Giải mã phân đoạn a hệ gen các chủng virus gumboro phân lập ở việt nam nhằm cung cấp nguồn gen cho nghiên cứu vaccine thế hệ mới

Luận văn

Trường đại học nông nghiệp hà nội

Lê thị kim xuyến

giải mã phân đoạn a hệ gen các chủng virus gumboro PHÂN LậP ở việt nam NHằM cung cấp nguồn gen cho

nghiên cứu vaccine thế hệ mới

Luận án tiến sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y M số : 62 62 50 10

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Lê Thanh Hòa

2 TS Nguyễn Bá Hiên

Hà Nội - 2010

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là số liệu ñầu tiên, hoàn toàn trung thực, chưa ñược công bố trong bất kỳ công trình hay tạp chí nào khác ở trong nước cũng như ở nước ngoài Mọi

sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn Các thông tin, tài liệu trích trong luận

án ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2010

Nghiên cứu sinh

Lê Thị Kim Xuyến

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến PGS.TS Lê Thanh Hòa - Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Bá Hiên - Trưởng Bộ môn Vi sinh vật

- Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, thầy ựồng hướng dẫn, ựã tận tình giúp ựỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phắ của Bộ Khoa học và Công nghệ cho ựề tài cấp Nhà nước KC.04.29 (2004 - 2006)

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Tập thể các anh chị em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học -

là nơi tôi công tác và cũng chắnh là nơi học tập nghiên cứu, ựã giúp tôi hoàn thành công việc nghiên cứu của mình

- Tập thể các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian sinh hoạt học tập tại Bộ môn

- TS Nguyễn Bá Thành, PGS.TS đinh Thị Bắch Lân và các ựồng nghiệp ựã giúp ựỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu bệnh phẩm

- Viện đào tạo Sau ựại học và các cán bộ phụ trách ựào tạo ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và học tập

Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến những người thân trong gia ựình ựã luôn khuyến khắch, ựộng viên cũng như chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình

Xin chân thành cảm ơn

Tác giả

Lê Thị Kim Xuyến

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

MỞ ðẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 ðẠI CƯƠNG VỀ BỆNH GUMBORO 4

1.1.1 Lịch sử và địa dư bệnh 5

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh 6

1.1.3 Cơ chế sinh bệnh 8

1.1.4 Triệu chứng lâm sàng 10

1.1.5 Bệnh tích 10

1.1.6 Chẩn đốn bệnh 13

1.1.7 Phịng bệnh Gumboro 13

1.2 SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO 15

1.2.1 Hệ gen của virus Gumboro 16

1.2.2 Protein của virus - cấu trúc và chức năng 19

1.2.3 Kháng nguyên của virus Gumboro 26

1.2.4 Cơ chế phân tử quá trình nhân lên của IBDV……… 28

1.2.5 Cơ chế phân tử của quá trình “chết theo chương trình” (apoptosis) và hậu quả do virus Gumboro gây ra……… 31

1.2.6 Epitope và sự biến đổi tính kháng nguyên và độc lực 34

1.3 CÁC CHỈ THỊ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS GUMBORO 40

1.3.1 Phản ứng RT-PCR thơng dụng trong nghiên cứu phân tử virus Gumboro 40

1.3.2 Chỉ thị di truyền sử dụng vùng “siêu biến đổi” 42

1.3.3 Chỉ thị di truyền sử dụng tồn bộ gen kháng nguyên VP2 43

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO Ở VIỆT NAM 44

1.5 TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS GUMBORO 48

Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

2.1.1 Giải trình tự chuỗi nucleotide gen kháng nguyên VP2 và phân

ñoạn A (VP2-4-3) của virus Gumboro phân lập tại Việt Nam 51 2.1.2 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả

hệ các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới dựa trên các

2.1.3 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả

hệ các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới dựa trên toàn

2.2 VẬT LIỆU 52

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54

2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 55 2.3.3 Phương pháp RT-PCR 56 2.3.4 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng ñiện di trên thạch

agarose 57 2.3.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR 58 2.3.6 Phương pháp tạo dòng 58 2.3.7 Phương pháp thu nhận DNA ñích trong sản phẩm PCR/RT-PCR

nhiều ñoạn 63 2.3.8 Phương pháp cắt-nối-ghép DNA 64 2.3.9 Phương pháp giải trình tự 64 2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học 66 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 71

3.1 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI NUCLEOTIDE GEN KHÁNG

NGUYÊN VP2 VÀ PHÂN ðOẠN A (VP2-4-3) 71 3.1.1 Kết quả xác ñịnh mẫu bệnh phẩm cung cấp nguồn RNA hệ gen virus 71 3.1.2 Kết quả giải trình tự gen kháng nguyên VP2 74 3.1.3 Kết quả giải trình tự phân ñoạn A 77

3.1.3.1 Giải trình tự phân ñoạn A chủng BDG23 từ mẫu bệnh

phẩm thu nhận tại Bình Dương 78

3.1.3.2 Giải trình tự phân ñoạn A chủng GHUT-12 từ mẫu bệnh

phẩm thu nhận tại Thừa Thiên-Huế 81

3.1.3.3 Giải trình tự phân ñoạn A từ chủng cường ñộc cổ ñiển

G202 phân lập tại Hà Nội 84 3.1.4 Danh sách ñăng ký Ngân hàng gen các chủng Gumboro 86

3.2 PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN

GỐC PHẢ HỆ CỦA CÁC CHỦNG GUMBORO VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI

DỰA TRÊN CÁC GEN TRONG PHÂN ðOẠN A 89

3.2.1 PHÂN TÍCH GEN VP2 91

3.2.1.1 Về thành phần nucleotide, amino acid 91

3.2.1.2 Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) 96

3.2.1.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 100

3.2.2 PHÂN TÍCH GEN VP5 103

3.2.2.1 Về thành phần nucleotide và amino acid 103

3.2.2.2 Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) 106

3.2.2.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP5 108 3.2.3 PHÂN TÍCH GEN VP4 109

3.2.3.1 Về thành phần nucleotide và amino acid 109

3.2.3.2 Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) 112

3.2.3.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP4 113

3.2.4 PHÂN TÍCH GEN VP3 115

3.2.4.1 Về thành phần nucleotide và amino acid 115

3.2.4.2 Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) 118

3.2.4.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP3 119

3.3 PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA CÁC CHỦNG GUMBORO VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI DỰA TRÊN TOÀN BỘ PHÂN ðOẠN A 121

3.3.1 Phân tích ñặc tính sử dụng nucleotide/amino acid ñể kiến tạo phân ñoạn A (VP2-4-3) ở 3 chủng BDG23, GHUT-12, G202 121

3.3.2 Về thành phần nucleotide và amino acid 124

3.3.3 Phân tích tỷ lệ ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) 128

3.3.4 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 130

3.4 THẢO LUẬN CHUNG 132 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 140

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 142

TÀI LIỆU THAM KHẢO 143

PHỤ LỤC 161

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AGP Agar Gel Precipitation Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch

CEF Chicken Embryo fibroblast Môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp CEK Chicken Embryo Kidney cells Môi trường tế bào thận thai gà

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

ELISA Enzym Linked

Immunosorbent Assay

Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết với enzyme

IBD Infectious Bursal Disease Bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm IBDV Infectious Bursal Disease

Virus

Virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm

INF Interferon

kDa kilo dalton

m.o.i multiplicity of infection Tỷ lệ gây nhiễm

RT-PCR Reverse transcriptase

polymerase chain reaction

vvIBDV Very virulent Infectious

Bursal Disease Virus

Virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm có ñộc lực cao

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang

2.1 Danh sách các mẫu bệnh phẩm Gumboro sử dụng nghiên cứu 53 2.2 Thành phần phản ứng RT-PCR và chu trình nhiệt trong nghiên cứu sinh học phân tử virus Gumboro 56 2.3 Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR và giải trình tự trong nghiên cứu virus Gumboro 57 3.1 Danh sách bản quyền ñăng ký gen VP2 và phân ñoạn A (VP2-4-3) trong Ngân hàng gen sử dụng trong nghiên cứu 87 3.2 Danh sách các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới sử dụng các gen của phân ñoạn A trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan

hệ nguồn gốc phả hệ 88 3.3 Vị trí sai khác nucleotide (74/178) dẫn ñến sai khác amino acid của gen kháng nguyên VP2 (1356 bp) giữa 28 chủng so sánh 93 3.4 55 vị trí sai khác amino acid của protein VP2 giữa 28 chủng so sánh 94 3.5 Sai khác về amino acid tại các vị trí quan trọng có vai trò quyết ñịnh về tính kháng nguyên và ñộc lực của virus Gumboro ở các chủng của Việt Nam và thế giới 95 3.6 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng

về amino acid (dưới ñường chéo) của gen kháng nguyên VP2 ở các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới 97 3.7 Tỷ lệ (%) tương ñồng về nucleotide (dưới ñường chéo) và amino acid (trên ñường chéo) của 16 chủng Gumboro trong nghiên cứu này (gen kháng nguyên VP2)……… 100 3.8 Các vị trí sai khác nucleotide dẫn ñên sai khác amino acid (21 trong số

28 sai khác) của gen mã hóa cho protein VP5 giữa 28 chủng so sánh 104 3.9 20 vị trí sai khác về amino acid của protein VP5 giữa 28 chủng so sánh 105 3.10 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng

amino acid (dưới ñường chéo) gen VP5 của các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới 107

3.11 Vị trí sai khác về nucleotide (26 trong số 109) dẫn ñên sai khác amino

acid của gen VP4 giữa 15 chủng 110 3.12 22 vị trí sai khác amino acid của protein enzyme VP4 giữa 15 chủng 110 3.13 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid ở VP4 giữa các chủng Âu - Mỹ

và Châu Á 111 3.14 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng

về amino acid (dưới ñường chéo) của gen VP4 giữa 15 chủng so sánh 112 3.15 Vị trí sai khác nucleotide (36 trong số 95) dẫn ñến sai khác amino acid

của gen VP3 giữa 15 chủng so sánh 117 3.16 25 vị trí sai khác amino acid của protein VP3 giữa 15 chủng so sánh 117 3.17 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng về

amino acid (dưới ñường chéo) của gen VP3 ở các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới 118 3.18 Thành phần nucleotide sử dụng trong VP2-4-3 (3039 nucleotide) ở

phân ñoạn A của 3 chủng BDG23, GHUT-12 và G202 122 3.19 Thành phần amino acid sử dụng trong polypeptide chung do VP2-4-3

mã hóa của 3 chủng BDG23, GHUT-12 và G202 123 3.20 Các vị trí có sai khác về nucleotide trong phân ñoạn A có ñộ dài 3039

bp giữa 3 chủng Gumboro của Việt Nam, lần lượt theo trật tự các gen VP2-VPx-VP4-VP3 126 3.21 Các vị trí sai khác amino acid của protein chung trong phân ñoạn A

giữa các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới, lần lượt theo trật

tự phân bố VP2-VPx-VP4-VP3 127 3.22 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng

về amino acid (dưới ñường chéo) của VP2-4-3 ở các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới (Âu-Mỹ và Châu Á) 129

