loại hợp chất này đồng h a tốt hơn loại hợp chất khác

Nguồn cacbon tự nhiên thường được dùng trong nuôi cấy vi nấm là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng Nồng độ gluxit thích hợp cho quá trình tổng hợp protease cũng thay đổi tùy loài vi nấm

Nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy quy mô thí nghiệm, theo tài liệu của Trần Thị Nhã Uyên (2010), c nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với vi nấm sinh protease c hoạt độ cao Các nguồn cacbon c tác dụng đến sựa tổng hợp protease của vi nấm c thể theo thứ tự:

Đối với A flavus: fructose→ glucose→ saccharose→ rhamnose→ mannose→

galactose→ arabinosa→ lactose

Đối với A awamori: fructose→ manito→ saccharose→ arabinose→ manose→

galactose→ lactose

Đối với A oryzae: fructose→ saccharose→ maltose→ glucose→ manito→

arabinosa→ galactose

+Ảnh hưởng của nguồn nitơ (N)

Nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và ảnh hưởng đặc biệt đến quá trình sinh protease vì nguồn nitơ đ ng vai trò là chất cảm ứng của enzyme này

Vi nấm c thể sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là pepton, casein, bột đậu nành, cao nấm men…Trong các nguyên liệu này đều c chứa axit amin tự do Các axit amin làm tăng hoặc giảm quá trình tổng hợp

protease như cystein kìm hãm khả năng sinh protease axit của Aspergillus Khi sử dụng

phối hợp nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease

Đối với một số loài nấm mốc như A oryzae, A awamori, A niger, A flavus

trên môi trường c các nguồn nitơ hữu cơ hoạt độ protease axit cao Trên môi trường

tăng lên 3,5 lần Khi thay tinh bột bằng glucose và bổ sung pepton hoạt độ enzyme tăng 6 lần Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ enzyme được nâng cao khi trong môi trường c đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ theo nghiên cứu của Trần Thị Nhã Uyên (2010)

1.4.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym Trong quá trình nuôi cấy vi nấm, khi vi nấm bắt đầu sinh bào tử là lúc sinh tổng hợp enzyme ngoại bào đạt cực đại Thời gian kết thúc sự tạo thành protease thường từ 100 giờ đến 120 giờ tùy vào chủng vi nấm (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

1.5 Tình hình nghiên cứu enzyme protease từ vi nấm biển trên thế giới và Việt Nam

a Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới c rất nhiều công trình nghiên cứu về chủng vi nấm biển Các vi sinh vật biển c thể sinh ra nhiều loại enzyme khác nhau, được sử dụng rộng rãi, c giá trị cho cuộc sống của chúng ta (Wang et al., 2016)

Enzyme protease từ vi sinh vật đã được nghiên cứu và thu nhận đầu tiên do

người Nhật tên là Takamine Đ là chế phẩm được tách từ chủng nấm mốc Asperillus

oryzae Tiếp theo đ , vấn đề nâng cao khả năng tạo protease của các chủng nấm mốc

ứng dụng cho công nghiệp rượu bia đã được nghiên cứu ở Nhật và ở Mỹ Trong nghiên cứu của Prabakaran và cs (2015) đã nghiên cứu về sàng lọc và sản xuất enzyme protease từ vi nấm biển và ứng dụng trong công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp thuộc da, trong sản xuất mỹ phẩm, dược phẩm, y học,… Ngoài ra, khi nghiên cứu về protease từ vi nấm biển như Kamat (2008) đã khẳng định vi nấm biển là nguồn thu protease, Damare (2006) cũng đã công bố nghiên cứu về chủng vi nấm biển

c hoạt tính protease khả năng kiềm và chịu lạnh từ nước biển sâu ứng dụng trong

(2016) về chủng Aspergillus oryzae CH93 trong sản xuất và tinh khiết chế phẩm sinh học protease Chủng Aspergillus oryzae CH93 được nuôi trên môi trường bán rắn với

