Đánh giá hiệu quả bảo vệ của piscivac irido si phòng bệnh cá mú ngủ do iridovirus gây ra ở cá mú nuôi

Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu về tính vô khuẩn, đánh giá độ an toàn và hiệu quả bảo vệ của vaccine đối với cá mú trân châu khi công cường Iridovirus ở thời điểm kháng thể đạt gi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Kim Cúc

Sinh viên thực hiện : Phan Thị Hoài Thi

Mã số sinh viên : 58131242

Khánh Hòa – 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi nhờ vào sự tìm hiểu, học hỏi, mọi sự giúp đỡ và các thông tin trích dẫn đã được nêu rõ nguồn gốc Các kết quả trong luận văn nằm trong nghiên cứu của

TS Trần Vĩ Hích mà tôi là một thành viên tham dự và được cho phép sử dụng tất cả các số liệu nghiên cứu dùng cho luận văn tốt nghiệp của mình,

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả thu được trong luận văn là trung thực

và chưa được công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác

Nha Trang, ngày 11 tháng 8 năm 2020

Sinh viên thực hiện

Phan Thị Hoài Thi

LỜI CẢM ƠN

Thời gian làm khóa luận là khoảng thời gian vô cùng đáng quý đối với tôi bởi nhờ đó mà tôi đã học hỏi được nhiều kinh nghiệm bổ ích, tích lũy thêm kiến thức cho bản thân Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cá nhân, tố chức đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến mái trường Đại học Nha Trang,

là nơi tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và rèn luyện trong suốt bốn năm qua; quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường cùng với các thầy cô bộ môn, những người đã cho tôi nền tảng kiến thức, những bài học, những kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành tốt bài khóa luận

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GVHD ThS Nguyễn Thị Kim Cúc, người đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn Giám đốc Trần Vĩ Hích Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản về sự chỉ bảo, hỗ trợ kinh phí, cơ sở vật chất trong quá trình thí nghiệm, cùng các anh chị, em và các bạn tại đây đã nhiệt tình giúp đỡ tôi, cho tôi những ý kiến bổ ích

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn hai cô cố vấn học tập và tập thể 58 Công nghệ Sinh học đã đồng hành cùng tôi suốt bốn năm học qua, với những tình cảm, kỷ niệm

và cho tôi học hỏi được nhiều điều trong cuộc sống

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, bố mẹ, anh chị em

đã ở bên ủng hộ và động viên tôi

Do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế, mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng không tránh khỏi những sai sót nhất định Tôi rất mong nhận được sự quan tâm, góp ý của quý thầy cô, anh chị và các bạn để khóa luận hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn! SV: Phan Thị Hoài Thi

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Bệnh cá mú ngủ do Iridovirus đang hoành hành và gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế thủy sản cũng như phát triển bền vững nghề nuôi cá mú Do đó, đề tài được thiết lập nhằm đánh giá hiệu quả bảo vệ của vaccine Piscivac irido Si ở cá mú trân châu nói riêng và họ cá mú nói chung Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu về tính vô khuẩn, đánh giá độ an toàn và hiệu quả bảo vệ của vaccine đối với cá mú trân châu khi công cường Iridovirus ở thời điểm kháng thể đạt giá trị cao nhất Kết quả cho thấy vaccine hoàn toàn vô khuẩn, an toàn, không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và không gây bất thường nào ở cá mú Tại thời điểm công cường độc, giá trị mật độ quang trung bình biểu thị nồng độ kháng thể kháng Iridovirus đạt 0,83 và cho hệ số bảo vệ (RPS) trung bình của vaccine là 73%

Từ khóa: Cá mú, bệnh cá mú ngủ, Iridovirus.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

TRÍCH YÊU LUẬN VĂN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG i

DANH MỤC CÁC HÌNH ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình nuôi cá mú trong và ngoài nước 3

1.1.1 Vài nét về đặc điểm cá mú 3

1.1.2 Tình hình nuôi cá mú trên thế giới 4

1.1.3 Tình hình nuôi cá mú ở Việt Nam 5

1.2 Bệnh cá mú ngủ do Iridovirus 6

1.2.1 Tác nhân gây bệnh 6

1.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 7

1.2.3 Lan truyền và phân bố bệnh 7

1.2.4 Chẩn đoán bệnh Iridovirus 8

1.2.5 Phương pháp phòng ngừa bệnh 9

1.2.6 Tình hình nghiên cứu dịch bệnh cá mú ngủ trên thế giới và Việt Nam 9

1.3 Vaccine phòng ngừa bệnh trong nuôi trồng thủy sản 10

1.3.1 Vaccine và nguyên lý của việc sử dụng vaccine 10

1.3.2 Tiêu chuẩn của vaccine 12

1.3.3 Vai trò của vaccine trong nuôi trồng thủy sản 14

1.3.4 Các phương pháp đưa vaccine vào cá 15

1.3.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới 17

1.3.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vaccine ở Việt Nam 20

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.1.2 Hóa chất, môi trường 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Chuẩn bị cá thí nghiệm 24

2.2.2 Kiểm tra độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá mú 25

2.2.3 Kiểm tra hiệu quả bảo vệ của vaccine phòng bệnh cá mú ngủ do Iridovirus 27 2.2.4 Xử lý thống kê số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Độ an toàn của vaccine thứ nghiệm đối với cá mú 34

3.1.1 Kết quả sự vô khuẩn của vaccine thử nghiệm 34

3.1.2 Ảnh hưởng của vaccine đến sự tăng trưởng của cá mú 34

3.1.3 Ảnh hưởng của việc tiêm vaccine đối với cơ thể cá mú 36

3.2 Hiệu lực bảo vệ của vaccine thử nghiệm đối với cá mú 38

3.2.1 Kết quả đánh giá nồng độ kháng thể cá chống lại Iridovirus thông qua chỉ số OD450nm 38

3.2.2 Hiệu lực bảo vệ của vaccine thử nghiệm 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC PL1 Phụ lục 1 Kết quả thí nghiệm an toàn PL1 Phụ lục 2 Kết quả thí nghiệm đánh giá hiệu quả bảo vệ PL2

i

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số vaccine được cấp phép dùng trong nuôi trồng thủy sản 19 Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm công cường Iridovirus vào ngày thứ 25 sau gây miễn dịch 41

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu quả bảo vệ của vaccine 28

Hình 3.1 Kiểm tra sự vô khuẩn của vaccine trên TSA và PYGA 34 Hình 3.2 Sự thay đổi về chiều dài cá mú ở hai nhóm thí nghiệm 35 Hình 3.3 Sự thay đổi về khối lượng cá mú ở hai nhóm thí nghiệm 36

Hình 3.5 Nồng độ kháng thể của cá tiêm vaccine và cá đối chứng thông qua giá trị

OD450nm ở hai lần thí nghiệm 38

Hình 3.7 Kết quả chẩn đoán Iridovirus cá chết bằng ELISA 40 Hình 3.8 Tỉ lệ tử vong tích lũy trung bình ở cá mú sau khi công cường Iridovirus ở hai lần thí nghiệm với nhóm đối chứng và nhóm tiêm vaccine 41

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ

1

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản là một ngành công nghiệp toàn cầu đang phát triển và ngày càng lớn mạnh với tốc độ tăng trưởng trung bình hằng năm khoảng 6% trên toàn thế giới (Dhar et al., 2014) Trong đó, cá mú là loài mang lại giá trị kinh tế cao không chỉ trong nước mà còn ở nhiều nước trên thế giới Với những đặc điểm ưu việt như lớn nhanh, chất lượng thịt ngon, cá mú là đối tượng đang được chú ý và ưa chuộng trên thị trường Cùng với đó, quy mô nuôi trồng cá mú đang ngày càng mở rộng nhanh chóng ở các tỉnh ven biển Việt Nam với 80% lồng và khoảng 500 ha ao đìa dùng cho nuôi cá mú (Lê Anh Tuấn, 2004)

