Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đèn led đến hiệu quả nhân giống in vitro cây lan gấm (ludisia discolor (ker gawler) blume)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ NA NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐƠN SẮC ĐÈN LED ĐẾN HIỆU QUẢ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN GẤM Ludisia disc

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ NA

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐƠN SẮC

(ĐÈN LED) ĐẾN HIỆU QUẢ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN GẤM (Ludisia discolor (Ker GawLer) Blume)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng – Năm 2016

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ NA

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐƠN SẮC

ĐÈN LED ĐẾN HIỆU QUẢ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN GẤM (Ludisia discolor (Ker GawLer) Blume)

Ngành: Công nghệ sinh học

GVHD Th.S Đàm Minh Anh

Đà Nẵng – Năm 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết

quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc ai

công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Na

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Đàm Minh Anh

- Thầy giáo đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực

hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Sinh - Môi Trường,

trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã tận tình truyền đạt kiến thức

trong những năm tôi học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình,

bạn bè thân yêu đã luôn động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để

tôi có thể hoàn thành với kết quả tốt nhất

Xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Na

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về ánh sáng đơn sắc LED 3

1.1.1 Cấu tạo, nguyên tắc hoạt động và lịch sử phát triển của đèn LED 3

1.1.2 Ứng dụng của đèn LED trong sản xuất 5

1.2 Vai trò của nguồn chiếu sáng đến sự phát triển của cây giống in vitro 6

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng ánh sáng đèn LED trong nuôi cấy in vitro 7 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

1.4 Giới thiệu về lan gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume) 11

1.4.1 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố 11

1.4.2 Công dụng của cây lan gấm 11

1.4.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan gấm 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 14

2.3.2 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro cây lan gấm trong điều kiện ánh sáng đèn LED 16

2.3.3 Phương pháp tạo rễ in vitro cây lan gấm trong điều kiện ánh sáng đèn LED 16

2.3.4 Phương pháp đưa cây ra đất 17

2.3.5 Xử lý thống kê 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 18

3.1 Ảnh hưởng của ánh sáng khác nhau lên khả năng nhân nhanh chồi cây lan gấm in vitro 18

3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng khác nhau đến khả năng tạo rễ cây lan gấm in vitro 23

3.3 Ảnh hưởng của ánh sáng khác nhau đến chất lượng cây con tại vườn ươm 27

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 39

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

B-R : Blue -Red

BA : 6- benzyl adenime

Cs : Cộng sự HPS : High pressure siodium (đèn sodium cao áp) LED : Light Emitting diode (đèn đơn sắc)

MHL : Metal lalide light (đèn halogen kim loại)

MS : Murashige và skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid

FL : Fuorescent lamp (đèn huỳnh quang)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

3.1 Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến khả năng nhân

3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến khả năng tạo rễ

3.3 Ảnh hưởng của ánh sáng khác nhau đến khả năng phát

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

3.1 Ảnh hưởng của ánh sáng đến chiều cao và số chồi

3.3 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả nang tạo rễ cây

3.5 Quá trình thích nghi cây lan gấm in vitro ngoài

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Thực vật đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh từ hàng ngàn năm nay [37] Nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển, sử dụng chủ yếu các loài thảo dược truyền thống để bảo vệ sức khỏe [11], nhu cầu của toàn xã hội đối với thuốc thảo dược không những lớn mà ngày một tăng [59] Tuy nhiên, các loài cây thuốc trong tự nhiên đang bị suy giảm bởi sự khai thác quá mức, các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường,… dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng [68]

Cây lan gấm (Ludisia discolour (Ker Gawler) Blume) là loài lan quý

hiếm, có giá trị dược liệu và kinh tế cao Ở Việt Nam, loài lan này phân bố chủ yếu ở trong những khu rừng thứ sinh, trung du và miền núi của các tỉnh Quảng

Ninh, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Quảng Nam và các tỉnh Tây Nguyên [3]

Trong những năm gần đây việc khai thác sử dụng quá mức và do những bất lợi của điều kiện môi trường dẫn tới số lượng cây trong tự nhiên càng suy giảm

[12], [48] Chính vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật in vitro trong sản

xuất giống góp phần bảo tồn và phát triển loài lan quý trên đã được ứng dụng

và có những thành công bước đầu Tuy nhiên, sản phẩm cây giống khi đưa ra vườn ươm còn gặp hạn chế về phát sinh hình thái của lá và chiều dài đốt thân dẫn đến hiệu quả giai đoạn ra vườn còn thấp