Các chủng vi nấm biển ngoài khả năng sinh enzyme protease ngoại bào, còn c khả năng tổng hợp nên một số hoạt tính khác như kháng nấm, kháng vi rút, chống ung thư…ví dụ như: nghiên cứu Liang và cs (2017) đã nghiên cứu về peptit kháng nấm và

kháng virút của chủng Simplicillium obclavatum EIODSF 020 phân lập từ mẫu trầm

tích biển thu thập ở Đông Ấn Độ Dương ( Bắc 10°00, Đông 84°33; độ sâu 4571 m) Cũng như trong nghiên cứu của Ma và cs (2006) về chủng nấm men biển

Aureobasidium pullulans sản xuất peptide c hoạt tính sinh học Protease kiềm ngoại

bào được nuôi cấy từ nấm men biển Aureobasidium pullulans đã được tinh sạch c hoạt

tính protease tăng gấp 2,1 lần so với trong supernatant bằng phương pháp phân tách ammonium sulfate -75) và sắc ký trao đổi anion (Dòng chảy nhanh DEAE Sepharose)

Ngoài nghiên cứu về các chủng vi nấm phân lập từ mẫu nước biển, trên thế giới

c nhiều công trình nghiên cứu về protease của các chủng nấm mốc trên đất liền, chẳng hạn như: trong công bố của Devi và cs (2008) đã nghiên cứu khả năng sinh

enzyme protease của chủng nấm mốc Aspergillus niger Hay nghiên cứu của Souza và

cs (2015) về khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng Aspergillus foetidus

các nguồn nitơ khác nhau

b Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Những năm gần đây, việc nghiên cứu và phân lập các chủng vi nấm trong tự nhiên để thu nguồn enzyme c giá trị là vấn đề đang được khoa học quan tâm nghiên cứu Trong các loại enzyme, protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất

Ở Việt Nam, ngành công nghệ enzyme vẫn chưa thật sự phát triển và đa số các nghiên cứu về enzyme thu được từ các chủng nấm mốc trên đất liền, đặc biệt là các

chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Mucor… như trong

nghiên cứu của Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười (2015) về tuyển chọn dòng

nấm mốc Aspergillus niger c khả năng sinh tổng hợp protease cao Ngoài chủng nấm mốc ra còn c thể thu nhận enzyme protease ngoại bào của Bacillus amyloliquefacien

N1 trong nghiên cứu của Đỗ Thị Bích Thủy (2012)

Tuy nhiên, các chủng nấm mốc này thường tổng hợp enzyme protease mà hoạt động của n bị hạn chế bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH, độ mặn…dẫn đến khả năng ứng dụng còn hạn chế Do đ , để thu được nguồn enzyme protease mới thì chúng ta phải phân lập các chủng mới c trong tự nhiên Một trong những hướng nghiên cứu mới mà khoa học đang quan tâm là tìm các chủng vi nấm được phân lập từ mẫu nước biển

Việt Nam c đường bờ biển dài trên 3000 km và khoảng 3000 hòn đảo ven bờ,

do vậy các loại hình đất ngập nước ven bờ rất phong phú như (rừng ngập mặn, bãi triều lầy, vịnh, ven đảo, cửa sông, rạn san hô ) và c tính đa dạng sinh học cao Do đ , hệ enzyme cũng sẽ rất đa dạng, c nhiều đặc tính quí báu mang lại giá trị kinh tế cao

Hiện tại Việt Nam cũng c nhiều các tài liệu và các công trình nghiên cứu liên quan đến khả năng sinh enzyme protease ngoại bào từ các chủng vi nấm biển, c thể

kể đến một số nghiên cứu và các tài liệu dưới đây:

Theo Trần Thị Nhã Uyên (2010), nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ, luận văn thạc sĩ sinh học, Trường đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh Nghiên cứu đã phân lập được 2 chủng đ là 12CM3.4

Penicillium paxilli và chủng 551LM3 Paecilomyces lilacinus Chủng Penicillium

C, pH 5 Điều kiện cho hoạt độ protease, chất cảm ứng là bột đậu nành, hàm lượng 5%, nhiệt độ

mặn 3%, độ ẩm 65%, pH 5, thời gian 60h Cũng nghiên cứu về rừng ngập mặn Cần Giờ của Võ Thị Bích Vân (2010) đã phân lập được 183 chủng nấm sợi thuộc hai chi

