Xác định hàm lượng khán thể dịch tả lợn ở lợn nái và so sánh hiệu lực của một số loài vaccxin dịch tả lợn hiện đang lưu hành tại việt nam

Luận văn

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp I

-

PHạM THị THANH BìNH

Xác định hàm lượng kháng thể kháng bệnh dịch tả lợn ở lợn nái và so sánh hiệu lực của một số loại vaccine dịch tả lợn hiện đang lưu hành tại Việt Nam

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYễN TIếN DũNG

Hà Nội - 2006

lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và ch−a từng đ−ợc ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

văn này đã đ−ợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn

đều đã đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc./

Tác giả

Phạm Thị Thanh Bình

Lời cảm ơn

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn, với sự nỗ lực của cá nhân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết

ơn và cảm ơn chân thành tới:

Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo Khoa sau Đại học, Khoa Chăn nuôi Thú Y - Trường Đại học Nông nghiệp, cán bộ Viện Thú Y Quốc Gia và đặc biệt các cán bộ của Bộ môn Siêu vi trùng - Viện Thú Y, những người đã giúp

đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập, tiếp thu kiến thức trong trương trình học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Tiến Dũng, Trưởng

bộ môn Siêu vi trùng Viện Thú y Quốc gia, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Cảm ơn các chủ trang trại chăn nuôi mà tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài, bởi lý do tế nhị chúng tôi đặt tên là trại A và B trong luận văn này, đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực hiện các nghiên cứu thí nghiệm

Cảm ơn sâu sắc tới gia đình và những người thân đã động viên, chia sẻ

và giúp đỡ tôi vượt qua mọi khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

và hoàn thành luận văn

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn !

Tác giả luận văn

Phạm Thị Phạm Thị Thanh Bình Thanh Bình Thanh Bình

Môc lôc

4.1 §iÒu tra t×nh h×nh sö dông vaccine DTL vµ mét sè th«ng tin vÒ bÖnh

4.2 Thực trạng hiệu giá kháng thể kháng bệnh DTL ở lợn nái nuôi tại

4.3 Thực trạng hiệu giá kháng thể thụ động kháng bệnh DTL ở lợn con

Đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng ở lợn con đối với vaccine DTL

4.3.2 Thực trạng đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng ở đàn lợn giống của

4.3.3 ảnh hưởng của kháng thể thụ động kháng bệnh DTL đối với miễn

dịch chủ động của lợn con tại thời điểm tiêm phòng lúc 3 tuần tuổi (trại A, sử dụng vaccine ngoại) và 4 tuần tuổi (Trại B, sử dụng

4.4 So sánh hiệu lực của một số loại vaccine phòng bệnh DTL thông qua

Danh mục các chữ viết tắt

BVDV : Bovine Viral Diarrhea Virus DTL : Dịch tả lợn

HGKT : Hiệu giá kháng thể KTTD : Kháng thể thụ động

Danh mục các bảng Bảng 4.1 Tình hình sử dụng vaccine phòng bệnh DTL cho đàn lợn con tại

100 trang trại chăn nuôi lợn sinh sản ở một số tỉnh khu vực phía Bắc 57 Bảng 4.2 Một số thông tin về sự hiểu biết bệnh DTL tại các trang trại chăn

Bảng 4.3 Phân bố hàm lượng kháng thể kháng bệnh DTL trên đàn lợn nái

Bảng 4.4 Phân bố hàm lượng kháng thể kháng bệnh DTL trên đàn lợn nái

Bảng 4.5 Hiệu giá kháng thể thụ động trên đàn lợn con tại thời điểm 4 tuần

Bảng 4.6 Hiệu giá kháng thể kháng bệnh DTL tại thời điểm sau tiêm

phòng 20 ngày đối với mũi 1 và mũi 2 của đàn lợn giống trại B 67 Bảng 4.7 ảnh hưởng của kháng thể thụ động kháng bệnh DTL đối với miễn dịch

chủ động của lợn con tại thời điểm tiêm phòng lúc 21 ngày tuổi (3 tuần) 70 Bảng 4.8 ảnh hưởng của kháng thể thụ động kháng bệnh DTL đối với

miễn dịch chủ động của lợn con tại thời điểm tiêm phòng lúc 28

Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra thân nhiệt của các lô lợn trước và sau khi tiêm

Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra thân nhiệt của lợn trước và sau khi công cường độc 77 Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra bạch cầu của lợn trước và sau khi tiêm vaccine 79 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra bạch cầu của lợn trước và sau khi công cường độc 80 Bảng 4.13 Diễn biến hàm lượng kháng thể kháng bệnh DTL sau khi tiêm

Danh mục các sơ đồ, biểu đồ

Hình 4.6 Biểu diễn mối tương quan giữa kháng thể thụ động ở mức hiệu

giá kháng thể ≤≤≤≤ 6log2 với hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng 73 Hình 4.7 Biểu diễn mối liên quan giữa kháng thể chủ động ở mức hiệu

giá kháng thể > 6log 2 với hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng 73 Hình 4.8 Minh họa diễn biến nhiệt độ cơ thể lợn trước và sau khi tiêm

Hình 4.12 Biểu đồ minh họa diễn biến hiệu giá kháng thể DTL sau tiêm

1 Mở đầu

Bệnh dịch tả lợn (bệnh dịch tả, dịch tả lợn) là bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh chỉ xảy ra ở loài lợn, đặc trưng bởi tỷ lệ mắc bệnh cao và gây xuất huyết ở nhiều cơ quan Trong trường hợp cấp tính, bệnh gây chết hàng loạt lợn với tỷ lệ rất cao, gây tổn thất lớn về kinh tế và nguy hiểm cho ngành chăn nuôi Bệnh xuất hiện trên thế giới cách đây hơn 100 năm và tồn tại ở nhiều quốc gia châu á và một số quốc gia châu Âu châu Mỹ (Nguyễn Tiến Dũng, Henry Too, 2002) [5, 32]

Đj có rất nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật đóng góp vào việc hiểu biết

về bệnh dịch tả lợn (DTL) cũng như các phương pháp phòng chống bệnh Tuy nhiên, cho tới nay bệnh dịch tả lợn vẫn tiếp tục được coi là bệnh nguy hiểm và gây nhiều thiệt hại nhất cho ngành chăn nuôi lợn (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) [5]

ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1923 và gây nhiều đợt dịch nghiêm trọng cho đến nay (Đào Trọng Đạt, 1989) [9] Đặc điểm của bệnh dịch tả lợn hiện nay là phát sinh lẻ tẻ, ít thành ổ dịch lớn Bệnh không điển hình cả về triệu chứng lâm sàng lẫn bệnh tích Thể cấp tính, quá cấp tính biểu hiện ít, trong khi đó xuất hiện nhiều thể mjn, thể ẩn, hiện tượng mang trùng Tuy bệnh dịch tả lợn là một trong số các bệnh được quy định phải tiêm phòng bắt buộc và phải công bố dịch nhưng kết quả tiêm phòng ở nước ta còn đạt quá thấp (Bùi Quang Anh, 2001) [1]

Việc phòng chống bệnh thường chủ yếu là kết hợp tiêm phòng vaccine và các phương pháp vệ sinh, kiểm dịch Đj có một số công trình khoa học nghiên cứu [8, 45, 7, 12] cho thấy mối liên quan giữa hàm lượng kháng thể kháng bệnh DTL ở lợn nái (nái) có ảnh hưởng đến sự bảo hộ và hình thành kháng thể

ở lợn con, và thời điểm thích hợp tiêm phòng cho lợn con Thực chất công việc

này đòi hỏi phải có sự nghiên cứu một cách khoa học trên nhiều lĩnh vực liên quan đến bệnh dịch tả lợn như: hàm lượng kháng thể kháng bệnh DTL ở nái, cũng như hiệu quả của vaccine đối với miễn dịch chống bệnh dịch tả lợn ở lợn con Trên thực tế, việc tiêm phòng đều đặn thường chỉ được tiến hành ở các trang trại chăn nuôi tập trung, mỗi một loại vaccine DTL được sử dụng khác nhau theo sự khuyến cáo của các hjng sản xuất trong và ngoài nước trong khi người chăn nuôi chưa hiểu về tình trạng miễn dịch trong đàn cũng như loại vaccine nào là tối ưu để sử dụng Do đó, bệnh DTL vẫn lác đác nổ ra trong các trang trại chăn nuôi tập trung này

