Nghiên cứu phân lập và xác định hoạt tính sinh học của một số hợp chất của loài an điền lá thông (hedyotis pinifolia wall ex g don) tại thừa thiên huế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG --- TRƯƠNG VŨ THÙY TRANG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CỦA LOÀI AN ĐIỀN LÁ THÔNG HEDYOTIS PINIFOLIA WA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG -

TRƯƠNG VŨ THÙY TRANG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT

CỦA LOÀI AN ĐIỀN LÁ THÔNG

(HEDYOTIS PINIFOLIA WALL EX G DON)

TẠI THỪA THIÊN HUẾ

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS GIANG THỊ KIM LIÊN

Đà Nẵng – Năm 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Trương Vũ Thùy Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Bố cục đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI HEDYOTIS 4

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY AN ĐIỀN LÁ THÔNG 5

1.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học 5

1.2.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học 7

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CÂY TRONG CHI HEDYOTIS 7

1.3.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học 7

1.3.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học 27

CHƯƠNG 2 NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 30

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30

2.1.1 Nguyên liệu 30

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm 31

2.2.2 Phương pháp xác định làm lượng tro 32

2.2.3 Phương pháp chiết mẫu thực vật 33

2.2.4 Phương pháp tách và tinh chế chất 33

2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 34

2.3 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO 35

2.4 ĐỊNH DANH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CÁC CAO 36

2.5 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CAO BuOH 36

2.5.1 Chạy cột sắc ký phần cao BuOH 37

2.5.2 Chạy cột sắc ký phân đoạn F4 38

2.5.3 Chạy cột sắc ký phân đoạn F5 38

2.8 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 39 2.8.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 39

2.8.2 Hoạt tính gây độc tế bào 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 CÁC THÔNG SỐ VẬT LÝ 43

3.1.1 Độ ẩm 43

3.1.2 Hàm lượng tro 43

3.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC CAO CHIẾT 44

3.2.1 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane 44

3.2.2 Thành phần hóa học trong dịch chiết EtOAc 48

3.2.3 Thành phần hóa học trong dịch chiết MeOH 51

3.3.CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 54

3.3.1 Cấu trúc của chất HPB2 54

3.3.2 Cấu trúc của chất HPB4 62

3.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 67

3.4.1 Hoạt tính kháng sinh 67

3.4.2 Hoạt tính độc tế bào 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (bản sao)

PHỤ LỤC

EtOAc: Ethyl acetate

GC/MS: Gas chromatography-Mass spectrometry

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Corelation

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

3.1 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane 45 3.2 Thành phần hóa học trong dịch chiết EtOAc 49 3.3 Thành phần hóa học trong dịch chiết MeOH 52 3.4 So sánh dữ liệu phổ giữa HPB2 và chất tham khảo 61 3.5 So sánh dữ liệu phổ giữa HPB4 và chất tham khảo 65 3.6 Hoạt tính kháng sinh của HPB2 và HPB4 67 3.7 Hoạt tính độc tế bào của HPB2 và HPB4 67

DANH MỤC CÁC HÌNH, ẢNH

1.1 Cây An điền lá thông thu hái tại Huế 4 1.2 Phân bố của cây An điền lá thông 5 2.1 Sơ đồ điều chế các cao 35 2.2 Sơ đồ phân lập cao BuOH 36 3.1 Sắc ký đồ của dịch chiết n-hexane của cây An điền lá thông 44 3.2 Phổ khối của squalene 47 3.3 Phổ khối của Phytol 47 3.4 Phổ khối của stigmasterol 48 3.5 Sắc ký đồ của dịch chiết EtOAc của cây An điền lá thông 48 3.6 Phổ khối của 4-methyl benzaldehyde 50 3.7 Phổ khối của 1,2,3-propanetriol monoacetate 51 3.8 Sắc ký đồ của dịch chiết MeOH của cây An điền lá thông 51 3.9 Phổ khối của 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyde 53 3.10 Phổ khối của 2-Furanmethanol 54 3.11 Phổ 1H-NMR của HPB2 55 3.12 Phổ 13C-NMR của HPB2 56

