PHÂN TÍCH PHÂN tử và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG sâu đục THÂN (SCIRPOPHAGA INCERTULAS) của các DÒNG lúa c71 CHUYỂN GEN cry1ac ở mức độ PHÒNG THÍ NGHIỆM và NHÀ lưới

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I

ĐỖ XUÂN ĐỒNG

PHÂN TÍCH PHÂN TỬ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG SÂU ĐỤC THÂN (SCIRPOPHAGA INCERTULAS) CỦA CÁC DÒNG LÚA C71 CHUYỂN GEN cry1Ac Ở MỨC ĐỘ

PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ NHÀ LƯỚI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số: 60 62 05

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ TRẦN BÌNH

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2007

Học viên

Đỗ Xuân Đồng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Trần Bình - Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Trưởng Phòng Công nghệ tế bào thực vật, người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến PGS.TSKH Lê Thị Muội, TS Chu Hoàng Hà và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, ủng hộ và giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học

Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, anh chị Phòng Công nghệ tế bào thực vật và sự động viên khích lệ của bạn đồng nghiệp trong và ngoài Viện

Cuối cùng, tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn bên tôi, quan tâm dành cho tôi những tình cảm sâu nặng, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2007 Học viên

Đỗ Xuân Đồng

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………4

MỤC LỤC

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.3 Cơ chế diệt côn trùng của protein độc 6

2.4 Sơ lược về công nghệ biến đổi di truyền 7

2.5 Tác hại của sâu bệnh lên sản xuất lúa gạo 10

2.6 Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng 10

3.2 Phương pháp nghiên cứu 22

3.2.1 Tách chiết ADN và kiểm tra cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 23

3.2.2 Phương pháp tạp plasmit tái tổ hợp mang gen cry1A(c) 25

3.2.3 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α 25

3.2.6 Phương pháp xác định trình tự nucleotit 27

3.2.7 Phương pháp xử lý trình tự gen thu được 28

3.2.9 Thử khả năng diệt sâu non của dòng lúa chuyển gen ở giai đoạn đẻ nhánh 30

Ở Việt Nam lúa được trồng phổ biến từ rất sớm và là nguồn lương thực

và thu nhập chủ yếu của người nông dân Tuy rằng hiện nay chúng ta đang là nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới [21] nhưng năng suất thu hoạch còn chưa cao, đời sống người dân trồng lúa vẫn gặp nhiều khó khăn về kinh

tế Một trong những nguyên nhân chủ yếu làm giảm sản lượng lúa là sự bất lợi về địa hình và bất lợi về điều kiện tự nhiên Hơn nữa sâu bệnh, đặc biệt sâu đục thân là nguyên nhân làm giảm năng suất từ 5-30% tổng sản lượng thu hoạch lúa ở hầu hết các nước châu Á [7] [18]

Để khắc phục thiệt hại do sâu bệnh gây ra đã có nhiều phương pháp được áp dụng, ví dụ biện pháp canh tác, cơ giới vật lý, hoá học, trong đó biện pháp phun thuốc hoá học hiện đang được sử dụng phổ biến rộng rãi hơn Tuy nhiên sử dụng thuốc hoá học lâu dài gây ra ô nhiễm môi trường, độc hại cho người sử dụng và làm suy giảm đa dạng sinh học trong hệ sinh thái nông nghiệp [12] Sự phát triển của kỹ thuật gen đã khắc phục được những nhược điểm trên, nhiều giống cây trồng cải biến di truyền mang gen có ý nghĩa thực

tiễn cao đã và đang được phát triển: cây bông Bt kháng sâu; lúa Bt kháng sâu; ngô Bt kháng sâu; cải canola kháng thuốc diệt cỏ; đu đủ kháng virus PRSV và

một số gen liên quan đến chất lượng dầu thực vật, hàm lượng tiền vitamin, hàm lượng axít amin, chín chậm, sản xuất protein làm vaccine, làm thuốc chuyển vào cây trồng v.v mang lại hiệu quả to lớn trong nông nghiệp [65] [47] [19] [31] [54] [15] [60]

Vì vậy, nghiên cứu để nâng cao chất lượng và ổn định sản lượng lúa bằng cách tạo ra các giống lúa có khả năng kháng được sâu bệnh và tác động của ngoại cảnh bất lợi là một trong những định hướng quan trọng trong công cuộc tạo giống mới ở Việt Nam [4]

Các kỹ thuật sinh học truyền thống như kỹ thuật lai chọn giống đã được con người sử dụng hàng ngàn năm qua để tạo ra các cây trồng có đặc tính riêng biệt Tuy nhiên, những kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian và có thể phải trải qua nhiều thế hệ mới có được những tính trạng mong muốn và loại bỏ những đặc tính không cần thiết Công nghệ sinh học sử dụng các kỹ thuật di truyền để biến đổi cây trồng bằng cách đưa những gen có giá trị vào bộ gen của cây nhận (thậm chí

kể cả gen của các loài vốn không có quan hệ họ hàng) và nhanh chóng tạo ra các cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Organisms) mang những đặc tính mong muốn

Đề tài nghiên cứu cấp nhà nước “Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi” do PGS TS Lê Trần Bình làm chủ nhiệm đã tạo ra các dòng lúa

chuyển gen C71 mang gen cry1A(c) (kháng sâu đục thân) [3] Tuy nhiên

những nghiên cứu sâu hơn trên các dòng lúa chuyển gen này như xác định số bản copy của gen chuyển, mức độ biểu hiện độc tố của gen chuyển ở trong cây và sự sai khác về kiểu hình là vấn đề cần được nghiên cứu và phân tích để nhanh chóng chọn được những dòng lúa chuyển gen có tính kháng cao và ổn