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Nội dung Trang

1.1 Vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ, nơi ñầu tiên

phát hiện bệnh Gumboro 6

1.2 Cấu trúc của hạt IBDV dưới kính hiển vi ñiện tử 6

1.3 Virus Gumboro thường tập hợp thành từng cụm nằm trong tế bào lympho B bị nhiễm 7

1.4 Bệnh tích túi Fabricius và hệ cơ 11

1.5 Ảnh vi thể của các tế bào ñại thực bào trong túi Fabricius bị virus Gumboro tấn công 12

1.6 Các hạt virus nhìn dưới kính hiển vi ñiện tử 15

1.7 Hệ gen của virus Gumboro bao gồm 2 phân ñoạn A và B nhìn dưới kính hiện vi ñiện tử 17

1.8 Sơ ñồ hệ gen và một số vùng quan trọng của IBDV serotype I và II 18 1.9 Các phân ñoạn A và B của hệ gen virus Gumboro qua ñiện di DNA và các thành phần protein qua ñiện di protein 20

1.10 Sơ ñồ minh hoạ hệ gen của virus Gumboro và quá trình tổng hợp protein cấu trúc 24

1.11 Quy luật biến ñổi epitope: cường ñộc -> ñộc lực yếu -> nhược ñộc và ngược lại 36

1.12 Sơ ñồ minh họa các bước của một chu kỳ phản ứng PCR 42

2.1 Sơ ñồ nghiên cứu tổng quát ñể thu nhận các chuỗi gen……… 55

2.2 Cấu trúc của vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen)……… 59

2.3 Quy trình tách chiết plasmid tái tổ hợp……… 61

3.1 Sơ ñồ minh họa vùng “siêu biến ñổi” hệ gen IBDV và vị trí bám của cặp mồi GF-GR……… 72

3.2 Kết quả ñiện di kiểm tra RNA tổng số, và sản phẩm RT-PCR sử dụng cặp mồi GF-GR……… 72

3.3 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI……… 73

3.4 Giản ñồ (chromatogram) một phần trình tự vùng “siêu biến ñổi” gen kháng nguyên VP2 của chủng BDG……… 74

3.5 Sơ ñồ minh họa gen VP2-4-3 trong hệ gen virus Gumboro và vị trí bám của cặp mồi GVF(Kz2) - GV2R trên gen VP2……… 76 3.6 Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR nhân gen kháng nguyên VP2 và

kiểm tra kết quả cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI……… 77 3.7 Sơ ñồ minh họa phân ñoạn A hệ gen và vị trí các cặp mồi bám ñể thu nhận các ñoạn gen phân ñoạn A bằng RT-PCR……… 78 3.8 Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR phân ñoạn A hệ gen virus

3.9 Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của phân ñoạn A

3.10 Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR phân ñoạn A hệ gen virus

Gumboro mẫu GHUT-12 và DNA plasmid tái tổ hợp cắt kiểm tra

giới trên cơ sở gen VP5 về thành phần nucleotide và amino acid 108 3.17 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng IBDV Việt Nam và

thế giới trên cơ sở gen VP4 về thành phần nucleotide và amino acid 114 3.18 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng IBDV Việt Nam và

thế giới trên cơ sở gen VP3 về thành phần nucleotide và amino acid 120 3.19 Mối quan hệ phả hệ giữa các chủng IBDV của Việt Nam và các chủng

của thế giới trên cơ sở phân tích toàn bộ phân ñoạn A (VP2-4-3) về thành phần nucleotide và amino acid……… 131

MỞ ðẦU

Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh ở gia cầm non, chủ yếu ở gà và gà tây, do một loại virus gây ra, có tên gọi là virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm, hay còn gọi là virus Gumboro Bệnh gây thiệt hại rất lớn về mặt kinh tế cho người chăn nuôi Ngày nay, bệnh Gumboro xảy ra ở hầu hết các vùng chăn nuôi tập trung trên thế giới và virus Gumboro gây bệnh có nhiều biến chủng khác nhau nhưng ñều thuộc

về serotype I và II, trong ñó serotype I có mức ñộ ñộc lực và tính gây bệnh cao, còn serotyp II hầu như không có tính gây bệnh

Tại Việt Nam, bệnh Gumboro ñược chính thức phát hiện từ những năm 1980 dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, dịch tễ học (Bitay và cs, 1984) [3] Từ ñó ñến nay, sau gần 30 năm phát hiện, mặc dù ñã có nhiều chương trình phòng chống

và sử dụng nhiều loại vaccine, Gumboro vẫn là bệnh khó xử lý, xảy ra ngày càng trầm trọng và lan rộng trên toàn quốc, gây thiệt hại lớn

Virus Gumboro là loại virus có hệ gen là RNA (ribonucleic acid) gồm hai sợi dương (ds RNA) cuộn tròn ñược phân làm hai ñoạn riêng biệt nên virus

Gumboro thuộc họ Birnaviridae (Dobos và cs, 1979) [55] Hai phân ñoạn trong hệ

gen RNA của virus Gumboro có tên gọi là phân ñoạn A và phân ñoạn B, ñều mang thông tin di truyền và có nhiệm vụ sinh tổng hợp 5 loại protein từ VP1 ñến VP5 (VP = viral protein) của virus, ñó là VP1, VP2, VP3, VP4, VP5 (Kibenge và cs, 1988) [92] Phân ñoạn B có ñộ dài khoảng 2800 nucleotide có chứa bộ phận gen mã hóa cho protein VP1 Protein VP1 tham gia vào quá trình tái tạo virus Gumboro với chức năng enzyme xúc tác RNA-polymerase (Tacken và cs, 2002) [183] Phân ñoạn

A có ñộ dài khoảng 3200 nucleotide, mã hóa cho protein chung gồm VP2, 4, 3 và một protein khác khung ñọc là VP5, trong ñó VP2 là một protein kháng nguyên của virus Gumboro VP2 có ñộ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai ñầu 5’ và 3’, nhưng lại có một vùng khoảng 500 nucleotide ở giữa của gen rất thay ñổi ở các

chủng khác nhau, gọi là vùng “siêu biến ñổi” (hypervariable region) (Yuwen và cs, 2008) [211] Thực chất tất cả quần thể virus Gumboro ñều thuộc họ Birnaviridae,

acid khơng đồng nhất Vùng này bao gồm 120 - 150 amino acid mà ở đĩ cĩ một số

amino acid quan trọng, chúng là các amino acid khung cấu tạo nên epitope kháng nguyên và độc lực Sự thay đổi của một, hai hay vài amino acid được gọi là epitope

trong vùng này cĩ tính chất quyết định đến sự kết hợp kháng thể do chúng hoặc do các chủng đồng kháng nguyên khác kích thích sinh ra Nếu khơng đồng nhất về thành

phần khung epitope, kháng nguyên vaccine sử dụng cĩ thể kích thích sinh kháng thể

với hàm lượng cao nhưng kháng thể này khơng thể hoặc khơng hồn tồn trung hịa được chủng virus gây bệnh khác vì khơng cĩ vị trí kết hợp kháng nguyên - kháng thể

tương ứng, do sai lệch về epitope của vaccine với chủng cường độc gây bệnh, và như

vậy mặc dù đàn gà được tiêm vaccine nhưng bệnh vẫn nổ ra (Letzel và cs, 2007) [113] ðứng trước tình hình này, việc nghiên cứu một loại vaccine đa chủng, mà đặc biệt là vaccine thế hệ mới để phịng bệnh Gumboro cho đàn gia cầm là hết sức cần thiết và trên thế giới hiện nay, nghiên cứu cơ bản và phát triển vaccine vẫn khơng ngừng được đẩy mạnh, nhằm tiến tới cĩ được những phương thức và loại hình vaccine tốt nhất phịng chống bệnh Gumboro (Müller và cs, 2003) [133]

Vaccine thế hệ mới hay cịn gọi là vaccine cơng nghệ gen là sản phẩm kết quả của quá trình thao tác và can thiệp của kỹ thuật gen đối với gen kháng nguyên của một hay nhiều loại vi sinh vật cần phịng chống, trong đĩ cĩ virus Gumboro đang ngày càng được quan tâm Nguồn nguyên liệu về gen và hệ gen của virus gây bệnh phải được phân lập, tách dịng, giải trình tự và phân tích đặc tính sinh học phân tử của chúng, đồng thời một khi nguồn gen đĩ đã được gài vào plasmid thì việc thu thập, lưu giữ làm nguyên liệu khung tạo nên thư viện gen để tiến hành các cơng đoạn tiếp theo là kết sức thuận lợi

ðể cĩ nguồn gen của một số chủng virus Gumboro cĩ tại Việt Nam, từ đĩ làm cơ sở dữ liệu cho nghiên cứu về gen và hệ gen của virus Gumboro, cũng như tạo nguồn nguyên liệu gen để cĩ thể sử dụng cho các chế phẩm thế hệ mới (chế phẩm chẩn đốn, vaccine thế hệ mới ), chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Giải mã phân đoạn A hệ gen các chủng virus Gumboro phân lập ở Việt Nam nhằm cung cấp nguồn gen cho nghiên cứu vaccine thế hệ mới”

Mục tiêu của ñề tài là: giải mã phân ñoạn A và gen VP2 của một số chủng Gumboro tại Việt Nam, lưu giữ gen kháng nguyên VP2 và phân ñoạn A trong plasmid, phân tích ñặc ñiểm sinh học phân tử của chúng nhằm có ñược dữ liệu và nguyên liệu cho nghiên cứu vaccine thê hệ mới.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

Gumboro có thể ñược coi là một bệnh cổ ñiển của ngành chăn nuôi gà công nghiệp Có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh, virus gây bệnh và vaccin phòng bệnh song bệnh vẫn bùng phát

Ở Việt Nam, virus Gumboro cũng rất ña dạng và phức tạp do chúng ta nhập khẩu con giống từ nhiều nước khác nhau trên thế giới, khi có bệnh xảy ra chúng ta không biết ñược virus Gumboro ñang mắc thuộc chủng nào và vì thế việc phòng bệnh chưa ñạt hiệu quả như mong muốn

Việc nghiên cứu trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen của virus ñã ñược thế giới công bố Tại Việt Nam, cho ñến thời ñiểm chúng tôi nghiên cứu công trình này, chưa có một nghiên cứu nào về vấn ñề giải mã toàn bộ phân ñoạn A và hệ gen của virus Gumboro phân lập nội ñịa

Bằng việc thu thập các chủng virus Gumboro ñương nhiễm ở Việt Nam, xem xét sự biến ñổi về thành phần gen, tính kháng nguyên và ñộc lực, nguồn gốc và mối quan hệ phả hệ của các chủng virus này, sẽ giúp chúng ta có hướng tạo ra các chế

phẩm ñể phòng bệnh này một cách hiệu quả

ðề tài ñược tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ðẠI CƯƠNG VỀ BỆNH GUMBORO

Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease - IBD) là bệnh truyền nhiễm lây lan cấp tính ở gà con (2-