Để góp phần vào việc khống chế bệnh dịch tả lợn và tìm hiểu thực tế về tình trạng miễn dịch của đàn lợn nái cũng như bước đầu đánh giá các loại vaccine DTL đang có mặt trên thị trường, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định hàm lượng kháng thể kháng bệnh dịch tả lợn ở lợn nái và so sánh hiệu lực của một số loại vaccine dịch tả lợn hiện đang lưu hành tại Việt Nam”

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Lịch sử và tình hình bệnh DTL

2.1.1 Lịch sử và tình hình bệnh DTL trên thế giới

Bệnh DTL đj xuất hiện trên thế giới cách đây hơn trăm năm Nguồn gốc xuất hiện bệnh này chưa được xác định rõ song vẫn còn hai quan điểm: (i) Bệnh DTL xảy ra lần đầu tiên ở Tenesse vào khoảng năm 1810, sau đó bệnh xuất hiện Pháp năm 1822, ở bang Ohio (Mỹ) vào năm 1830, ở Đức năm 1893 (Dahle.J, 1992) [26] (ii) Bệnh DTL lần đầu tiên xuất hiện ở nước Anh năm

1862 (Fuchs, 1968) [31] sau đó lây sang các nước châu Âu khác

Hiện nay bệnh lan tràn khắp thế giới và được coi là bệnh gây nhiều thiệt hại nhất cho ngành chăn nuôi lợn ở Mỹ chương trình thanh toán bệnh DTL bắt đầu năm 1962 và kết thúc sau đó 14 năm tiêu tốn hết 140 triệu đô la (van Oirschot 1992) [51]

ở châu Âu, bệnh DTL đj được khống chế một cách ráo riết thông qua tiêm phòng vào những năm của thập kỷ 60-70 trong thế kỷ XX, sau đó người

ta ngừng tiêm phòng để phát hiện và loại thải lợn mang trùng thông qua việc theo dõi huyết thanh của lợn Sau 16 năm nỗ lực tiêu diệt, bệnh DTL được xoá

bỏ năm 1978 ở Mỹ Anh và Bắc Ai Len là quốc gia sạch bệnh DTL từ năm

1965 nhưng bệnh lại trở lại Anh Quốc năm 1986, cả thảy có 7781 con lợn bị tiêu huỷ từ 26 ổ dịch, tiêu tốn lên tới 450.101 pao (Williams D.R và cs, 1998) [54] Chương trình tiêu diệt bệnh DTL là bắt buộc ở các quốc gia trong EU, tuy nhiên, bệnh vẫn lác đác nổ ra Năm 1994, có 52 ổ dịch nổ ra ở Bỉ bắt buộc nước này phải tiêu diệt 90.000 con lợn (Koenen F và cs, 1996) [37]

Bệnh gây thiệt hại ở tất cả các quốc gia, kể cả những nước có tiềm lực kinh tế rất mạnh, từng cho là đj được thanh toán bệnh DTL hay các quốc gia

được coi là sau mấy chục năm không có bệnh DTL

Năm 1997, đj mang đậm một dấu ấn đối với những cán bộ thú y và những người hoạt động trong nghề chăn nuôi lợn: 5 nước EU đj phải chịu thiệt hại do bệnh DTL bùng phát: Đức, Hà Lan, ý, Tây Ban Nha, Bỉ; tính đến ngày 31/12/1997 có 424 ổ dịch DTL tại Hà Lan xuất hiện trong một năm (Mesplede A và cs, 1998) [17] Tại Cộng hoà liên bang Đức, bệnh DTL xảy ra liên tục từ tháng 11/1982 đến tháng 9/1984, 395.000 lợn đj bị tiêu hủy Theo Rassow (Bùi Quang Anh, 2001) [1], bệnh DTL xảy ra liên tục từ năm 1993

đến tháng 5/1999 ở đất nước này, làm tổng số lợn tiêu huỷ lên tới 11 triệu con (Henry Too, 2002) [32] Năm 1997: ở ý có 55 ổ dịch bệnh DTL, Tây Ban Nha

có 78 ổ dịch, Bỉ có 8 ổ dịch và Hà Lan có 424 ổ dịch (Edwards S 1998) [29] Chiến dịch thanh toán bệnh DTL ở ý tiến hành từ năm 1995-2003 và trong năm 2003, sau 8 lần giám sát huyết thanh học đối với virus DTL, nước ý công

- Phân tích thông tin di truyền ARN của virus DTL của các ổ dịch người

ta thấy do cùng một loại virus Sự lây lan dịch là do sự can thiệp chậm chễ của chính quyền

- Chẩn đoán xác định chậm, che giấu thông tin về dịch bệnh và bán chạy lợn bệnh

Bài học ở châu Âu còn cho chúng ta thấy rằng sau nhiều năm không tiêm phòng đàn lợn trở nên mẫn cảm hơn với virus, mặc dù chủng virus gây ra ổ dịch không phải là loại cường độc

ở Châu á, có lẽ bệnh DTL xuất hiện và được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1895 ở Malaysia [23] Ngoại trừ Nhật Bản, bệnh dịch tả lợn ngày nay được xem là phổ biến và có tính chất địa phương ở hầu hết các quốc gia châu á (Henry Too, 2002) [32]

Nhật Bản được coi là quốc gia không có bệnh DTL trong thời điểm hiện nay Kết quả này là nhờ vào sự nỗ lực và quyết tâm thanh toán bệnh DTL một cách triệt để của cường quốc châu á này: Nhật Bản đj rất lo lắng với bệnh DTL gây ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn trong vòng 70 năm, bệnh DTL nổ ra giảm dần trong khoảng thời gian 1970-1980 do việc sử dụng vaccine nhược độc chủng GPE Cuối năm 1990, chiến dịch thanh toán bệnh được thực hiện và giám sát chặt chẽ trong vòng 5 năm Năm 2001, Nhật Bản bắt đầu ngừng tiêm vaccine DTL cho đàn lợn và công bố là quốc gia sạch bệnh (Takashi Ogawa, 2003) [47]

Trận dịch tả lợn bùng phát ở Hàn Quốc năm 2003 cũng là một sự cảnh báo về tính chất nghiêm trọng của bệnh DTL Những trận dịch xuất hiện ở các quốc gia châu á có xu hướng xảy ra sau những thiếu sót trong tiêm phòng, thay đổi chương trình tiêm phòng hoặc sau những biến động về lượng lợn trong đàn [32]

2.1.2 Lịch sử và tình hình bệnh dịch tả lợn tại Việt Nam

Bệnh DTL được phát hiện và mô tả lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm

1923 bởi Houdemer (Đào Trọng Đạt, 1985) [9] đến nay và luôn là mối đe doạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nước ta (Lê Minh Chí, 1998; Takashi Ogawa, 2003) [3,47]

Năm 1968 là năm có số ổ dịch xảy ra nhiều nhất ở Miền Bắc, có tới 481

ổ dịch nổ ra được thống kê (Lê Độ, 1981) [11] Năm 1972 - 1973, dịch phát

ra ở Nghệ An và Hà Tĩnh (Nguyễn Bá Huệ, 1975) [14] Cũng trong năm

1973, dịch xảy ra ở 11 trại lợn xung quanh Sài gòn Năm 1976 – 1978, dịch xảy ra tương đối rộng ở một số tỉnh Trung Trung Bộ: năm 1976 có 17 ổ dịch, năm 1977 có 36 ổ dịch và năm 1978 có 18 ổ dịch (Bùi Quang Anh, 2001) [1] Năm 1981, 15 tỉnh thuộc Nam Bộ có dịch làm chết 145.078 con lợn (Đào Trọng Đạt, 1985) [9]

Theo điều tra dịch tễ học từ 1995 – 1997, tại các tỉnh Ninh Thuận, Khánh

Hoà, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngji, Quảng Nam đều xuất hiện lợn bị bệnh dịch tả với số lượng không nhiều nhưng lẻ tẻ thường xuyên và có ở khắp nơi trong tỉnh (Nguyễn Thị Phương Duyên, 1999) [4] Theo báo cáo tại hội nghị toàn quốc bệnh dịch tả lợn năm 2003 tại Hà nội, bệnh DTL xuất hiện liên tục

từ năm 1998- tháng 9/2003 ở hầu hết các tỉnh phía Bắc, phía Nam nước ta Bệnh xuất hiện lẻ tẻ tại các cơ sở chăn nuôi, không thành ổ dịch lớn

