Thăm dò ảnh hưởng của colchicine, tia gamma (nguồn co60) đến cây hoa đồng tiền nam phi (gerbera jamesonii) trong in vitro

Luận văn

Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học nông nghiệp i

-

Nguyễn thị phương hoa

Thăm dò ảnh hưởng của colchicine, tia gamma (nguồn Co60) đến cây hoa đồng tiền Nam Phi (Gerbera jamesonii) trong in vitro

Lời cam đoan

- Tôi xin cam đoan rằng những số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đã

được chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương Hoa Nguyễn Thị Phương Hoa

Lời cảm ơn

Tác giả luận văn xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

- GS.TS Nguyễn Quang Thạch đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

- Tập thể các thầy giáo, cô giáo Khoa Nông học, Khoa Sau đại học,

đặc biệt là thầy cô và anh chị trong Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường

Đại học Nông nghiệp I đã trực tiếp đóng góp nhiều ý kiến quí báu về chuyên môn cho tác giả hoàn thành luận văn

- Cảm ơn bạn bè và người thân đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn !

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương Hoa Nguyễn Thị Phương Hoa

Mục lục

2.2 Một số ứng dụng của nuụi cấy mụ tế bào trong cụng tỏc chọn tạo giống

2.3 Chọn lọc ủột biến và ứng dụng ủột biến trong cụng tỏc chọn giống 14

2.5 Tớnh chất và tỏc dụng của Colchicine trong xử lý ủột biến 20 2.6 Tớnh chất và tỏc dụng của tia Gamma (γ) trong xử lý ủột biến 21 2.7 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu và ứng dụng chọn tạo giống bằng con ủường gõy

ủột biến trờn thế giới, trong khu vực và ở Việt Nam 24

3 Đối tượng, địa điểm , nội dung và phương pháp nghiên cứu 30

3.3 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 33 3.4 C¸c chØ tiªu theo dâi vµ ph−¬ng ph¸p xö lý sè liÖu 38

4 KẾT QUẢ nghiªn cøu VÀ THẢO LUẬN 40

4.1 Kết quả xử lý ña bội chồi ñồng tiền in vitro bằng Colchicine 40 4.1.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ và thời gian xử lý Colchicine ñến tỷ lệ

sống và tỷ lệ biến dị của chồi ñồng tiền cấy mô 40 4.1.2 Phân loại các dạng chồi thu ñược sau xử lý ña bội bằng Colchicine

4.1.3 Phân tích mức bội thể của các dạng cây sau xử lý ña bội bằng

4.1.4 Kích thước khí khổng, mật ñộ lục lạp và một số chỉ tiêu sinh lý

4.1.5 Tỷ lệ chồi ña bội ở các công thức xử lý colchicine và khả năng duy

4.1.6 Khả năng sinh trưởng, nhân nhanh và ra rễ của cây ñồng tiền ña

4.2.2 Khả năng sinh trưởng, phát triển của cây ñồng tiền tái sinh sau

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t

NXB : Nhµ xuÊt b¶n

CT : C«ng thøc CTTD : ChØ tiªu theo dâi

Danh môc c¸c b¶ng Bảng 4.1 Kết quả xử lý chồi ñồng tiền nuôi cấy mô bằng Colchicine sau

Bảng 4.2 ðặc ñiểm hình thái của các dạng chồi ñồng tiền tái sinh sau xử

Bảng 4.3 Tỷ lệ các dạng chồi thu ñược ở các công thức xử lý colchicine

Bảng 4.4 Cường ñộ quang hợp, hiệu suất quang hợp và cường dộ thoát

Bảng 4.5 Hàm lượng diệp lục của cây ñồng tiền ña bội in vitro 55Bảng 4.6 Tỷ lệ chồi ña bội ở các công thức xử lý colchicine (sau 3 lần

Bảng 4.7 Khả năng duy trì của cây ñồng tiền ña bội in vitro qua 5 lần

Bảng 4.8 Khả năng sinh trưởng và hệ số nhân của cây ñồng tiền ña bội

Bảng 4.9 Khả năng sinh trưởng và ra rễ của cây ñồng tiền ña bội in vitro

Bảng 4.10 Khả năng sinh trưởng của cây ñồng tiền ña bội ngoài vườn

Bảng 4.11 Kết quả xử lý chiếu xạ khối callus ñồng tiền sau 3 lần cấy

Bảng 4.12 Khả năng sinh trưởng của cây ñồng tiền tái sinh sau xử lý

chiếu xạ ngoài vườn ươm (sau 6 tuần theo dõi) 74Bảng 4.13 Khả năng sinh trưởng, phát triển của cây ñồng tiền tái sinh

sau xử lý chiếu xạ ngoài vườn sản xuất (sau trồng 4 tháng) 76

Danh môc c¸c h×nh

Hình 4.1 Chồi ñồng tiền trước và sau khi xử lý colchicine 2 tuần 42Hình 4.2 Kết quả thu ñược ở công thức xử lý Colchicine nồng ñộ 0,01%

trong 24, 48, 72h (sau lần cấy chuyển thứ 2) 44Hình 4.3 Kết quả thu ñược ở công thức xử lý Colchicine nồng ñộ 0,05%

trong 24, 48, 72h (sau lần cấy chuyển thứ 2) 45Hình 4.4 Kết quả thu ñược ở công thức xử lý Colchicine nồng ñộ 0,1%

trong 24, 48, 72h (sau lần cấy chuyển thứ 2) 45Hình 4.5 Các dạng chồi thu ñược sau xử lý Colchicine 47Hình 4.6 Biểu ñồ tỷ lệ các dạng chồi thu ñược ở các công thức xử lý

colchicine khác nhau (sau 3 lần cấy chuyển) 50Hình 4.7 Peak xác dịnh ñộ bội bằng phương pháp FC (Flow cytometry) 52Hình 4.8 Hình dạng khí khổng của cây ñồng tiền ña bội 53Hình 4.9 Biểu ñồ tỷ lệ chồi ña bội ở các công thức xử lý colchicine

Hình 4.10 Biểu ñồ thể hiện khả năng duy trì của cây ñồng tiền ña bội

Hình 4.11 Biểu ñồ thể hiện hệ số nhân của cây ñồng tiền ña bội in vitro 62Hình 4.12 Khả năng nhân nhanh của cây ñồng tiền ña bội in vitro 63Hình 4.13 Khả năng ra rễ của cây ñồng tiền ña bội in vitro 64Hình 4.14 Biểu ñồ tỷ lệ sống của cây ñồng tiền ña bội ngoài vườn ươm 66Hình 4.15 Cây ñồng tiền ña bội ngoài vườn ươm (sau 6 tuần ra cây) 66Hình 4.16 Biểu ñồ tỷ lệ mẫu tái sinh chồi ở các công thức xử lý chiếu xạ 71Hình 4.17 Callus ñồng tiền trước (1) và sau xử lý chiếu xạ 60 ngày (2) 72

Hình 4.18 Sự phát sinh hình thái của callus ñồng tiền ở các liều chiếu khác

nhau sau lần cấy chuyển thứ hai (sau xử lý chiếu xạ 60 ngày) 72

Hình 4.20 Cây ñồng tiền tái sinh sau chiếu xạ ngoài vườn ươm 75Hình 4.21 Một số dạng hoa lạ thu ñược sau xử lý chiếu xạ 77

1 1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Hoa ñồng tiền có tên khoa học là: Gerbera jamesonii Bol.ex.Adlam, là

một trong những loài hoa ñẹp, trồng phổ biến trên thế giới và ñược sử dụng làm hoa chậu, hoa cắt cành, hoa trồng cảnh Ở nước ta, hoa ñồng tiền ñược coi là một trong những loài hoa thương mại quan trọng, cho giá trị kinh tế cao, ñược nhiều ñịa phương quan tâm phát triển Hoa ñồng tiền ưu việt hơn một số loài hoa khác như hoa hồng, hoa lily, hoa lan là ra hoa và vẫn ñảm bảo chất lượng hoa cao vào mùa hè, ñây là thời ñiểm miền Bắc khan hiếm hoa nhất trong năm

Hoa ñồng tiền thuộc loại cây thân thảo, nhị bội (có bộ nhiễm sắc thể 2n=50), ra hoa quanh năm, rất phong phú về màu sắc và kiểu dáng hoa Các giống ñồng tiền ñược trồng ở Việt Nam thường là nhập nội từ Hà Lan, Pháp, Trung Quốc Các giống này ñều là các giống hoa ñồng tiền kép, hoa rất ñẹp, ñường kính hoa lớn 8 - 12 cm; màu sắc hoa phong phú, ña dạng, hoa cắm ñược rất lâu (15 - 20 ngày), hoa ñể trồng chậu khoảng 20 - 25 ngày/một lần ra hoa Sản lượng hoa cao, trung bình một cây cho khoảng 50 - 60 bông /năm