3.14 Phổ HMBC giãn rộng của HPB2 58

3.16 Phổ HSQC giãn rộng của HPB2 60 3.17 Phổ 1H-NMR của HPB4 63 3.18 Phổ 13C-NMR của HPB4 64

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Y học cổ truyền dân tộc chữa bệnh chủ yếu phụ thuộc vào châm cứu và các bài thuốc dân gian Các bài thuốc này lấy từ cây cỏ xung quanh chúng ta, phần lớn do kinh nghiệm từ nhiều đời, về bản chất hóa học, cũng như mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý vẫn chưa có nhiều nghiên cứu làm rõ vấn đề này Mặt khác, các bài thuốc dân gian, do hàm lượng các chất đặc trị thấp, nên thời gian chữa bệnh khá dài Do đó, việc nghiên cứu thành phần, tính chất dược lý cũng như tách chiết để tổng hợp chất đặc trị là cần thiết và rất có ý nghĩa

An điền lá thông, tên dân gian là bòi ngòi lá thông, có tên khoa học là

Hedyotis pinifolia Wall ex G Don, thuộc họ cà phê (Rubiaceae) Trong cây

An điền lá thông có một số thành phần đã được phân lập rất có giá trị nghiên cứu như acid ursolic, acid oleanolic, β-sitosterol do có khả năng phòng chống các bệnh ung thư, kháng sinh Mặt khác, tùy thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng, thành phần và hàm lượng các chất trong cây cũng thay đổi, trong khi

đó, các nghiên cứu về loài cây này lại rất ít, kể cả ở Việt Nam hay trên thế

giới Do đó, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu phân lập và xác định hoạt tính sinh

học của một số hợp chất của loài An điền lá thông (Hedyotis pinifolia Wall

ex G Don) tại Thừa thiên Huế” làm đề tài luận văn tốt nghiệp thạc sĩ của

mình, làm cơ sở khoa học cho các ứng dụng của loài cây này

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập một số hợp chất từ dịch chiết của loài An điền lá thông thu hái tại Thừa Thiên Huế

- Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Điều tra sơ bộ, thu thập và xử lý nguyên liệu là cây An điền lá thông

(Hedyotis pinifolia Wall ex G Don) thu hái tại Thừa Thiên Huế

- Định danh sơ bộ một số hợp chất có trong các mẫu cao của cây An điền

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Các phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên

- Nghiên cứu trên mạng internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về loài cây nghiên cứu

- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá

học, ứng dụng của chi và cây nghiên cứu

4.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

§ Xử lí mẫu: Nguyên liệu lá, cành cây An điền lá thông được rửa sạch, sấy khô và xay nhỏ

§ Nguyên liệu đã xử lý được chiết hồi lưu với các dung môi khác nhau như n-hexane, ethylacetate, methanol,…cô trên bếp cách thủy thu được các cao

§ Phân lập, tách và tinh chế các chất bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, các phương pháp kết tinh phân đoạn

§ Phân lập ban đầu và định danh một số cấu tử trong các dịch chiết bằng phương pháp GC/MS

§ Các phương pháp xác định cấu trúc các chất: kết hợp các phương pháp

đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR): COSY, HSQC, HMBC;

và các phương pháp khác để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

§ Các phương pháp thử nghiệm các hoạt tính sinh học: thử các hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh trùng gây bệnh,…

5 Bố cục đề tài

Luận văn gồm 75 trang, 7 bảng, 21 hình, ảnh, 46 tài liệu tham khảo và 41 phụ lục Với:

Phần mở đầu (3 trang)

Chương 1 – Tổng quan (26 trang)

Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm (13 trang)

Chương 3 – Kết quả và thảo luận (25 trang)

Kết luận (2 trang)

Tài liệu tham khảo (6 trang)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI HEDYOTIS

Chi Hedyotis thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) có rất nhiều loài đã được sử

dụng trong y học dân gian để chữa các bệnh viêm nhiễm, ung thư và các bệnh

khác, trong đó phải kể đến các loài Hedyotis biflora, H corymbosa, H

diffusa, H verticillata Ở Ấn độ, lá của loài H auricularia dùng làm thuốc

tiêu chảy và kiết lỵ, trong khi ở Sri Lanka nó được dùng như rau và có tác

dụng hạ huyết áp rất hiệu quả [31] Ở Trung quốc, loài H diffusa dùng để

chữa bệnh viêm dạ dày, ruột thừa và ung thư [42] Y học dân gian nước ta sử

dụng loài H herbacea làm thuốc long đờm, hạ nhiệt và thuốc bổ; loài H

tenelliflora có tác dụng giải độc, thanh nhiệt, tiêu sưng và giảm đau [2]

Loài An điền lá thông thuộc dạng cỏ đứng cao đến 25cm, đen đen lúc khô, cành vuông, có lông ở cạnh Lá có phiến hẹp dài 2-4,5cm, cưng cứng, gân phụ không rõ, lá bẹ chẻ làm thùy nhọn, chụm 1-10 hoa trắng, lá dài có lông, tai vành cao 1,5mm Nang tụ khai, to 3x2mm, trong dài, hột nhiều[10]