Dù vậy, với sự phát triển này đòi hỏi nuôi trồng thủy sản cũng như nghề nuôi

cá mú phải đối mặt nhiều thách thức Trong số những thách thức hạn chế sản xuất, bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn và gây ra thiệt hại nặng nề Các tác nhân chính gây bệnh truyền nhiễm cho cá mú nuôi gồm có vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm Bệnh cá mú ngủ do Iridovirus gây ra đã làm tổn thất nhiều đến kinh tế nuôi trồng thủy sản, điều này đe dọa nghiêm trọng sự phát triển bền vững của nghề nuôi cá mú nói riêng và nuôi trồng thủy sản nói chung

Một cách tiếp cận để phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả đó là việc tiêm phòng vaccine Tuy nhiên, hiện chưa có vaccine thương mại điều trị bệnh này ở

cá mú Được biết, một loại vaccine có tên Piscivac irido Si do công ty Kyoritsu Seiyaku sản xuất có khả năng chống lại Iridovirus dành cho cá chẽm cũng gây bệnh cá ngủ do Iridovirus Bên cạnh đó, một nghiên cứu của Gibson – Kueh và cộng sự (2004) đã báo cáo kích thước và phản ứng của Iridovirus cá mú với Iridovirus cá chẽm (RSIV – Red Sea bream Iridovirus) thông qua sử dụng bốn mồi RSIV cho phản ứng PCR rất giống nhau Sự tương đồng về kháng nguyên và di truyền giữa các Iridovirus cũng được chứng minh bởi Nakajima và cộng sự (1998), Hyatt và cộng sự (2000)

Do đó, đề tài này được thiết lập nhằm đánh giá an toàn và hiệu quả bảo vệ của

loại vaccine này đối với cá mú nhiễm Iridovirus với tiêu đề “Đánh giá hiệu quả bảo

vệ của Piscivac Irido Si phòng bệnh cá mú ngủ do Iridovirus gây ra ở cá mú nuôi”

2

Các nội dung chính đề tài:

1 Đánh giá tính an toàn của vaccine Piscivac irido Si đối với cá mú

2 Đánh giá hiệu quả bảo vệ của vaccine phòng bệnh cá mú ngủ

Ý nghĩa của đề tài:

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của luận văn là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

về vaccine và sản xuất vaccine phòng trị bệnh cá mú ngủ do Iridovirus gây ra ở

cá mú nuôi

Ý nghĩa thực tiễn: Sự thành công của luận văn là tiền đề trong việc sử dụng

vaccine thích hợp dùng cho bệnh cá mú ngủ do Iridovirus, góp phần làm giảm lượng kháng sinh và hoá chất, tránh ô nhiễm môi trường, thúc đẩy phát triển bền vững và an toàn cho ngành nuôi trồng thủy sản

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nuôi cá mú trong và ngoài nước

1.1.1 Vài nét về đặc điểm cá mú

Cá mú (Seranidae) là một trong 8 họ có số lượng loài lớn nhất của bộ cá Vược (Perciformes) (Nelson, 2006) Theo báo cáo của Fishbase năm 2014, họ cá mú đã được phát hiện lên đến 75 giống gồm 536 loài (Trần Công Thịnh và cs., 2015), trong

đó phân họ Epinephelinae chiếm phần lớn và phân bố rộng rãi, có đến 90% tổng sản lượng khai thác của họ cá này (Võ Văn Quang, 2018) Chúng có tên gọi khác là cá song và tên tiếng anh là grouper Cá mú được tìm thấy và phân loại theo hệ thống của Lindberg và Krasyukova (1969) như sau:

Ngành: Chordata

Lớp: Pisces

Bộ: Perciformes Họ: Serranidae Phân họ: Epinephelinae

Giống: Epinephelus Loài: Epinephelus spp

Thân mình cá mú thuôn dài, hơi dẹp về hai bên, miệng rộng và chếch, hàm dưới hơi nhô ra so với hàm trên, có nhiều răng nhọn, sắc, nhỏ Một trong những điểm

để phân biệt các loài cá mú qua hình thái bên ngoài đó là màu sắc trên cơ thể chúng

Ở điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển khác nhau của cá mú dẫn đến sự thay đổi màu sắc (Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương, 2006)

Cá mú sống chủ yếu ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới trong các hang đá, các rạn san hô, bụi rong, ở các vùng nước ven bờ, cửa sông, quanh các đảo cho tới vùng biển sâu 70 – 80 m (Đào Mạnh Sơn và Đỗ Văn Nguyên, 1998) Phổ nhiệt độ hoạt động thích nghi của cá từ 22 – 28°C nhưng thích hợp nhất từ 25 – 28°C Khi

4

nhiệt độ giảm xuống 18°C, cá bắt đầu kém ăn và gần như nằm im nếu nhiệt độ giảm xuống còn 15°C Khoảng pH thích ứng là 7,0 – 9,0 tuy nhiên 7,5 – 8,5 là khoảng pH tốt nhất cho sự sinh trưởng của cá Chúng sống trong môi trường nước biển độ mặn rộng từ 11 – 41‰ (Nguyễn Thị Thanh và Phạm Thị Dung, 2018)

Đây là một giống cá ăn thịt, có tập tính rình mồi và thường hoạt động vào ban đêm Trong môi trường sống ngoài tự nhiên, lúc còn nhỏ, chúng ăn động vật phù du nhưng khi lớn hơn khoảng 8 cm thì ăn cá con, tôm, cua,… Tuy nhiên, khi được thuần dưỡng trong điều kiện nuôi, cá có thể ăn được vào ban ngày (Lê Trọng Phấn, 1993; Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương, 2006; Nguyễn Thị Thanh và Phạm Thị Dung, 2018)

Một đặc điểm khá thú vị ở cá mú đó là sự chuyển đổi giới tính trong cùng một

cơ thể cá Cá có chiều dài nhỏ hơn 45 – 50 cm hầu như là cá cái, cá tiếp tục sinh trưởng đến 66 – 72 cm thường xuất hiện hiện tượng lưỡng tính, nhưng trên 74 cm và nặng trên 11 kg lại trở thành cá đực Thời điểm biến đổi này phụ thuộc từng loài và điều kiện môi trường sống Cá mú có thể đẻ quanh năm, nhưng tập trung vào những tháng mùa lạnh, nhiệt độ thấp, vì thế tùy từng vùng khác nhau mà mùa vụ hình thành

cá giống cũng khác nhau Sức sinh sản của cá mú khá cao, mỗi con cái có thể đẻ từ vài trăm nghìn đến vài triệu trứng (Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương, 2006; Nguyễn Thị Thanh và Phạm Thị Dung, 2018)

1.1.2 Tình hình nuôi cá mú trên thế giới

Cá mú phân bố rộng rãi từ Ấn Độ Dương đến Thái Bình Dương (Lê Văn Thắng

và cs., 2016), là những loài cá có giá trị kinh tế cao, với chất lượng thịt ngon Năm