Tính c ấp thiết của ñề tài

Trước ñây, cây giống ban ñầu thường ñược tạo bằng phương pháp tách chồi, gieo hạt cổ truyền, ñơn giản, không tốn kém song chất lượng cây giống kém, nhanh bị thoái hoá do nhiễm bệnh virus và già sinh lý Trong những năm gần ñây, nguồn giống chủ yếu là cây nuôi cấy mô nhập từ Hà Lan, Côn Minh – Trung Quốc với giá rất cao 5000 ñ/cây, nhưng cây giống không rõ nguồn gốc, thiếu chủ ñộng… ðây chính là nguyên nhân khiến giá hoa thương

phẩm còn khá cao, chưa ñáp ứng ñược nhu cầu của người dân Vì vậy, trong những năm gần ñây, công tác chọn tạo giống hoa ñồng tiền ở Việt Nam ñã bắt ñầu ñược quan tâm và nghiên cứu Viện Sinh học Nông nghiệp - ðại học Nông nghiệp I – Hà Nội ñã nghiên cứu và xây dựng thành công quy trình

nhân nhanh in vitro hoa ñồng tiền và áp dụng thành công ở nhiều ñịa phương

góp phần làm giảm giá thành cây giống, cây sạch bệnh, ñẻ khoẻ, chủ ñộng trong trồng trọt… và ñã ñáp ứng ñược một phần nhu cầu cây giống hoa ñồng tiền của thị trường

Tuy nhiên nhu cầu của người tiêu dùng, của thị trường luôn ñòi hỏi phải có nhiều giống hoa mới, lạ, ña dạng và phong phú hơn nữa ðể tìm ra ñược các giống cây có năng suất, phẩm chất như mong muốn nêu trên thì các nhà khoa học ñã áp dụng một số phương pháp chọn tạo giống ñược sử dụng phổ biến như: Lai hữu tính, chọn tạo giống mới, chọn tạo giống ưu thế lai, chọn tạo giống ñột biến và ña bội thể, chuyển gen… Trong ñó, chọn tạo giống ñột biến bởi các tác nhân hoá học hoặc vật lý trong nuôi cấy mô in vitro là hướng có hiệu quả, ñặc biệt trên ñối tượng hoa, lại dễ áp dụng trong ñiều kiện

Việt Nam Việc xử lý tạo dòng ñột biến in vitro còn cho phép thực hiện liên

tục, không phụ thuộc vào mùa vụ, có thể ñánh giá lọc dòng ngay cả trong ñiều

kiện nuôi cấy in vitro Hướng nghiên cứu tạo giống hoa mới ở Việt Nam kể cả

bằng phương pháp truyền thống (lai tạo hữu tính) cũng như các phương pháp

hiện ñại trong ñó có phương pháp xử lý ñột biến in vitro hầu như chưa ñược

tiến hành

Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Thăm dò ảnh hưởng của colchicine, tia gamma (nguồn Co 60 ) ñến

cây hoa ñồng tiền (Gerbera jamesonii) in vitro”

1.2 Mục ựắch và yêu cầu của ựề tài

1.2.1 Mục ựắch

Xác ựịnh ảnh hưởng của colchicine, tia gamma (nguồn Co60) lên sự phát sinh hình thái của cây hoa ựồng tiền cấy mô Từ ựó, góp phần dịnh hướng cho việc nghiên cứu tạo giống hoa ựồng tiền mới bằng phương pháp gây biến dị in vitro

- đánh giá ựược khả năng thắch nghi, sinh trưởng của các dạng biến

dị ngoài vườn ươm

2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây hoa ựồng tiền

2.1.1 Nguồn gốc, vị trắ, phân loại cây hoa ựồng tiền

2.1.1.1 Ngu ồn gốc

Hoa ựồng tiền (Gerbera jamesonii) còn gọi là hoa mặt trời ựược tìm

thấy ựầu tiên ở các tỉnh Transvaal, Natal, Barbeton và Swazilan của Nam Phi

Năm 1886, Gerbera jamesonii ựược du nhập vào Anh quốc và ựến năm 1910

ựã phát triển trở thành hoa thương mại phổ biến tại Pháp, Bắc Phi và nhiều nước khácẦ[17]

Ở Việt Nam, hoa ựồng tiền ựược người Pháp ựưa vào trồng từ những năm 1940, chủ yếu là ựồng tiền ựơn Tuy sinh trưởng, phát triển tốt, thắch nghi với ựiều kiện ngoại cảnh ở nước ta nhưng hoa nhỏ, cánh ựơn, màu sắc ựơn ựiệu nên không ựược trồng nhiều Hoa ựồng tiền kép Nam Phi mới chỉ du nhập vào Việt Nam một vài năm gần ựây, trồng ựầu tiên ở thành phố Nam định sau ựó ựưa ra Hà Nội và hiện nay trồng nhiều nhất ở đà Lạt Các giống này ựều là các giống hoa ựồng tiền kép hoa rất ựẹp, ựường kắnh hoa lớn 8 - 12 cm; màu sắc hoa phong phú, ựa dạng, hoa cắm ựược rất lâu (15 - 20 ngày), nếu hoa trồng chậu khoảng 20 - 25 ngày/một lần ra hoa Ngoài ra, sản lượng hoa cao, trung bình một cây cho khoảng 50 - 60 bông /năm và trở thành loài hoa ựược ưa chuộng hiện nay [6]

2.1.1.2 Phân lo ại thực vật

Trong hệ thống phân loại thực vật, hoa ựồng tiền ựược xếp vào lớp 2 lá

mầm (Dicotyleon), thuộc phân lớp cúc (Asteridae), bộ cúc (Asterales), họ cúc (Asteraceae) và có tên khoa học là Gerbera jamesonii [17]

Gerbera jamesonii thuộc họ Assteraceae ủược trồng thớch hợp ở vựng

nhiệt ủới và cận nhiệt ủới ðõy là loài cõy lưỡng bội với bộ nhiễm sắc thể 2n

= 50 ðõy là loài hoa thương mại của vựng Nam Phi từ những năm 30

Chi ủồng tiền cú khoảng 40 loài, ủược chia làm 3 nhúm: Hoa kộp, hoa ủơn, hoa ủơn nhị kộp, cú nhiều màu sắc phong phỳ (ủỏ, tớm, trắng, hồng, vàng, vàng phẩy…)

2.1.2 ðặc ủiểm thực vật học

2.1.2.1 Thõn lỏ

Thõn lỏ: thân ngầm không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, lá và hoa phát triển

từ thân Lá mọc chếch so với mặt đất một góc 15-45 Hình dáng lá thay đổi theo giống và sự sinh trưởng của cây, từ hình trứng thuôn đến hình thuôn dài Lá dài từ 15- 25cm, rộng 5-8cm, có hình lông chim xẻ thùy nông hoặc sâu, mặt lưng lá có lớp lông nhung Số lượng lá trên cây biến động từ 9,53 đến 41,78 lá, tuỳ theo từng giống

2.1.2.2 Rễ

Rễ ủồng tiền thuộc dạng rễ chùm, phát triển khỏe, rễ hình ống, ăn ngang và nổi trên bề mặt luống, rễ thường vươn dài tương ứng với diện tích lá tỏa ra

2.1.2.3 Hoa

Hoa đồng tiền do 2 loại hoa nhỏ hình lưỡi và hình ống tạo thành, là loại hoa

tự đơn hình đầu Hoa hình lưỡi tương đối lớn, mọc ở phía ngoài xếp thành một vòng hoặc vài vòng nhỏ Do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên được gọi là mắt hoa hay tâm hoa, rất được chú trọng Trong quá trình hoa nở, hoa hình lưỡi nở trước, hoa hình ống nở theo thứ tự từ ngoài vào trong theo từng vòng một Dựa trên cấu tạo của bông hoa người ta chia làm ba loại hoa sau:

Hoa kép: Cánh hoa gồm nhiều tầng, cánh dày đường kính hoa có thể đạt12-

15 cm Hoa tụ lại thành bông làm ở đầu trục chính, cuống dàI từ 20-60 cm, hoa bền mầu sắc phong phú Điển hình là các giống: Kép đỏ, kép trắng, kép tím, kép hồng…

Hoa đơn: Cánh có 1 tầng hoặc 2 tầng xếp xen kẽ, mỏng và yếu hơn hoa kép Hoa đơn nhị kép: Bên ngoài cùng vành cánh đơn, bên trong cánh kép dày

đặc Thông thường mầu cánh trắng, trong lớp nhị kép màu cánh sen

Quả Đồng Tiền thuộc dạng quả bế có lông, không có nội nhũ, hạt nhỏ, 1 gram hạt khoảng 280- 300 hạt

2.1.3 Các phương pháp nhân giống hoa đồng tiền

2.1.3.1 Nhân giống bằng hạt

Nhân giống bằng hạt là phương pháp nhân giống hữu tính, hạt có sự kết hợp giao tử đực và giao tử cái vậy muốn có cây giống to khỏe sinh trưởng, phát triển tốt cần phải chọn giống sinh trưởng khỏe, năng suất cao và ổn định, phẩm chất hoa tốt, màu sắc hoa đẹp tính chống chịu tốt Từ những giống tốt

đó chọn những cây điển hình mang đầy đủ đặc điểm của giống muốn nhận, sau đó cần chú ý chăm sóc chu đáo giống đp chọn, khi hạt chín nên chọn những hạt to mẩy, cân đối không có vết sâu bệnh… rồi gieo hạt ra ngoài vườn

ươm, trong bầu trong khay hay bảo quản trong túi chống ẩm để nơi thoáng mát tránh ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp chiếu vào cho tới lúc đem gieo, khi

đp mở túi hạt thì nên gieo ngay cả số hạt đó vì chúng mất khả năng nảy mầm rất nhanh trong điều kiện bình thường Nhưng nếu hạt chưa dùng có thể gói lại vào túi và để trong tủ lạnh trong thời gian ngắn

2.1.3.2 Nhân giống bằng phương pháp tách chồi

Đây là phương pháp nhân giống vô tính tự nhiên, lợi dụng khả năng tự phân chia của các cơ quan dinh dưỡng thành các cơ quan mới, có thể tạo thành một cá thể mới có khả năng sống độc lập và mang đặc điểm di truyền giống cây mẹ