Hình 1.1 Cây An điền lá thông thu hái tại Huế

Cây An điền lá thông phân bố chủ yếu ở dãi đất ven biển vùng nhiệt đới châu Á [40]: Ấn Độ, Thái Lan, Việt Nam, Myanma, Malaysia

Hình 1.2 Phân bố của cây An điền lá thông

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY AN ĐIỀN LÁ THÔNG

1.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Cho đến nay, mới chỉ có một công trình công bố về cây này của tác giả Lê

Hoàng Duy Các bộ phận trên mặt đất của cây Hedyotis pinifolia được thu hái

tại Bà Rịa – Vũng Tàu, có chứa các hợp chất phytol, hỗn hợp stigmasterol và

β – sitosterol, hỗn hợp acid ursolic và acid oleanolic, trihydroxyolean-12-en, 1,6-dihydroxy-7-methoxy-2-methylantraquinone, 1,6-dihydroxy-2-methylantraquinone, β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside và 4-O-[3-hydroxy-2(dihydroxymethylmethoxy)]propyl-α-L-rhamnopyranose và 4 đồng phân anthraquinones [6, 7]

OHC

OH

CH2

CH2HO

HO

4-O-[3-hydroxy-2(dihydroxymethylmethoxy)]-propyl-α-L-rhamnopyranose

1.2.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Cây An điền lá thông có tác dụng kháng sinh, giảm đau Ở Trung Quốc, cây được dùng để trị bệnh cam tích ở trẻ em và đòn ngã tổn thương Ở Malaysia, người ta dùng cây làm thuốc đắp các chỗ đau trên cơ thể [6]

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT

TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CÂY TRONG CHI HEDYOTIS

1.3.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

a Hedyotis biflora (L.) Lam – An điền hai hoa

Cây Hedyotis biflora có chứa β-sitosterol, γ-sitosterol, acid ursolic, acid

oleanolic, acid fumaric, protopine, đường galactose, đường glucose, đường

fructose, spergulacin, β-sitosterol O-β-D-glucopyranoside, stigmasterol

3-O-β-D-glucopyranoside, stigmast-3β,5α,6β-triol, philonotisflavone O-β-D-galactopyranosyl]-β-D-glucopyranoside, 1,5,6-trimethoxy-2-hydroxy-

7-O-[4""-9,10-antraquinone, acid 3β,6β-dihydroxyoleanolic, arabinopyranosyl-3α-D-glucopyranosylpropan và (4E,8Z)-1-O-β-D-

1-ethoxy-2α-L-glucopyranosyl-2-(2’-hydroxyhexadecanoylmino)nonadeca-4,8-dien-3-ol [14,19]

b Hedyotis capidellata var mollis Pierre ex Pid - Dạ cẩm, An điền

mềm

Cây Hedyotis capidellata có chứa các alkaloid β-carboline là

(-)-isocyclocapidelline, (+)-cyclocapidelline và isochrysotricine [12, 31, 33, 37]

c Hedyotis chrysotricha

Cây Hedyotis chrysotricha có chứa chrysotricine, asperuloside,

scandoside methyl ester, acid asperulosideic, acid deacetyl asperuloside,

loganin, deacetyl asperuloside, acetyl scandoside methyl ester ,

6β-hydroxygenipine, hedyoside, 6'-acetylasperuloside, acid asperuloside ethyl ester và 6’-acetyl deacetyl asperuloside [28, 29, 36]

d Hedyotis corymbosa (L.) Lam – Cóc mẵn

Hedyotis corymbosa có chứa các hợp chất sau: stigmasterol, γ

-sitosterol, acid ursolic, acid oleanolic, geniposide, asperuloside, deacetyl asperuloside, acid asperuloside, acid deacetyl asperuloside, acid deacetyl

asperuloside methyl ester (6α-hydroxygeniposide), acid 10-O-benzoyl deacetyl asperuloside methyl ester, 10-O-benzoyl scandoside methyl ester, scandoside methyl ester, 10-O-p-coumaroyl scandoside methyl ester và 10-

O-p-hydroxybenzoyl scandoside methyl ester [9, 23, 27, 34, 35]

d Hedyotis crassifolia A DC – An điền lá dày

Cây Hedyotis crassifolia có chứa các hợp chất 28(13)- lacton, acid sumaresinolic, acid 3α,13β-dihydroxyurs-11-en-28-oic