Như vậy, bệnh DTL hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam tồn tại dưới hai dạng: mjn tính và bẩm sinh (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) [5] DTL vẫn

đang là bệnh quan trọng trong chăn nuôi lợn, cần được khống chế để phát triển ngành chăn nuôi lợn

2.2 Virus dịch tả lợn

2.2.1 Nguồn gốc virus dịch tả lợn

Năm 1895, Salmon và Smith cho rằng bệnh DTL do một loại vi khuẩn gây ra và đặt tên cho loại vi khuẩn này là Bacillus cholerae suis Năm 1903, Schweinitz và Dorset đj xác nhận bệnh DTL là do một loại virus gây ra (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [18] Năm 1947, Holmes đặt tên cho virus gây bệnh DTL là Tortorsuis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [19] Nguồn gốc của virus DTL có rất nhiều ý kiến khác nhau những nghiên cứu gần đây xác

định virus gây bệnh DTL thuộc giống Pestivirus, họ Flaviridae, có tính kháng nguyên chung với virus gây bệnh tiêu chảy và bệnh Biên giới ở trâu

độc đến loại không độc, nhưng tất cả đều cùng một týp kháng nguyên

Độc lực của các chủng gây bệnh thay đổi lớn Chủng có độc lực cao gây bệnh thể cấp tính và có tỷ lệ chết cao, trong khi đó các chủng có độc lực trung bình thường gây bệnh thể á cấp tính hoặc mjn tính Các chủng có độc lực thấp gây bệnh nhẹ hoặc không biểu hiện triệu chứng lâm sàng Tuy nhiên chủng có độc lực thấp có thể gây chết lợn từ bào thai hoặc lợn mới sinh (Dunne, 1975) [28]

2.2.2.2 Hình thái, cấu trúc

Dưới kính hiển vi điện tử, virus DTL có đường kính khoảng 40-50 nm (nanomet) với vỏ bọc nucleocapsid dày khoảng 29 nm Nó bao gồm ARN virus, màng bao quanh nhân Trên bề mặt của các virion có những gai lồi dài khoảng 6-8 nm, là thành phần có tính chất bảo vệ virus Độ dài của gai này phụ thuộc vào gradient nồng độ của tế bào để virus sinh sôi nảy nở (Horzinek, 1981) [33]

Virion của virus chứa một chuỗi ARN đơn có phân cực, dài khoảng 12,3

kb (van Oirschot, 1992) [52] Bộ gen có trình tự sắp xếp theo một trật tự nhất

định, hệ thống mật mj của một polyprotein khoảng gần 3900 amino axit (a xít

a min) (Meyers et al 1989, Moormann et al 1990) [39, 40]

2.2.2.3 Độc lực

Không có mối liên quan giữa sự khác nhau của tính kháng nguyên với độc lực của virus DTL (Wensvoort et al 1989) Trong một nghiên cứu khác lại cho rằng tính độc của virus DTL sẽ bị giảm đi nhanh chóng bởi sự có mặt của kháng thể tiêu chảy ở bò (Bovine Viral Diarrhea Virus -BVDV) hơn là kháng thể virus DTL (Kamijyo et al 1977), (trích dẫn theo Bùi Quang Anh, 2001) [1]

Tuỳ thuộc vào độc lực của chủng virus gây bệnh mà tỷ lệ chết có thể từ 0-100% (Stewart W.C, 1981) [44]

Độc lực của chúng gây bệnh rất lớn Các chủng độc lực cao gây bệnh DTL cấp tính có tỷ lệ chết cao, trong khi đó các chủng có độc lực trung bình thường gây các nhiễm trùng á cấp tính và mjn tính Các chủng của virus biến chủng thường có

độc lực thấp hơn độc lực virus ban đầu (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [19]

Theo Bùi Quang Anh (2001) [1]: độc lực của virus DTL dường như không ổn định, việc tăng cường độc lực có thể được tiến hành sau một hoặc nhiều lần tiêm truyền qua lợn Có thể phân biệt độc lực của virus DTL ở bảng dưới đây (Dunne H.W., 1975) [28]

Độc lực của virus DTL

Dạng độc lực của virus Chỉ tiêu

Nuôi trong môi

trường tế bào PK 15

Nhân lên nhanh, điểm huỳnh quang lớn, rõ

Nhân lên chậm, điểm huỳnh quanh yếu Trong cơ thể động

vật

Nồng độ virus trong máu cao, thời gian tồn tại lâu Thường nhiễm vào tế bào biểu mô, tế bào lưới, đại thực bào và hạch Amiđan

Thường giới hạn ở các

tế bào biểu mô mạch quản

Ngày nay người ta đj ứng dụng các phương pháp làm giảm độc lực của virus và thu được một số chủng nhược độc có thể sử dụng làm vaccine như virus DTL chủng C, chủng GPE, chủng Thiverval

2.2.2.4 Phân loại

Theo van Oirschot (1992) [52]: nhờ áp dụng kỹ thuật kháng thể đơn dòng (MABs) có thể phân loại các chủng đa dạng của virus dịch tả lợn thành hai nhóm: Nhóm I: Gồm các chủng cường độc Alfort, chủng C, chủng Thiverval Nhóm II: Gồm các chủng 331 và nhiều chủng khác phân lập được từ lợn

bị bệnh

Mới đây khi nghiên cứu về dịch tễ học phân tử cho thấy virus DTL có 3 nhóm chính (Ken I nui & Nguyễn Tiến Dũng, 2003) [36]

- Nhóm I: hầu hết là các chủng phân lập từ trước thập kỷ 70 ở Mỹ và châu Âu

- Nhóm II: hầu hết là các chủng mới phân lập gần đây ở châu Âu và châu á

- Nhóm III: chỉ có ở châu á, ngoại trừ một chủng phân lập ở Anh năm 1966

ở châu á, nhóm I vẫn đang còn tồn tại, nhóm II đang trở thành nhóm gây bệnh chính

ở Việt nam, nhóm I tồn tại đến năm 1991 Bệnh DTL hiện nay do nhóm

II gây ra ở cả miền Nam và miền Bắc Theo Nguyễn Tiến Dũng [5], số lượng các chủng virus DTL phân lập thuộc nhóm này tăng lên từ năm 1997

2.2.2.5 Đặc tính nuôi cấy

Có thể nuôi cấy virus trên môi trường tế bào thận lợn như CPK, PK15,

SK 6 hoặc FS-L3 Virus không gây bệnh tích tế bào (CPE) do virus nhân lên

có giới hạn trong nguyên sinh chất của tế bào Thế hệ đầu tiên của virus giải phóng ra khỏi tế bào khoảng 5-6 giờ sau khi gây nhiễm (van Oirschot, 1980) [50] Trong môi trường tế bào, virus lây lan sang tế bào bên cạnh và từ tế bào

mẹ sang tế bào con thông qua cầu nối nguyên sinh chất Do virus trưởng thành trong nguyên sinh chất của tế bào nên không thể phát hiện được kháng nguyên của virus DTL trên bề mặt tế bào bị nhiễm (Saatkamp H.W, 1998) [43]

2.2.2.6 Sức đề kháng của virus DTL

Virus DTL có sức đề kháng yếu, tuỳ thuộc vào trạng thái vật lý của chất chứa virus, ví dụ virus trong dịch nuôi cấy tế bào bị vô hoạt ở 60oC trong 10 phút, nhưng ở trong máu đj khử fibrin lại không bị vô hoạt ở 68oC trong vòng

30 phút Virus khá bền vững ở pH 5-10, trên dưới giá trị pH này, virus bị phá huỷ nhanh chóng Các chất tan như Ether, Chloroform, Deoxycholate, Nonided, P40, Saponin làm bất hoạt nhanh virus Người ta thường dùng NaOH 2% để tiêu độc chuồng trại Trong phân gia súc, virus có thể sống sót vài

ngày, sống lâu ở các sản phẩm thịt, thịt lợn đông lạnh do đó có tầm quan trọng rất lớn về mặt dịch tễ