Tõ tr−ắc tắi nay ph−ểng phịp nộy lộ tèt nhÊt vộ ệ−ĩc cịc nhộ trăng hoa

ậăng TiÒn −a sỏ dông Cịc khãm cẹy mứ ệ−ĩc trăng tõ 1-2 nẽm ệ−ĩc ệộo lến cớt bá 2/3 lị vộ rÔ răi nhẺp lỰi tõ 3-4 thẹn 1 khãm nhá răi ệem trăng vắi mẺt

ệé 20x30cm, sau 30-40 ngộy sỳ cho ra hoa ngay

Ph−ểng phịp nộy cã −u ệiÓm lộ nhanh ra hoa nh−ng khờ nẽng ệăng ệÒu kĐm, th−êng hay mang mẵm mèng sẹu bỷnh, yếu cẵu ệiÒu kiỷn chẽm sãc nghiếm ngẳt sau khi tịch cẹy.[26]

2.1.3.3 Nhẹn gièng bỪng ph−ểng phịp nuềi cÊy mề tạ bộo

Ngộy nay vắi nÒn cềng nghỷ sinh hảc hiỷn ệỰi, ng−êi ta ệp sỏ dông ph−ểng phịp nuềi cẹy mề tạ bộo thùc vẺt (in vitro) ệÓ tẽng nhanh sè l−ĩng cẹy gièng

Nuềi cÊy mề tạ bộo thùc vẺt: lộ ph−ểng phịp nuềi cÊy cịc mề tạ bộo thùc vẺt trến mềi tr−êng dinh d−ìng thÝch hĩp ệÓ cịc tạ bộo nhẹn lến tỰo khèi tạ bộo soma, sau ệã cịc tạ bộo phẹn hãa ệÓ tỰo thộnh chăi sau mét loỰt cịc quị trừnh nhẹn vộ ra rÔ ệÓ tỰo thộnh cẹy hoộn chửnh Nuềi cÊy mề tạ bộo lộ viỷc tỰo ệiÒu kiỷn ệÓ cịc tạ bộo phịt huy tÝnh toộn nẽng cựa tạ bộo thùc vẺt:Ợ Mẫi tạ bộo thùc vẺt ệÒu cã khờ nẽng phịt triÓn thộnh mét cể thÓ hoộn chửnh nạu gẳp ệiÒu kiỷn thuẺn lĩiẦ.Ợ(NguyÔn Quang ThỰch-NguyÔn Thỡ Lý Anh, 1998)

2.1.4 Tình hình s ản xuất và tiêu thụ hoa ựồng tiền ở Việt Nam

So với diện tắch tự nhiên sẵn có (33 triệu ha) thì diện tắch trồng hoa ở nước ta còn quá nhỏ (khoảng 2000 ha), tập trung chủ yếu ở các vùng trồng hoa truyền thống như: Ngọc Hà, Tây Tựu, Mê Linh, Sa Pa, đà Lạt Hiện nay trên cả nước ựã và ựang có nhiều vùng trồng hoa mới làm cho diện tắch ựất trồng hoa tăng lên ựáng kể với việc chú trọng sản xuất các loại hoa ựược ưa chuộng, mang lại giá trị kinh tế cao như: Hoa lan, hoa lyli, hoa ựồng tiền, hoa hồng, hoa cúcẦ trong ựó hoa hồng chiếm khoảng 50%, cúc từ 20 Ờ 30%

Với ựiều kiện tự nhiên thuận lợi cho trồng hoa, nhất là những nơi có nhiệt ựộ thấp như: Sa Pa, Mộc Châu, đà Lạt đó là những ựiều kiện tự nhiên thuận lợi, cần thiết ựể hoa Việt Nam lên ựường xuất ngoại

Hiện nay, giá trị tiêu thụ hoa cắt ở hai thành phố lớn là Hà Nội và thành phố Hồ Chắ Minh mới chỉ ở mức 1USD/người/năm, trong khi ựó ở các nước phát triển như: đức, Mỹ, Nhật Bản giá trị này là 16.1USD/người/năm Trong ựịnh hướng phát triển rau quả ựến năm 2010 Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn ựã chỉ rõ mục tiêu tăng thêm 8400 ha hoa và cây cảnh ựể nâng diện tắch hoa và cây cảnh lên trên 10000 ha với số lượng ước tắnh khoảng 3.5 tỷ cành hoa các loại, trong ựó tiêu thụ nội ựịa khoảng 2.5 tỷ cành, xuất khẩu 1.0 tỷ cành, giá trị xuất khẩu 60 triệu USD Tổng mức ựầu tư cho phát triển hoa cây cảnh ựến năm 2010 là 5 triệu USD và thu hút khoảng

110000 lao ựộng trồng hoa cây cảnh

Hiện nay, trung bình một sào lúa chi phắ hết 80000 ựồng lãi 26000 ựồng trong khi trồng ựồng tiền thì chi phắ một sào hết 27 triệu ựồng lãi 23 triệu ựồng

Cũng như nhiều chủng loại hoa khác, giá hoa ựồng tiền không ổn ựịnh, kết quả ựiều tra thực trạng sản xuất hoa ựồng tiền cho thấy, hoa ựồng tiền bán tại ruộng sản xuất dao ựộng từ 500 - 1100 ự/bông (tết 2006) bán tại thị trường

từ 1500 - 2000 ự/bông Trong khi giá thành và giá bán hoa ựồng tiền tại Việt Nam hết sức rẻ thì giá hoa ựồng tiền tại một số nước phát triển cao hơn rất nhiều, VD tại Mỹ là 20000 Ờ 25000 ự/bông và 9.99 - 114.99$ /bình hoa cắm

Qua các thông tin trên ta có thể thấy nhu cầu về hoa ngày càng tăng, thị trường hoa ngày càng mở rộng, ựã thúc ựẩy ngành trồng hoa ngày càng phát triển Vì vậy, việc nâng cao chất lượng, năng suất, phẩm chất các loại hoa nói chung và hoa ựồng tiền ựảm bảo tiêu chuẩn xuất khẩu và xuất khẩu ựược ựang

là ủũi hỏi thỳc ủẩy cụng tỏc chọn tạo giống và nhõn giống bằng cỏc phương

phỏp tiến bộ như: nhõn giống in vitro, cụng nghệ chuyển gen, chọn dũng tế

bào thực vật nhằm tạo ra cõy khoẻ, sạch bệnh, hệ số nhõn giống cao, làm tăng chất lượng và sản lượng hoa

2.1.5 Một số nghiên cứu về phương pháp nhân giống hoa Đồng Tiền ở Việt Nam

Cõy hoa ủồng tiền ở Việt Nam ủó ủược trồng từ rất lõu ủời, song chủ yếu là những giống hoa ủồng tiền ủơn cho nờn cỏc kết quả nghiờn cứu về giống hoa này cũn hạn chế Từ những năm 1950 trở lại ủõy, với sự xuất hiện của nhiều giống hoa ủồng tiền nhập nội ủó làm thay ủổi cơ cấu trồng ủồng tiền ở nhiều vựng trồng hoa và nhận ủược những sự quan tõm của cỏc nhà khoa học trong nước

Từ năm 1996, Nguyễn Quang Thạch; Mai Kim Tân; Nguyễn Trường Sơn đp nghiên cứu phương pháp nuôi cấy in vitro giống hoa Đồng Tiền từ Tiệp Khắc

và bước đầu thu được một số kết quả:

Tạo được nguồn mẫu sạch ban đầu bằng nuôi cấy Meristem trên môi trường MS-62 cải tiến có bổ sung auxin cytokinin với tỷ lệ là 1:2 và kích thước Meristem từ 1-2mm cho khả năng tạo callus và cụm chồi tốt nhất

Môi trường tốt nhất để tạo chồi nhân nhanh là MS+15%ND+8-10mg/lBA +0.5mg/lIAA cho hệ số nhân đạt từ 6.3-7 cây/tháng

Môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh hiệu quả cao nhất là MS + 10mg/lIAA+3% Sacaroza

8-Tiêu chuẩn cây con khi đưa ra đất cần đạt từ 4-5 lá 4-5 rễ chiều cao từ 4-5

cm giá thể thích hợp nhất là đất và phân chuồng hoai mục2:1

Năm 2004, Nguyễn Quang Thạch; Hoàng Thị Nga; Nguyễn Phương Hoa, Viện sinh học Nông Nghiệp, Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội đp nghiên cứu

xẹy dùng quy trừnh nhẹn gièng hoa ậăng TiÒn bỪng kỵ thuẺt nuềi cÊy mề vộ thu ệ−ĩc mét sè kạt quờ:

Bé phẺn tịi sinh tèt nhÊt lộ hoa non

Chạ ệé khỏ trỉng tèt nhÊt n−ắc zaven trong 10 phót sau ệã khỏ trỉng bỪng HgCl2 0.1% trong 5 phót

MềI tr−êng thÝch hĩp ệÓ tỰo thÓ tiÒn chăi lộ MS+1mg/lBA+0.2mg/lKi+0.2mg/lIAA+2.5%Sacaroza+6.5g Agar/l

MềI tr−êng thÝch hĩp cho quị trừnh nhẹn nhanh: MS+1mg/l Ki +2.5% Sacaroza+6.5g Agar/l