3β-hydroxyurs-11-en-và β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside [11]

e Hedyotis dichotoma Koen Ex Roth – An điền lưỡng phân

Rễ cây Hedyotis dichotoma có chứa hai hợp chất: 1,4-dihydroxy-2,3-

dimethoxyantraquinone và 9-hydroxy-2,3-dimethoxy-1,4-antraquinone

Năm 2009, Ngô Thị Thùy Dương đã cô lập được các hợp chất: (22E)-5α- stigmasta-7,22-dien-3β-ol, 2,5-dimethoxy-1,4-benzoquinone, acid 4-hydroxy- 3- methoxybenzoic, (22E)-5α-stigmasta-7,22-dien 3-O-β-D-glucopyranoside (22E)-5α- poriferasta-7,22-dien 3-O-β-D-glucopyranoside, D-(+)-pineidol, (6R,9S)-roseoside và acid 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-

asperuloside, 2,3-dimethoxy- 6-methylantraquinone,

3-hydroxy-2-methyl-1-methoxyantraquinone, kaempferol (1→2)]-β-D-galactopyranoside, quercetin 3-O-[(6-O-E-feruloyl)-β-D- glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside, quercetin 3-O-[(6-O-E- feruloyl)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-galactopyranoside, kaempferol 3-

3-O-[6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl-O-[β- D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-galactopyranoside, quercetin 3-3-O-[6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl-O-[β-D-

glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-galactopyranoside, 6-O-p-methoxycinamoyl scandoside methyl ester, 6-O-p-coumaroyl scandoside methyl ester, 6-O- feruloyl scandoside methyl ester và β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside [3,

18, 29, 30, 34, 43]

g Hedyotis herbacea L – An điền cỏ

Cây Hedyotis herbacea có chứa các hợp chất: α-amyrin, acid

ursolic, acid oleanolic, dihydroxy-2,3-dimethoxyantraquinone, dihydroxy-2- hydroxymethylantraquinone, 10-hydroxy-2-hydroxymethyl-1,4-antraquinone và 9-hydroxy-2,3-dimethoxy-1,4-antraquinone [18, 25]

1,4-h Hedyotis heynii R Br – Cỏ lữ đồng

Cây Hedyotis heynii có chứa các hợp chất stigmasterol, β-sitosterol, acid ursolic, acid oleanolic và β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside [1, 18]

i Hedyotis lineata Roxb – An điền lằn

Cây Hedyotis lineata có chứa: stigmasterol,

3,5,6-trimethyl-2-(3-hydroxy-3',7',11',14'-tetramethyl)pentadecylbenzoquinone,

3β-hydroxyurs-12-en-28-al, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde,

4-hydroxybenzaldehyde, acid 3β-acethoxy -19- hydroxyurs-12-en-28-oic, hỗn hợp acid ursolic và xid oleanolic và stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside

[12]

k Hedyotis merguensis Hook F – Răm núi

Năm 2009, Thái Hoàng Minh đã cô lập được từ cây răm núi các hợp

chất: stigmasterol, β–sitosterol, acid ursolic, β-sitosterol

3-O-β-D-glucopyranoside, acid

3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]oleanolic, β-D-glucopyranosyl 3-O-β-D-glucopyranosyl

oleanoate, β-D-glucopyranosyl glucopyranosyl]oleanoate, acid 3-O-{[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-[β-D- glucopyranosyl-(1→3)]- β-D-glucopyranosyl}oleanolic, acid 3-O-{[α-L-

3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-(1→2)]-β-D-glucopyranosyl}-oleanolic và β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-

rhamnospyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-[β-D-glucopyranosyl-glucopyranosyl]oleanoate [18]

l Hedyotis microcephala Pierre ex Pid - An điền đầu nhỏ

Các bộ phận thân, lá, rễ của cây Hedyotis microcephala có chứa các hợp chất: hỗn hợp stigmasterol và β–sitosterol, acid ursolic, 5– hydroxymethylfurfural, acid 3–O–β–D–glucopyranosyl oleannolic, ethyl 1’–