2.3 Dịch tễ bệnh DTL

Virus nói chung có cấu trúc tương đối giống nhau nhưng cơ chế gây bệnh của từng loại và sự tồn tại của từng loại virus trong cơ thể con vật và môi trường thì có những điểm khác biệt Chìa khoá thành công của các biện pháp phòng chống lại bệnh do virus gây ra là hiểu được bản chất của các đặc điểm của virus gây bệnh hay nói cách khác là dịch tễ học của bệnh đó Bệnh DTL cũng không nằm ngoài thông lệ nói trên

2.3.1 Loài vật mắc bệnh, lứa tuổi, mùa vụ

Loài vật mắc bệnh

Virus DTL có mặt ở khắp các quốc gia trên toàn thế giới và lợn là kí chủ duy nhất (bao gồm cả lợn nhà và lợn rừng) Bệnh có thể lây từ lợn rừng sang lợn nhà hoặc từ lợn nhà sang lợn rừng Các loài động vật khác và người không mắc bệnh này (Nguyễn Lương, 1997) [15] Nhiều tác giả đj gây bệnh cho chuột lang, chuột nhắt, gà, ngựa, trâu nhưng bệnh không biểu hiện trên những loài vật thí nghiệm này Năm 1941, Tenbroek (Bùi Quang Anh, 2001) [1] thông báo về việc nuôi cấy thành công virus DTL trong môi trường tế bào dịch hoàn lợn trong dung dịch Tyrode Năm 1950, Coronel và Albis (Bùi Quang Anh, 2001) [1] thực hiện thí nghiệm tiêm truyền virus DTL vào phôi trứng vịt và đj thích ứng được virus DTL trên phôi vịt Sau đời thứ 8 cấy truyền qua phôi vịt, virus đj mất độc lực với lợn nhưng gây được miễn dịch cho lợn Fonanelli và cộng sự (1959) đj thử tiêm cho phôi gà nhưng không thành công Năm 1965, Biro đj tìm cách thích ứng virus qua thỏ cho cừu (Nguyễn Lương, 1997) [15]

trạng miễn dịch của đàn lợn (Đào Trọng Đạt và Cs, 1990) [10] Lợn đực và lợn nái không biểu hiện triệu chứng lâm sàng nhưng có tỷ lệ mang trùng virus DTL [2,5]

Theo Bùi Quang Anh (2001) [1], lợn từ 2-6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh DTL cao nhất trong tổng số lợn mắc bệnh, lợn con theo mẹ 19, 24%; lợn trên

6 tháng tuổi 12,08%; còn lợn nái và lợn đực tỷ lệ mắc bệnh DTL thấp nhất (0,21 – 2,46%) nhưng lại là nguồn lây lan dịch bệnh

Mùa vụ mắc bệnh:

Bệnh DTL ở nước ta phát ra quanh năm Tuy nhiên, do biến động về cơ cấu đàn lợn và sự thay đổi của thời tiết nên bệnh xảy ra không theo một quy luật nhất định nào cả và cũng không có vùng dịch rõ rệt Theo thống kê của Lê

Độ (1981) [11] về tình hình bệnh DTL ở các tỉnh miền Bắc từ năm 1960 – 1980 cho thấy số ổ dịch xảy ra ở tháng 11, tháng 12 năm trước đến tháng 1, 2, 3 năm sau chiếm tới 80% số ổ dịch trong năm Nguyên nhân dịch xảy ra nhiều trong thời gian này có thể do trong vụ đông xuân do ảnh hưởng của thời tiết khí hậu nên thiếu nguồn nguyên liệu thức ăn tốt công với hiện tượng thu gom lợn để giết mổ trong dịp tết cổ truyền làm cho số lợn đj có miễn dịch bị thay thế bởi

đàn lợn mới chưa kịp tiêm phòng theo đúng lịch tiêm phòng hàng năm

2.3.2 Sự truyền lây

ở điều kiện tự nhiên, virus DTL xâm nhiễm vào lợn bằng đường mũi, miệng thông qua thức ăn, nước uống và tiếp xúc (van Oirschot, 1992, Nguyễn Tiến Dũng, 2002) [52, 5]

Mặc dù đj có miễn dịch bằng tiêm phòng, lợn vẫn có khả năng bị nhiễm

và bài thải virus DTL ra môi trường xung quanh (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) [5] Lợn bệnh bài thải một lượng lớn virus có trong dịch mũi, nước bọt, nước mắt, nước tiểu và phân ngay cả trước khi lợn có biểu hiện triệu chứng bệnh Lợn mang trùng sẽ bài thải virus trong một thời gian dài làm lây lan mầm bệnh trong trại hoặc khu vực chăn nuôi (van Oirschot, 1992) [52]

* Theo Nguyễn Tiến Dũng (2002) [5], bệnh DTL có thể truyền lây từ trại lợn này sang trại khác do:

- Cho lợn ăn đồ thừa nhà bếp có những mẩu thịt lợn bị bệnh DTL

- Qua các véc tơ cơ học: người chăn nuôi (giày dép, quần áo có dính virus), đồ dùng (cuốc xẻng, bao tải đựng thức ăn), các phương tiện vẫn chuyển lợn thương phẩm từ trại này đến trại khác hoặc đến các lò mổ cũng làm lây lan bệnh dịch

- Do tiếp xúc: đưa lợn mắc bệnh từ nơi khác về nhập nuôi cùng lợn sẵn có

* Tuy nhiên một nghiên cứu mới đây cho thấy vai trò của sự truyền lây virus DTL qua các yếu tố cơ học được đánh giá có ảnh hưởng rất lớn (Dewulf

và cộng sự, 2002) [27]

2.3.3 Sinh bệnh học

Sự nhiễm bệnh tự nhiên với các chủng virus DTL có độc lực cao được

đặc trưng bởi các giai đoạn:

- Nhiễm virus ở hạch lâm ba amidan

- Nhiễm virus huyết

- Nhiễm virus phủ tạng

Trong trường hợp lây nhiễm bệnh tự nhiên với các chủng có độc lực cao,

virus xâm nhập vào cơ thể lợn thông qua con đường mũi – miệng tới lưu trú vị trí đầu tiên là hạch amiđan Tại đây virus tăng sinh ở các tế bào thượng bì, sau

đó xâm nhập vào máu và vào tế bào hệ võng mạc nội mô đi vào vòng tuần hoàn lớn và nhiễm virus ở phủ tạng và các hạch lâm ba Virus sản sinh nhiều nhất trong tế bào nội mô của mạch quản Một số lượng lớn virus được tạo ra ở mô bào đích thứ hai như lá lách, hạch lâm ba, nội tạng, tuỷ xương, dẫn đến nồng độ virus cao trong máu và xâm nhập vào các cơ quan chức năng khác như hệ thần kinh trung ương, hệ thống hô hấp, hệ thống tiêu hoá Tại cơ quan

bị nhiễm virus có hiện tượng thực bào do các đại thực bào tiến hành và virus phát triển thông qua hệ thống lưới nội bì mao mạch Sự nhân lên của virus trong bạch cầu và các hệ thống lưới nội bì dẫn đến giảm bạch cầu do đó lợn dễ

bị nhiễm khuẩn thứ phát Các chủng virus có độc lực cao lan tỏa trong cơ thể lợn trong vòng 5-6 ngày (Trần Đình Từ, 1990) [21] Cách lây nhiễm đối với các chủng virus có độc lực trung bình cũng tương tự cách lây nhiễm với những chủng có độc lực cao nhưng bệnh tiến triển chậm hơn và số luợng virus nhân lên cũng ít hơn Lây nhiễm với những chủng virus có độc lực thấp chủ yếu ở các biến đổi hệ bạch huyết và các cơ quan toàn hoàn cục bộ

Do những bệnh tích ở mạch quản, các phủ tạng bị thấm tương dịch, xuất huyết, nhồi huyết, hoại tử cục bộ Virus gây hình thành mụn loét ở niêm mạc ruột già sau khi gây hoại tử ở những nang lâm ba riêng biệt và làm đông sợi huyết tạo thành những nốt loét hình cúc áo ở ruột già, đây là một trong những bệnh tích đặc trưng của bệnh DTL