6 tuần tuổi) Nguyên nhân gây ra bệnh Gumboro là một loại virus RNA có tên là virus gây viêm túi truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease Virus - IBDV) hay còn gọi là virus Gumboro Sự nhiễm IBDV có thể làm gia tăng trầm trọng mức ñộ nhiễm bệnh với những tác nhân gây bệnh khác và làm giảm khả năng ñáp ứng miễn dịch của gia cầm

Các tế bào lympho trong túi Fabricius là những tế bào ñích của virus Gumboro

Gà ở ñộ tuổi 3 - 6 tuần có tính nhạy cảm cao với virus, khi túi Fabricius phát triển lớn nhất Hậu quả của IBDV gây nhiễm ở gia cầm là làm teo nhỏ các mô lympho

và cuối cùng là phá hủy cấu trúc túi Fabricius làm cho cơ quan có thẩm quyền miễn dịch này mất hoàn toàn hoặc một phần chức năng ñáp ứng miễn dịch dẫn ñến suy giảm miễn dịch (immunosuppression) (Sharma và cs, 2000) [167]; (Müller và

cs, 2003) [133]

Virus ở các dạng ñộc lực cổ ñiển, nguyên nhân gây ra nhiều vụ dịch xảy ra trước ñây, thường gây ra tỷ lệ chết khoảng từ 1 - 50% số gà nhiễm trong ñàn (Müller và cs, 2003) [133] Ở những ñàn gà thịt thương phẩm bị nhiễm, tỉ lệ này

có thể lên ñến 50%, tuy nhiên ở các ñàn gà trong ñộ tuổi 3-6 tuần tỉ lệ chết ít khi vượt quá 3% Người ta thấy rằng, khi thay thế các ñàn gà mái tơ Leghorn (thay ñàn) ở trong ñộ tuổi nhạy cảm với bệnh có thể làm gia tăng tỉ lệ chết của số gà nhiễm bệnh trong ñàn lên ñến 20% (Müller và cs, 2003) [133] Trong các ñàn ñang ở thời kì ñẻ trứng, có sự giảm sút sản lượng trứng và cả chất lượng trứng Bên cạnh khả năng gây chết, IBDV còn gây suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm bệnh Ở các ñàn gà thịt thương phẩm, sự suy giảm khả năng miễn dịch ñược biểu hiện rõ rệt bởi tỉ lệ xâm nhiễm cao của các virus ñường hô hấp và làm gia tăng tỉ lệ

chết do sự nhiễm trùng máu của vi khuẩn E coli (trực khuẩn ruột già) trong suốt

một phần ba cuối của chu kỳ phát triển 6-8 tuần Vaccine sống nhược ñộc có thể không phát huy tác dụng ở cả các ñàn gà thịt và ñàn gà mái tơ sau tiêm chủng nhằm chống lại với các bệnh ñường hô hấp như là bệnh viêm phế quản và bệnh Newcastle

Từ năm 1986 ñến nay, các chủng IBDV ñộc lực cao ñã gây ra nhiều vụ dịch lớn ở Châu Âu, bao gồm nhiều chủng có thể gây chết tới 70% số gà nhiễm bệnh trong các ñàn gà mái ñẻ (Van Den Berg, 1991; 2000) [192, 193]; (Zorman-Rojs và cs, 2003) [217] Các chủng virus này có sự tương ñồng kháng nguyên với chủng virus “cổ ñiển” gây bệnh dịch Gumboro trong nhiều thập kỷ và có thể gây ra các tổn thương bệnh tích ñặc trưng (Eterradossi và cs, 1992) [60] ðặc biệt, các chủng IBDV có ñộc lực cao (very virulent IBDV = vvIBDV) có khả năng “lẩn tránh” ñược ñáp ứng miễn dịch dịch thể sinh ra sau kích thích bằng chủng virus cổ ñiển (không bị trung hòa bởi các kháng thể này), khi xâm nhiễm và gây bệnh ở gà mẫn cảm

ðược phát hiện lần ñầu tiên cách ñây hơn 50 năm, cho ñến nay bệnh Gumboro vẫn ñang là mối ñe dọa nguy hiểm với ngành chăn nuôi gà công nghiệp ở khía cạnh suy giảm miễn dịch do virus gây ra Sự thay ñổi tính kháng nguyên cũng như

sự xuất hiện các chủng virus có tính gây bệnh cao trong nhiều ñàn gia cầm ñược tiêm vaccine (Dolz và cs, 2005) [58]; (Yuwen và cs, 2008) [211], ñã kích thích nỗ lực quan tâm nghiên cứu các chủng Gumboro mới xuất hiện cả về bệnh và nguyên nhân gây bệnh

1.1.1 Lịch sử và ñịa dư bệnh

IBDV là loại virus thuộc họ Birnaviridae, nhóm Birnavirus, ñược phát hiện

ñầu tiên vào năm 1957 tại vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex thuộc bang Delaware của

Mỹ (Hình 1.1), nhưng mãi ñến năm 1962 mới ñược Cosgrove miêu tả cặn kẽ (Cosgrove, 1962) [50] Năm 1970, Hitchner ñề nghị chính thức coi bệnh do Cosgrove phát hiện là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (IBD) hay còn gọi là bệnh Gumboro ñể ghi nhớ ñịa danh phát hiện bệnh ñầu tiên (Hitchner, 1970) [73]

Hình 1.1: Vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ,

nơi ñầu tiên phát hiện bệnh Gumboro

Từ khi ñược phát hiện ñến nay, bệnh ñã lan truyền nhanh chóng và rộng rãi trên nhiều nước có nền chăn nuôi gà công nghiệp phát triển Ở Việt Nam bệnh ñược phát hiện năm 1984 (Bitay và cs, 1984) [3]

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh

1.1.2.1 Hình thái, cấu trúc và phân loại virus gây bệnh Gumboro

IBDV là một virus hoàn toàn mới, thành viên của nhóm Avibirnavirus thuộc

họ Birnaviridae (Brown, 1986) [41], là một virus có kích thước không lớn, khoảng 58

- 60 nm, dạng hình khối ña diện cấu trúc ñối xứng 20 mặt (Dobos và cs, 1979) [55], (Hình 1.2)

Hình 1.2: Cấu trúc của hạt IBDV dưới kính hiển vi ñiện tử

(Nguồn: vir.sgmjournals.org/ /vol86/issue8/cover.shtml)

Trong nguyên sinh chất của tế bào bị nhiễm, dưới kính hiển vi ñiện tử, có thể quan sát thấy tập hợp virus Gumboro, xếp ñều ñặn cạnh nhau (Hình 1.3) Mỗi một nguyên sinh chất có thể chứa một vài tập hợp virus nói trên

Hình 1.3: Virus Gumboro thường tập hợp thành từng cụm nằm trong tế bào lympho

B bị nhiễm (Nguồn: 210.36.18.48/gxujingpin/dwwswx/ev/16.htm)

IBDV không có vỏ bọc ngoài cùng (envelop), mà chỉ là virus dạng trần, hay còn gọi là nucleocapsid, bao gồm nhân chứa ribonucleic acid (RNA) và bao quanh hệ gen là lớp vỏ protein hay còn gọi là capsid Vỏ capsid của virus bao gồm 32 ñơn vị hình thái, mà mỗi một ñơn vị hình thái còn ñược gọi là capsomer ñan chéo nhau tạo thành (Hirai và cs, 1979) [72] Mỗi capsomer ñược tạo thành bởi 4 loại protein khác nhau (Dobos, 1979) [54] Các nucleotide trong ribonucleic acid (RNA) của virus Gumboro ñược xếp thành ñôi cuộn tròn và phân làm hai ñoạn riêng biệt (Becht và cs, 1988) [35]; (Müller và cs, 1979) [128]; (Müller và Lange, 1985) [130], ñây là một ñặc ñiểm hết sức ñặc trưng của loại virus này do vậy, theo sự phân loại mới nhất hiện nay, IBDV ñược xếp vào nhóm virus có chứa RNA và là thành viên ñại diện ñầu tiên

của nhóm Avibirnavirus (Leong và cs, 2000) [112]

1.1.2.2 Phân type huyết thanh học

Cho ñến nay người ta coi tất cả các loại IBDV thuộc 2 serotype: I và II Hai serotype của IBDV có thể ñược phân biệt bằng phản ứng trung hòa virus (McFerran

và cs, 1980) [123]

Serotype I bao gồm các chủng virus cường ñộc Gumboro gây bệnh cho gà,

mà tùy thuộc vào mức ñộ ñộc lực, người ta phân ra làm 4 nhóm chính: nhóm cường ñộc cao (very virulent group), nhóm cổ ñiển (classical group), nhóm biến ñổi (variant group) và nhóm nhược ñộc (attenuated group) (Wu và cs, 2007) [202] Giữa các chủng trong cùng serotype I có thể có mức ñộ cộng ñồng kháng nguyên không ñều nhau, nhiều trường hợp chủng này chỉ cho 30% miễn dịch chéo với chủng khác

Serotype II bao gồm tất cả các chủng IBDV gây nhiễm và ñược phân lập ở

gà tây Chúng không gây bệnh ở gà nhưng có thể gây nhiễm, cũng tương tự các chủng ở type I không gây bệnh cho gà tây nhưng có thể tồn tại ở gà tây ñể lan truyền trở lại bệnh cho gà

1.1.2.3 Tính gây bệnh của IBDV

Trong tự nhiên: gà nhà và gà tây là hai loại mẫn cảm với virus Gumboro,

trong ñó type I gây bệnh cho gà nhà và type II gây bệnh cho gà tây Người ta cũng ñã phát hiện thấy IBDV ở gà Nhật và chim bồ câu sống hoang dã ở Châu Phi (Kasanga và

cs, 2007; 2008) [90, 91] Một số loài chim hoang dã như vịt trời, ngỗng trời, chim ác là, cũng có thể bị nhiễm virus Gumboro, bị bệnh và chết Virus Gumboro phân lập từ những loài chim hoang dã này có thể gây bệnh trở lại cho gà mẫn cảm, gây chết tới 60% và làm teo túi Fabricius (Jeon và cs, 2008) [87]

Trong phòng thí nghiệm: khác với một số virus gây bệnh ở ñộng vật khác

là có thể gây bệnh dễ dàng trên chính ñộng vật mẫn cảm hoặc trên một số ñộng vật cảm thụ phòng thí nghiệm như chuột lang, chuột bạch, thỏ và một số ñộng vật khác Với virus Gumboro, ngoài gia cầm mẫn cảm (gà 2 - 6 tuần tuổi), virus chỉ có khả năng gây bệnh trên phôi gà hoặc môi trường tế bào xơ phôi gà mà không có khả

năng gây bệnh trên các ñộng vật cảm thụ phòng thí nghiệm

1.1.3 Cơ chế sinh bệnh

Khác với nhiều loại virus gây bệnh ở gia cầm mà cơ quan thích ứng cho sự nhân lên và gây bệnh thuộc về các cơ quan nội tạng hay da, niêm mạc, virus gây bệnh Gumboro lại chọn túi Fabricius - cơ quan có thẩm quyền miễn dịch chủ yếu ở gia cầm làm cơ quan thích ứng cho sự nhân lên và gây bệnh của mình, cụ thể là các tế

bào lympho B mang thụ thể kháng thể IgG bề mặt và ñại thực bào (Nakai và Hirai, 1981) [142]; (Terasaki và cs, 2008) [187]