2008, sản lượng cá mú nuôi ở khu vực Châu Á – Thái Bình Dương đạt 75 nghìn tấn (FAO, 2014) Theo thống kê năm 2003, sản lượng cá mú nuôi trên toàn thế giới lên đến 54.000 tấn Chỉ riêng khu vực Đông Nam Á (không tính Indonesia), tổng sản lượng cá mú nuôi hằng năm là 23.000 tấn, khoảng 80% sản lượng này dựa vào nguồn giống sinh sản tự nhiên và 20% từ nguồn nhân tạo Ước tính để sản xuất ra số lượng

cá đó thì cần khoảng 65 triệu cá bột (Sadovy, 2000)

5

Cá mú được nuôi trong các lồng bè và ao đìa ở Thái Lan, Malaysia, Singapore, Trung Quốc,… trong đó Trung Quốc là nơi cung cấp lượng cá mú nhiều nhất với 65% tổng sản lượng Cá lớn nhanh và đạt kích thước thương phẩm trong 6 – 8 tháng (Nguyễn Văn Thái, 2005) Phần lớn các loài cá thuộc họ Serranidae đều có giá trị cao trên thị trường cá tươi sống ở Singapore, Nhật Bản, Hồng Kông, Trung Quốc,… và

cả Việt Nam Với tiềm năng lợi nhuận lớn và giá trị thương phẩm cao nên việc phát triển nuôi cá mú được quan tâm nhiều trên thế giới, nhất là ở khu vực Châu Á – Thái Bình Dương (Lê Anh Tuấn, 2004)

1.1.3 Tình hình nuôi cá mú ở Việt Nam

Để đáp ứng nhu cầu thị trường và tránh cạn kiệt nguồn cá mú tự nhiên, nghề nuôi cá mú ở nước ta đã hình thành và ngày càng phát triển mạnh, dọc theo bờ biển

từ Bắc vào Nam, tập trung chủ yếu ở vùng biển các tỉnh như: Quảng Ninh, Hải Phòng, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu,…(Võ Văn Quang và cs., 2012) Theo

Bộ Thủy sản Việt Nam năm 2003, sản lượng nuôi cá mú hằng năm lên đến 3.000 tấn, đạt giá trị kinh tế khoảng ba trăm tỉ đồng; số lồng nuôi cá mú chiếm phần lớn trong khoảng 6.800 lồng nuôi cá biển với hơn 500 ha ao đìa (Lê Anh Tuấn, 2004)

Nhu cầu về giống cá mú trong nuôi trồng ước tính từ ba triệu đến năm triệu con/năm Tuy nhiên, phần lớn được khai thác từ tự nhiên, nhân giống nhân tạo chỉ đáp ứng được một phần nhỏ (Lê Anh Tuấn, 2004) Cá giống được đánh bắt từ các nguồn tự nhiên hoặc nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Indonesia, Ở Việt Nam có một

số nơi có thể sản xuất giống cá nhưng nguồn cung cấp không nhiều (dưới 1 triệu con/ năm) như ở phía bắc có Viện Nuôi trồng Thủy sản I, ở miền trung có Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III và Đại học Nha Trang, khu vực phía nam Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II (Pomeroy et al., 2002) Tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn đang thực hiện với quy mô nhỏ, chủ yếu là các hộ gia đình

Các loài cá mú thường được nuôi ở Việt Nam: cá mú chấm đen (Epinephelus malabaricus), cá mú chấm nâu (E coioides), cá mú chấm đỏ (E akaara), cá mú blee- ker (E bleekeri), cá mú sáu sọc (E sexfasciatus), cá mú chấm tổ ong (E merra), cá

6

mú mỡ (E tauvina), cá mú nghệ (E fuscoguttatus),…(Đào Mạnh Sơn và Đỗ Văn

Nguyên, 1998; Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương, 2006)

Với sự phát triển ngày càng lớn mạnh trong việc nuôi cá mú, không tránh khỏi những thách thức về dịch bệnh truyền nhiễm hiện đang xảy ra như nhiễm virus, vi khuẩn, ký sinh trùng và nấm Một số bệnh do virus là nguồn lây nhiễm nghiêm trọng gây tử vong nặng ở cá mú Trong hầu hết các trường hợp mắc bệnh, giai đoạn ấu trùng là giai đoạn dễ bị tổn thương nhất Với bản tính ăn thịt của cá mú, chúng có thể

dễ dàng nhiễm virus từ thức ăn mang mầm bệnh virus Hơn nữa, virus có thể ảnh hưởng đến việc truyền dọc từ cá bố mẹ có khả năng mang virus (Nagasawa and Cruz-Lacierda, 2004)

Trên thế giới, bệnh nhiễm virus thường gặp ở cá mú xảy ra nhiều như bệnh hoại tử thần kinh do Piscine Nodavirus (VNN – Viral Nervous Necrosis) gây bệnh

cho cá mú E akaara và E fuscoguttatus ở Đài Loan (Chi et al., 1997), E malabaricus

ở Thái Lan (Danayadol et al., 1995),… và bệnh do Iridovirus như bệnh ở tế bào lympho, bệnh mụn rộp,… Trong đó bệnh cá mú “ngủ” do Iridovirus đã gây tử vong hàng loạt cá mú và làm tổn thất nặng nề ban đầu ở Singapore (Chua et al., 1994), Đài Loan (Chou et al., 1998),… ở các lồng nuôi trên biển

1.2 Bệnh cá mú ngủ do Iridovirus

1.2.1 Tác nhân gây bệnh

Bệnh cá mú ngủ do Iridovirus, một loài thuộc chi Ranavirus có tên là Grouper

Iridovirus (GIV) gây nên (Murali et al., 2002) GIV còn có tên gọi khác là Grouper Iridovirus of Taiwan (TGIV) và Singapore grouper Iridovirus (SGIV) (Nakajima, 2003) Iridovirus có cấu trúc đa diện với 20 mặt tạo thành khối hình cầu, đường kính

vỏ bao quanh là 220 – 240 nm và đường kính nhân 130 – 160 nm Trung tâm của lõi bên trong là DNA thẳng mạch kép được bao bọc bởi 2 lớp vỏ cấu tạo bằng capsid và ngoài cùng có riềm lông tơ (Chinchar et al., 2017), có kích thước xấp xỉ 140 kb (Jancovich et al., 2010)

Có một sự nhầm lẫn trong các tài liệu vì một bệnh có biểu hiện lâm sàng tương

7

tự, được mô tả ở cá mú chấm nâu vào năm 1993 ở Thái Lan Virus này được chỉ định gây ra bệnh Grouper Sleepy Disease Iridovirus (GSDIV) và khác với GIV Sau đó,

được xác định là có liên quan chặt chẽ với loài RSIV thuộc chi Megalocytivirus

(Sudthongkong et al., 2002) Virus xâm nhiễm và ký sinh chủ yếu ở các vị trí như gan, thận, lá lách của cá mú

mở của xương nắp mang liên tục để lấy oxi trong không khí (Đỗ Thị Hòa và cs., 2004)

Khi kiểm tra mô bệnh học, lá lách phình to, tím tái và nhận thấy có sự hoại tử nhiều cơ quan đặc biệt là lá lách Sự phá vỡ màng tế bào lá lách hình elip cùng sự thoái hóa của chúng, cô đặc nhiễm sắc thể, rã nhân tế bào và giảm mô tạo máu ở các

cơ quan tạo máu Hoại tử hệ lưới nội mô của thận và virus xâm nhập vào đại thực bào cũng được quan sát thấy (Hick et al., 2016) Lá lách và tiểu thể thận đóng vai trò quan trọng là nơi lây nhiễm và sao chép GIV (Peng et al., 2015)