MềI tr−êng ra rÔ cho chăi invitro MS+0.1mg/lαNAA +2.5% Sacaroza+6.5g Agar/l

Giị thÓ ẻ giai ệoỰn v−ên −ểm (5-6) tuẵn lộ mỉn +trÊu hun (1:1) Viện Sinh học Nông nghiệp - đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội ựã nghiên

cứu và xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro hoa ựồng tiền và áp

dụng thành công ở nhiều ựịa phương [20] Hiện nay Viện Sinh học Nông nghiệp ựang tiếp tục nghiên cứu tạo các dòng hoa ựồng tiền mới và kỹ thuật

ra cây bằng phương pháp thuỷ canh, khắ canh

Công ty hoa Hafarm (đà Lạt Ờ Lâm đồng) ựã ứng dụng công nghệ trồng hoa ựồng tiền trong nhà lưới thu ựược hiệu quả rất cao, sản lượng gấp

10 Ờ 15 lần so với trồng hoa thông thường

Viện nghiên cứu rau quả, ngoài công tác nghiên cứu chọn giống hoa mới, trong những năm 1999 Ờ 2002 cũng ựã nghiên cứu thành công quy trình sản xuất hoa ựồng tiền tiên tiến như ựiều tiết sinh trưởng và nở hoa cho hoa ựồng tiền

2.2 Một số ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác chọn tạo

giống cây trồng

Ngày nay nhờ những thành tựu của nuôi cấy mô tế bào mà công tác chọn tạo giống thực vật có thêm nhiều phương tiện mới ñể cải tiến, cung cấp giống cây trồng nói chung và cây hoa có giá trị nói riêng trên thị trường Có rất nhiều phương pháp ñược ứng dụng nuôi cấy mô cho kết quả khả quan trong chọn tạo giống thực vật như: Biến dị soma; nuôi cấy bao phấn và sản

xuất cây ñơn bội; nuôi cấy phôi, nuôi cấy noãn và thụ phấn in vitro

2.2.1 Biến dị soma và chọn lọc dòng tế bào

Trước ñây, nuôi cấy mô ñược sử dụng làm kỹ thuật mới ñể tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng ñể sản xuất hàng loạt cây ñồng nhất mang các ñặc ñiểm của các giống ưu tú

Tuy nhiên, với thời gian và các công trình nghiên cứu ở nhiều loại cây trồng nói chung và cây hoa có giá trị kinh tế, người ta thấy rằng tế bào và mô ñược nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến ñổi di truyền bao gồm số lượng, cấu trúc NST, ñột biến gen, hoạt hoá các gen di ñộng… Các biến dị này ñược truyền cho cây khi tái sinh Tập hợp các biến dị

di truyền hình thành trong quá trình nuôi cấy mô gọi là biến dị soma

Một ưu ñiểm quan trọng của biến dị soma là khả năng chọn lọc dòng tế bào in

vitro Có thể nuôi cấy, xử lý hàng triệu tế bào trong một không gian hạn chế

và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong ñiều kiện bất lợi gọi là tác nhân chọn lọc Cũng có thể kết hợp xử lý ñột biến trong nuôi cấy ñể tăng tần

số biến dị Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới có thể xác ñịnh ñược bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy

Chọn lọc dòng tế bào in vitro bao gồm:

− Nuôi cấy tế bào từ một kiểu gen ñã thích nghi nhưng có nhược ñiểm

ở một tính trạng nhất ñịnh và cần ñược cải tiến

− Xử lý tế bào nuôi cấy bằng các tác nhân chọn lọc thích hợp

− Tái sinh cây từ những tế bào sống sót

Các tế bào có thể tiếp xúc với tác nhân chọn lọc thông qua nuôi cấy ở các nồng ñộ hay mức khác nhau của tác nhân chọn lọc Có thể xử lý tế bào trong nuôi cấy huyền phù ñồng nhất hơn nhiều so với tế bào trong nuôi cấy callus Tế bào sống sót ñược chuyển sang môi trường tái sinh ñể chồi và rễ phát triển Các ñặc tính biểu hiện trong nuôi cấy mô phải biểu hiện ở cây tái sinh

2.2.2 Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây ñơn bội

Nuôi cấy bao phấn rất có ích ñối với các nhà chọn giống vì thể ñơn bội kép có thể sử dụng ngay làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phối Các dòng ñơn bội kép ñã tạo ra cơ hội duy nhất ñể cải tiến hiệu quả chọn lọc ñối với nhiều tính trạng và kĩ thuật này ñã ñược áp dụng thành công tại Trung Quốc trong việc tạo ra các giống lúa

Tuy nhiên, hạn chế trong việc áp dụng phương pháp này là khả năng nuôi cấy khó và tính ñặc thù cao của kiểu gen Ngoài ảnh hưởng của loài, kiểu gen trong loài, khả năng tạo ñơn bội bằng con ñường nuôi cấy bao phấn/hạt phấn còn bị ảnh hưởng phát triển của giai ñoạn bao phấn, ñiều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, hiệu quả lưỡng bội hoá bằng Colchicine…

2.2.3 Nuôi cấy phôi, nuôi cấy noãn và thụ phấn in vitro

Các nhà chọn giống chủ yếu ñã và ñang tận dụng biến dị di truyền hiện

có trong nguồn gen trồng trọt bằng cách sử dụng nhiều sơ ñồ lai và chọn lọc khác nhau Tuy nhiên, một khó khăn lớn khi sử dụng các loài hoang dại lai

với cây trồng là tính bất hợp, phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có quan

hệ xa thường yếu và không có khả năng sống thường chết sau khi hình thành hợp tử mà không thể phát triển thành hạt có khả năng sống Vì vậy nuôi cấy phôi hay cứu phôi là một phương pháp khắc phục hàng rào bất hợp, bảo ñảm phôi non phát triển, nảy mầm và phát triển thành cây con

Thụ phấn và thụ tinh in vitro là phương pháp ñã ñược áp dụng ñể tạo ra

con lai giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào noãn bình thường sau khi thụ phấn [21]

2.2.4 Xử lý ñột biến thực nghiệm in vitro

Một trong những hướng tạo giống cây trồng nhanh chóng là kết hợp giữa xử lý ñột biến nhân tạo với nuôi cấy mô Người ta có thể sử dụng những

cơ quan ñang trong giai ñoạn phát triển mạnh như ñỉnh chồi, callus…ñể làm nguyên liệu cho xử lý Thông thường chúng ta hay sử dụng các tác nhân gây ñột biến như tia gamma…….(tác nhân vật lý) hoặc tác nhân hoá học như colchicine, oryzalin…Xử lý ñột biến in vitro bằng colchicine ñồng thời kết hợp với nhân nhanh in vitro ñã cho ra một cách nhanh chóng những dòng tứ bội, cung cấp nguồn nguyên liệu cho lai tạo giống không hạt ở một số cây trồng có múi như cam, quýt, bưởi…hay tạo ra những dòng, giống hoa năng suất cao, chất lượng tốt… Bên cạnh ñó, chiếu xạ kết hợp với nuôi cây mô ñã ñược nhiều nhà khoa học chứng minh là phương pháp nhanh chóng tạo ra các biến dị mong muốn và nhân giống một cách nhanh chóng Một số kết quả thực hiện trên chuối, khoai tây, hoa cúc ñã cho thấy thành công ban ñầu của phương pháp này là tạo ñược nguồn nguyên liệu phong phú cho chọn giống hoặc lai tạo giống Hiện nay kỹ thuật này ñược áp dụng cho nhiều ñối tượng cây trồng khác, dặc biệt là những cây trồng nhân giống sinh dưỡng [15]

Như vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ñã sử dụng hết sức hiệu quả cho

việc tạo ñột biến Việc chiếu xạ các mô nuôi cấy hoặc các dòng tế bào ñơn giúp các nhà thực nghiệm khắc phục ñược các ñột biến thể khảm khi chiếu xạ hạt giống hoặc cây hoàn chỉnh Nhờ tính hoàn chỉnh của tế bào thực vật mà từ các ñột biến trong nhân ta có thể thu ñược cây ñột biến hoàn chỉnh

2.3 Chọn lọc ñột biến và ứng dụng ñột biến trong công tác chọn giống

Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học - kỹ thuật, ngày nay nhiều phương pháp chọn tạo giống ñã – ñang ñược quan tâm và phát triển Trước ñây phương pháp chọn tạo giống cổ ñiển, phải cần ít nhất từ 6 - 10 thế

hệ Trong khi ñó, bằng phương pháp chọn giống ñột biến nhân tạo (ñột biến thực nghiệm) chỉ cần 3 – 6 thế hệ Với phương pháp ñột biến nhân tạo, sử dụng các tác nhân gây ñột biến hoá lý có thể làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể và phương pháp chọn lọc giống thực vật thông qua con ñường ñột biến là một phương pháp có ý nghĩa ñặc biệt quan trọng ñể tạo vật liệu khởi ñầu trong chọn giống cây trồng

2.3.1 Khái niệm, ý nghĩa và phân loại ñột biến

2.3.1.1 Khái ni ệm và ý nghĩa

ðột biến là những biến ñổi về vật chất di truyền, xảy ra ở cấp ñộ phân

tử (ADN) hoặc cấp ñộ tế bào (NST)