Qua con ñường tiêu hóa, do thức ăn, nước uống virus xâm nhập vào hệ tiêu hóa Tại ñây, chúng ñược các tế bào ñại thực bào tiếp nhận, ñồng thời tiếp xúc với tế bào lympho B còn non là loại mẫn cảm với virus, bắt ñầu thực hiện quá trình nhân lên, quá

trình này là sự nhân lên cục bộ, hay sự nhân lên sơ cấp Chỉ sau 6-8 giờ, một số lượng

virus Gumboro ñáng kể ñược giải phóng và xâm nhập vào hệ tuần hoàn ðây là lần thứ nhất virus xuất hiện trong máu, nhưng người ta không gọi là sự nhiễm trùng máu vì số lượng virus không nhiều Hệ tuần hoàn chỉ làm nhiệm vụ vận chuyển virus ñi khắp cơ thể mà trước hết là ñến lách, túi Fabricius và một số cơ quan khác Thông thường 9-11 giờ sau khi vào hệ tiêu hóa, một số lượng lớn virus Gumboro ñã có mặt trong túi Fabricius và bắt ñầu tấn công các loại hình tế bào lympho B, ñây là quá trình nhân lên

toàn phần hay sự nhân lên thứ cấp Số lượng lớn virus Gumboro ñược giải phóng ñã

xâm nhập vào hệ tuần hoàn lần thứ hai, lúc này người ta coi sự có mặt của virus Gumboro trong máu là sự nhiễm trùng máu (viremia)

Theo Skeeles và cs (1980) [173], virus Gumboro tác ñộng gây nên hiện tượng bệnh lý ñông máu, do vậy trong hệ tuần hoàn xuất hiện các cục huyết khối, làm nghẽn mạch mao quản, chủ yếu là vùng niêm mạc túi Fabricius và ở một số nơi khác, dẫn ñến hiện tượng xung huyết Khi không chịu nổi áp suất gia tăng của máu, mao mạch bị ñứt gây nên hiện tượng xuất huyết Sự xuất huyết thường gặp ở các vùng cơ ñùi, cơ lườn thành tia, thành mảng, thành vệt dài và có màu tím, màu hồng, ñồng thời ở túi Fabricius, lách, gan cũng có thể xảy ra trường hợp tương tự

Cứ như vậy, sự xung huyết, xuất huyết từ quy mô nhỏ (từng ñiểm li ti) ñến quy mô lớn (vệt, mảng) và có màu sắc ña dạng từ hồng ñến tím hoặc nâu ñen Một số biến ñổi bệnh lý trong một số cơ quan có thể dần dần mất ñi và dần

phục hồi chức năng vốn có, nhưng ñối với túi Fabricius sự phục hồi không xảy ra

Do virus Gumboro phá hủy túi một cách trầm trọng, virus nhân lên trong tế bào

lympho B, phá hủy chúng làm giảm ñáng kể số lượng tế bào này Số lượng tế bào lympho

mất ñi không ñược bù ñắp nên chức năng miễn dịch của túi bị mất một phần hoặc hoàn

toàn dẫn ñến sự suy giảm miễn dịch (immunosuppression) Mức ñộ suy giảm miễn dịch phụ thuộc vào ñộc lực của virus, thời gian và ñiểm xâm nhập vào cơ thể gà (Hirai và cs, 1979) [72]; (Sharma và cs, 2000) [167]

1.1.4 Triệu chứng lâm sàng

ðối với ñàn gà mẫn cảm, thời gian nung bệnh xảy ra ngắn, khoảng 2-3 ngày: gà ngoẹo ñầu, rúc mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, thích nằm, mắt lim dim mỏi mệt và thường dồn về một góc chuồng, gà kém ăn hoặc bỏ ăn, uống nhiều nước, mất ñịnh hướng,

ỉa phân trắng, loãng hoặc toàn nước có khi lẫn máu, lúc ñầu nhiệt ñộ tăng, sau giảm và nếu không qua khỏi thì gà chết trong vòng vài ngày

Do ñặc tính truyền ngang rất mạnh, virus Gumboro gây nên tỷ lệ nhiễm trong ñàn có khi ñạt 100% Thông thường từ ngày thứ 3 sau triệu chứng lâm sàng ñầu tiên, trong ñàn bắt ñầu có cá thể chết và chết ồ ạt trong vòng 5-7 ngày, sau ñó giảm chết rất nhanh, thường 10-12 ngày có thể dứt bệnh, gà dần hồi phục, tuy nhiên các cá thể bị bệnh qua khỏi thông thường bị tổn thương khá nặng, ñặc biệt là hệ miễn dịch dẫn ñến suy giảm miễn dịch

1.1.5 Bệnh tích

1.1.5.1 Bệnh tích ñại thể

bệnh với bệnh tích ñại thể ñiển hình: túi Fabricius thường sưng rất to, có kích thước và trọng lượng gấp 2-3 lần bình thường Xung quanh túi có thủy thũng keo nhầy vàng, có khi

có bọc dịch thẩm xuất bọc quanh túi Fabricius Nếu chích hết nước, túi lộ rõ ra, căng tròn, sưng phù Túi chuyển màu sắc từ vàng sáng sang màu trắng ñục Túi dễ cấu, dễ bục, các nếp gấp múi khế sưng không rõ nét Niêm mạc sưng dầy lên làm cho dung tích khoang túi

trở nên hẹp lại ðây là giai ñoạn viêm sưng (Hình 1.4A)

Có nhiều cá thể bị bệnh Gumboro, hiện tượng viêm sưng ñi kèm với hiện tượng xuất huyết và thẩm xuất dịch vào trong lòng túi Fabricius, niêm mạc túi có ñiểm xuất huyết, ñôi khi thành vệt, niêm mạc túi chuyển từ màu trắng sang màu thâm tím, nâu ñen (Hình 1.4B)

Theo Cheville (1967) [49], túi Fabricius bắt ñầu tăng về kích thước và trọng lượng trong khoảng 48-72 giờ sau khi nhiễm do thủy thũng và xuất huyết Kích thước túi có thể tăng gấp 2-3 lần so với bình thường Vào ngày thứ 4 sau nhiễm, kích thước túi vẫn còn to gấp ñôi, sau ñó mới nhỏ dần lại Ngày thứ 5 sau nhiễm trọng lượng túi bằng trọng lượng ban ñầu và sau ñó bắt ñầu teo ñi ðến ngày thứ 8 trọng lượng túi chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban ñầu

Hình 1.4: Bệnh tích túi Fabricius và hệ cơ

A: Hình ảnh túi Fabricius sưng to, xung quanh có thủy thũng keo nhầy (Nguồn: www.vemedim.vn/benhvadieutri), B: Hình ảnh xuất huyết bên trong túi (Nguồn: www.medvet.umontreal.ca/ /OrigiInfect/), C: Hình ảnh cơ ñùi, cơ lườn bị xuất huyết ñiểm hoặc thành từng vệt, từng mảng có màu ñỏ hay màu nâu thẫm (Nguồn: http://www.anova.com.vn/contents/article)

ngực của gà ñã khô nhăn lại, có mầu thẫm, ñặc biệt có xuất huyết những ñám lấm chấm hoặc thành từng vệt, có khi các vệt xuất huyết hợp lại tạo thành mảng lớn (Hình 1.4C) Ngoài ra, lách có thể bị sưng nhẹ Gan sưng, bề mặt có những vệt loang lổ mầu vàng, có thể có hoại tử rìa gan, ñôi khi ñiểm hoại tử hợp thành từng vệt nhỏ, mầu vàng sáng ăn sâu vào nội mô của gan Thận có thể bị sưng, trên bề mặt có những ñiểm xuất huyết, hoại tử Tuyến ức bị xuất huyết ñiểm, vệt hoặc từng mảng,

có khi xuất huyết ăn sâu vào các thùy của tuyến

1.1.5.2 Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể xuất hiện sớm ở các cơ quan có cấu trúc từ tổ chức lympho

và các cơ quan tạo miễn dịch như túi Fabricius, tuyến ức (thymus), lách, hạch, các

mô lympho ở ruột, chỉ trong vòng vài giờ ñến vài chục giờ sau khi virus cường ñộc Gumboro xâm nhập vào cơ thể

Theo Müller và Lange (1985) [130], có sự tập trung của ñại thực bào và các

tế bào lympho trong vòng 4-5 giờ sau khi gây nhiễm qua ñường tiêu hóa và sau 11 giờ xuất hiện những tế bào lympho bị nhiễm virus, nếu gây nhiễm trực tiếp vào túi Fabricius chỉ sau 6 giờ ñã xuất hiện những tế bào lympho bị nhiễm virus

Theo Helmboldt và Garner (1964) [70], 24 giờ sau khi nhiễm các tế bào lympho trong túi Fabricius ñã bị thoái hóa, các tế bào lympho ở vùng tủy của nang ñã bắt ñầu quá trình hoại tử Virus tấn công và phá hủy các tế bào lympho B non và lympho B trưởng thành, nên chỉ trong thời gian rất ngắn lượng tế bào lympho B ñã giảm ñáng kể (Kim và cs, 2000) [99] Trung tâm bị hoại tử ngày càng tăng, các vách nang giảm dần, nang bị thu hẹp lại, có các hình tròn, chữ nhật, ô van khác nhau Các trung tâm hoại tử xuất hiện không bào (vacuole), không còn tế bào lympho hoặc chỉ còn rất ít tập trung ở vùng ngoại vi nang Thay vào các vị trí của các tế bào lympho là các tế bào heterophil, các mảnh tế bào bị phân hủy một phần, các tế bào hệ lưới nội

mô Toàn bộ các nang lympho bị hủy hoại và có thể quan sát thấy các mức ñộ khác nhau (Kulkarui và cs, 1982) [105] (Hình 1.5)

Hình 1.5: Ảnh vi thể của các tế bào ñại thực bào trong túi Fabricius bị virus Gumboro tấn công

Ghi chú: A: sự hủy hoại của tế bào ñại thực bào; B: tập hợp virus ñang nhân lên trong tế bào ñại thực bào (Nguồn: ss.niah.affrc.go.jp/disease/EM/em_en/virus0.html)

Vào ngày thứ 3 hoặc 4, sự thủy thũng, xung huyết và tập trung của các tế bào của túi làm cho túi Fabricius sưng to Sự khám phá vai trò của các tế bào T trong miễn dịch bệnh lý ñược gây ra bởi IBDV và sự phục hồi của những mô bị nhiễm ñã cho thấy có sự xâm nhiễm của cả tế bào lympho T (CD4+) và tế bào

lympho T (CD8+) làm cho số lượng lympho T tăng tối đa vào ngày thứ 7 sau khi nhiễm (Kim và cs, 2000) [99] Các tế bào T ở trong túi Fabricius ngăn cản sự nhân lên của virus trong túi trong giai đoạn đầu của bệnh, nhưng cũng thúc đẩy quá trình phá hủy mơ túi và làm chậm quá trình hồi phục của mơ thơng qua việc giải phĩng ra các cytokine gây độc tế bào (Rautenschlein và cs, 2002) [154] Khi phản ứng viêm mất dần, túi Fabricius teo đi, các nang rỗng phát triển ở vùng tủy nang túi Cĩ sự hoại tử và thực bào của các tế bào heterophil và tương bào (plasmocyte), cĩ sự xơ hĩa của các tế bào phân cách các nang Sự tăng sinh tế bào nền biểu mơ cĩ những đám dịch nhầy mucin trên bề mặt