O–β–D–glucopyranoside, β–sitosterol 3–β–O–D–glucopyranoside và acid 3– O–[α–L–rhamnopyranosyl–(1→3)– β–D–glucopyranosyl]oleanolic [5]

m Hedyotis nigricans L - Hoa kim cương

Các bộ phận trên mặt đất của cây Hedyotis nigricans có chứa các hợp chất: stigmasterol, α-amyrin, acid ursolic, acid oleanolic, primuletin (hay 5-

hydroxyflavone), chrysin (hay 5,7-dihydroxyflavone), luteolin (hay 5,7,3',4'-

tetrahydroxyflavone), biochanin A (hay 5,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavone)

và arbutin [18]

n Hedyotis pressa Pierre ex – An điền sát

Từ cây Hedyotis pressa, Lại Thị Kim Dung đã cô lập được các flavonoid như: amentoflavone, 3,5,7,4’-tetrahydroxyflavone 3-O-β-D-glucopyranoside

và 3,5,7,4’-tetrahydroxyflavone [4]

o Hedyotis symplociformis (Pid.) Phamhoang - An điền dung

Các bộ phận trên mặt đất của cây Hedyotis symplociformis có chứa các hợp chất: ethyl (19Z,22Z)-heptacosane-19,22-dienoate, triacontanol, hỗn hợp stigmasterol và β-sitosterol, hỗn hợp acid ursolic và acid oleanolic, vanilin,

acid 3β,13β-dihydroxyurs-11-en-28-oic, β-sitosterol glucopyranoside, kaempferol 3,7-O-di[α-L-rhamnopyranoside] và ethyl 1’-β-

3-O-β-D-D-glucopyranoside [17]

p Hedyotis acutangula Champ Ex Benth - An điền cạnh nhọn

Nghiên cứu thành phần hóa học trên cây Hedyotis acutangula, Nguyễn Minh Phương và cộng sự đã tìm thấy các hợp chất sau: taraxerol, β-sitosterol, olean-12- en-3β,28,29-triol, acid ursolic, acid oleanolic, stigmasterol và phytosterol [18]

q Hedyotis auricularia L – An điền tai, cỏ đồng tiền

Cây Hedyotis auricularia có chứa các hợp chất stigmasterol, β-sitosterol, acid ursolic, acid oleanolic, auricularin, stigmasterol 3-O-β-D- glucopyranoside, 1’-O-ethyl-β-D-galactopyranoside, 3,7,2’,4’-tetramethoxy-

5-hydroxyflavone, naringenin (5,7,4’-trihydroxyflavanon) và tetramethoxy-5-hydroxyflavone [18, 21, 40]

3,7,2’,4’-r Hedyotis tenelliflora Blume

Năm 2005, Jing-Feng Zhao và cộng sự đã cô lập từ rễ cây được hai iridoid mới là teneoside A và teneiside B, cùng với hai iridoid đã biết là deacetyl asperuloside và scandoside methyl ester [23]

Cấu trúc của một số hợp chất cô lập được từ các cây thuộc chi Hedyotis

được trình bày như sau:

- Các steroid trong chi Hedyotis

OH

OH HO

HO

H

(22E)-5α-Stigmasta-7,22-dien (22E)-5α-Poriferasta-7,22-dien 3-O-β-D-glucopyranoside 3-O-β-D-glucopyranoside

- Diderpen có trong chi Hedyotis

COOH HO

α-Amyrin 3β-Hydroxyurs-12-en-28-al Acid ursolic

COOHHOHHO2C

COOH

Acid 3β,24-dihydroxyurs12-en-28-oic Acid 3α,15β-dihydroxyurs11-en-28-oic

COOHC

HO

CH2OH

COOH HO

Acid 2α,3β,24-trihydroxyurs- Acid 3β,23-dihydroxyurs-

12-en-28-oic 12-en-28-oic

CH2OH

CO HO

HO

CH2OH

CH3HO

O

COOH O

OH

OH HO

HO

2α,3β,23-trihydroxyolean-12-en Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic

COOH O

OH

OH O

HO O OH HO

O

OH O

HO OH

HO

HO OH H

HO HO OH

H OH

Acid 3-O-{[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-

β-D-glucopyranosyl}oleanolic

O

COOH O

O

OH HO

O OH

HO

HO O H

HO HO

OH

H OH

H

Acid 3-O-{[α-L-rhamnospyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-[β-

D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosyl}oleanolic

CH3

CO O

OH

OH HO

HO

O O OH

OH H HO

HO H

β-D-Glucopyranosyl 3-O-β-D-glucopyranosyl oleanoate

O

CO

O O OH

OH HO

HO

O OH

OH HO

OH

O

O

OH HO

HO

O OH

OH HO

OH

O O O HO

O OH HO

HOH3C

β-D-Glucopyranosyl

3-O-{[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl}oleanoate

CO

O O OH

O

HO HO

O OH

OH O

OH

O OH HO

HOH3C

O

H OH HO

OH

OH

H

O O OH HO

HOHO

O O OH

HO

O OH

OH HO

OH

O O OH HO

β-D-Glucopyranosyl

3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→3)-α-arabinopiranosyl]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-oate