ðột biến là hiện tượng thường gặp trong tự nhiên cũng như trong nhân tạo Thông thường tỷ lệ ñột biến tự nhiên thường thấp và tốc ñộ chậm hơn so với ñột biến nhân tạo Do có tần số ñột biến cao nên người ta hay sử dụng ñột biến nhân tao trong tạo giống mới ðột biến gen có ý nghĩa rất lớn trong công tác chọn giống Nó có thể làm tăng tỷ lệ biến dị của sinh vật lên ñến hàng vạn lần, trong ñó có những biến dị không bao giời tìm thấy trong tự nhiên [7]

2.3.1.2 Phân lo ại ñột biến

Có hai loại ñột biến là: ñột biến gen và ñột biến NST:

ðột biến gen là những biến ñổi trong cấu trúc của gen, liên quan tới một hoặc một vài cặp nucleotide xảy ra ở một ñiểm nào ñó của phân tử ADN Thường gặp ở dạng mất thêm, thay thế, ñảo vị trí một cặp nucleotide

ðột biến NST là những biến ñổi về cấu trúc NST (mất ñoạn, lặp ñoạn, ñảo ñoạn, chuyển ñoạn) hoặc số lượng NST (thể dị bội, thể ña bội)

ðột biến gen có thể xảy ra ở tất cả các loài sinh vật, trong tế bào riêng rẽ hay trên toàn bộ cơ thể, trong mọi thời kỳ sinh trưởng, phát triển nhưng ở mức

ñộ khác nhau Những ñột biến xuất hiện do các ñiều kiện tự nhiên của môi trường tác ñộng gọi là ñột biến tự nhiên, còn những ñột biến xuất hiện do con người bằng việc xử lý các tác nhân vật lý, hoá học gọi là ñột biến nhân tạo

Hầu hết những biến ñổi di truyền có lợi ở thực vật xảy ra trong ñiều kiện

tự nhiên ñều ñược sử dụng trong các chương trình chọn tạo giống cây trồng, cây dại và trong các nguồn gen Thông qua lai tạo, các gen ñược tái tổ hợp thành các

tổ hợp gen mới triển vọng ðột biến tự nhiên xảy ra với tần số thấp hơn 1000 lần

so với ñột biến nhân tạo bằng phóng xạ Theo quan ñiểm của các nhà chọn giống thì hầu hết các ñột biến tự nhiên ñều là các ñột biến lặn và có hại Bằng kỹ thuật gây ñột biến nhân tạo, các nhà khoa học ñã tạo và làm tăng các ñột biến có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và ở cây trồng nói riêng Mặc dù còn rất nhiều những hạn chế, nhưng ñột biến nhân tạo ñã và ñang có những ñóng góp rất

có ý nghĩa trong công tác chọn tạo giống cây trồng

ðột biến có thể “sửa chữa” một số khuyết tật của các giống ñang phát triển trong sản xuất, có khả năng tạo giống nhanh vì các thế hệ sau dễ ổn ñịnh,

ít phân ly tính trạng như các phương pháp khác Bằng phương pháp gây ñột biến nhân tạo ñã tạo ra những nguồn vật liệu khởi ñầu rất phong phú Từ nguồn vật liệu này có thể lai tạo và chọn lọc các giống mới theo mục ñích của các nhà chọn giống

2.3.2 Các tác nhân gây ñột biến

Theo Rieger và cộng sự (1976) có hai loại tác nhân gây ñột biến là: tác nhân vật lý và tác nhân hoá học

2.3.2.1 Tác nhân hoá h ọc gây ñột biến

Phương pháp tạo giống ñột biến hoá học ñược ứng dụng rộng rãi trong vài chục năm gần ñây và ở nhiều nước trên thế giới ñã thu ñược nhiều kết quả tốt

Hiện nay, người ta biết ñến hàng chục nhóm chất cùng hàng ngàn dẫn xuất của chúng gây ñột biến Các chất gây ñột biến có thể làm thay ñổi cấu trúc NST và gen, gây nên ñột biến ở thực vật với tần số ñột biến cao hơn, tinh

vi hơn và ñặc hiệu hơn các tác nhân vật lý

Các chất hoá học gây ñột biến như các chất ôxy hoá, methyl hoá, ethyl hóa Cho ñến nay, các tác nhân hóa học chủ yếu ñược sử dụng ñó là các chất thuộc nhóm ankyl như: Nitrozoethyl ure, Colchicine, Nitrozomethyl ure…ñây

là những hoá chất ñã ñược thử nghiệm và chứng tỏ có khả năng gây ñột biến cao nhờ khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào và màng nhân, có ñặc ñiểm

làm thay ñổi trạng thái hoá học của NST

2.3.2.2 Tác nhân v ật lý gây ñột biến

Tác nhân vật lý gồm các tia bức xạ, sốc nhiệt từ trường, trong ñó các tia bức xạ ñược nghiên cứu sâu và ứng dụng rộng rãi nhất trong phát sinh ñột biến thực nghiệm Các nghiên cứu ñột biến phóng xạ ñược bắt ñầu từ những năm 1925 ở Ruồi giấm của Nuller và ở Ngô của Stadler Trong những năm gần ñây nhờ sự phát hiện mới trong vật lý nguyên tử ñã mở rộng phạm vi nghiên cứu, tạo giống ñột biến phóng xạ, bao gồm dạng phóng xạ hạt và phóng xạ ñiện từ

− Phóng xạ hạt là dòng chuyển ñộng của những hạt cơ bản: proton,

ñiện tử, nơtron…

− Phóng xạ ñiện từ là các sóng ñiện từ như: tia Gamma, tia X…

− Các dạng phóng xạ thường ñược sử dụng ñể gây ñột biến là hạt nơtron, tia X và phổ biến là tia Gamma với nguồn thường dùng là

− Hiệu quả chủ yếu của tia phóng xạ khi xử lý ñột biến là: Làm ñứt gãy mạch ADN dẫn ñến ñột biến NST, làm thay ñổi cấu tạo hoá học bazơ nitơ dẫn ñến sự biến ñổi gen, tạo sự liên kết chéo giữa hai phân

tử ADN gây sự chết của tế bào

2.3.3 Cơ chế gây ñột biến

Tiềm năng liên kết hydro của bazơ ADN xác ñịnh cả cấu trúc của ADN lẫn tính ñặc trưng chuyên hoá cho một cặp ñôi bazơ Chúng có thể bị thay ñổi bởi việc tạo ra những hỗ mang bazơ (bazơ tautomes) thông qua sự di chuyển proton Quá trình này có thể làm tăng chuỗi cải biến dẫn ñến ñột biến Tính hỗ mang của bazơ (tautome bazơ hoá) và sự luân phiên bazơ ñược sử dụng ñể giải thích sự phát sinh ñột biến transition và transversion Nghĩa là ở một thời ñiểm sao chép một bazơ trong mẫu ADN xuất hiện tính chất mã không thích hợp dẫn ñến sự sát nhập một gốc bazơ không ñúng vào ADN mới Hơn nữa, ADN và những tiềm thể của nó là ñối tượng cho sự xâm nhập liên tục cả từ nguôn nội sinh lẫn ngoại sinh có thể dẫn ñến tổn thương bazơ và cặp ñôi nhầm, tạo ra những ñột biến kiểu thay thế cặp bazơ Có những loại tổn thương bazơ làm mất ñi liên kiết hydro những loại ñó là sự mất một purine, toàn bộ

sự mở soắn bazơ (chủ yếu là do tính ñối xứng) và cả sự hình thành cuộn lớn làm ngăn cản sự tương tác bazơ với bazơ, những trường hợp như vậy là rất phổ biến

Với phương pháp ñột biến thực nghiệm, sử dụng các tác nhân gây ñột biến hoá, lý ñã làm tăng sự sai khác về mặt di truyền trong quần thể Trong hàng loạt ñột biến xuất hiện, bên cạnh những ñột biến có hại, còn có những ñột biến có lợi Chúng có thể nhân trực tiếp thành giống mới hoặc sử dụng làm vật liệu khởi ñầu cho công tác tạo giống [4]

2.4 ða bội thể và ứng dụng trong chọn giống

2.4.1 Khái niệm và ý nghĩa

ða bội thể là hiên tượng những sinh vật trong tế bào sinh dưỡng có số lượng NST tăng theo bội số nguyên lần của bộ NST ñơn bội (từ 3n trở lên)

ða bội thể nhân tạo có nhiều giá trị quý như tăng năng suất, phẩm chất Phần lớn các giống cây trồng không hạt như dưa hấu, cà chua, cam, quýt, bưởi…ñều do phương pháp ña bội thể tạo ra

2.4.2 Các dạng ña bội thể

- ða bội thể cùng nguồn: là ña bội thể ñược tạo nên bởi những NST giống nhau của cùng một loài Hiện tượng này xảy ra có thể do sự tăng ñôi số lượng NST trong hợp tử khi số lượng NST tương ñồng không bắt cặp hay sự hợp nhất cá giao tử làm cho giao tử lưỡng bội Thể ña bội này thường bị bất thụ do quá trình phân bào giảm nhiễm xảy ra khó khăn

- ða bội thể khác nguồn: là loại hình ña bội ñược hình thành bằng việc

tổ hợp các gennom từ hai hoặc nhiều làm tăng số lượng NST của cùng loài Loại ña bội thể này phụ thuộc vào ñặc tính của bố mẹ và di truyền không phức tạp như loại ña bội thể cùng nguồn

- ða bội lệch: ñó là sự thay ñổi bộ NST không bằng bội số ma tăng hay giảm từng NST riêng biệt (2n ± x) Các ña bội lệch thường dẫn ñến dị hình, sức sống kém do mất cân bằng bộ NST