1.1.6 Chẩn đốn bệnh

Cĩ nhiều phương pháp để chẩn đốn bệnh Gumboro đĩ là chẩn đốn bằng phương

pháp phân lập virus, chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh học và hiện nay,

chẩn đốn bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng phản ứng RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) và Real time PCR (Moody và cs, 2000) [126] RT-PCR là phương pháp hiện đại và chính xác, xác định sự cĩ mặt của một đoạn gen trong hệ gen virus Gumboro cĩ trong bệnh phẩm; real-time PCR xác định hàm lượng RNA thơng tin của virus Gumboro vừa định tính vừa định lượng (Moody và cs, 2000) [126] Phương pháp chẩn đốn nhanh bằng miễn dịch học sắc

ký (immunochromatographic test, ICT) cũng đã được phát triển và ứng dụng hiện nay (Zhang và cs, 2009) [212]

1.1.7 Phịng bệnh Gumboro

Do đặc điểm cấu tạo đặc biệt, IBDV cĩ sức đề kháng rất cao trong tự nhiên, khả năng tồn tại và lan truyền bệnh rất lớn, tính chất dịch tễ bệnh rất phức tạp Các biện pháp vệ sinh thú y, chăm sĩc nuơi dưỡng, kiểm dịch là các biện pháp đĩng gĩp tích cực trong phịng dịch, song chưa hồn tồn ngăn được bệnh xảy ra Biện pháp

cơ bản để khống chế bệnh là tạo miễn dịch cho gà Do bệnh thường xảy ra ở gà con nên việc tạo miễn dịch cho gà con là vơ cùng quan trọng

Cĩ nhiều loại vaccine như vaccine nhược độc cho gà con, vaccine vơ hoạt nhũ dầu cho gà mẹ Một loại vaccine “phức hợp miễn dịch - immune complex” đã được

phát triển, trong ñó các virus vaccine ñược pha trộn với một số lượng các kháng thể tối ưu (Whitfill và cs, 1995) [201] và ñược sử dụng ñể tiêm chủng trong phôi trứng

gà (noãn) Tuy nhiên, cơ chế hoạt ñộng chính xác của vaccine “phức hợp miễn dịch” vẫn chưa ñược làm sáng tỏ, người ta cho rằng “phức hợp miễn dịch” làm gia tăng các tế bào tua và ñại thực bào trong nang túi Fabricius, nơi virus tồn tại cho ñến khi giảm lượng kháng thể nhận ñược từ mẹ (Jeurissen và cs, 1998) [88]

Một số loại vaccine vector tái tổ hợp thế hệ mới sử dụng các virus dẫn truyền gen kháng nguyên VP2 hoặc toàn bộ phân ñoạn A của virus Gumboro ñã ñược thử nghiệm ñó là các loại vaccine có vector dẫn truyền chứa gen kháng nguyên virus Gumboro, cụ thể là vector virus ñậu gà (Shaw và Davison 2000) [169], vector virus herpes của gà tây (Tarpey và cs, 2007) [186], vector adenovirus ở gà (Francois và cs, 2001) [66]; (Perozo và cs, 2008) [149], vector virus gây bệnh Marek (Tsukamoto và

cs, 2002) [191] và vector virus Forest Semliki (Phenix và cs, 2001) [151], hay sử dụng bacteriophage T4 (Cao và cs, 2005) [45].Protein VP2 ñược biểu hiện trong hệ thống baculovirus riêng biệt (Dybing và Jackwood, 1998)[59]; (Yehuda và cs, 2000) [209] hoặc cùng với cytokine IL-6 (Liu và cs, 2005) [115]; các tiểu phần cấu tạo (giống hạt virus) tương tự virus ñược biểu hiện trong tế bào côn trùng (VLP = virus-like particle) của IBDV (Hu và cs, 1999) [75]; (Kibenge và cs, 1999) [98], tất cả các loại hình này cũng ñược coi là các vaccine mới cung cấp kháng nguyên miễn dịch trong ñịnh hướng phát triển vaccine phòng chống Gumboro

Một loại hình vaccine thế hệ mới khác là vaccine DNA cũng ñược sử dụng cho việc phòng chống ñối với IBDV, ñó là plasmid ñược thiết kế chứa gen kháng nguyên của virus Gumboro (Kim và cs, 2004) [101]; (Mahmood và cs, 2007) [121]; (Sun và

cs, 2005) [180], công nghệ ứng dụng vaccine dạng này ở Việt Nam cũng ñã ñược tiến hành nghiên cứu (Lê Thanh Hòa, 2006a) [18], cũng như vaccine tái tổ hợp gen kháng nguyên VP2 ñã ñược sản xuất và sử dụng trên quy mô lớn (Pitcovski và cs, 2003) [152]; (Rong và cs, 2005; 2007) [159, 160] Một phương thức mới dựa trên công nghệ cao ñã ñược thử nghiệm ñó là liệu pháp phá bỏ gen RNA thông tin VP2 của virus Gumboro thông qua cơ chế can thiệp RNA (RNA interference, RNAi) nhờ

vector dẫn truyền adeno-associated virus (Sun và cs, 2009) [181]; (Wang và cs, 2009) [199]

1.2 SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO

Các virus thuộc họ Birnaviridae có hệ gen chứa RNA 2 sợi (dsRNA = double

stranded RNA), ñược phân làm hai ñoạn A và B, nằm trong vỏ capsid 20 mặt, cấu tạo ñơn giản không có màng bao ngoài, ñường kính khoảng 60 nm, bao gồm virus gây viêm

túi Fabricius truyền nhiễm hay virus Gumboro gây bệnh ở gà trong nhóm Avibirnavirus,

virus gây hoại tử tuyến tụy của cá (Infectious pancreatic necrosis virus = IPNV), Tellina

virus (TV), Oyster virus (OV), Crab virus của loài nhuyễn thể trong nhóm Aquabirnavirus

và virus X ruồi dấm (Drosophila X virus = DXV) trong nhóm Entomobirnavirus (Murphy

và cs, 1995) [140] (Hình 1.6)

Hình 1.6: Các hạt virus nhìn dưới kính hiển vi ñiện tử

A: Virus gây hoại tử tuyến tuỵ của cá (IPNV) (Nguồn: medicine/) B: Virus X ruồi dấm (DXV) (Nguồn: www.umbi.umd.edu/~wul/) C: Virus Gumboro (IBDV) (Nguồn: 210.36.18.48/gxujingpin/dwwswx/ev/16.htm)

www.veths.no/ /Research/Aquatic-ðối tượng cảm nhiễm của IPNV là cá hồi thuộc loại salmon, một loại cá lưỡng cư nước mặn và ngọt, mặc dù virus IPNV cũng ñược phân lập từ cá sống hoàn toàn ở nước ngọt hoặc hoàn toàn ở nước mặn Virus có khả năng truyền ngang và truyền dọc, không

có bằng chứng ñược truyền qua vector sinh học Phân bố của virus khắp thế giới, gây bệnh nặng thành dịch ở các ñàn cá giống và cá con mới nở vài ngày tuổi Bệnh tích ñặc trưng là hoại tử ở tuyến tuỵ, và cũng có bệnh tích tuy chưa có hoại tử ở thận, gan, tinh hoàn, buồng trứng, ruột, não v.v Cá bị nhiễm nếu không phát triển thành bệnh, không biểu hiện lâm sàng và bệnh tích, và trở thành vật mang trùng nguy hiểm

đối tượng trong tự nhiên có cảm nhiễm của virus DXV là ruồi dấm, Drosophila

melanogaster Virus lây truyền theo phương thức truyền ngang, và không có vector trung gian Phân bố ựịa lý của DXV chưa ựược xác ựịnh Ruồi dấm bị nhiễm bệnh thường có ựộ mẫn cảm cao với khắ carbonic (CO2) đắch tấn công và bệnh lý tổ chức học còn chưa rõ

đối tượng cảm nhiễm tự nhiên của virus Gumboro (IBDV) là gà và gà tây Rất hạn hữu, IBDV phân lập ựược từ vịt, và các loại chim nuôi, gia cầm cảnh khác Truyền ngang vẫn là phương thức chắnh, không có sự trung gian của vector Phân

bố IBDV rộng khắp thế giới, ựắch tấn công là túi Fabricius, tế bào Lympho-B, gây suy giảm miễn dịch Gà cảm nhiễm ở lứa tuổi 3-6 tuần, chết do viêm túi Fabricius,

do hậu quả phức hợp miễn dịch bệnh lý, do nghẽn mạch máu và các rối loạn tuần hoàn và cơ quan có bệnh tắch

1.2.1 Hệ gen của virus Gumboro

đặc ựiểm hệ gen của virus là phân tử RNA sợi ựôi (dsRNA=double stranded RNA) chứa hai phân ựoạn có tên gọi là phân ựoạn A và phân ựoạn B (Mủller và cs, 1979) [128] (Hình 1.7)

Hiện nay người ta ựã xác ựịnh hoàn chỉnh trình tự nucleotide của 2 phân ựoạn gen A (có ựộ dài khoảng 3.200 bp) và B (có ựộ dài khoảng 2.800 bp) (Kim và Yeo, 2003) [100]; (Kong và cs, 2004) [102]; (Mundt và Mủller, 1995a) [139]; (Petkov và

cs, 2007) [150], và ựã có nhiều trình tự dữ liệu nucleotide của nhiều chủng IBDV ựã ựược xác ựịnh và lưu trữ trong Ngân hàng gen

Hình 1.7: Hệ gen của virus Gumboro bao gồm 2 phân ñoạn A và B

nhìn dưới kính hiện vi ñiện tử (Nguồn: Lê Thanh Hòa, 2003c [16])

Trình tự nucleotide của phân ñoạn A của một số chủng virus thuộc serotype I (Brown và Skinner, 1996) [43]; (Hosseini và cs, 2004) [74]; (Hudson và cs, 1986)[76] và serotype II (Kibenge và cs, 1991) [94] cũng như phân ñoạn B của các chủng thuộc serotype I (Morgan và cs, 1998) [127], và các chủng thuộc serotype II (Kibenge và cs, 1996) [95] ñã ñược giải mã và công bố Vùng trình tự mã hóa của phân ñoạn B có sự tồn tại mức ñộ tương ñồng tương ñối cao về nucleotide (89%) và amino acid (93-98%) (Brown và Skinner, 1996) [43], ở cả các chủng gây bệnh thuộc serotype I và không gây bệnh thuộc serotype II Trình tự các motif của RNA polymerase phụ thuộc RNA virus (RdRp) ñược bảo tồn trong cả hai serotype của IBDV (Hình 1.8) Trong phân ñoạn A, sự tương ñồng thấp hơn về nucleotide và amino acid tương ứng là 83%-84% và 90% ñáng chú ý ở các vùng mã hóa giữa các chủng thuộc serotype I và II (Kibenge và cs, 1991) [94] ðiều này chủ yếu xảy ra tại

vùng “siêu biến ñổi” liên quan tới các epitope ñặc hiệu của từng serotype virus trong

protein cấu trúc VP2 (Kibenge và cs, 1991; 1999) [94, 98]