CO

O O OH OH HO

HO

O OH

OH HO

OH

O O O HO

O OH HO

OHOOH

O O

O O HO

OH

OH

OH HO

OCH3

OCH3O

O

OCH3

OCH3O

O

OH

OCH3

OCH3O

O

OHOCH3

3-Hydroxy-2-methyl- 1,4-Dihydroxy- 3-Hydroxy-2-formyl-1- 1-methoxyantraquinone 2,3-dimethoxy- methoxyantraquinone -antraquinone

CH2OH O

O

OH

OH

CH3O

O

OH HO

CH2OH O

O OH

1,4-Dihydroxy- 3,6-Dihydroxy- 9-Hydroxy-2,3-dimethoxy 2-hydroxylmethyl- 2-methylantraquinone -1,4-antraquinone

H3CO

H3CO

2,5-Dimethoxy-1,4-benzoquinone 1,5,6-Trimethoxy-2-hydroxyantraquinone

OH OH

5-Hydroxyflavone 5,7-Dihydroxy- 5,7,3’,4’-Tetrahydroxy- (primuletin) -flavone (chrysin) -flavone (luteolin)

O

OCH3O

H3CO

OCH3OCH3OCH3

O OH

O

OH OH

HO O

OH OH

O OH OH

OH OH

OH

HO

OH

O HO

HO

O

O OH

HO

OCH3

5,7,4’-trihydroxyflavanon 5,7-dihydroxy-4’-metoxisoflavone (naringenin) (biochanin A)

- Các flavoneol có trong chi Hedyotis

O

OH

O OH

HO

OH

3,5,7,3’,4’-Pentahydroxyflavone 3,5,7,4’-tetrahydroxyflavone (quercetin) (kaempferol)

OCH3

O OH

HO

O

O

OHHO

HO

O O OH

HO

O

O HO

HO

O

H OH

OH HO

OH H

Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside Kaempferol 3-O-rutinoside

O

OH

O OH O

O

O

O

OH HO

HOHOOH

HO

O

O HO

HO

O

H OH

OH

OH H OH

Kaempferol 3,7-O- Kaempferol 3-O-β-D-galctopyranosyl-(1→6)-

di[α-L-rhamnopyranoside] β-D-glucopyranoside

OH

O OH

HO

O

O HO

HO

O

OH H

HO

O

O HO

HO

O OH

OH

OH H

HO

O

O HO

HO

O OH

OH H

HO

O

O HO

HO

O OH

OH H

- Các iridoid trong chi Hedyotis

O

HO H

HOGlc

CO

H3CCOOAcid asperulosideic Deacetyl asperuloside ethyl ester Asperuloside

COOCH3

BzO

Deacetyl asperuloside Hedyotoside 10-O-Benzoyl deacetyl

asperulosideic methyl ester

O

HO H

HOGlc

HOGlc

COOCH3

HOHO

Acid deacetyl Deacetyl asperuloside Scandoside methyl ester asperuloside methyl ester

OH

HOGlc

COOCH3

O

HO

CC

H O

CH

BzO

10-O-p-coumaroyl scanoside 10-O-Benzoyl scandoside methyl ester

methyl ester

O H

H OGlc

COOCH3

O

HO

C O

H

H OGlc

COOCH3

HO

O C C

H O

C H

H3CO

10-O-(p-Hydroxybenzoyl)scandoside 6-O-(p-methoxy cinnamoyl)scandoside

methyl ester methyl ester

O H

H OGlc

COOCH3

HO

O C C

H O

C H HO

O H

H OGlc

COOCH3

HO

O C C

H O

C H HO

H3CO

6-O-p-Coumaroyl scandoside 6-O-Feruloyl scandoside

methyl ester methyl ester

- Các alkaloid trong chi Hedyotis

OHHO

NH2OH

(+)-cyclocapidellin Hedyocapidin 5-Hydroxytryptamin

N

N

H NH

OH

O

OO

OHHO

OHO

HO

OO

O

OHHO

H

1-Ethoxy-2-α-L-arabinopyranosyl-3-α-D-glucopyranosylpropane

HOH

HOH2CHO

HOH2 C O CHO

COOH

OH

H3CO

5-hydroxymethylfurfural Acid 4-hydroxy-3-methoxybenzoic

1.3.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

a Hedyotis auricalaria L – An điền tai

An điền tai có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, làm dịu cơn đau, chữa cảm mạo, phát sốt, đau họng, viêm ruột, viêm mủ da, mụn nhọt Người dân thường dùng cây tươi dã nát để đắp lên hoặc nấu nước chữa các vết rắn cắn, rết cắn [18]

b Hedyotis biflora (L.) Lam – An điền hai hoa

An điền hai hoa có vị đắn, tính mát, có tác dụng thah nhiệt, bổ thần kinh, chữa vết rắn cắn và trị đau bao tử