định Với mục tiêu như vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân tích

phân tử và đánh giá khả năng kháng sâu đục thân (Scirpophaga

incertulas) của các dòng lúa C71 chuyển gen cry1A(c) ở mức độ phòng thí

nghiệm và nhà lưới”

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây lúa

Cây lúa thuộc họ Hòa thảo, thân bụi, lá mềm Cây lúa trồng thuộc chi

oryza với nhiều loài khác nhau Trong số 23 loài đã được phân loại thì chỉ có

2 loài là O glaberrima Sreud và O sativa L được trồng cấy Loài O

glaberrima Sreud được trồng chủ yếu ở một số nước miền Tây châu Phi

Loài O sativa L được trồng khắp thế giới (phần lớn tập trung ở châu Á) và

được chia thành 3 loài phụ: indica, japonica và javanica Lúa indica được thuần hoá đầu tiên ở vùng Đông ấn, từ đó phân tán đến các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, ngày nay lúa indica chiếm 80% các giống lúa trồng trên thế giới; lúa japonica bắt nguồn từ vùng nam Trung Quốc, được trồng chủ yếu ở các nước ôn đới và cận ôn đới còn lúa javanica chỉ được trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia [36] [37]

Lúa O sativa L có số nhiễm sắc thể đơn bội là n = 12 Đa số các loài lúa

dại và lúa trồng hiện nay có bộ gen ở trạng thái lưỡng bội và là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo [37]

Theo Khush, 1997 và Ikeda, 2001 trên thế giới có khoảng 120 loại lúa

được trồng Từ năm 1960, Viện Nghiên cứu lúa quốc tế đã nghiên cứu, cải tiến những giống lúa tốt, có hạt dẻo ngon và việc phổ biến những giống lúa đó chiếm 70% diện tích trồng lúa trên thế giới

Lúa là một trong những loại cây lương thực chính, chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên trái đất và cung cấp thức ăn cho hơn một nửa dân số thế giới Theo thống kê, trên thế giới có 15 nước trồng hơn một triệu hecta lúa, trong đó có tới 13 nước ở Châu Á Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu Bănglađét,

Inđônêsia và Thái Lan, mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mỹ La Tinh Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng Việt Nam, nhưng sản lượng trồng lúa lại thấp hơn Việt Nam hai đến

ba lần [48]

Việt Nam, với 80% dân số sống bằng nghề nông nghiệp, trong sản xuất nông nghiệp, lúa không những cung cấp lương thực cho toàn bộ dân số trong nước mà còn mang lại hiệu quả kinh tế cao do xuất khẩu gạo ra thị trường quốc tế Theo thống kê, năng suất lúa nước ta đạt 34568,8 nghìn tấn năm

2003, đạt 36148,9 nghìn tấn năm 2004 và năm 2005 đạt 35832,9 nghìn tấn [11]

2.2 Các gen có hoạt tính gây độc của Bt

2.2.1 Sơ lược về Bt

Bt (Bacillus thuringiensis) là trực khuẩn sinh bào tử, hiếu khí hoặc hiếu

khí không bắt buộc, gram (+) Bt có khả năng sản sinh protein tinh thể độc ở dạng ngoại bào (β, α, γ-exotoxin) và nội bào (δ-endotoxin) Trong đó δ-endotoxin là một họ protein tinh thể độc chính gây độc hệ tiêu hoá của côn trùng Trong các loại độc tố này thì δ-endotoxin, β-exotoxin là các độc tố được nghiên cứu nhiều nhất về mặt phân tử và phổ tác dụng với côn trùng, chúng tác dụng hầu hết lên các loại côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Hai cánh (Diptera), Cánh cứng (Coleoptera) và tuyến trùng (Nematoda) [26]

2.2.2 Phân loại gen mã hoá độc tố của Bt

2.2.2.1 Các gen nội độc tố cry

Có rất nhiều loại gen mã hóa cho các protein có hoạt tính diệt côn trùng

của Bt (gọi tắt là gen độc) chủ yếu là các gen cry, người ta đã phân tích trình

tự của 50 gen mã hóa cho protein tinh thể độc Một số giống nhau hoàn toàn, một số khác gần giống nhau đại diện cho cùng một gen hoặc nhiều gen hoặc

là biến dạng từ một gen [26]

Năm 1986, Whiteley đã xây dựng một hệ thống phân loại các gen cry

dựa trên cơ sở khác nhau về trọng lượng protein, phổ tác dụng với côn trùng được chia thành năm nhóm chính:

Bảng 1.1 Bảng phân nhóm gen cry

Nhóm

Mã hóa cho protein độc (kDa)

Phổ tác dụng với côn trùng

Diptera

Lepidoptera, Coleoptera

1.2.2.2 Các gen ngoại độc tố khác

Gen cytA: Là gen tổng hợp nên protein độc với tế bào động vật có xương

sống và không xương sống, hồng cầu động vật có vú Gen này mã hoá protein

có trọng lượng khoảng 27kDa (trình tự không đồng nhất với bất kì gen cry nào) và hoạt tính chống côn trùng của protein này vẫn chưa được xác định rõ Nhưng theo một số nghiên cứu cho thấy protein này kết hợp vói một số

protein do gen cryI mã hoá tạo ra phức hợp tinh thể hình trứng có tác dụng

độc với côn trùng [52]