Toàn bộ các trình tự không mã hóa ñầu 5' và 3' của phân ñoạn A và B ở các chủng thuộc serotype I và các chủng thuộc serotype II của IBDV ñã ñược giải mã

và công bố (Kibenge và cs, 1996) [95]; (Mundt và Müller, 1995a) [139] Trình tự ñầu tận cùng 5' trong cả hai phân ñoạn gen VP4 VP3 13'NC ñều tồn tại một trình tự

bảo tồn gồm 32-nucleotide là GGA U(A/G)C GAU (C/G)GG UCU GAA CC(c/u) C(G/U)G G(GI-)A GUC AC (Hình.1.8)

ngay sát h2 Gắn thêm 1 aa giữa h1, h2 Xoá ñi 1 aa

RdRp Trình tự bảo tồn RNA phụ thuộc RNA polymerase

IBDV serotype I

Phân ñoạn B hệ gen

STI

STII

STI STII

STI

STII

Hình 1.8: Sơ ñồ hệ gen và một số vùng quan trọng của IBDV serotype I và II

Các trình tự ñầu tận cùng 3’của cả hai phân ñoạn của các chủng IBDV ñược kết thúc với một trình tự gồm 5 nucleotide bảo tồn -GCGGU- (Kibenge và cs, 1996) [95] Như vậy, ñầu tận cùng của các phân ñoạn này ở hệ gen IBDV giống với các phân ñoạn khác của các virus RNA khác như Reovirus (Antczak và cs, 1982) [30]

và Influenza virus (Stockle và cs, 1987) [178] nơi có ñầu 5’ và 3’ tương ứng nằm giữa các phân ñoạn của hệ gen Tại ñầu tận cùng 5' và 3' trong cả hai phân ñoạn hệ

gen của IBDV, có các cấu trúc tận cùng thẳng và lặp ñược cho là chứa ñựng các tín hiệu quan trọng cho sự nhân lên, sao chép và bao gói virus

Ngay sát các cấu trúc lặp ở ñầu tận cùng 3' trên phân ñoạn A và 5’ trên phân ñoạn B có khả năng tạo thành các cấu trúc bậc hai hình vòm (loop) và mầm (stem) (Kibenge và cs, 1996) [95] Các cấu trúc vòm và mầm là những cấu trúc có liên quan trong quá trình sao chép RNA, dịch mã và khép vỏ của các virus chứa RNA khác như virus bại liệt (Simoes và Sarnow, 1993) [172] Trong phân ñoạn A của IBDV, có sự khác nhau giữa các chủng thuộc serotype I và II trong các cấu trúc bậc hai ñược tạo ra bởi vùng 5' không mã hóa phía trước gen VP5; những cấu trúc này

có thể liên quan trong quá trình nhân lên của virus, trong nhận diện tế bào chủ ñặc hiệu và có lẽ cả tính gây bệnh (Mundt và Müller, 1995a) [139]

Hai phân ñoạn A và B của IBDV cũng chứa ñựng những sự thay ñổi nuleotide ñặc hiệu với từng serotype trong các vùng không mã hóa Khi so sánh các chủng IBDV thuộc serotype II với các chủng thuộc serotype I, ñã có sự thay ñổivề nucleotide trong vùng 5' không mã hóa mà ñặc trưng cho serotype trên phân ñoạn A, và trên phân ñoạn

B (Kibenge và cs, 1996) [95] Không có sự thay ñổi ñặc trưng cho serotype ñược tìm thấy trong trình tự ñầu tận cùng 3' của phân ñoạn A, rất ít thay ñổi nuleotide ñược xác ñịnh trong trình tự ñầu tận cùng 3' của phân ñoạn B (Kibenge và cs, 1996) [95]

1.2.2 Protein của virus - cấu trúc và chức năng

Hai phân ñoạn RNA của IBDV ñều mang thông tin di truyền và có nhiệm vụ sinh tổng hợp 5 loại protein có tên gọi là VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Hình 1.9)

Phân ñoạn A (segment A) của hệ gen virus Gumboro có bao gồm hai khung

ñọc mở (ORF = Open Reading Frame)

(polyprotein) có phân tử lượng là 108 kDa, mà trong quá trình tiếp theo sẽ ñược phân cắt thành các polypeptide riêng biệt, là những protein cấu trúc, có tên gọi là VP2, VP4, VP3 (Azad và cs, 1987)[31]; (Becht và cs, 1988) [35], (Hudson và cs, 1986)[76]; (Kibenge và cs, 1997) [97]

Hình 1.9: Các phân ñoạn A và B của hệ gen virus Gumboro

qua ñiện di DNA (trái); và các thành phần protein qua ñiện di protein (phải)

Ghi chú: A: Virus Gumboro chỉ có 2 phân ñoạn RNA là phân ñoạn A và phân ñoạn B, trong khi một loại virus chứa RNA khác, virus Reo (Reo3) chứa tới 9 phân ñoạn B: Một số thành phần protein của virus Gumboro, trong ñó có VP1, VP2a và VP2b, VP3, VP4 Cột bên cạnh là chỉ thị di truyền protein (marker)

(Nguồn: www.weblo.com/domain/available/kda1969.com/

VP2 là ñoạn RNA ñầu tiên trong chuỗi gen hợp nhất VP2-4-3 mã hóa cho protein chung của phân ñoạn A Toàn bộ chuỗi nucleotide mã hóa cho protein chung VP2-4-3 của phân ñoạn A có ñộ dài 3039 bp, bao gồm cả bộ mã khởi ñầu ATG (của VP2) và bộ mã kết thúc TGA (của VP3), sau khi tổng hợp, polypeptide sắp xếp theo trật tự: NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH (Ye và cs, 2007) [208] Từ ñó, nhờ hoạt ñộng của VP4 là enzyme protease, polypeptide chung này tự phân cắt thành VP2 nguyên thủy (pVP2, còn gọi là VPX) có trọng lượng phân tử là 48 kDa, VP3 (28 kDa) và VP4 (32 kDa) (Lejal và cs, 2000) [111] Cuối cùng, polypeptide VP2 (VPX) ñược tém gọn lại tại ñầu C (carboxyl, -COOH), ñể tạo nên VP2 trưởng thành có trọng lượng 37 kDa (Da Costa và cs, 2002) [51] VP2 và VP3 là hai loại protein cấu trúc, sau khi ñược phân cắt thành sản phẩm ñộc lập, các protein này ñược lắp ghép lên bề mặt virion tạo nên hai lớp ngoài và trong của cấu trúc capsid của virus (Oña và cs, 2004) [146] VP2 có ñộ dài 1.356 bp, có bộ mã khởi ñầu ATG nhưng không có bộ mã kết thúc vì tiếp nối vào ñó là chuỗi nucleotide của VP4 (Jackwood và Sommer-Wagner, 2007) [85]

Ở protein VP2 cĩ sự liên quan tồn tại của một sản phẩm tiền phân cắt, đĩ là một protein lớn hơn VP2 (pVP2) cĩ thể được tìm thấy trong các tế bào nhiễm, sau đĩ được phân cắt thành VP2 cĩ hoạt tính ở trong hạt virus hồn chỉnh (Müller và Becht, 1982) [129] Sanchez và Rodriguez (1999) [163] đã xác định được các vị trí phân cắt

ở giữa các protein pVP2-VP4 là 511LAA513 và giữa VP4-VP3 là 754MAA756 Sự phân cắt cuối cùng chuyển pVP2 thành VP2 dường như được điều khiển bởi sự tương tác qua lại giữa VP3 (Chevalier và, 2002) [48] với VP1 (Tacken và cs, 2000) [182] cũng như với phân tử dsRNA của virus (Tacken và cs, 2002) [183] trong suốt quá trình khép vỏ virus Quá trình xử lí pVP2 (chứa các amino acid từ vị trí 1-512) tạo ra phân tử protein VP2 cĩ hoạt tính (chứa các amino acid từ vị trí 1- 441) và 4 phân đoạn peptide nhỏ (từ amino acid 442 đến 487, 488 đến 494, 495 đến 501, và 502 đến 512)

do enzyme VP4 nhận biết và phân cắt, trong đĩ cĩ ít nhất 3 phân đoạn peptide kết hợp với hạt virus (Da Costa và cs, 2002) [51] Nếu đột biến thay thế S (serine) bằng

K (lysine) tại các vị trí nhận biết của enzyme VP4 (487AAS489, 494AAS496 và 501AAS503) thì ảnh hưởng đến quá trình phân cắt của enzyme VP4 (Rodríguez-Lecompte và Kibenge, 2002) [157] Một lượng lớn protein pVP2 đã được tìm thấy,

cùng với nhiều chuỗi polypeptide bất thường khác, trong “các tiểu phần virus chưa hồn thiện”, được hình thành trong điều kiện chênh lệch tỷ lệ gây nhiễm (m.o.i - multiplicity of infection), tạo cho các phân tử này cĩ khả năng ngăn cản quá trình tái tạo các tiểu phần IBDV hồn chỉnh (Müller và cs, 1986) [131]

Tất cả các chủng IBDV đều cĩ mức độ giống nhau khá cao ở các gen qui định

sự tổng hợp protein VP1, VP3, VP4, VP5, chúng chỉ khác nhau ở gen qui định sự

tổng hợp protein VP2 hay chính xác hơn chúng chỉ khác nhau ở vùng “siêu biến đổi” của VP2 (Jackwood và Sommer-Wagner, 2007) [85] Chính vì vậy vùng “siêu biến đổi” được chọn làm đích để so sánh, chẩn đốn các chủng virus cường độc Gumboro (Lê Thanh Hịa, 2003c) [16]; (Dolz và cs, 2005) [58]; (Yamaguchi và cs,

2007) [205] VP2 bao gồm một vùng được gọi là vùng “siêu biến đổi” cĩ nhiều amino acid cĩ vai trị làm thành các epitope, chịu trách nhiệm trong quá trình kích

thích cơ thể động vật bị nhiễm bệnh sản sinh ra kháng thể trung hịa (Fahey và cs, 1989)[64] Sự biến đổi bất kỳ một amino acid nào thuộc loại epitope trong VP2 đều

có thể dẫn ñến sự thay ñổi nhất ñịnh của tính kháng nguyên và tính gây bệnh (Eterradossi và cs, 1998) [62]; (Letzel và cs, 2007) [113]