1.2.3 Lan truyền và phân bố bệnh

Cá mú nhiễm bệnh có thể tử vong khoảng 12 – 24h sau khi đã bỏ ăn, chủ yếu xảy ra vào ban đêm hoặc vào sáng sớm Cá được tiêm virus thí nghiệm sẽ phát triển các triệu chứng của bệnh và chết sau 3 – 4 ngày Bệnh thường ảnh hưởng đến cá mú nuôi khi đạt kích cỡ 100 – 200 g/con và cá trưởng thành 2 – 4 kg/con (Nagasawa and Cruz-Lacierda, 2004)

Đây là một bệnh thường gặp ở giống Epinephelus như E tauvina, E malabaricus, E coioides Bệnh cá mú ngủ ở cá mú chấm đen và cá mú chấm nâu cho

thấy tống số tử vong tích lũy lên tới 90% trong khoảng 4 tuần (Qin et al., 2003) Khi bệnh cấp tính có thể gây chết 50% cá trong ao, lồng (Nagasawa and Cruz-Lacierda,

2004) Mặt khác, theo báo cáo của Peng và cộng sự (2015), tỉ lệ tử vong ở cá mú E

8

lanceolatus đạt tới 81% sau 5 ngày cho nhiễm bệnh bằng cách tiêm vào màng bụng

Thông thường, tỉ lệ tử vong liên quan đến bệnh do GIV là từ 30 – 100% tùy thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có độ tuổi của cá (Hick et al., 2016)

Tại Việt Nam, Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2004) đã báo cáo sự xuất hiện bệnh có dấu hiệu lâm sàn giống cá mú ngủ tại vịnh Hạ Long trong các lồng nuôi cá mú Bệnh thường xảy ra vào tháng 3 đến tháng 8 hằng năm

1.2.4 Chẩn đoán bệnh Iridovirus

Các dấu hiệu bệnh lý như đã mô tả ở phần trên chỉ chẩn đoán bệnh sơ bộ, nhưng để có kết quả chính xác hơn cần phải thực hiện các phương pháp chẩn đoán khác như: phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM – Transmission Electron Microscope), phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), phương pháp ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay),…

Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua: Phương pháp cho phép quan sát mẫu vật ở cấp độ phân tử hoặc thậm chí nguyên tử với độ phân giải rất cao nhờ sử dụng chùm tia điện tử năng lượng cao, mở rộng phạm vi độ phóng đại lên đến hàng triệu lần (Alberti and Nuzzaci, 2007) Chinchar và Mao (2000) phân loại tác nhân gây bệnh ở động vật máu lạnh thuộc họ Iridoviridae nhờ phương pháp này Qin và cộng

sự (2002), (2006) đã sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua để quan sát kháng nguyên Iridovirus trong nghiên cứu của mình

Phương pháp PCR: PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác đoạn DNA đích trong mẫu nghiên cứu từ đó thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen trong tế bào với độ chính xác cao DNA đích sau khi khuếch đại được xác định thông qua điện di gel, giải trình tự gen,… (Nguyễn Văn Duy, 2013) Phương pháp sử dụng chẩn đoán phát hiện RSIV ở cá chẽm bệnh (Oshima et al., 1998), phát hiện TGIV (Chao et al., 2002), White Sturgeon Iridovirus (WSIV) (Kwak et al., 2006),…

Phương pháp ELISA: Phương pháp này dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Enzyme này khi bổ sung cơ chất sẽ thủy phân cơ chất dẫn đến thay đổi màu sắc Nếu xuất hiện

9

màu tức là có phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể, từ đó thông qua đo mật độ màu để xác định nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Đây là phương pháp cho kết quả nhanh chóng, tiết kiệm, dễ thực hiện và độ nhạy cao (Kennedy, 2005) ELISA được sử dụng trong chẩn đoán Iridovirus như Chao và cộng sự (2002) phát hiện TGIV ở Đài Loan, Shi và cộng sự (2003) phát hiện GIV, Qin và cộng sự phát hiện SGIV năm 2002,…

1.2.5 Phương pháp phòng ngừa bệnh

Với khả năng lây nhiễm và tỉ lệ tử vong cao do bệnh cá mú ngủ gây ra, các hộ dân nuôi cá mú lồng cần chú ý áp dụng chặt chẽ các biện pháp phòng chống dịch bệnh Cần phải nghiêm ngặt trong việc quản lý các yếu tố môi trường thích hợp và

ổn định, kiểm soát nguồn thức ăn cá, thường xuyên theo dõi loại bỏ cá chết và xác định nguyên nhân cá chết để có cách phòng ngừa, tránh lây lan sang các con cá khác cũng như lồng nuôi khác Son và cộng sự (2009) đã nghiên cứu chế độ ăn uống của

chế phẩm sinh học Lactobacillus plantarum kháng bệnh GIV của E coioides Kết quả cho thấy việc phối trộn thức ăn với L plantarum ở mức 108 cfu/kg thúc đẩy sinh trưởng, tăng khả năng miễn dịch và sức đề kháng chống lại GIV cũng như tăng tỉ lệ sống đối với cá mú bệnh Hoặc vào mùa phát bệnh cá mú ngủ, bổ sung vitamin C vào thức ăn với liều 20 – 30 mg/kg cá/ngày, mỗi tháng cho ăn một đợt từ 7 – 10 ngày (Đỗ Thị Hòa và cs., 2004) Một trong những phương pháp hiệu quả dùng để phòng trị bệnh truyền nhiễm đó là dùng vaccine (Sommerset et al., 2005; Plant and Lapatra, 2011; Dhar et al., 2014) Tuy nhiên hiện nay, bệnh này ở cá mú chưa có cách điều trị bằng vaccine thương mại

1.2.6 Tình hình nghiên cứu dịch bệnh cá mú ngủ trên thế giới và Việt Nam

Bệnh cá mú ngủ do Iridovirus là một hội chứng có tỉ lệ tử vong cao trong nuôi trồng cá mú Năm 1992, bệnh được phát hiện ở Singapore và gây tử vong tới 50% trữ lượng cá mú chấm nâu Dịch bệnh tái phát với tỉ lệ tử vong tích lũy cao và không có dấu hiệu lâm sàng tiền sử nào khác ngoài hôn mê và chán ăn đã được báo cáo ở cá

mú mỡ (E tauvina) vào năm 1992 (Chua et al., 1994) và cá mú chấm đen năm 1998

10

(E malabaricus) (Kasornchandra and Khongpradit, 1997)

Một căn bệnh với các dấu hiệu lâm sàng tương tự và tỉ lệ tử vong 60% của cá

mú vàng Epinephelus awoara xảy ra ở Đài Loan Chou và cộng sự (1998) quan sát

được các hạt virus có đường kính 230 ± 10 nm ở lá lách cá bệnh Tiến hành phân tích phân tử, hình thái virus, tác giả đặt tên virus gây bệnh này là Grouper Iridovirus of Taiwan (TGIV)

Qin và cộng sự (2003) tiến hành thí nghiệm phân lập và nghiên cứu đặc điểm loài virus thuộc họ Iridovirus Từ các dữ liệu phân tích, tác giả cho biết virus phân

lập từ cá mú bị bệnh E tauvina ở Singapore, thuộc chi Ranavirus của họ Iridovirus

và tạm đặt tên là Singapore Grouper Iridovirus (SGIV) SGIV làm bệnh nghiêm trọng với khả năng gây chết 96% cá mú