Có thể tóm tắt cách sinh bệnh của virus DTL qua sơ đồ dưới đây:

Virus (từ môi trường)

Mạch quản và hệ thống lưới nội mô (nhiễm trùng huyết lần 1)

↓ Lá lách (tăng sinh tại đây) ↓

Vòng tuần hoàn bạch huyết (nhiễm trùng huyết lần 2)

Các cơ quan (njo, hệ hô hấp, tiêu hoá, sinh sản)

Theo Bùi Quang Anh (2001) [1]:

- Lợn nái mang thai, virus DTL có thể truyền qua nhau thai ở tất cả các giai đoạn Virus theo máu và phát triển ở một số nơi dọc theo nhau thai, cuối cùng lan truyền từ bào thai này đến bào thai khác (van Oirschot, 1979) Tại các bào thai cũng phân bố trong các cơ quan nội tạng và đường máu giống như ở lợn sau khi sinh nhiễm bệnh với chủng có độc lực cao Hậu quả cuối cùng của cách lây nhiễm từ trong bào thai có thể rất khác nhau tuỳ thuộc vào thời gian lây nhiễm và độc lực của chủng virus (Terpstra C., 1991)

- Những bào thai bị nhiễm bệnh ở giai đoạn 45 ngày đầu sau khi thụ thai thường có khuynh hướng chết trước khi sinh hoặc phát sinh hiện tượng lây nhiễm dai dẳng và có đáp ứng miễn dịch cao hơn các bào thai nhiễm bệnh lúc

65 ngày hoặc muộn hơn Mặt khác những bào thai lây nhiễm với những chủng virus có độc tính trung bình lúc 45 ngày cuối của thời kỳ thai thường có biểu

hiện triệu chứng bệnh sau khi sinh hoặc một thời gian ngắn sau khi sinh hoặc thải virus trong trường hợp lây nhiễm với những chủng virus có độc lực thấp (van Oirschot, 1997) [53]

- Khi virus DTL xâm nhập, hệ lưới nội mạc võng mô của thành mạch quản có nhiều biến đổi Các tế bào mang tính thực bào sưng to do thuỷ thũng, các mạch quản ngoại biên gijn rộng, một số bị tắc mạch dẫn đến các bệnh tích

đặc trưng của DTL như xung huyết, xuất huyết, nhồi huyết, hoại tử, viêm njo

và thoái hoá các tế bào nội bì gây nghẽn mạch thấm nhiễm bạch cầu qua mạch thường thấy ở 70-90% trường hợp lợn chết (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [18] 2.4 Bệnh DTL

2.4.1.2 Thể cấp tính

Dạng bệnh này thường gây sốt cao từ 41-42oC, lợn biểu hiện mệt lả một cách điển hình (lợn bỏ ăn, nằm chất đống) Sau 24-48 giờ mắt sưng húp và viêm kết mạc với các triệu chứng ngoài da (vết chàm tím, xuất huyết hoặc tụ huyết màu đỏ tại các vùng da mỏng như tai, mõm, bụng, chân, bẹn, bao dương vật ), lợn tiêu chảy thối khắm với mùi đặc trưng, lợn có thể có triệu chứng hô hấp (ho) và triệu chứng thần kinh (liệt nhẹ các chi sau, đi loạng choạng, run cơ bắp), tử vong trong thời gian 6-20 ngày sau khi phát bệnh

2.4.1.3 Thể á cấp tính hoặc mCn tính

Thể bệnh này diễn ra trong 3 giai đoạn:

- Giai đoạn đầu kéo dài trong thời gian 10-15 ngày, toàn bộ đàn lợn phát bệnh, các triệu chứng cục bộ giống như thể cấp tính nhưng với mức độ nhẹ

- Giai đoạn hai là giai đoạn thuyên giảm

- Giai đoạn ba với các mầm bệnh bội nhiễm và sự phát bệnh toàn thân kèm với các triệu chứng cục bộ về hô hấp hoặc tiêu chảy kết hợp (viêm phổi

và viêm ruột thông thường do Salmonella) Bệnh súc gày mòn dần, sau đó tử vong trong vòng thời gian 1-3 tháng

2.4.1.4 Thể không điển hình

Thể bệnh này biểu thị dưới các dạng rất khác nhau như rối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, thai chết, thai gỗ, dị dạng gây run rảy bẩm sinh, rối loại vận động, chết yểu ), chậm lớn, chết rải rác Hơn nữa, trong các trường hợp không điển hình, virus DTL có thể lưu hành một cách không rõ ràng nhất là ở lợn sinh sản với các trường hợp lâm sàng lẻ tẻ nổ ra khi có các

điều kiện không thuận lợi (Mesplede A,1999) [17]

Theo Nguyễn Lương, 1997 [15] đây là thể khó phân biệt của DTL vì bệnh kéo dài và không có các thời kỳ rõ rệt Thể bệnh nhẹ hơn bình thường và thường chỉ một loại phủ tạng có bệnh tích: chẳng hạn chỉ phổi, ruột, hay thần kinh đặc biệt bị bệnh Ngược lại, khi các triệu chứng lại đặc biệt hơn nhiều Nguyên nhân của thể không điển hình có thể có nhiều: độc tố của virus gây bệnh, các nhiễm trùng thứ phát, sức đề kháng bẩm sinh của giống nòi, thức ăn, cách nuôi dưỡng chăm sóc Triệu chứng sẽ dễ dàng quan sát ở những con lợn trong trạng thái có sức khoẻ kém (Rober, 1968: quan sát trong Viện nghiên cứu ở Đảo Reims) Lợn chậm phát triển và suy dinh dưỡng, các bệnh tích và triệu chứng không giống bệnh DTL thông thường

2.4.2 Mối quan hệ giữa độc lực của virus DTL lây bệnh với các thể bệnh biểu hiện

- Các chủng virus có độc lực khác nhau thì gây ra thể bệnh khác nhau: các chủng độc lực cao thì gây bệnh thể cấp tính với sự bùng phát các ổ dịch có

tỷ lệ lợn chết cao Các chủng virus có độc lực trung bình thường gây ra thể bệnh á cấp tính hoặc thể không điển hình Các chủng virus có độc lực yếu chỉ gây bệnh nhẹ

- Các chủng virus có độc lực khác nhau thì tốc độ lây lan cũng khác nhau: lợn nhiễm bệnh DTL với chủng virus cường độc thường lây lan nhanh hơn và gây tỷ lệ chết cao hơn so với chủng nhược độc (Trần Đình Từ, 1990) [21] 2.4.3 Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng chính của bệnh DTL là kém ăn, chậm chạp, ể oải và tiếp theo là táo bón và tiêu chảy Theo Nguyễn Tiến Dũng (2002) [5], những triệu chứng thông thường của bệnh DTL là:

- Sốt cao trên 40oC lợn bỏ ăn lông xù, run rẩy

- Da tai xuất huyết đỏ từng đám, ở những vùng bụng, chân có những

điểm xuất huyết lấm chấm (như muỗi đốt)

- Lúc đầu táo bón, sau chuyển dần sang tiêu chảy và tiêu chảy kéo dài Chúng có thể nằm túm tụm với nhau trên nền chuồng hay nằm chồng do lạnh

- Viêm kết mạc mắt, sưng mắt là dấu hiệu lâm sàng sớm nhận thấy nhất

ở lợn Viêm kết mạc nặng có thể thấy dịch mủ dày làm cho hai mí mắt dính lại với nhau

- Lợn bồn chồn, hay nằm vào một góc chuồng, sau đó đứng dậy đi lại rồi nằm một chỗ Lợn nằm và rên khẽ hoặc nghiến răng

- Tất cảc các loại lợn đều có thể mắc bệnh này nhưng thường các biểu hiện trên ở lợn 20-60kg

- Giảm bạch cầu huyết

* Các trường hợp lợn mắc bệnh mạn tính:

- Đối với thể bệnh này, dấu hiệu lâm sàng ít nghiêm trọng hơn và thời kỳ bệnh có thể kéo dài tới 30 ngày Những đặc điểm thường thấy là lợn kém ăn, gầy rạc dần và đi lại xiêu vẹo

- Một số trường hợp da tím bầm trước khi chết, một số khác lại đi tiêu chảy phân thối khắm, một số khác do kế phát vi khuẩn đường hô hấp gây chứng thở thể bụng