2.4.3 Một số ñặc ñiểm của cây ña bội

- Về hình thái: Cây ña bội thường có thân to, cao; lá dày xanh ñậm; khí khổng, hạt phấn lớn; hoa quả to

- Về sinh lý: cây ña bội sinh trưởng phát triển chậm hơn so với cây bình thường Cường ñộ hô hấp, áp suất thẩm thấu của tế bào nhỏ hơn cây nhị bội Tuy nhiên, cây ña bội lại có khả năng chống chịu (chống hạn, chống bệnh) cao hơn

- Về sinh hoá: ở cây ña bội hàm lượng các chất như ñường, protein, lipit, vitamin… thường cao hơn so với cây nhị bội

- Về tính bất dục và ñặc tính di truyền: cây ña bội thể cùng nguồn hoặc cây tam bội có tính bất dục cao do quá trình phân bào không bình thường Cây ña bội có ưu thế lai duy trì ñược lâu hơn và khi tự phối ít thoái hoá hơn cây nhị bội Cây ña bội ít phân ly hơn cây nhị bội

2.4.4 Nguyên tắc và các phương pháp xử lý ña bội

- Nguyên tắc xử lý ña bội: xử lý ña bội là dùng các tác nhân lý, hóa… tắc ñộng vào cơ thể sinh vật lúc chúng ñang trong giai ñoạn phân chia tế bào mạnh nhất nhằm là cho quá trình diễn ra không bình thường và hình thành lên thể ña bội Khi xử lý ña bội cần tuân thủ 3 nguyên tắc sau: một là xử lý lúc tế bào phân chia mạnh nhất (mô phân sinh ñầu rễ, thân; hạt nẩy mầm, cây phân cành ) Hai là: tác ñộng vào lúc tế bào phân chia ở giai ñoạn hậu kỳ nhằm làm ñứt thoi dây tơ vô sắc giúp số lượng NST nhân ñôi mà không phân ly ñược Ba là: tác ñộng vào giai ñoạn mạt kỳ lúc tế bào chưa phân chia, kìm

hãm sự phân chia sinh ra tế bào có hai nhân

- Các phương pháp xử lý ña bội:

Nếu xét về tác nhân gây ña bội thì có hai tác nhân chính, ñó là: vật lý (chán thương cơ giới, ly tâm, thay ñổi ôn ñộ ñột ngột) và hoá học (Indol acetic acid, sunf amit, colchicine …) Trong các tác nhân gây ña bội lý hoá học, thường ñược áp dụng 3 phương pháp chính:

- Phương pháp gây chấn thương: hiệu quả với cây họ cà, tạo ra ñược nhiều cây ña bội có giá trị cao như: táo, mía, cà chua…

- Phương pháp thay ñổi nhiệt ñộ: áp dụng cho lúa khi hình thành tế bào

mẹ hạt phấm tiến hành nâng nhiệt ñộ từ 20 – 30 lên trên 400C

- Phương pháp xử lý colchicine: khi sử dụng phương pháp nầy cần chú

ý ñến nồng ñộ và thời gian thích hợp cho từng ñối tượng xử lý Nồng ñộ thông thường dao ñộng từ 0,01% ñến 1,6% và thời gian xử lý từ 1 – 10 ngày tuỳ từng ñối tượng ðối tượng xử lý có thể là hạt, ñỉnh sinh trưởng (mầm hoặc cây con), ñầu rễ…

2.5 Tính chất và tác dụng của Colchicine trong xử lý ñột biến

Colchicine hay còn gọi là Acetyltrimethylcolchicinic acid là một alkaloid ñược chiết xuất từ rễ cây colchicine – autumnale L mọc nhiều ở ðịa Trung Hải Công thức hoá học của colchicine là: C22H25O6N, trọng lượng phân

tử 399.43 là một chất kiềm thực vật có ñộc tính cao Colchincine là hoá chất bền vững với nhiệt ñộ, dễ bị mất hoạt tính bởi ánh sáng, dễ hoà tan trong nước (Blakeslee and Avery, 1937)

Nebel (1937) và Dermen (1938) ñã cho rằng Colchicine cản trở các NST trong nhân tế bào phân chia về 2 cực bởi vì nó làm ñứt các thoi vô sắc trong giai ñoạn phân bào Như vậy, ở các tế bào với số lượng NST ñã ñược

nhân ñôi, dưới tác ñộng của Colchicine sẽ không làm chia 2 nữa, dẫn ñến việc tạo ra tế bào ña bội thể

Do tính chất và cơ chế tác ñộng của Colchicine là tác ñộng lên sự hình thành và phá huỷ thoi vô sắc, vì vậy người ta thường xử lý Colchicine lên các

mô ñang có nhiều tế bào phân chia nhất hoặc xử lý các mô ở thời ñiểm có chỉ

số phân bào cao nhất (Trần Duy Quý, 1997)

Colchicine là chất có khả năng gây ña bội hoá cao trong dung dịch lỏng

nó dễ dàng khuyếch tán vào các mô tế bào, có hiệu quả ñối với các tế bào ñang phân chia và không có tác dụng với các tế bào ngủ nghỉ Vì vậy, về mặt

lý thuyết một mô phân sinh có thể chuyển từ dạng nhị bội sang dạng tứ bội nếu mô ñó ñựơc xử lý Colchicine với thời gian và liều lượng thích hợp ở thời ñiểm thích hợp trong quá trình phân chia tế bào của cây

Burnham (1962) cho biết Colchicine có hiệu quả gây ña bội thể dao ñộng từ nồng ñộ 0.001 ñến 1% (trọng lượng/thể tích) và thời gian xử lý từ 30 phút ñến 24 giờ Tuy hiệu quả của Colchicine còn phụ thuộc nhiều yếu tố khác như kiểu gen, phương pháp, nồng ñộ và thời gian xử lý, thời ñiểm xử lý Các cơ thể có kiểu gen khác nhau cảm ứng với Colchicine khác nhau

Thông thường xử lý Colchicine trên các mẫu ñang ở thời kỳ phân chia mạnh như mô sẹo, tiền chồi, noãn non Các nhà khoa học ñã nhận thấy cây ña bội thể không bị khảm bằng nuôi cấy mô sẹo phôi hoá trên môi trường có chứa Colchicine nồng ñộ 0.05 % và 0.1 % Muốn nhận ñược hiệu quả cao khi gây ña bội thể dưới tác dụng của Colchicine phải tạo ñiều kiện cho các tế bào của mẫu bị xử lý phân chia mạnh mẽ Làm như vậy không những nâng cao ñược hiệu quả ña bội của Colchicine mà còn giảm ñược tính khảm phức tạp của các cây (Wu and Mooney, 2002)

2.6 Tính chất và tác dụng của tia Gamma (γγγγ) trong xử lý ñột biến

Tia gamma thuộc nhóm bức xạ ion hoá, có bước sóng ngắn nhất từ

0,005Ǻ - 1,4Ǻ) chứa năng lượng hoạt hoá từ 1 – 1000MeV và không bị lệch trong ñiện trường Tia gamma ñược tạo ra khi một số chất ñồng phóng xạ phân huỷ, ñồng thời cũng tạo ra tia α (proton) và tia β (electron)

Tia Gamma nguồn Co60 có bước sóng ngắn nên hiệu quả xuyên thấu cao Tia gamma cũng không bị chệch khỏi từ trường hay ñiện trường nhưng

do không mang ñiện nên khi ñi qua cơ thể sinh vật không có tác dụng ñiện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng ñiện ly gián tiếp nhờ hiệu ứng quang ñiện ðể xử

lý cây trồng, người ta thiết kế những “trường” Gamma lớn trong ñó có nguồn

Co60 ñược ñặt ở trung tâm, bao quanh là cây trồng cần nghiên cứu hoặc là các hộp có chứa thiết bị chiếu ñược ñặt cùng với ñối tượng chiếu

Những tác dụng tạo nên sự thay ñổi về cấu trúc và chức năng tế bào thì cần phải nhiều ngày ñến hàng tháng mới biểu hiện ra và phát hiện ñược Những công trình nghiên cứu ñã cho thấy rằng nhân tế bào là rất quan trọng

ñể có ñược hiệu quả mong muốn trong chiếu xạ ở mức ñộ tế bào, tia gamma (Co60) có thể làm biến ñổi cấu trúc NST và huỷ hoại quá trình phân chia tế bào (nguyên phân và giảm phân) Chúng chia làm hai loại: ñột biến NST và ñột biến chromatid ðối với nguyên phân, tia gamma có thể gây ra các hậu quả sau: kìm hãm hay dừng tạm thời hoặc hoàn toàn; tăng ñộ nhớt hay kết dính NST (gây chết); làm sai hình NST một các phức tạp tuy nhiên, nếu bức

xạ ở liều thấp lại kích thích sự phân bào ðối với giảm phân, nó thường gây nên tính sai hình NST ở Diplonem, hậu kỳ I hoặc II [ðỗ Hữu Ất, 1996]

Hiệu quả chiếu xạ thực vật ở thế hệ ñầu ñược thể hiện ở những biến ñổi dương tính, ñó là những biến ñổi về cấu trúc, hình thái, sinh lý, sinh trưởng, sinh sản và gây chết Sau khi xử lý chiếu xạ, có hai dạng hiệu quả: tức thời và lâu dài ðối với dạng hiệu quả tức thời thường là sự biến ñổi hoá sinh, sinh lý, vật chất di truyền Với hiệu quả chậm thường gây ra các biến ñổi nêu trên trong suốt quá trình sinh trưởng phát triển của thực vật ðối với các loài thực

vật, liều lượng chiếu xạ thấp có tác dụng kích thích sinh trưởng, còn liều cao lại kìm hãm và nếu cao quá sẽ gây chết tế bào hoặc cơ thể