Murali và cộng sự (2002) đã nghiên cứu đặc điểm phân tử và khả năng gây

bệnh do GIV phân lập từ cá mú vàng Epinephelus awoara, tác giả chứng minh GIV

là thành viên của chi Ranavirus từ việc phân tích phân tử Tác nhân gây bệnh GIV

được nghiên cứu ở cá mú vàng bằng cách tiêm virus vào màng bụng Tỉ lệ tử vong tích lũy lên đến 100% trong vòng 11 và 25 ngày sau khi nghiễm bệnh, nhóm đối chứng không có cá mú chết

Qin và cộng sự (2002), đặc tính kháng nguyên của SGIV phân lập từ cá mú

bệnh Epinephelus spp ở Singapore được điều tra bằng cách sử dụng kháng thể IgG

của thỏ để kháng lại virus Nghiên cứu này tạo điều kiện phát triển các kỹ thuật chẩn đoán và phát minh vaccine phòng ngừa GIV

Nakajima và cộng sự (1998) so sánh kháng nguyên của Iridovirus cá chẽm với Iridovirus ở các loài cá khác, trong đó có GIV, cho biết RSIV và GIV có chung epitop

Theo Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2004), tác giả khẳng định có dấu hiệu bệnh cá

mú ngủ xuất hiện trên cá mú lồng ở vịnh Hạ Long vào thời điểm tháng 3 – 8

1.3 Vaccine phòng ngừa bệnh trong nuôi trồng thủy sản

1.3.1 Vaccine và nguyên lý của việc sử dụng vaccine

11

Vaccine là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mà không gây bệnh Kháng nguyên ở đây có thể là vi khuẩn, virus sống hoặc chết, các protein, DNA được tách chiết từ vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật

có cấu trúc kháng nguyên giống vi sinh vật gây bệnh đã được giảm độc lực, bị bất hoạt, biến đổi để đảm bảo an toàn cho vật chủ sử dụng (Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2016)

Nguyên lý của vaccine là “gây ra trong cơ thể sống một đáp ứng chủ động của

hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố có khả năng gây bệnh và nhờ đó làm mất khả năng này” (Trích Vũ Triệu An và Homberg, 2001)

Dễ hiểu hơn, khi vaccine (kháng nguyên) vào cơ thể lần đầu tiên, cơ thể nhận diện chúng là “vật lạ” và từ đó kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể trung hòa kháng nguyên đó Sau khi quá trình nhiễm trùng này kết thúc, các tế bào lympho không biệt hóa sẽ ghi nhớ, lưu giữ hình ảnh cấu trúc kháng nguyên (tế bào nhớ), cho phép đáp ứng miễn dịch nhanh hơn (kháng thể sinh ra nhiều và nhanh) khi gặp lại các tác nhân gây bệnh đó lần sau với liều lượng cao hơn Hình 1.1 là một ví dụ về sự đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B khi có mặt kháng nguyên

12

Hình 1.1 Hai cách phát triển của tế bào lympho B hoạt hóa

(Nguồn: Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2016)

1.3.2 Tiêu chuẩn của vaccine

Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật ngày càng tiến bộ, vaccine mới tạo

ra hay cải tiến có nhiều điểm ưu việt hơn về các mặt như độ tinh sạch, an toàn, hiệu lực,…Tuy nhiên, dù có thay đổi ra sao thì điều kiện tiên quyết cơ bản để vaccine được phép sử dụng đó là độ an toàn và hiệu lực của chúng

1.3.2.1 Sự an toàn của vaccine

Không chỉ vaccine dùng cho người mới cần đảm bảo an toàn mà tất cả các loại vaccine cho bất kỳ sinh vật nào cũng phải được chứng thực không gây độc, không gây bệnh và không xảy ra các phản ứng phụ đáng kể cho đối tượng sử dụng Vaccine được coi là an toàn khi đảm bảo các yêu cầu:

Thứ nhất, vô khuẩn, tức là không nhiễm các vi sinh vật khác đặc biệt vi sinh vật gây bệnh

Thứ hai, thuần khiết, không lẫn tạp nhiễm các kháng nguyên lạ khác ngoài

13

kháng nguyên đích gây đáp ứng miễn dịch

Thứ ba, không gây độc, sau khi tiêm vaccine với liều lượng nhất định không gây ra phản ứng phụ nào cho thủy sản ở giai đoạn nhỏ nhất

Những yêu cầu về độ an toàn này cần được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn và được cấp phép sử dụng mới được sản xuất, sử dụng trên thị trường (Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2016)

1.3.2.1 Hiệu lực bảo vệ của vaccine

Một vaccine được đánh giá là có hiệu lực tốt thì nó phải gây được đáp ứng miễn dịch bảo vệ ở mức độ cao và tồn tại trong cơ thể thời gian dài Tùy thuộc vào bản chất, tính lạ, liều lượng, đường vào,…mà hiệu lực gây miễn dịch của vaccine cũng khác nhau Ví dụ như nếu vaccine chứa kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh và được cơ thể nhận diện là chất lạ thì hiệu lực vaccine sẽ cao

Hiệu lực của vaccine cần được đánh giá trên động vật thử nghiệm trước khi đưa vào thực địa Hai vấn đề cần xác định ở môi trường thí nghiệm đó là mức độ đáp ứng miễn dịch sau tiêm chủng (hàm lượng kháng thể chống lại bệnh) và hiệu quả bảo

vệ động vật thủy sản khi công cường độc tác nhân gây bệnh Trước khi đưa ra sử dụng rộng rãi, vaccine phải được thử nghiệm trên thực địa Lúc này, vaccine sẽ được tiêm chủng cho cả một quần thể và theo dõi, thống kê tình trạng, đồng thời đánh giá khả năng bảo vệ khi mùa dịch tới (Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2016)

Có hai phương pháp để xác định hiệu quả bảo vệ của vaccine đó là hệ số bảo

vệ tương đối (RPS – Relative Percent Survival) và gia tăng liều gây chết 50% (LD50

– Lethal Dose 50 percent) Hệ số bảo vệ tương đối cho phép thực hiện các thí nghiệm tại phòng thí nghiệm cũng như ngoài thực địa Phương pháp này đánh giá tỉ lệ sống dựa trên tỉ lệ cá chết tích lũy của các nghiệm thức (NT) cá tiêm vaccine và NT cá không tiêm vaccine khi công cường tác nhân gây bệnh Số lượng cá mỗi NT cần có tối thiểu 25 cá thể với hai lần lặp lại Hệ số bảo vệ tương đối được đánh giá khi cảm nhiễm tác nhân gây bệnh ở nhóm đối chứng phải đạt tỉ lệ cá tử vong hoặc mắc bệnh trên 60% và nhóm gây miễn dịch không được vượt quá 24%, đồng thời số cá chết do

14

các nguyên nhân khác không vượt quá 10%

Tuy nhiên phương pháp gia tăng liều gây chết 50% chỉ được thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm Phương pháp cho phép xác định liều gây chết 50% cá do tác nhân gây bệnh ở nhiều NT cá đối chứng và cá tiêm vaccine với 6 cá thể/nhóm theo liều lượng gây nhiễm tăng dần Vaccine được đánh giá có tiềm năng bảo vệ tốt cho

cá thí nghiệm khi LD50 của nhóm cá tiêm vaccine cao hơn 100 lần so với LD50 của nhóm cá đối chứng (Đỗ Thị Hòa và cs., 2004)