Nhóm gen vip (Vegetative Insecticidal Protein): Ngoài các gen cry tạo

độc tố trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, còn có nhiều hướng nghiên cứu mới về gen vip Gen vip mã hoá các protein trong pha sinh

dưỡng trong chu trình phát triển của vi khuẩn Bt và Bc có hoạt lực diệt côn trùng có phổ tác dụng mạnh hơn các protein độc do gen cry mã hóa [38] Một

số gen vip (vip1, vip2, vip3) có phổ diệt côn trùng rất rộng và mạnh như protein vip3 có kích thước khoảng 88,6 kDa và có hoạt tính kháng sâu xám (Agrotis ypsilon) cao gấp 260 lần so với protein cry1A và có phổ hoạt động

rộng kháng một số loài côn trùng Bộ Cánh vảy như: sâu xám, sâu cắn chồi

thuốc lá (Heliothis virescens) và sâu xanh hại ngô (Helicoverpa zea) [58] và

protein vip được xử lý mất đoạn đầu C và N để mở rộng phổ hoạt động như

diệt sâu đục củ khoai tây (Phthrimea opercullelar), sâu đục thân ngô (Chilo

partellus), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu tơ hại cải bắp (Plutella xylostella) [51]

Về cơ chế tác dụng độc của các loại protein vip cũng được nghiên cứu và

bước đầu cho thấy giống như phương thức tác dụng của tinh thể độc δ-

endotoxins Tuy nhiên, protein vip có hoạt lực sau 48-72 giờ sau khi ăn protein độc, trong khi đó đối với protein cry là 16-24 giờ [61]

Gần đây, đã có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động, hoạt lực diệt

côn trùng, phổ tác dụng về gen vip để tiến tới phân lập và thiếp kế tạo vector

chuyển gen vào thực vật Theo các nhà khoa học việc tìm ra các gen vip có hoạt tính diệt côn trùng mạnh và ứng dụng để tạo ra cây chuyển gen có tính kháng sâu và phổ tác động rộng hơn là vấn đề đang quan tâm của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [6] [51] [52] [58] [61]

2.3 Cơ chế diệt côn trùng của protein độc

Protein độc của Bt có nhiều loại khác nhau nhưng chúng có cơ chế tác

động gây độc chung với côn trùng gồm 3 bước chính [6] [16] [26]:

i Sau khi nuốt phải tinh thể độc (tiền độc tố), dưới tác động của môi trường

có độ pH>10 và sự hoạt động của enzym protease ở ruột giữa của ấu trùng

phân giải tiền độc tố tạo ra protein dạng hoạt hoá có kích thước khoảng

xác chết đã tạo thành nền móng cho sự sinh trưởng của Bacillus

thuringiensis từ những bào tử

Hình 1.1 Cơ chế diệt côn trùng của protein độc

2.4 Sơ lược về công nghệ biến đổi di truyền

Trong lịch sử loài người, từ xa xưa nông dân đã biết sử dụng kỹ thuật lai chọn giống để cải tiến giống cây trồng, vật nuôi Việc sử dụng liên tục và lai tạo các giống có chất lượng nhất là cơ sở để duy trì và tăng cường các đặc tính tốt qua nhiều thế hệ Dựa trên sự đa dạng di truyền tồn tại sẵn trong quần

thể, trong đó có các đột biến xảy ra ngẫu nhiên trong tự nhiên, nông dân và gần đây là các chuyên gia tạo giống đã chọn tạo được các giống động, thực vật mang những đặc tính mong muốn như kháng sâu bệnh, tăng sản lượng, chất lượng và chống chịu với môi trường khác nghiệt Đến nay, kỹ thuật này phần lớn giống cây trồng vật nuôi sử dụng trong các nông trại và vẫn tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp [55] [20]

Ngày nay, với sự can thiệp của con người, quá trình chọn tạo giống có thể vượt qua các dào cản của tự nhiên Biến đổi di truyền hay còn gọi là kỹ thuật di truyền, được hình thành từ những năm 1970, sử dụng các thao tác để phân lập các gen từ một hoặc nhiều cá thể động vật, thực vật và vi sinh vật , thiết kế và chuyển chúng vào trong nguyên liệu di truyền của tế bào ở các cá thể khác để tạo các sinh vật biến đổi di truyền Khi đã được biến nạp vào tế bào sinh vật, thông qua quá trình sinh sản bình thường, trong các thế hệ con cháu có thể tìm thấy sự có mặt của những gen này ở các cá thể biến đổi di truyền [32] [43]

Về bản chất, kỹ thuật lai chọn giống tiến hành lựa chọn các gen tái tổ hợp dựa trên các đa dạng di truyền tồn tại tự nhiên trong các cá thể động thực vật quan tâm Vì vậy, kỹ thuật này cho phép chọn lọc và lai tạo giống với các tính trạng chịu ảnh hưởng của một vài gen riêng lẻ cũng như các tính trạng chịu sự kiểm soát của một gen Lai giống thường xảy ra giữa các cá thể của cùng một loài hoặc loài có quan hệ họ hàng Ở đây, các nhà tạo giống không biến đổi nguyên liệu di truyền của các cá thể nghiên cứu Trong khi ở kỹ thuật

di truyền, các nhà khoa học tiến hành phân lập các gen riêng lẻ kiểm soát các tính trạng cụ thể, nhân chúng lên và thiết kế chúng với các nhân tố điều khiển tách từ các gen khác để tạo ra ‘kết cấu gen’ nhằm đảm bảo chúng có thể hoạt động tốt trong sinh vật đích Sau đó, chúng được chuyển vào trong sinh vật đích ở các vị trí ngẫu nhiên Các kỹ thuật sử dụng phương pháp GM