- Một kinh nghiệm khác để xác định bệnh DTL là chữa bằng các loại kháng sinh đều không khỏi

- Rất khó phân biệt lợn mắc bệnh DTL thể á cấp tính và mjn tính Lợn mắc bệnh dạng này có thể sống được tới 3 tháng nhưng hầu như cuối cùng đều bị chết Lợn mắc bệnh DTL thể á cấp tính và mjn tính có thể có những mụn viêm da giống bệnh đậu lợn (Too, 2002) [32]

* Hiện nay thể bệnh mjn tính đang phổ biến trong đàn lợn ở nước ta Tuỳ theo từng mức độ cường độc của chủng virus mà ta có thể thấy nhiều triệu chứng lâm sàng khác nhau:

- Thể bệnh DTL điển hình trong đó có siêu cấp tính, cấp tính và mjn tính là các dạng có các triệu chứng như đj diễn tả trên

- Thể bệnh DTL không điển hình biểu hiện ở hai loại: (i) loại thứ nhất biểu hiện rối loạn sinh sản, sảy thai, chết thai, hoặc thai gỗ, dị dạng, lợn con sinh ra run rảy, liệt, chết yểu hoặc lợn con dung nạp miễn dịch ( chết vào lúc 3-4 tuần tuổi) (ii) loại thứ hai là lợn mang trùng và chỉ phát bệnh trong trường hợp gặp các yếu tố bất lợi

2.4.4 Bệnh tích

Theo Đào Trọng Đạt (1990) [10], bệnh DTL là bệnh quần thể Khi quan sát bệnh tích cần tổng hợp ít nhất là từ 3 đến 5 con Nếu theo dõi mổ khám ngay từ những con lợn bệnh đầu tiên sẽ thấy biểu hiện đầy đủ các bệnh tích

của bệnh ở thể điển hình Theo quan sát của các tác giả Đào Trọng Đạt, Nguyễn Tiến Dũng (1989) [8], Nguyễn Xuân Bình (1998) [2], Bùi Quang Anh (2001) [1], báo cáo của các Chi cục thú y trong hội nghị toàn quốc về bệnh DTL (2003) việc tìm thấy đầy đủ các bệnh tích điển hình của bệnh DTL thời gian gần đây là rất khó

Nguyễn Tiến Dũng (2002) [5] cho rằng:đối với bệnh DTL, các bệnh tích cần chú ý xem xét để chẩn đoán là:

- Lách bị nhồi huyết, bên rìa lách có các đám tụ máu đen sậm Trong chẩn đoán nếu xảy ra 25-65% các trường hợp này, được coi như là một bệnh tích chỉ định cho bệnh DTL Cùng nhận định này còn có van Oirschot [51]

- Loét niêm mạc vùng van hôi manh tràng: phần nối giữa ruột già và ruột non có các đám loét bựa bên trong, các đám loét có hình tròn như chiếc cúc áo

- Loét amiđan, cuống lưõi, xuất huyết amiđan, tiểu thiệt

- Xuất huyết lấm chấm ở phủ tạng, thận, bàng quang, túi mật, niêm mạc dạ dày, ruột và ở ngoài da

- Các hạch ruột bị xuất huyết màu đỏ xen với màu trắng (gọi là đá hoa vân)

2.4.5 Chẩn đoán bệnh DTL

Bệnh DTL do virus gây ra cho một loài vật chủ duy nhất là lợn do đó để chẩn đoán bệnh DTL người ta thường dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích trong quá trình mổ khám và một số kỹ thuật chẩn đoán khác

2.4.5.1 Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng và bệnh tích mổ khám Việc chẩn đoán lâm sàng một ổ DTL thể cấp tính điển hình có thể dựa vào lịch sử bệnh, triệu chứng lâm sàng và những bệnh tích mổ khám như đj mô tả trong phần triệu chứng và bệnh tích mổ khám

Trên thế giới trước đây việc chẩn đoán bệnh DTL thường dựa vào phương pháp này (OIE manual, 1996) [41]

Nước ta hiện nay việc chẩn đoán bệnh DTL vẫn dựa chủ yếu vào kết quả

mổ khám (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) [5] Tuy nhiên, do tính diễn biến phức tạp của bệnh nên phương pháp này kém chính xác Để có kết quả chính xác người ta phải sử dụng các phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 2.4.5.2 Dựa vào kỹ thuật chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Kỹ thuật chẩn đoán trong phòng thí nghiệm đối với bệnh DTL thường dựa vào 3 tiêu chí:

Kiểm tra trên kính hiển vi: lấy bệnh phẩm của gia súc, nhuộm gram kiểm tra trên kính hiển vi Nếu không thấy vi khuẩn thì có thể nghi là bệnh DTL sau khi kết hợp với kết quả chẩn đoán lâm sàng Trong trường hợp bắt màu gram tức là có vi khuẩn, có thể nghi là bệnh ghép giữa DTL với một số bệnh khác (Nguyễn Lương, 1997) [15] Đây chỉ là phương pháp chẩn đoán loại trừ chứ không khẳng định

Tiêm truyền động vật thí nghiệm: theo Bùi Quang Anh (2001) [1], J.E.Pearson (1998) cho rằng: phương pháp phát hiện virus DTL cổ điển chính xác nhất là tiêm truyền cho lợn, song phương pháp này đòi hỏi phải có nhiều thời gian và rất tốn kém

Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm để chẩn đoán bệnh DTL theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) [19]:

- Dùng lợn để gây bệnh: lợn con từ 3-4 tháng tuổi, khoẻ mạnh, không nằm trong ổ DTL và chưa tiêm phòng vaccine DTL

- Bệnh phẩm là 1 ml máu và 0,5 gr lách của lợn nghi mắc bệnh, pha thành huyễn dịch 1/10, xử lý kháng sinh rồi gây bệnh cho lợn khoẻ đj được chọn bằng đường tiêm dưới da Nếu trong bệnh phẩm có virus DTL thì 3 ngày sau khi tiêm, lợn kém ăn, sốt cao 41-42oC, nhiệt độ này giữ vững trong vòng 4-5 ngày liền, lợn bỏ ăn, táo bón, con vật có hiện tượng viêm kết mạc mắt Sau một tuần lễ con vật ỉa chảy, phân có lẫn máu và có mùi hôi thối Nếu kéo dài

có thể gây triệu chứng thần kinh Cuối cùng nhiệt độ hạ thấp xuống 35-36oC, con vật mệt lả rồi chết

- Mổ khám: thấy lợn có những bệnh tích sau: niêm mạc miệng, lưỡi, lợi

tụ máu, loét, lách có hiện tượng nhồi huyết, thận xuất huyết đầu đinh ghim, trên những vùng da mỏng có những chấm xuất huyết, niêm mạc dạ dày, ruột

tụ máu, van hồi manh tràng, ruột già loét hình cúc áo

b) Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học

Đây là phương pháp đj và đang được áp dụng để chẩn đoán bệnh DTL tại Việt Nam

- Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch:

Phản ứng này được Mansi thực hiện lần đầu tiên năm 1957 để chẩn đoán virus DTL Phản ứng này chỉ có giá trị đối với lợn chưa được tiêm phòng vaccine DTL

Nguyên lý của phản ứng: trong môi trường thạch, kháng nguyên và kháng thể khuyếch tán theo mọi hướng nhưng nếu tương ứng thì tại chỗ gặp nhau sẽ kết hợp với nhau thành một vạch trắng đục mắt thường có thể nhìn thấy được

Nguyên liệu: tuỳ theo mục đích mà sử dụng kháng nguyên chuẩn hay kháng thể chuẩn

Kháng nguyên nghi: hạch, lách của lợn nghi mắc bệnh, nghiền với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/1 có pha thêm 1-2% axit phenic, lọc qua gạc và ly tâm lấy nước trong

Kháng nguyên dương: được chế tạo như trên hạch, lách của lợn được tiêm virus DTL cường độc

Kháng nguyên âm: được chế tạo như trên từ hạch, lách lợn khỏe mạnh

Kháng thể: là kháng huyết thanh DTL được chế từ lợn hoặc thỏ bằng phương pháp gây tối miễn dịch