Sự tổn thương chiếu xạ xảy ra trong một quần thể tế bào là hiếm gặp Một vài tế bào bị tổn thương lớn ñến mức chết, những tế bào khác thì phụ thuộc vào kết quả của sự ion hoá Vì thế những cơ thể ña bào có khả năng phục hồi lại ñược từ những liều của chiếu xạ ion nửa gây chết Thậm chí trong phạm vi một tế bào, những phân tử không bị tổn thương có thể thông qua quá trình trao ñổi chất ñể phục hồi dần ñến mức bình thường Nhưng hiệu quả phục hồi sinh lý sớm như vậy dựa trên quá trình trao ñổi chất bình thường và cần ñược phân biệt với sự sửa chữa nghĩa là phục hồi những chức năng ban ñầu

Sự chết của tế bào sau khi chiếu xạ không phải chỉ ñơn thuần là do bất

kỳ một nhân tố ñơn lẻ nào, mà nó là kết quả của sự tổn thương sâu sắc của một hoặc một vài chức năng quan trọng tuỳ thuộc vào kiểu của tế bào, hoạt ñộng của nó vào thời ñiểm chiếu xạ và phụ thuộc vào ñiều kiện chiếu xạ

Liều lượng phóng xạ biểu thị bằng các ñơn vị ño khác nhau Lượng phóng xạ ion hoá ñược xác ñịnh bằng ñơn vị ño là rơnghen (r), là lượng phóng xạ có khả năng gây ra 2,08.109 cặp ion trong 1 cm3 không khí ở O0C dưới áp suất 760mmHg ðối với 1cm3 mô còn sống thì 1 rơnghen có khả năng gây ra số cặp ion lơn hơn 1000 lần.[ ]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, sử dụng chiếu xạ như là một phương tiện ñể tạo ra những hiệu quả ñột biến ở thực vật thu ñược một số lượng các biến số có liên quan ñến kỹ thuật chiếu xạ như:

− Liều chiếu

− Tỷ lệ liều lượng

− Sự chiếu xạ dài hạn và ngắn hạn

− Chiếu xạ hồi quy

Trong các yếu tố trên thì tỷ lệ liều lượng là rất quan trọng Những thay ñổi về liều lượng trên mỗi ñơn vị thời gian có ảnh hưởng ñến kết quả sinh học thu ñược Những thay ñổi di truyền gây ra bởi tổn thương ñơn là không bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ liều lượng và thể hiện mối tương quan tuyến tính với liều lượng Rất nhiều những sai hình NST ñược gây ra bởi hai hay nhiều sự chiếu

xạ ion hoá Vì nhân tố thời gian cũng ñóng vài trò quan trọng nên những sai hình NST bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ liều lượng và thể hiện mối tương quan tuyến tính ñường cong Do những nguyên nhân này mà tỷ lệ liều chiếu cần ñược lựa chọn một cách cẩn thận và ghi chép lại

Ngoài ra sự thay ñổi ñược tạo ra còn do ñộ nhạy cảm và nhiều nhân tố làm thay ñổi như:

− Những nhân tố sinh học như là nhân tế bào và thể tích NST ở gian kỳ (interphase) và những khác biệt di truyền

− Những nhân tố môi trường như là ñiều kiện ñủ hoặc thiếu oxi trong

mô, lượng nước trong hạt, nhiệt ñộ và sự bảo quản sau chiếu xạ Những nhân tố hoá học như là sự có mặt hoặc vắng mặt của chất bảo vệ phóng xạ và của chất nhạy cảm phóng xạ trong khi xử lý

2.7 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chọn tạo giống bằng con ñường

gây ñột biến trên thế giới, trong khu vực và ở Việt Nam

2.7.1 Trên thế giới và trong khu vực

Trong nhiều thập kỷ trở lại ñây, trên thế giới, nhiều phòng thí nghiệm khác nhau ở các nước ñã tiến hành việc nghiên cứu thực nghiệm: nghiên cứu

về cơ chế phân tử của quá trình ñột biến (Dubinin, 1970, 1979, 1985; Taraxov, 1975, 1979, 1990, 1992; Nguyễn Hữu ðống, 1978, 1982, 1989…),

cũng như việc ứng dụng nó trong công tác chọn giống các loại cây trồng nông nghiệp (ngô, lúa, lúa mì, ñậu, lạc, hoa, cây cảnh…) và thu ñược nhiều kết quả

to lớn Một vài nghiên cứu gây tạo biến dị bằng chiếu xạ ở chuối in vitro (Novak và cs, 1990) và khoai tây (Sonnino và cs, 1986; Ahloowalia, 1990) Tại hội nghị Di truyền quốc tế (1993), Sidorova và Morgun ñã công bố việc tạo thành công 2 giống lúa mì mùa ñông thông qua các biến dị tái sinh từ callus và chiếu xạ tia gamma lên hạt (dẫn theo Maluszynski, 1995) [15]

Theo FAO/IAEA thì số lượng các cây trồng mới ñược tạo ra bằng phương pháp ñột biến cảm ứng (bằng các nhân tố vật lý hoặc bằng các nhân

tố hoá học, hoặc bằng sự phối hợp giữa các nhân tố vật lý và hoá học cùng với việc sử dụng các phương pháp chọn giống cổ ñiển như lai tạo, chọn lọc cá thể, chọn lọc hàng loạt… ñã tăng lên nhanh chóng Theo thống kê của FAO Năm

1960 chỉ có 7 giống cây trồng ñột biến trên thế giới thì ñến năm 1980 có 500 giống, năm 1990 có 1970 giống (Nguyễn Hữu ðống, 2000)[45] Nhiều giống lúa mang tính trạng quý ñã ñược tạo nên do ñột biến như: nửa lùn (126 giống), chín sớm (110 giống), chất lượng hạt cao (16 giống), chịu mặn (9 giống)…[43]

Tại châu Á, ñã thành lập Hiệp hội chọn giống ñột biến do Nhật Bản tài trợ Năm 1996, Việt Nam ñã trở thành thành viên chính thức của Hiệp hội và Viện Di truyền Nông nghiệp ñược chỉ ñịnh làm cơ quan ñầu mối ðây là một

cơ hộ thuận lợi ñể các nước trong khu vực nói chung và Việt Nam nói riêng

có ñiều kiện hợp tác, trao ñổi thông tin, ñào tạo cán bộ trong lĩnh vực khoa học này

2.7.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chọn tạo giống bằng con ñường gây ñột biến ở Việt Nam

Trong công tác chọn tạo giống cây trồng, một trong những hướng quan trọng ñể tạo ra cây tam bội, ñặc biệt ñối với cây có múi như: cam, quýt, bưởi… là dùng phép lai giữa giống nhị bội và giống tứ bội Tuy nhiên công tác này vẫn còn hạn chế bởi sự thiếu nguồn gen tứ bội, do vậy việc sử dụng các tác nhân gây tứ bội hoá kiểu gen cây trồng rất ñược chú trọng trong ñó colchicine có hiệu quả khá cao Một trong những hướng nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới là sử dụng các kỹ thuật tạo tứ bội thể khác nhau như: xử lý colchicine trên cành, mắt ghép, chồi…ngoài tự nhiên hoặc xử

lý chồi, mô sẹo in vitro hoặc tạo dòng tứ bội từ dung hợp tế bào trần nhị bội với nhau…

Năm 2004, Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự tại trường ðH Kyushu, Nhật Bản ñã tạo thành công dòng tứ bội trên cây Alocasia × amazonica nhị bội (2n=28) bằng colchicine và oryzalin Kết quả thu ñược cho thấy, khi xử lý colchicine nồng ñộ 0.05% trong 72 giờ cho tỷ lệ dòng tứ bội cao nhất (20%) ðối với mẫu xử lý bằng oryzalin tỷ lệ dòng tứ bội cao nhất ở nồng ñộ 0.05% trong 48 giờ Bên cạnh ñó, hầu hết trên các công thức có xử lý colchicine hoặc oryzalin ñều xuất hiện dòng tứ bội ngoại trừ nồng ñộ colchicine 0.01% ngâm trong 24 giờ không là có tác dụng [19]

Năm 2005, Hà Thị Thuý và cộng sự của Viện Di truyền Nông nghiệp

ñã nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của tính trạng không hạt và tạo thành công dòng tứ bội trên cây cam xã ðoài, cam Vân Du bằng xử lý colchicine chồi của các giống này in vitro Bên cạnh ñó tác giả còn tạo thành công dòng tứ bội của cây quýt Chum, bưởi và cam Phúc Trạch từ xử lý colchicine trên cành in vivo, xử lý thành công trên hạt của cây cam Sành, cây bưởi ðỏ…[24]

Bên cạch việc sử dụng colchicine trong xử lý ựột biến tạo dòng tứ bội, nhiều kết quả nghiên cứu còn cho thấy hiệu quả gây ựột biến với tần số tương ựối cao của tia gamma mà nguồn sử dụng chắnh ựể chiếu xạ là Co60 ựối với một số cây trồng như: cây lúa, cây ngô, cây ựậu tương, cây hoa cúcẦ