(Genetically Modìfied) liên quan đến các bước xảy ra ở mức phân tử bên ngoài cơ thể sinh vật Việc ứng dụng các kỹ thuật mới này đã tạo ra những bước phát triển vượt bậc trong quá trình tiến hóa Thông qua sự biến đổi di truyền, gen được chuyển và biến đổi theo cách không thể xảy ra trong quá trình tiến hóa của tự nhiên cũng như lai chọn giống như giữa các loài khác nhau và giữa động vật – thực vật và vi sinh vật Rất nhiều rào cản tự nhiên có thể dễ dàng vượt qua như việc chuyển một hoặc nhiều gen giữa các cơ thể sinh vật không có quan hệ di truyền [63] [28]

Hình 1.2 Những giai đoạn chính yếu trong quá trình tạo một sinh vật chuyển

đổi gen

Công nghệ GM đã phát triển nhanh chóng trên nhiều đối tượng và được ứng dụng rộng rãi không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong ngành dược và

trong công nghiệp để sản xuất các hóa chất mới tinh khiết, các chất phụ gia thực phẩm, các chất phụ gia thực phẩm và các dược phẩm sử dụng các ‘nhà máy’ sản xuất là các GM

2.5 Tác hại của sâu bệnh lên sản xuất lúa gạo

Sâu bệnh luôn là một trong những đối tượng gây hại nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp trên toàn thế giới Ngành trồng lúa phải đương đầu với hơn 133 loài côn trùng phá hại từ khi hạt lúa được gieo xuống cho tới khi bảo quản trong kho [8] Hàng năm thế giới tiêu tốn khoảng 10 tỷ đô la cho việc sản xuất thuốc trừ sâu nhưng sản phẩm nông nghiệp vẫn bị thất thoát từ 20 - 30% do sâu bệnh phá hoại

2.6 Công nghệ Sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng

Hiện nay, nhiều quốc gia đang phát triển trên thế giới phải đối mặt với những thách thức do sự tăng nhanh dân số, trong khi năng suất nông nghiệp không tăng với mức tương ứng để cung cấp đủ lương thực cho toàn bộ dân số thế giới Vì vậy, để tăng năng suất cây trồng mà vẫn giữ được một môi trường bền vững chỉ có thể đạt được khi ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong sản xuất nông nghiệp

Để khắc phục những yếu tố hạn chế năng suất cây trồng, lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng của công nghệ sinh học thực vật phải tập trung vào: (i) Tăng cường tính kháng của cây trồng với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh và côn trùng; (ii) Cải biến thông tin di truyền để tăng cường sự chuyển hoá các chất trong thực vật thành protein; (iii) Tăng cường carbohydrate có giá trị dinh dưỡng và (iv) Nghiên cứu ảnh hưởng của stress do môi trường tác động lên thực vật như: hạn, mặn, nhiệt độ thấp…để khắc phục và nâng cao tính chống chịu của thực vật [39] Góp phần tạo nên ngày càng nhiều đóng góp có giá trị trong lĩnh vực sinh học trong sản xuất nông nghiệp Kỹ thuật nuôi cấy mô và

tế bào thực vật được sử dụng như một phương pháp sinh học hiện đại để nghiên cứu các lĩnh vực sinh lý, sinh hoá di truyền…ở thực vật Bằng con đường nuôi cấy mô và tế bào có thể tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân bất lợi lên thực vật ở các mức độ khác nhau như mức gen, mức tế bào riêng rẽ, tế bào mô, các cơ quan nuôi cấy phân lập và mức cây hoàn chỉnh Với những hệ thống đó, các nhà khoa học có thể nghiên cứu một cách riêng biệt hay tổ hợp theo ý muốn các tác động mà ngoài tự nhiên khó thực hiện, từ đó có thể tìm hiểu và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu

Hệ thống tế bào và mô nuôi cấy còn cho phép chọn tạo, thử hàng loạt, gây đột biến…trong phòng thí nghiệm để tìm ra các dòng tế bào và cây có tính chống chịu cần thiết đối với các tác nhân bất lợi do môi trường

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, các nhà khoa học có thể định vị, xác định và phân lập các gen kiểm soát các tính trạng quan trọng, từ

đó sử dụng kỹ thuật di truyền để biến nạp các gen đó vào những giống cây trồng cần cải tiến [13] Bằng con đường biến nạp gen, công nghệ sinh học thực vật giúp tạo ra các cây trồng chuyển gen với những tổ hợp tính trạng hoàn toàn mới, có tác dụng cải tiến giống cây trồng Trong mô hình chuyển gen vào cây hai lá mầm thì cà chua, bông, cải dầu, khoai tây là những cây thành công nhất và thâm nhập thị trường sớm nhất (1994 là năm đánh dấu cây trồng chuyển gen đầu tiên (cà chua Flav’r Sav’r) có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kỳ [20]

2.7 Các phương pháp phân tích cây chuyển gen

Theo Brien và Henry (2000) [15], sự biểu hiện của gen chuyển trong thực vật chuyển gen là không thể dự tính trước được và phụ thuộc nhiều yếu

tố, bao gồm sự biểu hiện của gen chuyển, số bản copy của gen chuyển và tính toàn vẹn về cấu trúc của ADN được chèn Sự bất hoạt của gen chuyển có thể xảy ra ở mức độ phiên mã hay sau phiên mã Sự methyl hoá ADN cũng

thường xảy ra cùng với sự bất hoạt của gen chuyển

2.7.1 Phương pháp thử tính kháng kháng sinh (phương pháp sử dụng gen

marker chọn lọc)

Promoter CAMV35S thường được sử dụng để khởi đầu sự biểu hiện của gen chọn lọc ở lúa Gen chọn lọc được dùng trong chuyển gen vào lúa thường

là hph (gen kháng hygromycin), bar (kháng thuốc diệt cỏ phosphinothricin)