VP4 chính là protease, một loại enzyme có chức năng phân cắt protein, có vai trò tự ñộng trong cắt rời chuỗi polypeptide do toàn bộ phân ñoạn A tổng hợp gọi là protein chung Protein chung ñược tổng hợp do toàn bộ cấu trúc ña gen (polycistronic) của phân ñoạn A (Azad và cs, 1987)[31]; (Kibenge và cs, 1997) [97] Theo Da Costa

và cs (2002) [51], có 4 vị trí amino acid quan trọng trong protein enzyme VP4, có vai trò xúc tác trong quá trình phân cắt protein chung ñó là Aspartic acid tại vị trí 514 (D514), Histidine tại 546 (H546), Aspartic acid tại 589 (D589), Serine tại 652 (S652)

và nếu ñột biến xảy ra ở vị trí D514 sẽ ngăn cản một phần quá trình phân cắt protein chung, nếu ñột biến thay thế H bằng P (Proline) ở vị trí 546 sẽ hoàn toàn không có quá trình phân cắt protein chung, nếu ñột biến thay thế D bằng P ở vị trí 589 và S bằng P ở vị trí 652 sẽ gây ra sự thay ñổi trong quá trình phân cắt protein chung

Theo Lejal và cs (2000) [111], enzyme này sử dụng bộ ñôi xúc tác serine - lysine (S652 và K692), nếu xảy ra ñột biến thay thế S và K ở 2 vị trí này thì emzyme VP4 sẽ bị bất hoạt, không có quá trình phân cắt protein chung

VP2 và VP3 lần lượt tạo nên phần vỏ capsid bên ngoài và bên trong của virus (Caston và cs, 2001) [47], trong ñó VP2 trình diện trên bề mặt, là thành phần protein bề mặt, còn VP3 lặn sâu vào bên trong, là thành phần cấu tạo bên trong Có 2 epitope kháng nguyên của VP3 (từ vị trí amino acid 109 ñến 119, 177 ñến 190 trong protein VP3 hay từ vị trí 864 ñến 874, 932 ñến 945 trong chuỗi protein chung) ñược xác ñịnh bằng Western blot và ELISA (Deng và cs, 2007a; b) [52, 53] Trình tự của

2 epitope này tương ñồng hoàn toàn trong nhiều chủng vvIBDV, chủng cường ñộc cổ ñiển, chủng nhược ñộc cũng như các chủng thuộc serotype II và rất bảo tồn (Deng và

cs, 2007a; b) [52, 53]

bp (Yu và cs, 2005) [210], mã hóa cho một loại protein khác có tên gọi là VP5, mà chuỗi DNA này lồng vào trong phần gen của VP2 Do vậy hai loại protein này sử dụng chung một phần chuỗi nucleotide làm thành phần của mình, nhưng bộ ba mã

hóa cho thành phần amino acid lại khác nhau, hay nói cách khác là sao chép lệch khung VP5 là một protein có trọng lượng phân tử bé (16,5-17 kDa) mới ñược phát hiện gần ñây, VP5 ñược chứng minh là một loại protein không cấu trúc, không có vai trò trong sự nhân lên của virus (Mundt và cs, 1997) [138], nhưng có chức năng trong quá trình ñiều hòa sao chép và tổng hợp protein, ñặc biệt trong quá trình khởi

phát sự “tự nguyện chết” (apoptosis) của tế bào dẫn ñến suy giảm miễn dịch (Mundt

và cs, 1995b) [136] và ñược tụ tập gần màng tế bào thực hiện chức năng ly giải tế bào ñể giải phóng virus (Lombardo và cs, 2000) [116]

Phân ñoạn A của hệ gen RNA của virus Gumboro bao gồm một operon ñơn nhất liên kết các gen VP2, VP3 và VP4 với nhau, khi sao chép thông tin thì tạo nên một sợi RNA thông tin hoàn chỉnh, tổng hợp nên một protein chung có phân tử lượng là 108 kDa, sau ñó ñược enzyme do VP4 tổng hợp phân cắt tạo thành các sản phẩm riêng biệt Phần ñầu và phần cuối của các phân ñoạn của hệ gen có những vùng nucleotide không chứa gen gọi là vùng không mã hoá (NC = non coding region), làm ranh giới phân chia hệ gen làm ñôi và có tác dụng khởi ñộng, ñiều hòa trong sao chép và tổng hợp sản phẩm protein

Phân ñoạn gen B có ñộ dài khoảng 2.800 bp chỉ chứa duy nhất một cấu trúc

gen mã hóa cho sự tổng hợp một protein duy nhất có tên gọi là VP1 VP1 có hoạt tính sinh học chịu trách nhiệm là enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA của virus Enzyme này có vai trò xúc tác trong quá trình tổng hợp nguyên liệu RNA, vật liệu di truyền của virus (Hình 1.10)

VP1 là một protein enzyme (RNA-polymerase) có liên kết giữa phân ñoạn A và

B của hệ gen bằng mối liên kết chặt chẽ với hai ñầu tận cùng của nó bằng một protein nhỏ liên kết (VPg) (Müller và Nitschke, 1987) [132] Trong virus gây hoại tử tuyến tụy của cá (IPNV), VP1 ñược nối với ñầu tận cùng 5’ của hai phân ñoạn trong hệ gen bằng liên kết serine-5'-GMP phosphodiester (Calvert và cs, 1991) [44] Do có sự

giống nhau của IBDV và IPNV trong phản ứng guanyl hóa in vitro (Dobos, 1993)

[56], vì vậy VP1 của IBDV cũng ñược cho là chứa ñựng vị trí gắn với guanine ở ñầu 5’ tận cùng của các phân ñoạn hệ gen

Protein chung (108 kDa )

DÞch m

Protein chung (108 kDa )

DÞch m

Protein chung (108 kDa )

DÞch m

Kh¸ng nguyªn

Hình 1.10: Sơ ñồ minh hoạ hệ gen của virus Gumboro

và quá trình tổng hợp protein cấu trúc

Ghi chú: hệ gen bao gồm 2 phân ñoạn (A và B), trong ñó phân ñoạn B mã hóa cho 1 protein (VP1); phân ñoạn A mã hóa cho protein VP5 và một protein chung, sau khi phân cắt sẽ cho 3 loại protein sản phẩm ñộc lập bao gồm: VP2; VP4 và VP3 (Lê Thanh Hòa, 2003c) [16]

Protein cấu trúc VP1 liên kết với ñầu kết thúc của cả hai phân ñoạn của hệ gen virus (Müller và Nitschke, 1987) [132] và có các hoạt tính của nhiều enzyme (Kibenge và Dhama, 1997) [96]; (Spies và Müller, 1990) [177] Các protein VP1 của

Birnavirus tạo thành một nhóm phụ ñặc trưng của enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA (Shwed và cs, 2002) [171] Một phân tích phả hệ sử dụng trình tự nucleotide phân ñoạn B của các chủng IBDV ñộc lực cao ñược phân lập từ các ổ dịch, ñã cho thấy các chủng IBDV ñộc lực cao này tách ra thành một nhánh riêng biệt (Islam và cs, 2001b) [79] Tuy nhiên, cho ñến nay nguồn gốc phát sinh phân ñoạn B của các chủng virus này vẫn chưa ñược xác ñịnh, người ta cho rằng phân ñoạn B của các chủng virus trên có thể ñược tạo ra do sự tự sắp xếp lại cấu trúc của nó Trong tự nhiên, có hiện tượng sắp xếp chéo các phân ñoạn giữa các chủng tạo nên hiện tượng

lai ghép khi nhiều chủng cùng tồn tại gây nhiễm với nhau (Luque và cs, 2007) [119]; (Wei và cs, 2006) [200]

Hiện nay, công nghệ ”di truyền ngược” (reverse genetics technology) ñược sử

dụng một cách có hiệu quả trong nghiên cứu virus RNA Hệ thống di truyền ngược trở nên phù hợp cho việc xác ñịnh các trình tự từ ñầu 5’ ñến ñầu 3’ của cả hai phân ñoạn của hệ gene IBDV (Ben và cs, 2008) [36]; (Mundt và Vakharia, 1996) [135]

Sử dụng hệ thống này, dòng cDNA có ñộ dài ñầy ñủ của cả hai phân ñoạn ñã tạo ra, nạp vào plasmid trong hộp gen phù hợp, sau ñó gây ñồng nhiễm trên tế bào thích ứng, tạo nên virus Gumboro với một số tính năng thay ñổi có ñịnh hướng và những thế hệ tiếp theo của virus vẫn có khả năng di truyền và truyền nhiễm (Mundt và cs, 2003) [137] Gen khởi ñộng T7 ñược gắn ngay ở ñầu trên của phân tử cDNA và sử dụng enzyme T7 RNA polymerase cho sự sao chép ñược xảy ra hoàn thiện Bên cạnh ñó, phân tử cDNA có gắn trình tự của promoter khởi ñộng T7 có thể ñược sử dụng ñể chuyển nạp vào các tế bào ñã ñược tiếp truyền trước với một virus vector tái tổ hợp biểu hiện enzyme T7 polymerase (Boot và cs, 1999) [37] Các IBDV nhân tạo và sinh ra từ virus ñậu gà tái tổ hợp ñược phân biệt với nhau dựa trên sự khác nhau về kích thước của chúng (Lim và cs, 1999) [114] ñã công bố thế hệ IBDV ñược tạo ra bằng quá trình chuyển nạp các tế bào với cDNA dưới sự kiểm soát của vector có chứa promoter khởi ñộng CMV Virus Gumboro hoang dã (tự nhiên), thường không thể nhân lên trong các tế bào nuôi cấy thông thường, cũng có thể ñược tái tạo bằng phương pháp di truyền ngược, nhưng thế hệ virus ñược sinh ra cần phải ñược tiếp truyền trong các tế bào của túi Fabricius (Boot và cs, 2000b) [39] hoặc trong phôi trứng gà (Islam và cs, 2001a) [78] Việc ứng dụng hệ thống này cho phép tạo ra các chủng IBDV không chứa gen mã hóa VP5 (Mundt và cs, 1997) [138]; (Yao và cs, 1998) [206], sắp xếp lại hoặc tái tổ hợp serotype I và serotype II (Boot và

cs, 2000a) [38]; (Zierenberg và cs, 2004) [216] giữa các type huyết thanh hoặc giữa các chủng ñộc lực tạo ra các chủng IBDV tái tổ hợp (Boot và cs, 2000a) [38], (Schröder và cs, 2001) [166], cũng như các chủng IBDV có các ñột biến ñiểm do ñột biến gen tại các vị trí trực tiếp mã hóa cho các amino acid ñã làm thay ñổi các amino acid do chúng mã hóa (Lim và cs, 1999) [114]; (Mundt, 1999) [134]; (Raue và cs,

2004) [153]; (Van Loon và cs, 2002) [195]

1.2.3 Kháng nguyên của virus Gumboro

IBDV bao gồm 2 thành phần cấu tạo nên: đĩ là nhân virus (core) và lớp vỏ protein bao quanh nhân (capsid)

Các lớp protein bao bọc xung quanh nhân cĩ chức năng đa dạng, bên cạnh việc đảm bảo chức năng tối cần thiết của virus trong quá trình gây bệnh và tồn tại, đĩ là các protein thụ thể tiếp xúc với tế bào thích ứng, protein đảm bảo điều kiện sống, nhân lên và gây bệnh của virus, cịn cĩ hai loại protein đặc biệt chịu trách nhiệm về tính kháng

nguyên của virus, đĩ là protein thuộc loại gs (group-specific) và protein thuộc loại ts