Trichoderma và Fusarium c khả năng sinh enzyme protease mạnh

Thêm một nghiên cứu nữa về khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng vi sinh vật của một số chủng nấm phân lập từ mẫu sinh vật biển Việt Nam của Nguyễn Đình Luyện

và cs (2012) Phân lập được 38 chủng vi nấm biển c nguồn gốc khác nhau như trầm tích và các sinh vật biển Kết quả cho thấy, 23 trong số 38 chủng c khả năng ức chế

sự phát triển của các vi sinh vật kiểm định bao gồm 4 chủng c hoạt tính ức chế mạnh lên ít nhất 5 vi sinh vật kiểm định bao gồm cả vi khuẩn, nấm mốc và nấm men Đáng chú ý là cả 9 chủng nấm phân lập từ bọt biển đều c hoạt tính kháng vi sinh vật, và 6 trong số 11 chủng từ mẫu trầm tích biểu hiện hoạt tính Kết quả bước đầu cho thấy nấm biển c khả năng cho khai thác các chất c hoạt tính kháng vi sinh vật, vốn thường được sử dụng từ vi sinh vật đất liền

Ngoài các chủng nấm mốc được phân lập từ mẫu nước biển c khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào, còn c các chủng vi khuẩn cũng c khả năng sinh enzyme protease theo như nghiên cứu của Đỗ Mạnh Hào và Phạm Thế Thư (2010) Kết quả nghiên cứu cho thấy từ 50 mẫu nước và trầm tích vùng ven biển Hải Phòng đã phân lập được 65 chủng vi khuẩn điển hình thuộc 31 loài, 16 chi, 8 họ và 2

bộ Nhiều chủng vi khuẩn c hoạt tính nitrat hoá, phản nitrat, phân giải protein, tinh bột và khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phạm vi, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi nấm biển sinh enzyme protease được phân lập từ các mẫu nước biển ven bờ ở Vịnh Nha Trang Sau đ chọn ra một chủng

c hoạt tính protease cao nhất trong số các chủng phân lập để nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất cho sinh tổng hợp protease

* Phạm vi nghiên cứu: đề tài tập trung khảo sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của 160 chủng vi nấm biển được phân lập tại 11 vị trí thu mẫu ở Vịnh Nha Trang và Vịnh Vân Phong thuộc bộ sưu tập vi nấm biển của nh m nghiên cứu Vi sinh, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 07/2017 đến 07/2019 tại Phòng thí nghiệm Vi sinh và Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Chủng vi nấm biển

Tổng số 160 chủng vi nấm biển phân lập tại Vịnh Nha Trang được cung cấp bởi

nh m nghiên cứu Vi sinh, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang Các chủng vi nấm biển được bảo quản ở ống thạch nghiêng trong điều

và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang (Bảng PL1)

2.2.2 Hóa chất

2.2.2.1 Oligonucleotide

Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR nhằm khuếch đại và giải trình tự đoạn gen ITS1F_KYO2 và ITS4 của chủng nấm nghiên cứu được tổng hợp bởi công ty Phù Sa, Việt Nam Trình tự và các thông số của 2 mồi được trình bày trong Bảng 2.1

2.2.2.2 Môi trường nuôi vi nấm

 Môi trường thạch PDA (Potato Dextrose Agar), Difco (MT 1) để hoạt

Cách pha: Pha 39 g bột môi trường PDA trong 1 lít nước cất Hấp khử trùng ở

Tài liệu

Sản phẩm PCR

dự kiến (bp)

Mồi

xuôi ITS1F_KYO2

TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-

5’-3’

53,5

(Toju

et al., 2012)

5’-3’

56,4

(White

et al., 1990)

 Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose, Difco) (MT2) để hoạt

kháng sinh ampicillin (0,05%) và streptomycin sulfate (0,075%) Đối với môi trường YPD agar, ngoài các thành phần trên, bổ sung thêm 15 g agar cho 1 lit môi trường