Hoạt động của promoter CAMV35S được điều khiển bởi sự biểu hiện của gen reporter Thông qua sự biểu hiện của gen chọn lọc, các tế bào mang gen chuyển

sẽ được chọn lựa thông qua sự phát triển của các tế bào này trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian và rất hiệu quả trong sàng lọc cây lúa chuyển gen [59]

2.7.2 Phương pháp sinh học phân tử

Trước hết phải khẳng định nguyên liệu tạo được là cây chuyển gen thực

sự thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử ở mức độ phòng thí nghiệm Xác định sự có mặt của gen được chuyển trong tế bào của dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Thực hiện phép lai phân tử Southern nhằm xác định gen chuyển được gắn vào genom có bao nhiêu bản copy trong cây chuyển gen, sử dụng mẫu dò là đoạn gen chuyển được đánh dấu huỳnh quang còn ADN được tách từ mô của cây chuyển gen Xác định gen chuyển

có được phiên mã thành mARN hay không được thực hiện bằng kỹ thuật lai Northern giữa mẫu dò là đoạn ADN của gen đánh dấu huỳnh quang và ARN tổng số của mô cây chuyển gen Và bước cuối cùng là xác định gen chuyển có biểu hiện và tạo ra sản phẩm cuối cùng của nó là protein bằng kỹ thuật lai Western giữa protein của cây chuyển gen và kháng thể đặc hiệu với protein đó được tinh sạch từ nguồn khác Mặt khác hoạt tính gen chuyển còn được thử bằng các phép thử chỉ thị như thử tính kháng kháng sinh, thử tính diệt sâu,

nhưng ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô nhà lưới

Điểm tiếp theo là phải xác định phương thức và đặc điểm di truyền của gen chuyển và tính trạng được gen chuyển mã hoá đồng thời kiểm tra mức độ đồng hợp tử của thế hệ con cái chúng bằng cách lai chéo hay tự phối và phép thử tính kháng kháng sinh

2.7.2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuật nhân ADN đặc hiệu, được sử dụng cho mục đích nhân nhanh một số lượng không hạn chế nguyên bản của một đoạn ADN nhất định PCR là một phương pháp đơn giản và được ứng dụng rộng rãi trong phân tích cây chuyển gen Đặc điểm của phản ứng PCR là nhanh và nhạy, nhưng cũng bộc lộ những hạn chế đáng kể như: mức độ ngoại nhiễm cao, giới hạn kích thước của trình tự

cần khuyếch đại, các sai sót trong quá trình tổng hợp bởi Taq-polymerase…

nên điều kiện phản ứng cần được tối ưu hoá

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, sử dụng ADN khuôn và

các hoá chất như Taq - polymerase, các nucleotit, cặp primer đặc hiệu và máy

gia nhiệt để khuyếch đại một đoạn ADN thành một lượng lớn trong một thời gian ngắn Phản ứng PCR được tiến hành theo ba bước sau:

Bước 1: Biến tính ADN từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách

nâng nhiệt độ lên 94oC – 95oC trong thời gian ngắn (30 giây – 1 phút)

Bước 2: Tiếp hợp đoạn mồi thông qua việc hạ nhiệt độ xuống 35oC -

60oC Đoạn mồi sẽ tiếp hợp với ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở vị trí tương đồng

Bước 3: Phản ứng chuỗi polymerase, được tiến hành ở 72oC, là nhiệt độ

cho phép ADN Taq – polymerase hoạt động tổng hợp phân tử ADN, kéo dài

từ đầu 3’ – OH của đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung

Sau một chu kỳ gồm 3 bước như trên, một đoạn ADN khuôn được nhân lên thành hai Các đoạn ADN vừa được nhân bản trong mỗi chu kỳ trước lại được dùng làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Chiều dài thực tế của đoạn ADN được nhân bản đúng bằng khoảng cách xuất phát từ hai đầu đoạn mồi Như vậy, sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN khuôn ban đầu [9]

2.7.2.2 Kỹ thuật lai Southern (Southern blotting)

Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) nói chung và lai Southern nói riêng dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò ADN (ARN) với các phân tử ADN (ARN, protein) được lưu giữ trên giá thể để dò tìm các phân tử sinh học đặc trưng Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử phức tạp Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lưu giữ như màng nitrocellulose, màng nylon, màng giấy cellulose, nhưng vẫn duy trì

được khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác [1] [2] [9]

Đối với ADN, phương pháp này được Edwind M Southern xây dựng và thử nghiệm thành công vào năm 1975 Ở đây, quá trình lai phân tử xảy ra khi hai đoạn mạch đơn ADN bắt cặp và gắn kết với nhau trên nguyên tắc bổ xung cho nhau Các bước tiến hành trong kỹ thuật này có thể được tóm tắt như sau:

- ADN bộ gen được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bằng một hay nhiều enzym giới hạn (RE) và được phân tách bằng điện di trên bản gel

- ADN được biến tính ngay trên bản gel rồi được thấm truyền lên màng lai Trong quá trình thấm truyền vị trí các đoạn ADN trên màng lai được giữ nguyên như trên bản gel

- ADN cố định trên màng được đem lai với mẫu dò ADN có đánh dấu bằng phóng xạ hoặc hoá học Sau quá trình lai người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp

- Cuối cùng người ta dùng kỹ thuật phóng xạ hoặc hoá học tự ghi để định vị các phân tử lai và hiển thị trên phim thành từng băng dạng vạch ngang

Kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật phân tích màng thấm chuyển Southern (Southern blot analysis), gọi tắt là lai Southern [1] [5]

Khi ứng dụng lai Southern đối với các ARN, kỹ thuật này được đặt tên là

lai Northern Bước phát hiện các băng ARN được tiến hành thông qua lai với

mẫu ADN hoặc ARN đánh dấu Còn khi tiến hành kỹ thuật này với protein thì gọi là lai Western để phát hiện các băng protien bằng kháng thể đánh dấu Tới nay đã có nhiều phương pháp cải tiến, hình thành nhiều kỹ thuật phối hợp như

Southwestern, phát hiện băng protein bằng ADN đánh dấu hoặc Western xa,

dùng mẫu protein không phải kháng thể (non-antibody) [1] [2]

Về nguyên tắc, kỹ thuật thấm chuyển không thay đổi nhiều từ khi được phát minh, nhưng chủng loại các màng và kỹ thuật phát hiện các loại đại phân

tử thông qua lai đánh dấu hay miễn dịch đánh dấu kèm với các bộ kit luôn được cải tiến cho tiện lợi và an toàn Màng nitrocellulose được dùng rất nhiều, nhưng gần đây trong hai loại màng nylon trung tính và màng tích điện thì loại màng sau do tích điện nên có sức gắn ADN cao hơn Đương nhiên trong kỹ thuật Western, chất liệu nitrocellulose vẫn đang được sử dụng rộng rãi, ngoài

ra còn có màng polyvinylidene diflouride (PVDF) và màng nylon [5]

Việc phát hiện các phân tử trên màng được tiến hành thông qua kỹ thuật đánh dấu Trong nhiều năm kỹ thuật đánh dấu bằng đồng vị phóng

xạ đã được ứng dụng một cách rộng rãi, phổ biến nhất là gắn các nucleotide với các đồng vị phóng xạ 32P dạng 32P-dNTP Ưu điểm lớn

của phương pháp phóng xạ này là có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện được vết ADN ở mức ng (10-9 g) và thấp hơn Tuy nhiên phương pháp đánh dấu phóng xạ đòi hỏi phòng thí nghiệm có những thiết bị kiểm tra

và bảo đảm an toàn phóng xạ đồng bộ Những năm gần đây kỹ thuật phi phóng xạ (non-radioactive) hay kỹ thuật đánh dấu lạnh (cold labelling) đang từng bước thay thế kỹ thuật phóng xạ Trong đó nổi bật

là kỹ thuật phát quang hoá học kích hoạt (Enhancing Chemical Luminevà csence, ECL) và kỹ thuật sử dụng đánh dấu với digoxigenin (DIG) [1] [24]

Kỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử rất quan trọng và được sử dụng nhiều trong các phân tích phân tử như:

- Lập bản đồ giới hạn của một gen

- Phát hiện các đa hình độ dài (fragment polymorphism) của cùng một gen ở các chủng khác hay giữa các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn giữa chúng

- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen

vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn

- Phát hiện sinh vật chuyển gen, đánh giá số lượng bản gen và điểm gắn của gen chuyển

2.7.2.3 Kỹ thuật lai Northern blotting

Khi ứng dụng kỹ thuật Southern đối với ARN, kỹ thuật này được đặt tên

là kỹ thuật Northern, bước phát hiện các băng ARN được tiến hành thông qua lai với mẫu ADN hoặc ARN đánh dấu

2.7.2.4 Kỹ thuật lai Western blotting

Kỹ thuật lai Western Blotting là kỹ thuật lai protein-protein Protein mẫu

sau khi được phân tách bằng điện di gel acrylamide sẽ được chuyển sang cố định trên một chất giá cũng bằng điện di Chất giá thường sử dụng là các loại màng khác nhau như màng nitrocellulose, diazophenylthio (DPT), diazobenzyloxymethyl (DBM), nylon Protein đã cố định trên màng sẽ được phát hiện bằng phản ứng miễn dịch kép gồm hai giai đoạn

+ Protein mẫu cố định trên màng đóng vai trò một kháng nguyên sẽ kết hợp với protein khác có tính chất là một kháng thể kháng lại protein này (kháng thể thứ nhất) Kháng thể được tạo ra nhờ gây phản ứng miễn dịch khi tiêm protein mẫu vào thỏ hoặc chuột và sau đó tách lấy kháng thể từ huyết thanh của chúng

+ Kháng thể thứ nhất lại tiếp tục được lai với kháng thể thứ hai (kháng thể kháng globulin miễn dịch anti-immunoglobulin) đã được gắn với một protein có hoạt tính enzym thường là peroxidase củ cải ngựa hoặc alkaline phosphatase Chính các enzym này sẽ phân huỷ cơ chất BCIP/NBT từ không màu thành màu xanh giúp chúng ta quan sát được sự có mặt và vị trí của

protein mẫu trên bản gel [10] [14] [50]