1.3.3 Vai trò của vaccine trong nuôi trồng thủy sản

Một vấn đề cấp bách cần giải quyết hiện nay đó là việc tiêu thụ kháng sinh quá mức dẫn đến một số chủng vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh Một khi vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng lại kháng sinh dẫn đến hiệu quả phòng ngừa và điều trị bệnh không có hoặc rất thấp (Sarter et al., 2007) Ngoài ra, sử dụng kháng sinh không đúng cách còn gây ra những hệ lụy khác như ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe con người và chất lượng sản phẩm cá (Hồ Thu Thủy và cs., 2019) Do đó, sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản không còn là phương pháp phòng ngừa chính Việc này cần được kiểm soát chặt chẽ và có các biện pháp điều tiết

Chẳng hạn như việc làm giảm đáng kể lượng kháng sinh trong nuôi cá hồi ở

Na Uy kể từ khi đưa vaccine vào sử dụng Vào năm 1987, trước khi sử dụng vaccine rộng rãi, ở Na Uy đã sử dụng khoảng 50.000 kg kháng sinh mỗi năm nhưng đến năm

1997, việc sử dụng vaccine làm giảng đáng kể lượng kháng sinh xuống còn 2.000 kg (Sommerset et al., 2005) Vào tháng 9 năm 2008, Cục Quản lý Thực phẩm

1.000-và Dược phẩm Hàn Quốc (Korea Food and Drug Administration) đưa ra thông báo cấm sử dụng các loại kháng sinh trong thức ăn cho gia súc và cá nuôi trong các trang trại (Adams, 2009)

Để giải quyết vấn đề kháng sinh trong nuôi trồng, vaccine thủy sản ra đời góp phần và đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh truyền nhiễm Đặc biệt không có nguy cơ kháng thuốc ở động vật thủy sản là yếu tố giúp vaccine được chấp nhận rộng rãi và ưu tiên hàng đầu (Gudding, 2014) Với hiệu quả bảo vệ của vaccine,

15

việc tiêm vaccine như một phương pháp tối ưu để ngăn ngừa loạt các bệnh do vi khuẩn, virus,… (Plant and Lapatra, 2011) và góp phần vào sự bền vững về môi trường, xã hội và kinh tế trong nuôi trồng thủy sản toàn cầu

1.3.4 Các phương pháp đưa vaccine vào cá

Hiện nay có rất nhiều phương pháp khác nhau dùng để đưa vaccine vào cơ thể

cá trong nuôi trồng nhưng ba con đường lây nhiễm chính đó là tiêm, tiếp xúc qua da

và cho ăn Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và hạn chế riêng tùy thuộc vào loài cá

và loại vaccine Tuy nhiên, hầu hết vaccine sử dụng hiện nay đều truyền chủ yếu bằng cách tiêm

1.3.4.1 Phương pháp tiêm

Tiêm là phương pháp được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản Có hai cách gây nhiễm vaccine cho cá gồm tiêm dưới màng bụng và tiêm cơ (Nguyễn Quốc Bình, 2012; Dhar et al., 2014) Việc tiêm đòi hỏi cá phải có kích thước khá lớn, tốn nhiều công sức, nhân lực và gây căng thẳng cho cá Ngoài ra, chúng có thể gây ra tổn thương cho cá ở vị trí tiêm, có thể gây chết cá Việc tiêm không nên thực hiện ở giai đoạn đầu của cá do kích thước khá nhỏ, rất khó khăn và không được tiêm cho cá nhỏ

do sự phát triển miễn dịch có thể không đủ (Lillehaug, 2014)

Mặt khác, tiêm cung cấp kháng nguyên trực tiếp cùng sự có mặt của tá dược

và các chất bổ trợ khác nhằm tăng đáp ứng miễn dịch mà các phương pháp khác không mang lại Các kháng nguyên được bảo vệ ở dạng tinh khiết cao và dễ dàng lưu trữ ở điều kiện lạnh vì chúng rất cô đặc (Dhar et al., 2014) Theo báo cáo của nhiều tác giả cho rằng việc tiêm kháng nguyên vào cơ kích thích sản sinh kháng thể lớn hơn

so với tiêm vào màng bụng (Nguyễn Thị Phương Huyền, 2011)

Đây là phương pháp hữu hiệu nhất để tạo ra kháng thể toàn thân và hiệu quả bảo vệ tốt nhất (Harikrishnan et al., 2011) Những loại vaccine được gây nhiễm bằng

tiêm dưới màng bụng phòng ngừa các bệnh như bệnh nhiễm Streptococcus, Lactococcus, bệnh hoại tử thận và lách, bệnh hoại tử tuyến tụy,…và tiêm bắp như

bệnh hoại tử cơ quan tạo máu,… (Ma et al., 2019)

16

1.3.4.2 Phương pháp tiếp xúc qua da

Đưa vaccine vào cơ thể cá bằng cách cho tiếp xúc qua da cá vào bể nước chứa dung dịch vaccine được chứng minh là một cách nhẹ nhàng và an toàn Vaccine được đưa vào cả da và tất cả bề mặt niêm mạc có thể tiếp cận với chất lỏng xung quanh

Có các kiểu cho vaccine tiếp xúc qua da như ngâm, phun, tắm,…(Newman, 1993)

Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong việc tạo miễn dịch niêm mạc nhưng

ít hơn cho miễn dịch dịch thể Mặt khác, khả năng đáp ứng miễn dịch của cá còn tùy thuộc vào nhiệt độ, độ pH, kích cỡ, tình trạng cá, thời gian tiếp xúc, nồng độ kháng nguyên,…Với lượng chất lỏng để ngâm thì việc lây nhiễm thường giới hạn ở những

cá có kích thước bé hoặc có thể tắm, phun đối với cá lớn hơn Việc xử lý cá nhỏ sẽ giảm sốc ở mức tối tiểu, với số lượng lớn làm giảm căng thẳng và tỉ lệ tử vong liên quan ở cá (Bogwald and Dalmo, 2019) Đây là một phương pháp ít tốn kém và đòi hỏi lao động không nhiều như phương pháp tiêm

Tuy nhiên, tạo miễn dịch cho cá bằng cách này có thể tốn thời gian và nhiều chi phí đối với cá lớn hơn, chi phí cho các thiết bị chuyên dụng (Assefa and Abunna, 2018) Nó cũng không dễ dàng để bổ sung tá dược và các hợp chất thích thích miễn dịch khác vào dung dịch ngâm, phun,… Vaccine được pha loãng thành dung dịch và

có thể mất đi khi quá trình lây nhiễm kết thúc (Dhar et al., 2014)

Một số vaccine phòng ngừa bệnh Pasteurela, bệnh nhiễm herpesvirus ở cá

chép,… được áp dụng phương pháp này (Ma et al., 2019)

1.3.4.3 Phương pháp cho ăn

Phương pháp đưa vaccine vào cơ thể bằng miệng có thể được thực hiện ở mọi lứa tuổi cá và được sản xuất với giá rẻ Nhờ thông qua đường miệng nên cá không cần xử lý trước cũng như giảm chi phí phòng ngừa và nguồn lao động Do đó, vaccine cho ăn có thể được sử dụng lặp đi lặp lại trong vòng đời của cá nuôi, từ phát triển khả năng miễn dịch dịch thể ở cá con, cá trước khi thả nuôi lồng và ngay cả thời điểm virus bùng phát Từ việc cho cá ăn, kháng nguyên nồng độ cao có thể được đưa trực tiếp vào đường tiêu hóa, kích thích miễn dịch toàn thân và niêm mạc (Chen et al.,

17

2014; Dhar et al., 2014)