(type-specific)

Loại protein cĩ tính kháng nguyên cĩ khả năng kích thích cơ thể sinh ra loại kháng thể kết tủa (precipitating antibody), được gọi là kháng nguyên đặc hiệu nhĩm hay cịn gọi là gs kháng nguyên hay gs protein (group specific protein) Loại này khi kết hợp với kháng thể đặc hiệu sẽ tạo nên phản ứng kết tủa, và nếu thực hiện phản ứng trong thạch thì người ta gọi phản ứng đĩ là phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch AGP Phản ứng này được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đốn phát hiện kháng thể Gumboro

Loại protein cĩ tính kháng nguyên cĩ khả năng kích thích cơ thể sinh ra loại kháng thể trung hịa (neutralizing antibody), được gọi là kháng nguyên đặc hiệu type hay cịn gọi là ts kháng nguyên hay ts protein (type specific protein) Loại kháng nguyên này khi kết hợp với kháng thể trung hịa đặc hiệu sẽ tạo nên phản ứng trung hịa VN (Virus Neutralization), cĩ tác dụng vơ hiệu hĩa sự hoạt động của virus Phản ứng này thường được dùng để định tính và định lượng kháng thể đặc hiệu trong chẩn đốn và kiểm tra mức độ miễn dịch Gumboro

Về cấu trúc phân tử, hai loại protein gs và ts đan chéo vào nhau tạo nên các lớp protein bề mặt và vỏ bọc, bao bọc lấy nhân virus, trong đĩ ts protein cĩ xu hướng là bề mặt, bao gồm các lớp protein nổi, các gai, mĩc, các receptor thụ thể nằm ngồi cùng, cịn gs protein thường nằm lặn sâu hơn, xen kẽ vào các protein cấu trúc khác và gắn chặt với lớp protein liên kết với acid nucleic trong nhân virus Hai type huyết thanh (serotype) của IBDV cĩ thể được phân biệt bằng phản

ứng trung hòa virus (McFerran và cs, 1980) [123] Serotype I gồm các chủng virus gây bệnh, trong khi các chủng virus của serotype II, ñược phân lập chủ yếu ở gà tây, không gây bệnh cũng như không tạo ra tác dụng bảo hộ chống lại các chủng virus serotype I ở gà Nhiều chủng biến ñổi kháng nguyên ñã ñược phát hiện ở Mỹ (Snyder và cs, 1988) [174], ở Trung Mỹ (Jackwood và Sommer, 1999) [81] và hiện nay ở cả Châu Úc (Sapats và Ignjatovic, 2000) [164].Có sự phụ thuộc chặt chẽ về cấu hình không gian của các kháng thể trung hòa với kháng nguyên chịu trách nhiệm cảm ứng, kháng nguyên này ñược khu trú trên phân tử protein VP2 (Becht và

cs, 1988) [35] Khi so sánh các trình tự nucleotide của một vài trình tự virus thuộc serotype I, cho thấy nhiều trình tự của vùng mã hóa VP2 có xu hướng thay ñổi cao

về trình tự nucleotide, và ñược gọi là vùng “siêu biến ñổi” (biến ñổi cao) của VP2

ðiều này ñã ñược xác nhận bằng việc phát sinh nhiều ñột biến ñã ñược phát hiện ra sau khi giải trình tự nucleotide (Jackwood và Sommer, 2005a) [83]; (Schnitzler và

cs, 1993) [165]; (Mickael và Jackwood, 2005) [125] Sự sắp xếp trình tự nucleotide vùng biến ñổi VP2 của các chủng IBDV ñộc tính cao xuất hiện cùng thời ñiểm ở Châu Âu, Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á, ñã xác nhận các virus này thuộc cùng một nhóm (Jackwood và Sommer, 2005a) [83]; (Jackwood và Sommer-Wagner, 2005b) [84]; (Zierenberg và cs, 2001) [215], có tính kháng nguyên tương tự nhau và

có chung nguồn gốc phả hệ (Eterradossi và cs, 1999) [63]; (Islam và cs, 2001a) [78] VP2 là một loại protein kháng nguyên có tính chất bảo vệ virus ñã ñược chứng minh bằng các phương pháp khác nhau như phương pháp miễn dich học, phương pháp sinh học phân tử, phương pháp tiếp truyền ñộng vật thí nghiệm Do vậy, VP2 ñại diện cho tính kháng nguyên và tính gây bệnh của virus Tuy nhiên có một vùng

hẹp trong cấu trúc gen của VP2 - ñược gọi là vùng “siêu biến ñổi”, chúng rất thay ñổi

trong các chủng khác nhau, nằm ở giữa VP2, chịu trách nhiệm ñặc biệt về tính kháng nguyên, kích thích cơ thể sinh kháng thể tham gia phản ứng trung hòa virus

(Jackwood và cs, 2008) [86] Như vậy, VP2 chính là loại hình kháng nguyên ts

(type-specific antigen)

Nhóm các epitope ñặc hiệu và không phải là serotype trung hòa khu trú chủ yếu

trên phân tử VP3 (Deng và cs, 2007b) [53]; (Mahardika và Becht, 1995) [120];

(Öppling và cs, 1991b) [148] - một thành phần protein làm khung cấu tạo nên capsid thuộc loại hình kháng nguyên kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể kết tủa Do vậy,

VP3 là loại hình kháng nguyên ñặc hiệu theo nhóm gọi là gs (group-specific) (Lê

Thanh Hòa, 2003c) [16]; (Deng và cs, 2007a) [52] VP2 ñược sử dụng nhằm phân biệt các chủng và tính ñộc lực khác nhau của các chủng virus Còn VP3 ñược sử dụng làm kháng nguyên kết tủa tìm kiếm loại virus Gumboro khác nhau trong việc phân nhóm (Casañas và cs, 2008) [46]; (Wang và cs, 2008) [198] VP3 kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể kết tủa mà virus Gumboro thuộc cả serotype I và II ñều kích thích sản sinh ñược Vì vậy, VP3 dễ dàng cho phản ứng kết tủa chéo và chỉ có tác dụng nhận biết virus Gumboro ñơn thuần và phân biệt sơ bộ với các virus khác (Deng

và cs, 2007a) [52]; (Öppling và cs, 1991a) [147]

1.2.4 Cơ chế phân tử quá trình nhân lên của IBDV

IBDV có cấu trúc tương ñối ñơn giản và hệ gen chỉ bao gồm nucleotide mã hóa cho 5 loại protein Sau khi virus ñược thụ thể có trên bề mặt của màng tế bào tiếp nhận thì virus thực hiện quá trình xâm nhập sâu hơn Thụ thể tế bào là một phần cấu trúc trên màng tế bào ñược biến ñổi ñặc hiệu ñể tiếp nhận virus Gumboro (Nieper và Müller, 1998 [145]; (Zhu và cs, 2008) [214] Quá trình xâm nhập xuyên qua màng tế bào ñược thực hiện theo cơ chế thông thường Giai ñoạn tiếp theo là virus phải lột vỏ capsid ñể giải phóng hệ gen RNA Quá trình ñầu tiên ñược thực hiện là virus sao chép thông tin và tổng hợp protein VP1 bởi vì VP1 có giá trị làm enzyme xúc tác RNA polymerase cho các quá trình tiếp theo (Nagarajan và Kibenge, 1997) [141]

Tiếp theo là sự tổng hợp một protein chung từ phân ñoạn A của RNA hệ gen virus Protein này ñược gọi là tiền protein có phân tử lượng là 108 kDa Giai ñoạn tiếp theo là tiền protein chung này ñược phân cắt thành 2 loại protein khác Một loại có tên gọi là VP2a có phân tử lượng 45- 50 kDa hay còn gọi là VPX (Lee và cs, 2004) [110] Loại thứ hai là VP3 và VP4 có phân tử lượng là 35- 60 kDa Giai ñoạn này gọi là giai ñoạn phân cắt Tiếp theo V2a ñược phân cắt tiếp thành VP2b có phân tử lượng 40-45 kDa và là thành phần bề mặt của vỏ capsid có trách nhiệm có tính kháng nguyên và tính ñộc lực của virus, hay còn ñược chính thức coi là VP2 kháng nguyên, thành phần tham gia phản ứng trung hòa (neutralization test) Còn VP3 và VP4 ñược phân cắt

thành 2 loại hình protein riêng biệt Loại thứ nhất có phân tử lượng bé (28 kDa) gọi là VP4 có hoạt tính sinh học là emzyme ñó chính là protease của virus, giúp cho thao tác phân cắt protein khác nhau của virus Loại thứ hai có tên gọi là VP3 (30-32 kDa) làm thành phần bên trong của vỏ capsid, chịu trách nhiệm như là một protein cấu trúc, và

ñó cũng chính là thành phần kháng nguyên tham gia phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch (phản ứng AGP = agar gel precipitation) (Deng và cs, 2007a) [52]; (Tacken và

cs, 2003) [184]

RNA của hệ gen virus cũng phải ñược nhân lên ñể tạo nguyên liệu cho virus mới Trong quá trình này, VP1 xúc tác như một RNA-polymerase tổng hợp nên sợi RNA hệ gen - ñó là các phân ñoạn A và B Các phân ñoạn này tập hợp với nhau và coi là sợi dương làm khuôn cho virus tổng hợp nên sợi âm Các sợi âm này là thành phần chính của hệ gen virus Sau khi ñược nhồi vào trong vỏ capsid thì phân ñoạn A lại kết hợp với phân ñoạn B tạo nên loại hình thái RNA hai sợi

Các virus mới ñược hình thành này tiếp cận màng tế bào (Lympho-B) gây áp lực lên màng tế bào làm thành phần màng tế bào biến ñổi và giúp ñỡ virus chồi ra ngoài

màng tế bào Người ta gọi giai ñoạn này là giai ñoạn “nảy chồi” (budding) Có hàng

chục nghìn virus ñược giải phóng ra khỏi tế bào theo cơ chế này

Một số chủng IBDV ñã ñược thích ứng nhân lên và gây bệnh trong tế bào nuôi cấy nguyên thủy tạo nên bệnh tích tế bào (CPE) của gà như tế bào lympho của túi Fabricius, tế bào thận phôi thai gà (chicken embryo kidney cells - CEK) và tế bào xơ phôi gà (chicken embryo fibroblast, CEF (Lukert và Davis, 1974) [117]; (Zheng và cs, 2008) [213] Các chuỗi polypeptide ñặc hiệu của IBDV ñã ñược tìm thấy trong tế bào lympho túi Fabricius của gà sớm ngay sau 90 phút, trong môi trường nuôi cấy tế bào

ñó 6 h (Müller và Becht, 1982) [129] và trong môi trường tế bào xơ phôi gà tại 48 và

96 h (Zheng và cs, 2008) [213] sau khi gây nhiễm

Chu kỳ nhân lên kéo dài hơn 48 h ñã ñược ghi nhận trong những dòng tế bào ñộng vật có vú như tế bào Vero, tế bào BGM-70 và dòng DF1 Hơn nữa, IBDV thuộc

họ Binaviridae có khả năng nhân lên trong tế bào ñộng vật có vú (Kibenge và cs,

1988) [92]