2.7.3 Phương pháp sử dụng các phép thử sinh học (phép thử chỉ thị)

Phương pháp sử dụng các phép thử chỉ thị cho phép xác định được hoạt tính của gen chuyển trong cây chuyển gen Với mỗi loại cây trồng được chuyển những loại gen khác nhau nhằm tạo ra những tính trạng mong muốn thì lại có những phép thử đánh giá đặc thù cho từng đối tượng nhưng nhằm mục đích chung là đánh giá nhanh khả năng biểu hiện của gen bằng chính bộ phận của cây trồng chuyển gen đó Đây là một trong những phương pháp đánh giá cây chuyển gen rất có hiệu quả, các cây mặc dù đã được xác định là

có gen chuyển bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, Southern, Western,…nhưng không thể bỏ qua bước thử đặc tính sinh học vì nó luôn gắn

liền với biểu hiện thực tế của gen chuyển Chẳng hạn, khi chuyển gen

cry1A(c)/cry1A(b) (kháng sâu đục thân), đã có nhiều tác giả sử dụng phép thử

sinh học [34] [47] [19]), với gen gna (kháng rầy nâu) tác giả Foissac (2000) [25] cũng sử dụng phép thử này hoặc Xa21 (kháng bệnh bạc lá) [56] đã sử dụng chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) lây nhiễm với

cây chuyển gen để đánh giá khả năng kháng bệnh của cây chuyển gen Ngoài các gen kháng sâu bệnh ở trên sử dụng phương pháp thử sinh học thì còn có

những nhóm gen khác cũng sử dụng những phép thử này, như gen TPS (gen

chịu mặn và hạn) khi được chuyển vào cây trồng cũng cần phải đánh giá tính chịu mặn và hạn của cây chuyển gen thông qua các chỉ tiêu sinh lý và sinh hoá liên quan Các phép thử có thể được tiến hành ở qui mô phòng thí nghiệm hoặc điều kiện tự nhiên

Để thu được kết quả thử nghiệm sinh học có độ tin cậy cao, cần phải chú ý đến độ đồng đều về mặt hình thái và tuổi cây, nguồn lây nhiễm sâu bệnh,…vv các dòng cây có cùng chế độ phân bón và điều kiện chăm sóc

2.8 Một số thành tựu về tạo cây lúa chuyển gen

Gen cry1A(b) tổng hợp điều khiển bởi promoter 35S được chuyển vào giống lúa indica (IR58) bằng súng bắn gen Kết quả là các cây lúa chuyển gen

có khả năng kháng lại hai loài sâu nguy hiểm nhất của lúa ở khu vực châu Á

là sâu đục thân vàng (Yellow Stem Borer - YSB) và sâu đục thân trơ (Stripped Stem Borer – SSB) Ngoài ra các cây lúa chuyển gen cũng có khả

năng ức chế hoạt động phá hoại của hai loài sâu cuốn lá Cnaphalocrous

medianalis và Marasima patanis [65] Để tăng cường sự biểu hiện của các cry

trong các cây lúa chuyển gen, gen cry1A(c) được thiết kế lại và chuyển vào giống lúa indica IR64, kết quả là các cây lúa chuyển gen hoàn toàn có khả

năng loại trừ được tính nguy hiểm của sâu SSB [47] Gần đây, rất nhiều gen

cry1A(b) tổng hợp hoặc sửa đổi được điều khiển bởi các promoter (35S, Ubi1,

Act1) và promoter đặc hiệu mô đã được sử dụng và thu được kết quả rất khả quan trong việc phòng trừ chống sâu SSB và YSB [23] [29] ở công trình Data

và cộng sự đã tuyên bố: “Quần thể lớn các thực vật chuyển gen có thể tiêu

diệt 100% ấu trùng sâu YSB” Tác giả cũng gợi ý sử dụng promoter đặc hiệu

mô để giới hạn đến mức tối đa sự biểu hiện của protein Bt ở các bộ phận con người sử dụng Cheng và cs (1998) [19] đã thành công trong việc tạo ra quần

thể lớn các dòng lúa chuyển gen cry1A(b) và cry1A(c) bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Kết quả các dòng lúa chuyển gen ở thế hệ R1 chứng minh các gen cry1A(b) và cry1A(c) đã

được gắn, di truyền và biểu hiện trong quần thể các dòng lúa chuyển gen, tác giả sử dụng Ubiquitin promoter và kết quả là thu được mức độ biểu hiện cao các gen Bt và tính độc của các protein Bt với các loài sâu SSB và YSB cũng

đã được khẳng định Thực tế sản xuất đang diễn ra là các loài côn trùng đã có

hiện tượng quay trở lại phá hoại các dòng lúa chuyển đơn gen Bt và điều này

đã được chứng minh ở mức độ phân tử bơỉ công trình của Tabashnik và cs (1997) [53]

Maqbool và cs (1998) [44] đã chuyển gen Bt kiểu mới (cry2A) vào lúa

bằng súng bắn gen Kết quả là ở thế hệ R2, một dòng lúa chuyển gen có hàm lượng protein Bt chiểm 5% hàm lượng protein tổng số của lá, ở một dòng lúa

khác có hàm lượng protein Bt chiếm 0,1 - 1% hàm lượng protein tổng số ở lá

Các thí nghiệm phân tích dã chứng minh hai giống lúa chuyển gen này hoàn toàn có khả năng chống sâu YSB và sâu cuốn lá Đến năm 1999, nhóm nghiên

cứu này đã đồng thời chuyển 2 gen cry1A(c), cry2A và một gen mã hoá cho protein ngưng kết tế bào (lectin) ở cây hoa điểm trắng vào giống luá indica

Kết quả là các giống lúa chuyển 3 gen kể trên có tính kháng sâu cao hơn nhiều so với giống lúa chuyển đơn gen

Phương pháp chuyển gen được áp dụng thành công đầu tiên ở lúa bởi

Toriyama và cs; Zhang và cs vào năm 1988 [66], Brien và cs, 2000 [15] Từ

đó đến nay, có ít nhất 50 giống lúa (hầu hết là lúa Japonica và Indica) đã

được chuyển gen qui định những tính trạng nông học quí như kháng thuốc diệt cỏ, kháng virus, vi khuẩn, nấm, sâu hại hoặc gen tăng cường tính chống chịu như gen chịu úng, mặn, hạn, lạnh… Bảng 1 tóm tắt một số thành công trong chuyển gen đối với các tính trạng có giá trị ở cây lúa [33] [35] [64] [41]