Môi trường thạch dùng hệ thống chùm 6 hoặc 7 lỗ trong đó có 1 lỗ trung tâm Yêu cầu đường kính các lỗ phải bằng nhau

Đọc kết quả: căn cứ vào đường kết tủa

Phản ứng dương tính: ở phần thạch giáp giới giữa lỗ chứa kháng thể DTL với lỗ chứa kháng nguyên nghi xuất hiện đường kết tủa trắng, giống như vạch kết tủa ở phần thạch giáp giới giữa lỗ chứa kháng thể DTL và kháng nguyên dương

Phản ứng âm tính: ở phần thạch giáp giới giữa lỗ chứa kháng thể DTL với lỗ chứa kháng nguyên nghi không xuất hiện đường kết tủa, giống như đối chứng âm

- Phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu

Phản ứng này được Segre dùng lần đầu tiên để chẩn đoán DTL năm 1962 Nguyên lý của phản ứng: bình thường virus DTL không hấp phụ lên hồng cầu do đó phải xử lí hồng cầu bằng axit tanic 1%, chất này có một chức gắn với hồng cầu, còn một chức gắn với virus DTL, lúc này virus DTL dễ dàng hấp phụ lên hồng cầu cừu, thỏ hoặc chuột lang nhưng không gây ngưng kết hồng cầu Khi gặp kháng thể tương ứng, virus DTL sẽ kết hợp với kháng thể làm hồng cầu dính lại với nhau thông qua cầu nối kháng thể, gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu

Nguyên liệu:

Bệnh phẩm (kháng nguyên nghi) là lách, hạch lâm ba của lợn nghi mắc bệnh, nghiền với nước sinh lý, sau đó ly tâm lấy nước trong rồi cho hấp phụ lên hồng cầu thỏ hoặc chuột lang đj được xử lý bằng axit tanic 1%

Kháng thể dương là kháng huyết thanh DTL chế từ lợn được gây tối miễn dịch

Kháng thể âm là huyết thanh của lợn khoẻ mạnh

Đọc kết quả:

Phản ứng dương tính: có hiện tượng ngưng kết, hồng cầu rải đầy trên thành ống

Phản ứng âm tính: không có hiện tượng ngưng kết, hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn

- Phản ứng trung hoà trên thỏ (Virus Neutralization)

Nguyên lý của phản ứng: virus DTL cường độc và virus DTL nhược độc

có tính gây bệnh khác nhau cho thỏ và lợn nhưng có tính kháng nguyên như

nhau Có thể dùng virus DTL cường độc tiêm cho thỏ, gây miễn dịch, sau đó chứng minh tính miễn dịch của thỏ đối virus DTL bằng cách tiêm virus nhược

độc DTL cho thỏ (Nguyễn Như Thanh, 2001) [20]

Nguyên liệu và cách tiến hành:

Bệnh phẩm là lách, hạch lâm ba của lợn nghi mắc bệnh, nghiền với nước sinh lý thành huyễn dịch 1/10 và 1/100 và xử lý kháng sinh, dùng để tiêm tĩnh mạch tai với liều 1 ml cho 2 thỏ khoẻ mạnh của lô thí nghiệm (thỏ 1: tiêm huyễn dịch nồng độ 1/10, thỏ 2: tiêm huyễn dịch nồng độ 1/100)

Sau 7-10 ngày, dùng giống virus nhược độc DTL pha thành huyễn dịch 1/10 và 1/100 tiêm tĩnh mạch tai với liều 1 ml cho hai thỏ nói trên (thỏ 1: tiêm huyễn dịch nồng độ 1/10, thỏ 2: tiêm huyễn dịch nồng độ 1/100) và hai thỏ khoẻ mạnh khác ở lô đối chứng

Đọc kết quả:

ở lô đối chứng, hai thỏ có hiện tượng sốt điển hình

ở lô thí nghiệm, thỏ không có phản ứng sốt Lấy máu của 2 thỏ này tiêm cho 2 thỏ khoẻ mạnh khác thì những thỏ đó cũng không có phản ứng sốt

điển hình Điều này chứng tỏ virus nhược độc DTL đj bị kháng thể DTL trung hoà Kháng thể này có được là do bệnh phẩm có chứa virus DTL đj kích thích cơ thể thỏ sản sinh ra Như vậy bệnh phẩm có virus DTL

- Phản ứng kháng thể huỳnh quanh

Nguyên lý của phản ứng: Dùng kháng thể DTL đj được nhuộm màu huỳnh quanh cho tác động với kháng nguyên là bệnh phẩm nghi mắc bệnh DTL đj được cố định trên tiêu bản

Nếu kháng thể DTL gặp kháng nguyên tương ứng (tức là bệnh phẩm

có virus DTL) thì có sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Phức hợp này bám chặt vào phiến kính nên khi rửa nước không bị trôi Soi dưới kính hiển vi huỳnh quanh sẽ thấy có sự phát sáng của kháng thể DTL đj

được nhuộm màu huỳnh quang

Nếu kháng thể DTL không gặp kháng nguyên tương ứng thì sẽ không

có sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên, khi rửa nước kháng thể nhuộm màu huỳnh quanh sẽ bị rửa trôi, do đó khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quanh sẽ không thấy hiện tượng phát sáng của chất màu huỳnh quang

Nguyên lý của phản ứng: dùng kháng nguyên (hoặc kháng thể) đặc hiệu

đj biết hấp thụ lên bề mặt các khay nhựa rồi cho thêm kháng thể (hoặc kháng nguyên) cần tìm vào Nếu tương thích sẽ có phản ứng xảy ra, các kháng thể (hoặc kháng nguyên) cần tìm sẽ không bị rửa trôi và được giữ lại trong khay nhựa Quá trình này được phát hiện bởi một kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng có gắn Enzym Hoạt động của enzym này làm thay đổi màu sắc của cơ chất tương ứng được cho vào ngay sau đó làm cho chúng ta có thể nhận biết bằng mắt thường để xác định phản ứng có xảy ra hay không

Đọc kết quả: Nếu phản ứng được xác định có xảy ra thì khi so màu trên máy quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ phản ứng

- Phương pháp trung hoà huyết thanh có gắn men (NPLA-

Neutralising Peroxidase- Linked Assay)

Phương pháp này dùng để định danh và định lượng gián tiếp các kháng thể DTL có trong các mẫu huyết thanh nhờ vào nguyên tắc đo lường mức độ

ức chế của mẫu huyết thanh trên tính gây nhiễm của virus DTL trên môi trường nuôi cấy tế bào Phương pháp này còn áp dụng để tìm hay định danh sự

có mặt hay không có mặt của virus DTL trên môi trường tế bào nuôi cấy

Phương pháp trung hoà huyết thanh không thể phân biệt được kháng thể tạo ra do cảm nhiễm virus DTL tự nhiên với kháng thể tạo ra do tiêm phòng vaccine Tuy nhiên phương pháp này có thể đo lường hàm lượng kháng thể thụ động hay chủ động trong các đàn lợn Hiện nay phương pháp này dùng

để đánh giá khả năng miễn dịch của đàn và phương pháp này cũng được sử dụng trong các nghiên cứu theo dõi khái quát tình hình của đàn, nó có thể giúp cho các nhà nghiên cứu một sự hiểu biết về tình hình kháng thể của đàn lợn hay theo từng nhóm tuổi của lợn

Nguyên lý của phản ứng: pha lojng huyết thanh cẩn chẩn đoán với dung dịch môi trường có chứa 5% huyết thanh bào thai bê (không có kháng thể BVDV) trên khay nhựa với nhiều lỗ giếng theo một sơ đồ đj được thiết kế sau

đó cho virus DTL với một lượng không đổi trừ phần đối chứng Tiếp theo cho

tế bào CPK hoặc tế bào PK vào tất cả các lỗ giếng Sử dụng dung dịch ACE để nhuộm và đọc kết quả trên kính hiển vi soi ngược

Chuẩn bị

Sử dụng tế bào CPK hoặc tế bào PK15 (tế bào PK15 thì mỏng hơn

và to hơn nên khi nhuộm sẽ dễ dàng để nhận biết hơn) Tế bào là khâu quan trọng trong nhuộm, nếu tế bào không tốt có thể ảnh hưởng đến kết quả nhuộm NPLA