 Môi trường Czapek- Dox thạch (cải tiến) để sàng lọc sơ bộ khả năng sinh

Cách pha: Cân 10 g sữa gầy pha trong 500 ml nước cất (đã được làm ấm ở nhiệt

các thành phần còn lại vào bình chứa dung dịch skim milk khuấy đều hỗn hợp, tiếp tục cho 15 g agar vào khuấy đến khi hỗn hợp tan đều Sau đ điều chỉnh pH = 7,5 ± 0,2 và

 Môi trường Czapeck- Dox lỏng (cải tiến) dùng cho sinh tổng hợp enzyme

Cách pha: Cân 10 g sữa gầy pha trong 500 ml nước cất (đã được làm ấm ở nhiệt

đều hỗn hợp, sau đ tiếp tục cho FeSO4.7H2O vào bình trên khuấy cho đến tan đều Cuối cùng thêm nước cất vào bình trên cho đến đủ 1000 ml Tiến hành điều chỉnh pH

2.2.2.3 Thiết bị chuyên dụng

- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

- Cân phân tích BL 3200H (Shimadzu, Nhật)

- Tủ âm sâu DF 9007 (Labkorea, Hàn Quốc)

- Tủ cấy (Telstar AV 100, Tây Ban Nha)

- Tủ sấy ED115 (Binder, Đức)

- Nồi hấp khử trùng (Sturdy industrial Co., Ltd, Đài Loan)

- Lò vi s ng (LG, Hàn Quốc)

- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)

- Tủ ấm Binder BF115 (Binder, Đức)

- Máy đo quang phổ UV-VIS Dr6000 (Hach, Mỹ)

- Máy lắc nước 1205SW2 (Vision, Hàn Quốc)

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát và bố trí thí nghiệm

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát được thể hiện ở hình 2.1

2.3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc sơ bộ khả năng sinh enzyme ngoại bào bằng phương pháp đo đường kính phân giải protease

Chuẩn bị môi trường cảm ứng sinh tổng hợp enzyme protease (MT3) trong bình

kháng sinh ampicillin (0,05%) và streptomycin sulfate (0,075%) Dùng các đĩa petri vô trùng (sấy ở 160ºC trong 120 phút) c kích thước bằng nhau, r t 20 ml môi trường từ bình tam giác vào mỗi đĩa, để nguội, bảo quản trong tủ ấm 37ºC sau 2 ngày kiểm tra sự tạp nhiễm Cấy chấm điểm (1 điểm) chủng nấm mốc và cấy vạch (3 vạch) chủng nấm men nghiên cứu vào đĩa, ủ ở nhiệt độ phòng (28ºC) Sau 5 ngày lấy các đĩa petri ra để

đo đường kính phân giải protease, chọn 10 chủng c khả năng sinh enzyme ngoại bào mạnh, được thể hiện theo sơ đồ hình 2.2 và hình 2.3

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu

Các chủng vi nấm biển

Tuyển chọn chủng vi nấm dựa trên việc xác

định hoạt độ enzyme protease bằng phương

pháp Anson cải tiến

Chọn 01 chủng c hoạt tính enzyme protease

mạnh và ổn định nhất

Xác định điều kiện thích hợp cho

khả năng sinh tổng hợp enzyme protease

Sàng lọc sơ bộ khả năng sản sinh enzyme

protease ngoại bào bằng phương pháp đo

đường kính vòng phân giải protease Chọn ra

10 chủng c hoạt tính protease mạnh

Hoạt hoá các chủng vi nấm biển trên môi

trường thạch PDA hoặc YPD

Định danh chủng

vi nấm

Giải và phân tích trình tự gen

PCR khuếch đại đoạn gen ITS1-5,8S- ITS2

Tách chiết DNA tổng số

Quan sát hình thái khuẩn lạc và

Thời gian nuôi cấy

Nhiệt độ

nuôi cấy

Nguồn nitơ hữu

cơ và vô

cơ