Dù vậy, phương pháp này cũng có những trở ngại đáng kể cần giải quyết trước khi được chấp nhận sử dụng Cảm ứng miễn dịch dịch thể của vaccine không mạnh bằng tiêm và hiệu quả bảo hộ cũng không đồng đều Vaccine khi trộn với thức ăn hoặc các nguyên liệu khác có thể làm mất tính ổn định của kháng nguyên Ngoài ra, việc duy trì sự ổn định của kháng nguyên đặc biệt khó khăn trong điều kiện nhiệt độ

và độ ẩm cao ở các nước châu Á và vùng nhiệt đới Do đó, phương pháp này còn phải tốn nhiều chi phí đóng gói (Mutoloki et al., 2015)

Những vaccine dùng phương pháp này để phòng ngừa các bệnh như bệnh hoại

tử tuyến tụy với kháng nguyên là capsid protein VP2 và VP3, bệnh xuất huyến đường tiêu hóa (ERM) (Ma et al., 2019)

1.3.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh rất quan trọng trong việc duy trì nuôi trồng thủy sản bền vững, cả về kinh tế và môi trường Các biện pháp phòng ngừa dựa trên

sự kích thích hệ thống miễn dịch của cá là một giải pháp hiệu quả Vaccine đầu tiên

cho nuôi trồng thủy sản, vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm khuẩn Yersinia ở cá hồi,

được cấp phép tại Hoa Kỳ vào năm 1976 Kể từ đó, việc sử dụng vaccine được mở rộng sang các nước khác và các loài mới cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng thủy sản (Gudding and Muiswinkel, 2013)

Nghiên cứu về vaccine cá và miễn dịch cá đã tăng lên trong suốt thế kỷ XX và

đã có hơn 10.000 báo cáo về vaccine cá trong 20 năm qua (Ma et al., 2019) Thống

kê từ năm 1977 đến năm 2011 theo cơ sở dữ liệu Wipsglobal, 347 sáng chế đăng ký

về vaccine cho nuôi trồng thủy sản tập trung ở các quốc gia như Mỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản,…(Nguyễn Quốc Bình, 2012) Cho đến nay, chỉ có khoảng

36 loại vaccine sử dụng cho nhiều loại cá được cấp phép và có sẵn trên thị trường toàn thế giới (bảng 1.1) (Shefat, 2018)

Tiêm phòng vaccine đóng vai trò quan trọng trong nuôi cá thương phẩm với

18

quy mô lớn đặc biệt làm giảm đáng kể lượng kháng sinh sử dụng Nhờ vậy, việc nuôi

cá hồi đã giảm thiểu nguồn bệnh lây nhiễm, là minh chứng cho sự thành công của phòng ngừa dịch bệnh bằng vaccine, mang lại hiệu quả kinh tế cao (Sommerset et al., 2005) Ngoài cá hồi, vaccine thương mại đang có mặt trên thị trường còn dùng cho

cá nheo Mỹ (bộ cá da trơn), cá chẽm châu Âu, cá chẽm châu Á, cá cam sọc, cá đuôi vàng, cá rô phi, cá tuyết Đại Tây Dương, cá bơn,…(Thompson and Adams, 2004; Sommerset et al., 2005; Ma et al., 2019 )

Vaccine cá có sẵn được bào chế dạng sống nhược độc hoặc bất hoạt toàn bộ tế bào Hiện nay, vaccine được phân loại theo hai tiêu chí sau: thứ nhất, theo nguồn gốc gồm có vaccine bất hoạt, vaccine giảm độc lực, vaccine tái tổ hợp, vaccine DNA và vaccine peptid tổng hợp, vaccine giải độc tố; thứ hai, theo hiệu lực miễn dịch gồm vaccine đơn giá và vaccine đa giá Sự tiến bộ của công nghệ sinh học, sinh học phân

tử và miễn dịch học trong thủy sản dẫn đến việc phát triển các loại vaccine thế hệ mới hiệu quả như vaccine thành phần, vaccine nano, vaccine thực phẩm cùng nhiều loại khác (Assefa and Abunna, 2018; Ma et al., 2019)

19

Bảng 1.1 Một số vaccine được cấp phép dùng trong nuôi trồng thủy sản Tên vaccine Loài cá tiêm phòng Phòng bệnh

Bệnh do vi khuẩn

Edwardsiella Ictalurii Cá da trơn Bệnh gan thận mủ

Listonella anguillarum Cá hồi, cá chẽm Bệnh do Vibrio

Streptococcus agalactiae Cá rô phi Bệnh do Streptococcus Aeromonas hydrophila Cá hồi, cá da trơn Bệnh xuất huyết

Photobacterium damsela Cá chẽm, yellowtail Bệnh do Pasteurela Flavobacterium Columnare Cá trê, cá hồi Bệnh trắng đuôi

Vibrio Anguillarum-Ordalii Cá hồi, cá hồi cầu vồng Bệnh Vibrio

Lactococcus garvieae Cá hồi, cá đuôi vàng Bệnh do Lactococcus

Bệnh do virus

Infectious Hematopoietic

Necrosis Virus (IHNV) Cá hồi

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu

Infectious Pancreatic

Iridoviral Disease Vaccine Cá chẽm Bệnh Iridovirus

Nguồn: Shefat (2018)

20

1.3.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vaccine ở Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam việc phát triển vaccine cho thủy sản ngày càng được

chú trọng Bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri xảy ra trên toàn thế giới, gây

tử vong cao và thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành công nghiệp cá da trơn, đặc biệt

là ở Việt Nam và Hoa Kỳ Để kiểm soát nhiễm khuẩn Edwardsiella, người dân sử

dụng kháng sinh và các phương pháp phòng ngừa khác Tuy nhiên, kể từ khi xuất hiện vaccine đặc trị, việc kiểm soát dịch bệnh có hiệu quả rõ rệt Ở Việt Nam, vaccine

được sử dụng để phòng ngừa với cá tra (Pangasanodon hypophthalmus) (Bogwald

and Dalmo, 2019) Đây là vaccine thương mại đầu tiên được thử nghiệm và cấp phép

sử dụng cho cá da trơn ở Việt Nam

Ngoài ra, vaccine bất hoạt phòng ngừa bệnh nhiễm trùng huyết do vi khuẩn

Aeromonas hydrophila gây ra ở cá da trơn cũng được cấp phép sử dụng và bán ở nước

ta (Ma et al., 2019) Ngoài hai loại vaccine được cấp phép sử dụng ở nước ta, vaccine trong nuôi trồng thủy sản đều nhập khẩu từ nước ngoài Hiện cũng có nhiều công trình nghiên cứu về vaccine trong những năm gần đây Tuy nhiên chưa có vaccine nào được ứng dụng trong thực tiễn

Năm 2015, Nguyễn Thị Tâm và cộng sự đã nghiên cứu về dịch bệnh hoại tử thần kinh (NNV) và đã sản xuất thành công vaccine bất hoạt bằng cách sử dụng β-propiolactone 0,01% + hydroxit nhôm để bất hoạt virus Bằng phương pháp ngâm, vaccine được đánh giá hiệu lực và an toàn trên mô hình thực nghiệm Kết quả cho thấy vaccine an toàn với cá mú từ giai đoạn ấu trùng đến cá bột và tỉ lệ sống của cá ngâm vaccine cao hơn so với nhóm cá đối chứng từ 30 – 34% Tuy nhiên, để đánh giá chính xác hơn hiệu quả phòng bệnh, vaccine cần được theo dõi thêm một mùa dịch bệnh cũng như tiến hành các nghiên cứu tiếp theo để nâng cao hiệu quả phòng bệnh của vaccine