Năm 1983, ở Thái Lan, Dechatiwongse và cộng sự cho biết phần dịch

nước chiết từ phần trên mặt đất của cây H biflora đã được sấy khô có tác

dụng làm hạ đường huyết đối với những con thỏ bị gây cho bệnh tiểu đường [2, 18]

c Hedyotis capidella Wall ex G Don – An điền mềm, Dạ cẩm

Dạ cẩm có vị ngọt, hơi đắng, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, làm giảm cơn đau, tiêu viên, lợi tiểu Cây Dạ cẩm được dùng để chữa trị các bệnh lở loét miệng lưỡi, loét dạ dày, tá tràng, viêm họng, chữa vết thương, làm nhanh chóng lên da non Chữa lở loét miệng bằng cách lấy toàn thân cây băm nhỏ, nấu thành cao lỏng, trộn mật ong, bôi len vết thương hằng ngày Chữa vết thương làm nhanh chóng lên da non bằng cách lấy lá tươi dã với muối đắp lên vết thương [17]

d Hedyotis corymbosa (L.) Lam – Cỏ lưỡi rắn

Ở nước ta từ thời Tuệ Tĩnh, người dân đã biết dùng cỏ lưỡi rắn để chữa trị rắn cắn, đậu, sởi

Ở Trung Quốc, cỏ lưỡi răn được phối hợp với Bán Chi Liên để chữa ung thư phổi, gan

Ở Ấn Độ, cây này được dùng để trị sốt rét, sốt cách nhật, ăn uống không tiêu, thần kinh suy nhược, vàng da, bệnh về gan, trị giun

Cỏ lưỡi rắn còn có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi tiểu, tiêu sưng, trị viêm dây thần kinh, viêm phế quản, viêm ruột thừa, trị đòn, ngã bầm dập, đau nhứt xương cốt, thấp khớp, trị mụn nhọt, bướu ác tính và trị các chứng nham [9, 11, 14]

e Hedyotis diffusa Willd – Bạch hoa xà thiệt thảo

Bạch hoa xà thiệt thảo có tác dụng khác sinh, trị đau hầu họng, viêm nhiễm đường tiểu, đường ruột, viêm loét dạ dày, tá tràng, nóng sốt (kể có sốt xuất huyết, sởi, thủy đậu), trị sỏi thân, sưng hạch bạch tuyết, viêm gan, ung thư gan, ung thư phổi, ung thự dạ dày, ung thư cổ tử cung [28, 43]

Bạch hoa xà thiệt thảo có tác dụng kích thích sự tăng sinh của tế bào lưới nội mô, nâng cao sức thực bào của bạch cầu, Do đó, có tác dụng điều trị một

số chứng nhiễm khuẩn, có khả năng kháng ung thư [44]

Năm 1996, Hong Xi Xu và cộng sự đã khảo sát, sàng lọc một số cây thuốc

cổ truyền ở Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia về khả năng khác protease

HIV-1, trong đó có cây Hedyotis diffusa [27]

f Hedyotis herbacea L – An điền cỏ

Cây thảo dược H herbacea được sử dụng trong y học cổ truyền của

Malaysia và Trung Quốc cho nhiều mục đích khác nhau như làm thuốc bổ, trị viêm ruột thừa, bệnh viêm gan, rắn cắn, điều trị amydal Ngoài ra, người ta còn dùng cây này làm thuốc đắp nhằm giúp lưu thông máu

Ở Ấn Độ, toàn cây sắc uống trị sốt rét và dùng tắm cho bệnh tê thấp Bột nghiền ra cùng với mật ong dùng cho người bị bệnh sốt và sưng đau thấp khớp Cây còn được dùng nấu với dầu và dầu này dùng để trị bệnh nhân chân

to và đau mình Lá dùng trị bệnh hen suyễn và lao phổi [12, 18]

g Hedyotis heynii R Br – Cỏ lữ đồng

Theo Phan Đức Bình, chi Hedyotis ở nước ta có 63 loài, trong đó có 4 loài tương đối giống nhau đó là Hedyotis heynii (cỏ lữ đồng), hedyotis diffusa (bạch hoa xà thiệt thảo), Hedyotis corymbosa (cỏ lưỡi rắn) và Hedyotis biflora