Pha virus DTL với liều gây nhiễm 50% tế bào (50% tissue culture infective dose – TCID50) theo phương pháp của Reed Muench (Thomas M., 1992) [48]

PBS 1% tween 80:

40 ml PBS (-) x 25 cho vào chai, thêm vừa đủ 1 lit PBS (-), chai đj có khuấy từ và bật máy khuấy từ trước Sau đó đong 10 ml Tween 80 vào chai đang khuấy từ

Kháng thể 1 (kháng thể lợn kháng virus DTL polycolonal pha ở 1/200) trong PBS 1%.Tween 80

Kháng thể 2 (Congjugate -Kháng huyết thanh lợn có gắn men Hyperoxidase HPO) pha ở 1/600 pha trong dung dịch PBS 1% tween 80

Cơ chất ACE:

50 àl dung dịch cơ chất ACE cho một giếng

Các bước thực hiện phản ứng NPLA:

Cho vào trong mỗi giếng 50àl môi trường có 5% huyết thanh bào thai

bê (FCS) không có kháng thể kháng BVDV vì kháng thể kháng BVDV có thể trung hoà với virus DTL do đó có thể ảnh hưởng đến kết quả của trung hoà virus

Pha lojng huyết thanh theo sơ đồ đj thiết kế từ trước

Cho vào mỗi giếng 50 àl virus DTL đj được pha TCID50 (liều gây nhiễm tế bào 50%) trừ đối chứng

Phần đối chứng cho vào ít nhất virus pha lojng 0, -1, -2, -3, -4

ủ 37oC trong 1 tiếng cứ 20-30 phút lại lôi ra mix một lần

Tách tế bào PK15 hoặc CPK cho vào 100 àl trên giếng

ủ tế bào ở 37oC trong 2-3 ngày tối đa là 4 ngày

Rửa đĩa 3 lần với PBS 1% tween 80

* Cho kháng thể 1: mỗi giếng của đĩa 50àl dung dịch kháng thể 1 Để trong tủ ấm 37oC trong 30 phút Sau đó lấy đĩa ra rửa 3 lần bằng PBS 1% tween 80

* Cho kháng thể 2: mỗi giếng của đĩa cho 50àl dung dịch kháng thể 2 Để trong tủ ấm 37oC trong vòng 30 phút

* Cho cơ chất ACE: Cơ chất phải sử dụng ngay sau khi pha Cho vào mỗi

ô giếng 50àl dung dịch cơ chất ACE Để trong tủ ấm 37oC trong vòng 10-20 phút

Đọc kết quả: bằng kính hiển vi soi ngược nếu phần đối chứng đạt yêu cầu

- Nếu phần nguyên sinh chất của tế bào bắt mầu đỏ nâu của ACE thì kết luận không có kháng thể

- Nếu phần nguyên sinh chất của tế bào bình thường và không bắt màu thì kết luận có kháng thể

Phương pháp PCR là một kỹ thuật chẩn đoán có tính nhạy cao và rất chuyên biệt trong đó người ta dùng kỹ thuật sinh học phân tử để tách chiết, nhân lên và định danh đoạn ARN của virus DTL Phương pháp RT-PCR có thể được dùng để định danh sự hiện diện của virus DTL và đặc biệt phù hợp cho việc phân tích các mẫu máu hay huyết thanh và được dùng

Phương pháp tiến hành

* Chiết tách ARN tổng số bằng Trizol

- Chuẩn bị dụng cụ:

Pipetman 100, 200, 1000 àl

Đầu típ 100, 200, 1000àl

Tuýp 1,5ml ( không có men ARNase và ADNase)

- Tiến hành:

Cho 100àl mẫu vào tuýp 1,5ml

Cho tiếp 1000àl Trizol

Đảo đều hoặc votex trong vài giây Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Cho thêm 200àl Chloroform Votex kỹ trong 15 giây Để ở nhiệt độ phòng trong 3 phút

Ly tâm 12000vòng/phút trong 15 phút

Lấy khoảng 400àl phần nước nổi (nước mầu trắng) sang tuýp 1,5ml mới

Chú ý của bước này: không được để lẫn với phần nước mầu đỏ

Cho thêm vào 500àl Isopropanol (Isopropyl Alcohol) Đảo nhẹ 3-4 lần

- TiÕn hµnh: - Pha master mix: theo thø tù sau (cho 1 ph¶n øng)

KÝch th−íc (bp) Classical Swine Fever Virus-CSFV

*Phương pháp chạy điện di nằm ngang

- Đổ gel Agarose:

Chuẩn bị khuôn và lược để đổ gel

Pha gel agarose 2% trong đệm TAE (hoặc TBE)

Đun cách thủy (hoặc dùng lò vi sóng) để gel tan hoàn toàn

Khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 50oC cho Ethidium bromide 1/10 000 (1àl Ethidium bromide/10ml dung dịch đệm) Lắc đều

Chú ý: Ethidium bromide rất độc nên phải rất cẩn thận không được để dây vào da

Đổ gel vào khuôn đj cài sẵn lược

Đợi khi gel nguội (đj đông lại) thì tháo bỏ lược

Chuyển gel vào máy chạy điện di đj có dung dịch đệm TAE (hoặc TBE)

Chú ý: Để gel với đầu có giếng cho mẫu ở phía cực (-) của bể chạy gel

- Chạy điện di:

Dùng pipette lấy khoảng 10àl sản phẩm PCR trộn đều với 1àl loading buffer trên giấy parafilm rồi cho vào giếng trên gel

Chạy điện di theo chiều từ (-) sang (+), 100mV trong khoảng 30 phút

Đọc kết quả bằng máy đọc gel

2.5 Vaccine và lịch sử quá trình phòng chống bệnh Dịch tả lợn

Ngay sau khi có khái niệm về vaccine cũng như tác dụng của nó, con người đj áp dụng thành tựu này trong về phòng chống các bệnh truyền nhiễm

ở người cũng như ở gia súc Việc phòng chống bệnh DTL cũng nằm trong quy luật đó

2.5.1 Sử dụng huyết thanh tối miễn dịch và hỗn dịch virus cường độc để phòng trị bệnh DTL

Ban đầu (1908) để phòng ngừa DTL bằng tiêm phòng vaccine Dorset và cộng sự đj tạo ra một dạng nhiễm trùng có kiểm soát Virus DTL có độc lực hiện diện trong máu lợn bệnh đj được tiêm đồng thời với huyết thanh tối miễn dịch Đây là một cách khá thô sơ nhưng đạt hiệu quả miễn dịch cao theo cách

đánh giá lúc đương thời Phương pháp này khá nguy hiểm vì sự kết hợp các liều sai sẽ dẫn đén việc tạo ra ổ dịch hoặc sẽ không tạo được miễn dịch, nhưng nó

được sử dụng trong vòng hơn 50 năm và đj góp phần vào sự phát triển chăn nuôi lợn ở Mỹ

2.5.2 Vaccine vô hoạt

Bước phát triển tiếp theo là sản xuất ra các loại vaccine vô hoạt trong đó

có vaccine vô hoạt kết tinh tím (CVV) là loại được dùng phổ biến nhất và rất

an toàn khi tiêm cho lợn Đây là sự nghiên cứu thành công bởi McBride và Cole (1936) và sau đó là Doyle (1942) trong việc tạo ra loại vaccine này (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) [5]

Vaccine này được điều chế bằng cách vô hoạt virus DTL trong máu, lách

và những mô thuộc hệ lưới nội mô khác bằng chất Crystal violet Theo các tác giả, miễn dịch có thể kéo dài 10 tháng nhưng trên thực tế các báo cáo khác

đều cho rằng chỉ có thể đảm bảo miễn dịch 100% trong vòng sáu tháng (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) [5] Tuy nhiên người ta nghi ngờ chất luợng của

nó khi so với những tiêu chuẩn vaccine hiện tại về tính an toàn và hiệu lực của các lô sản xuất có thể có biến động vì các ổ dịch DTL xảy ra có thể do một số lô sản xuất có thể không được vô hoạt hoàn toàn (Campbell, 1967) [25]

Có ý kiến khác lại cho rằng virus trong cơ thể con vật thấp và virus DTL rất dễ bị phá huỷ nên chỉ có vaccine vô hoạt bằng kết tinh tím là thành công và thực sự có hiệu quả (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) [5]