Nguyễn Hoàng Nhật Uyên và Đặng Thị Hoàng Oanh (2019), nghiên cứu ghi

nhận vaccine Streptococcus agalactiae bất hoạt ở mật độ 108 có khả năng kích thích

miễn dịch và kéo dài ít nhất đến 4 tuần sau khi tiêm ở cá rô phi (Oreochromis

21

niloticus) Mặt khác, hiệu quả bảo hộ của vaccine đối với cá khá cao, 80,1% với liều

tiêm 0,05 ml/con và 88,1% với hai liều tiêm 0,1 ml/con và 0,2 ml/con

Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về vaccine phòng trị bệnh cá mú ngủ do Iridovirus nhưng trên thế giới lại có trong phòng bệnh ở cá chẽm Do đó, thí nghiệm này được thiết lập nhằm xác định vaccine này có phù hợp với cá mú nhiễm Iridovirus hay không, đồng thời đánh giá tính an toàn và hiệu quả bảo vệ của nó đối với cá mú trong điều kiện thí nghiệm

22

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Cá mú trân châu hay còn gọi là cá mú lai (hình 2.1)

là sản phẩm lai giữa cá mú nghệ (đực) (Epinephelus lanceolatus) và cá mú cọp (cái) (Epinephelus fuscoguttatus)

Hình 2.1 Cá mú trân châu

- Thời gian nghiên cứu: từ ngày 20/3/2020 đến ngày 10/7/2020

- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản, trường Đại học Nha Trang, số 2 Nguyễn Đình Chiểu, phường Lộc Thọ, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

2.1.2 Hóa chất, môi trường

- Vaccine thử nghiệm: vaccine Piscivac irido Si được cung cấp từ công ty Kyoritsu Seiyaku, Nhật Bản Vaccine gồm hai thành phần là Iridovirus bất hoạt (≥106,6 TCID50/ml) và Streptococcus iniae bất hoạt (≥ 5x107 CFU/ml)

23

- Nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) (PSS – Physical saline solution): Nước muối được hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút

- Dung dịch gây mê Ethylen Glycol Monophenyl Ether

- Iridovirus stock (chủng BIV1301, 104,55 TCID50/ml) bảo quản ở -80°C

- Môi trường TSA (Tryptic Soya Agar)

- Môi trường PYGA (Pepton Yeast – extract Glucose Salt Agar)

- Vật liệu kiểm tra nồng độ kháng thể từ huyết thanh:

 Kháng nguyên ELISA (dịch Iridovirus bất hoạt)

 Dung dịch skim – milk 10%

 Dung dịch rửa Tween20 – PBS 0,05% (1000 ml PBS + 0,5 ml Tween20)

 Kháng thể đơn dòng kháng Ig cá mú (HRP – Horseradish Peroxidase /pha loãng 100 µl HRP + 5,4 ml PBS)

 Dung dịch cơ chất so màu HRP

 H2SO4 1M

- Vật liệu chẩn đoán Iridovirus:

 Kháng thể đơn dòng kháng Iridovirus (M10/pha loãng tỉ lệ 1/100 với PBS) do công ty Kyoritsu Seiyaku cung cấp

 Anti-Mouse IgG (HRP/pha loãng tỉ lệ 1/2000 với 1% skim-milk PBS)

 Lách cá mú

 Dung dịch skim – milk 10%

 Dung dịch rửa Tween20 – PBS 0,05%

 Dung dịch cơ chất so màu HRP

 H2SO4 1M

24

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp nghiên cứu cũng như bố trí thí nghiệm được thực hiện theo trình tự thể hiện ở hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát phương pháp nghiên cứu của đề tài

Xác định nồng độ kháng thể

Hiệu quả bảo vệ của vaccine

Quan sát hình thái cá mú

Đo chiều dài,

khối lượng cá

mú

Công cường độc Iridovirus

25

ăn uống tốt và đã được kiểm tra không bị nhiễm Iridovirus trước đó Tất cả chúng đều thuộc cùng loài cá mú có cùng độ tuổi và kích thước từ Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản Cá được thích nghi với điều kiện nuôi thử nghiệm ít nhất một tuần trước khi tiến hành thí nghiệm

Nuôi cá trong các bể thủy tinh có thể tích 2m3 và mực nước biển (độ mặn 30 – 32 ‰) cho vào bể có độ cao khoảng 0,8 m, nhiệt độ môi trường từ 25° đến 30°C Các bể được sục khí liên tục để cung cấp oxi cho cá Cho cá ăn bằng thức ăn viên dành cho cá vược mỗi ngày một lần với tỉ lệ cho ăn 8 – 10% trọng lượng cơ thể Trong quá trình nuôi, nước được thay đổi hằng ngày (khoảng 30% thể tích) theo mô tả của Ou-yang và cộng sự (2012) có cải tiến

Cá trước khi làm thí nghiệm an toàn và đánh giá hiệu quả không được cho ăn

ít nhất 24h (Thanasaksiri et al., 2018)

2.2.2 Kiểm tra độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá mú

2.2.2.1 Kiểm tra sự vô khuẩn của vaccine thử nghiệm

Môi trường TSA như là môi trường sinh trưởng được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Môi trường PYGA là môi trường phân lập vi nấm gây bệnh

ở nước lợ và nước mặn

Tiến hành: chuẩn bị các đĩa peptri chứa môi trường TSA và PYGA Sau đó,

hút 100 µl dịch vaccine cho vào các đĩa, cấy trang và ủ tủ ấm ở 28°C Sau 48h và 72h, kiểm tra sự xuất hiện của các khuẩn lạc vi khuẩn, nấm trên các đĩa thạch

2.2.2.2 Phương pháp xác định độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá mú

Phương pháp này dựa theo thí nghiệm tương tự ở cá chẽm đã được Trần Vĩ Hích mô tả năm 2014 và trình bày theo sơ đồ bố trí hình 2.3

26

Hình 2.3 Sơ đồ thực hiện kiểm tra độ an toàn của vaccine Bắt 100 con cá đã bỏ đói 24h, chuẩn bị dùng cho kiểm định sự an toàn của vaccine Chia 100 con thành 2 nhóm, nhóm tiêm vaccine 50 con và nhóm đối chứng tiêm nước muối sinh lý 50 con Một lần tiêm bắt mỗi bể 15 – 20 con cá cho vào các thùng nhỏ theo từng mẻ riêng biệt Sau đó, gây mê cá bằng Ethylene Glycol Monophenyl Ether với liều 150 ppm để dễ dàng tiêm vaccine hoặc PSS Đo khối lượng, chiều dài cá mú trước khi tiến hành thí nghiệm an toàn

Cá được tiêm vaccine với liều gấp đôi theo khuyến cáo của nhà sản xuất (0,1 ml/con) bằng phương pháp tiêm xoang bụng (hình 2.4) Cùng một thể tích, dung dịch nước muối sinh lý được tiêm cho nhóm cá đối chứng Cứ tiếp tục từng mẻ tiếp theo như vậy đến khi hết 100 con cho hai nhóm Cá sau khi tiêm được nuôi trong bể thủy tinh tách riêng với cá chưa tiêm ở cùng điều kiện môi trường Cá vẫn được cho ăn bằng thức ăn viên theo liều lượng như cũ và thay nước mỗi ngày với thể tích bể 50%

100 con cá mú khỏe mạnh

Tiêm 0,1 ml PSS

vào mỗi cá mú

Tiêm 0,1 ml vaccine vào mỗi cá mú

Theo dõi cá, ghi lại số lượng cá chết

31 ngày

31 ngày

Đo kích thước và cân nặng của cá mú Bắt 5 con/bể giải phẫu

kiểm tra nội quan