Bảng 1.2 Thành công trong tạo cây lúa chuyển gen

Datta và cs, 1999

protein )

kháng virus đốm vàng

codA chịu mặn Sakamoto và cs, 1998

P5CS chịu mặn Igarashi và cs, 2002

3.1.2 Sâu đục thân

Sâu đục thân hai chấm (Scirpophaga incertulas) được thu ngoài tự nhiên

và nuôi nhân tạo trong phòng thí nghiệm và ngoài trại thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh học

Kháng thể kháng cry1A(c) do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện

Công nghệ sinh học cung cấp

Kit tinh sạch ADN (QIAquick Gel Extraction Kit), và tách chiết plasmit (QIAprep Spin Miniprep Kit) của hãng QIAGEN (Đức) Kit gắn gen vào

vectơ pGEM®-T của hãng Promega

Các hoá chất thông dụng khác (ampicillin, IPTG, X-gal, agarose,…) của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech Các hoá chất sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào; hygromycin do các hãng Sigma (Mỹ), Nga, Trung Quốc cung ứng

b Thiết bị

Máy li tâm các loại (Sigma); máy PCR (Thermal Cycler PTC 100 của hãng MJ Research, Mỹ); thiết bị điện di ADN (Bio-Rad, Mỹ); máy đo quang phổ Model 8425 A (Hewlett Packard); máy chụp ảnh (Pharmacia Biotech, Mỹ); máy soi ADN (Bio-Rad, Mỹ); cân phân tích (Metler, Thuỵ Sỹ); tủ sấy Ketong 101 (Trung Quốc), nồi khử trùng, dàn cây, bình nuôi cây; kính hiển vi điện tử soi nổi (Olympus SXZ ILLK 100, Japan); thiết bị chuyển màng; tủ nuôi cấy vi sinh vật và các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen, Viện công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Tách chiết ADN và kiểm tra cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

ADN tổng số được tách nhanh theo phương pháp của Gawel và cs

(1991) [27] Nghiền kỹ 1,2 g lá trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, thêm vào

1ml Bufer A (50 mM Tris-HCl pH8; 300 mM NaCl; 20 mM EDTA; 2% PVP; 0,1% Sodium Ascorbate; 1,5% Sarkosine; 1g/100 ml Bufer A) Giữ lạnh 2 phút rồi thêm 1ml Phenol: Chloroform, lắc kỹ Giữ trong đá 5 phút, ly tâm

4oC, 10000 vòng/phút trong 15 phút Chuyển phần dịch nổi sang ống khác có sẵn 1ml isopropanol, lắc nhẹ và giữ lạnh -20oC trong 30 phút Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, loại bỏ phần dịch nổi, rửa cồn và làm khô ADN

bằng máy Speed - vac, hoà tan trong TE Nồng độ và độ sạch của ADN được

xác định bằng điện di và phổ hấp phụ trên máy quoang phổ (Hewlett Parkard Mỹ) ADN được dùng làm mẫu để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng

kỹ thuật PCR Với gen cry1A(c), kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với chu trình

nhiệt: 95o C trong 3 phút, (95o C 1 phút, 55o C 1 phút, 72o C 1 phút) 30 chu

kỳ, 72o C 10 phút lưu giữ 4o C ; sử dụng cặp mồi có trình tự:

5'- AGGTGCTGGGTTCGTTCTCG-3' và

5'- CATTGTTGTTCTGTGGTGGGATTT- 3'

3.2.2 Phương pháp tạo plasmit tái tổ hợp mang gen cry1A(c)

Sản phẩm PCR của gen cry1A(c) được kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 0,9% Sau đó được làm sạch (thôi gel) theo bộ kit QIAquick Gel Extraction và gắn vào vectơ tách dòng pBT của Phòng Công nghệ tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học Các bước tiến hành như sau:

- Bổ sung 500 µl dung dịch QG, ly tâm 13.000 v/p 1 phút

- Thêm 750 µl dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

- Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1

phút để loại bỏ hết dung dịch PE

- Hoà tan ADN trong 30 – 50 µl nước cất hoặc dung dịch EB, đã được làm ấm đến 500C, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút + Gắn gen vào vectơ tách dòng pBT

Sản phẩm thôi gel được gắn vào vectơ tách dòng pBT

Hình 3.1 Vector pBT Bảng 3.1 Thành phần phản ứng gắn gen vào vectơ

T4 ligase

10 7,5

1 0,5

1

Tổng 20

Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ và sau đó được biến nạp

vào tế bào khả biến E coli DH5α

3.2.3 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E coli DH5α

+ Chuẩn bị tế bào khả biến: Tế bào E coli DH5α được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5

ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, qua đêm Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào

50 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, trong 2-3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 40C) Ly tâm 4000 v/p, ở 40C, trong 5 phút Thu cặn và hoà tan trong 30 ml CaCl2 0,1M,

để trong đá 15 phút, sau đó ly tâm 4000 v/p, ở 40C, trong 5 phút (lặp lại ba lần,

để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút) Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100 ml LB ban đầu Bổ sung 15-20% glycerol Chia 50 µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840C

+ Biến nạp: Bổ sung 20 µl vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ Hỗn hợp được đặt trong đá 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút và sau đó đặt vào đá 5 phút Bổ sung 300 µl môi trường LB lỏng, hỗn hợp được nuôi ở 370C, lắc 200 v/p trong 1 giờ Cấy trải 150-250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc bổ sung 100mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100 µM, ủ đĩa ở 37oC trong 16 giờ