Nhờ việc sử dụng tia gamma, người ta ựã thu ựược nhiều dạng ựột biến

có giá trị ở nhiều loại cây trồng khác nhau Vắ dụ như ở họ hoà thảo ựã thu ựược những dạng rơm ngắn, chống ựổ, có khả năng sinh trưởng mạnh, chống chịu tốtẦChiếu xạ kết hợp với nuôi cấy in vitro ựã ựược chứng minh là phương pháp có giá trị ựể tạo ra các biến dị mong muốn và nhân giống một cách nhanh chóng

Ở Việt Nam, các nghiên cứu và ứng dụng của phương pháp gây ựột biến thực nghiệm và chọn giống thực vật ựã ựược bắt ựầu khá sớm Năm

1966, Bộ môn Di truyền giống, đH Tổng hợp Hà Nội bắt ựầu nghiên cứu trên cây lúa và cây ựậu tương Sau ựó hướng nghiên cứu này ựược triển khai ở một

số cơ sỏ như: Viện KHKTNN, Viện Cây lương thực và Thực phẩm, Viẹn Di truyền nông nghiệp, Trường đH Sư phạm HN I, đH Nông nghiệp IẦ Trong

ựó có một vài tác giả ựã thành công về tạo giống lúa ựột biến trên lúa như: Vũ Tuyên Hoàng 1982, Nguyễn Minh Công và cs 1995, 1996, 1999, Trần Duy Quý 1978, 1999 ; trên ngô có Nguyễn Hữu đống và cs 1997, 1998, 2000; đặng Văn Hạnh và cs 1994; trên cây ựậu tương có các tác giả như: Trần đình Long 1980; Võ Hùng và cs 1982 Ầ

Trong 20 năm trở lại ựây, nước ta ựã ựã thu ựược nhiều thành tựu ựáng

kể trong việc nâng cao sản lượng lương thực, ựặc biệt là lúa nhờ phương pháp gây ựột biến thực nghiệm từ năm 1989 Ờ 2000, Viện DT nông nghiệp ựã công

bố 6 giống lúa quốc gia: DT 10, DT 11, DT 13, DT 33, DT 16 và Nếp thơm

DT 21 Năm 2003, Lê Xuân đắc, Bùi Văn Thắng và cộng sự thuộc Viện

Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG ựã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tia gamma (Co60) ựến khả năng sống sót và tái sinh cây từ mô sẹo trên một số giống lúa ựịa phượng Kết quả cho thấy, liều chiếu xạ thắch hợp cho mô sẹo của 4 giống (Tám Xoan, Tám ấp bẹ, Dự thơm, Tẻ Di Hương) từ 7 Krad ựến 9 Krad Tác giả tiến hành chiếu xạ với các liều chiếu khác nhau trên 6000 khối mô sẹo và ựã thu ựược 1271 dòng cây, một số dòng ở MR0 ựã

có biểu hiện thấp cây ựạng ựược các tác giử nghiên cứu trên ựồng ruộng ựể chọn ra các dòng có triển vọng làm giống

Hiện nay, Việt Nam có 44 giống cây trồng ựược tạo nhờ tác nhân gây ựột biến vật lý và hoá học Phần lớn các giống này tập trung ở các ựối tượng như: lúa, ngô, ựậu tương, còn các ựối tượng khác như hoa, cây cảnh vẫn còn hạn chế

Năm 2002, đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh ựã bước ựầu tạo nguồn vật liệu khởi ựầu cho chọn tạo giống cúc bằng gây ựột biến thực nghiệm từ việc chiếu xạ tia gamma (Co60) trên chồi in vitro Tác giả cho rằng tia gamma (Co60) ựã gây ảnh hưởng ựến khả năng sinh trưởng phát triển của cây hoa cúc in vitro, ảnh hưởng ựến hình thái và gây hiện tượng bạch tạng, dị dạng thân lá

Năm 2005, đào Thanh Bằng, Nguyễn Phương đoài, Nguyễn Quang Minh và cs thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp ựã công bố kết quả chọn giống hoa cúc bằng chiếu xạ in vitro và ựã thu ựược nhiều màu sắc hoa khác nhau, dạng hoa khác nhau đối tượng cụ thể ựem ựi chiếu xạ là khối callus của giống hoa cúc màu trắng CN43, các tác giả ựã sử dụng dải liều lượng từ 1,0 cho ựến 15 Krad kết quả thu ựược cho thấy liều gây chết 50% về khả năng tái sinh chồi là từ 5,0 krad và thu ựược 3 thể ựột biến màu hoa (màu vàng, màu hồng và màu chóp cánh màu xanh)[9]

Như vậy, thực tế gần 20 năm qua, nhờ áp dụng kĩ thuật hạt nhân như

chiếu xạ hạt giống trước khi gieo, chiếu xạ hạt giống ñể gây các ñột biến di truyền những tính trạng quý như cây thấp, chống ñổ, chín sớm, năng suất cao, chống chịu sâu bệnh… Chiếu xạ hạt, củ khi bảo quản ñể tránh thất thu và hao hụt khi bảo quản nông sản ñã ñược phát triển mạnh Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, một số trung tâm ñã tạo ra ñược 20 giống cây trồng gồm: lúa, ngô, ñậu tương, lạc, cà chua, dâu tằm, táo, các giống cây ăn quả không hạt… bằng phương pháp ñột biến cảm ứng bổ sung vào cơ cấu giống cây trồng, góp phần vào tăng năng suất và sản lượng lương thực thực phẩm hàng năm một cách ổn ñịnh

Trong thời gian vừa qua và hiện nay ñã có khá nhiều nghiên cứu nhằm ứng dụng kỹ thuật hạt nhân vào nông nghiệp, cụ thể là:

− Sử dụng kỹ thuật ñồng vị phóng xạ ñể nghiên cứu quá trình dinh dưỡng của cây trồng nhằm sử dụng có hiệu quả nhất phân bón ñể thu ñược năng suất và chất lượng cao

− Sử dụng kỹ thuật chiếu xạ ở liều thấp cho hạt giống trước khi gieo ñể kích thích ñộ nảy mầm, sinh trưởng và phát triển cũng như tăng khả năng chống chịu sâu bệnh

− Sử dụng chiếu xạ ñể bảo quản hạt giống, củ giống, chống muối mọt, chống nảy mầm làm hao hụt và suy giảm chất lượng củ giống và hạt giống

− Sử dụng chiếu xạ hạt khô, hạt nảy mầm, bao phấn, hợp tử và tiền phôi của cây lúa, ngô, ñậu tương, hoa, cây cảnh ñể tạo ra các ñột biến có lợi như thấp cây, chống ñổ, chín sớm, năng suất cao, chống chịu sâu bệnh và các ñiều kiện bất lợi

+ Tăng hàm lượng protein trong hạt

+ Thay ñổi màu sắc hoa, các dạng bất dục ñực ñể sử dụng vào công nghệ lúa lai, ngô lai…

3 Đối tượng, địa điểm , nội dung

và phương pháp nghiên cứu

3.1 ðối tượng và ủịa ủiểm nghiờn cứu

ư Thớ nghiệm xử lý ủột biến bằng colchicine ủược tiến hành trờn giống hoa ủồng tiền kộp, màu trắng nhị nõu Bộ phận xử lý là chồi in vitro

ư Thớ nghiệm xử lý ủột biến bằng chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) ủược tiến hành trờn giống hoa ủồng tiền kộp, mầu ủỏ nhị nõu Bộ phận xử lý là callus

ư Hai giống ủồng tiền này ủều cú nguồn gốc từ Hà Lan, nhập nội vào Việt Nam từ Cụn Minh, Trung Quốc

ư Tỏc nhõn vật lý gõy ủột biến là tia γ nguồn Co60, chiếu xạ ủược thực hiện tại trung tõm chiếu xạ Quốc Gia- Cầu Diễn – Hà Nội

ư Tỏc nhõn gõy ủột biến hoỏ học là colchicine (acetyl trimethyl colchicine)

ư Cỏc thớ nghiệm ủược tiến hành tại phũng thớ nghiệm, vườn thực nghiệm Viện Sinh học Nụng nghiệp, trường ðại học Nụng nghiệp I, Hà Nội

Hỡnh 3.1 Mẫu hoa xử lý colchicine Hỡnh 3.2 Mẫu hoa xử lý chiếu xạ

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Xử lý chồi đồng tiền bằng colchicine

a Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý colchicine đến chồi đồng tiền nuôi cấy mô

Bao gồm 3 thí nghiệm nhỏ với 12 công thức, trong đó có 9 công thức xử

lý colchicine (xử lý với 3 nồng độ 0,01%; 0,05%; 0,1% và 3 thời gian khác nhau 24h, 48h, 72h) và 3 công thức đối chứng (không xử lý colchicine nhưng ngâm mẫu trong 3 thời gian khác nhau 24h, 48h, 72h) Mỗi công thức xử lý

e Thí nghiệm 5: Đánh giá khả năng sinh trưởng của các dạng cây thu được sau

xử lý colchicine in vitro (về hệ số nhân, khả năng ra rễ)

f Thí nghiệm 6: Theo dõi, đánh giá sinh trưởng của các dạng cây ngoài vườn

ươm

3.2.2 Xử lý đột biến callus đồng tiền bằng chiếu xạ tia gamma nguồn Co60

g Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ đến tỷ lệ sống

và khả năng sinh trưởng của callus đồng tiền

Callus được xử lý với 8 liều chiếu khác nhau: 0 Krad, 3 Krad, 6Krad, 9 Krad, 12 Krad, 15 Krad, 18 Krad, 21 Krad Mỗi liều chiếu 45 mẫu