(An điền hai hoa) Dân gian đã sử dụng lẫn lộn cả bốn loại này với cùng công dụng như cỏ lưỡi rắn để chữa trị viêm gan, viêm đường tiết niệu, thanh nhiệt, giải độc, trị rắn cắn, độc rắn và ung thư [12]

CHƯƠNG 2

NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày 0,2mm

Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck và Sephadex LH – 20

Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC/MS đo trên máy Agilent 7890A/5975C Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR, 13C – NMR, HSQC

và HMBC đo trên máy Bruker Avance – 500 MHz, chất chuẩn nội là TMS cho 1H – NMR và tín hiệu dung môi (CDCl3) cho 13C – NMR

Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và 365nm dùng để soi bản mỏng

Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc, cột sắc ký,…

Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng Vanilin 1% trong dung dịch methanol – H2SO4 đặc, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 110oC

Dung môi dùng để chạy cột và triển khai sắc ký lớp mỏng bao gồm hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH và BuOH loại tinh khiết đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm

+ Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm Cân cốc mẫu đã sấy

+ Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi Ghi nhận khối lượng m2(g)

Công thức tính độ ẩm (W):

W =

x100%

Trong đó:

m0: khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi

m1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy

m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi

Lấy kết quả trung bình của năm lần thí nghiệm

2.2.2 Phương pháp xác định làm lượng tro

- Nguyên tắc: đốt cháy và nung mẫu nguyên liệu ở nhiệt độ 6000C đến khối lượng không đổi Độ chênh lệch khối lượng trước và sau khi đem tro hóa chính là hàm lượng hữu cơ bị đốt cháy, tro còn lại chứa chất vô cơ

- Tiến hành thí nghiệm:

+ Đặt chén nung vào lò đã được đốt nóng, giữ trong 60 phút ở nhiệt độ

6000C, sau đó lấy ra và đặt vào bình hút ẩm khi nhiệt độ ở trong bình hút ẩm ngang bằng với nhiệt độ môi trường Tiến hành cân chén nung với sai số không vượt quá 0,001g Khối lượng cốc là mo(g)

+ Cân mẫu nguyên liệu 2g, cho mẫu vào chén nung, sau đó đặt lên bếp điện và nung nấu ở nhiệt độ 1000C cho đến khi mất nước hoàn toàn Đặt chén vào lò nung ở nhiệt độ 6000C trong khoảng 60 phút, làm nguội trong bình hút

ẩm ở nhiệt độ môi trường rồi đem cân Quá trình này lặp đi lặp lại cho đến khi hiệu quả hai lần cân cuối cùng không vượt quá 0,001g Ghi lại giá trị khối lượng nhỏ nhất Khối lượng cốc và tro sau khi nung là m2(g)

- Xử lí kết quả: Hàm lượng tro chung (X) tính bằng phần trăm khối lượng của chất khô còn lại so với khối lượng chất khô ban đầu:

X = x 100%

Trong đó:

mo là khối lượng cốc (g)

m1 là khối lượng mẫu đem phân tích (g)

m2 là khối lượng cốc và tro sau khi nung (g)

X là hàm lượng tro (%)

Lấy kết quả trung bình của năm lần thí nghiệm song song

2.2.3 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được chiết theo phương pháp chiết rắn lỏng Có nhiều kỹ thuật chiết như: chiết ngấm kiệt, chiết ngâm dầm, chiết Soxhlet, chiết lôi cuốn hơi nước…

Đối với kỹ thuật chiết ngấm kiệt: mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, EtOAc và BuOH Với mỗi loại dung môi được chiết ba lần Cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng để tiếp tục nghiên cứu

Đối với kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu thực vật (bột cây) trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả

Rót dung môi tinh khiết (H2O, MeOH) vào bình cho đến bề mặt của lớp bột cây Chiết mẫu ở nhiệt độ từ 550C – 600C Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc Quá trình chiết được lặp lại nhiều lần, mỗi lần chiết khoảng 1h Gộp dịch chiết, cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không, thu được cao chiết tổng Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo lộn, xốc đều hoăc sử dụng máy siêu âm Cao chiết tổng này được chế thêm nước và chiết phân lớp lần lượt với n-hexane và

CH2Cl2 bằng phễu chiết Với mỗi loại dung môi thực hiện chiết 3 lần Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao chiết n-hexane và CH2Cl2) để tiếp tục nghiên cứu

Trong khuôn khổ đề tài này, tôi thực hiện việc chiết mẫu theo kỹ thuật chiết ngâm dầm

2.2.4 Phương pháp tách và tinh chế chất

Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng với các hệ