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là một công cụ đắt lực trong việc nghiên cứu nhân giống các loài thực vật thông qua nhiều phương

thức nuôi cấy khác nhau với nhiều ưu điểm vượt trội như hệ số nhân giống

cao, cây giống có độ đồng đều, khỏe và sạch bệnh, sản phẩm cây giống có tỷ

lệ sống và sinh trưởng cao khi cho ra vườn ươm Chất lượng các cây giống

của thực vật nuôi cấy in vitro được điều hòa bởi các nhân tố môi trường như:

nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và nguồn carbon Trong đó, nguồn chiếu sáng là

một trong những yếu tố rất quan trọng đối với ngành công nghiệp vi nhân

giống nói chung và công nghệ nuôi cấy mô thực vật in vitro nói riêng Chất

lượng ánh sáng có những ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh lý của cây [54], [58]

Hiện nay, nguồn ánh sáng đang được sử dụng thông dụng trong nuôi cấy

in vitro là ánh sáng huỳnh quang, các loại đèn halogen kim loại, natri cao áp,

dây tóc cũng được sử dụng nhằm tăng cường độ ánh sáng, tuy nhiên những nguồn ánh sáng này có những bước sóng không cần thiết cho sự sinh trưởng của cây [36] Trong khi đó, đèn LED có nhiều ưu điểm hơn với kích thước nhỏ, độ bền cao, tuổi thọ lâu dài, nhiệt độ tỏa ra mát mẻ, vùng quang phổ có thể kiểm soát được, ít hao tốn điện năng [14], [15], [28] Với những ưu điểm trên, thì đèn LED đang được thay thế dần đèn huỳnh quang trong nguồn chiếu sáng như vi nhân giống [61]

Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc (đèn LED) đến hiệu quả

nhân giống in vitro cây lan gấm (Ludisia discolor (Ker GawLer) Blume)”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về ánh sáng đơn sắc LED

1.1.1 Cấu tạo, nguyên tắc hoạt động và lịch sử phát triển của đèn LED

Đèn LED (Light-Emitting diode) được cấu tạo từ hai khối bán dẫn Một

khối chứa các điện tử điện tích âm (n-type) và khối còn lại mang điện tích dương (p-type) Khối bán dẫn loại p chứa nhiều lỗ trống tự do mang điện tích dương nên khi ghép với khối bán dẫn n (chứa các điện tử tự do) thì các lỗ trống này có xu hướng chuyển động khuếch tán sang khối n Cùng lúc khối p lại nhận thêm các điện tử (điện tích âm) từ khối n chuyển sang Kết quả là khối p tích điện âm (thiếu hụt lỗ trống và dư thừa điện tử) trong khi khối n tích điện dương (thiếu hụt điện tử và dư thừa lỗ trống) Ở biên giới hai bên mặt tiếp giáp, một số điện tử bị lỗ trống thu hút và khi chúng tiến lại gần nhau, chúng có xu hướng kết hợp với nhau tạo thành các nguyên tử trung hòa Quá trình này có thể giải phóng năng lượng dưới dạng ánh sáng (hay các bức

xạ điện từ có bước sóng gần đó) Sự tích điện âm bên khối p và dương bên khối n hình thành một điện áp gọi là điện áp tiếp xúc Điện trường sinh ra bởi điện áp có hướng từ khối n đến khối p nên cản trở chuyển động khuếch tán và như vậy sau một thời gian kể từ lúc ghép 2 khối bán dẫn với nhau thì quá trình chuyển động khuếch tán chấm dứt và tồn tại điện áp tiếp xúc Lúc này điện áp tiếp xúc p - n ở trạng thái cân bằng Điện áp tiếp xúc ở trạng thái cân bằng khoảng 0,6 V đối với điốt làm bằng bán dẫn Si và khoảng 0,3 V đối với điốt làm bằng bán dẫn Ge [6]

Henry Josef Round là người báo cáo đầu tiên về đèn LED vào năm 1907 [53] Tuy nhiên, nghiên cứu của Round đã bị lãng quên trong nhiều thập kỷ cho đến khi chúng được cải tiến và ứng dụng lần đầu tiên bởi Nick Holonyak vào năm 1962 Loại đèn LED này đã được thương mại hóa trong những năm thập niên 60 của thế kỷ XX Công nghệ chế tạo đèn LED thật sự bùng nổ trong những năm thập niên 70 của thế kỷ XX Các xu thế hướng tới nhiều ứng

dụng thực tế (như máy tính, đồng hồ kỹ thuật số và các máy kiểm tra thiết bị) cũng bắt đầu phát triển Các kỹ thuật chế tạo vật liệu ngày càng được cải tiến, cường độ ánh sáng phát ra càng gia tăng và đèn LED được sử dụng cho mục đích thắp sáng Trong những năm 1980, một loại vật liệu mới ra đời, GaAlAs (gallium aluminum arsenide) đã được phát triển Công nghệ GaAlAs tạo đèn LED cung cấp hiệu suất cao hơn trước đây, điện năng yêu cầu rất thấp vì vậy

có thể tiết kiệm được lượng điện năng tiêu thụ Đèn LED có thể dùng cho các bảng hiệu hay thông báo vì dễ dàng thiết kế được mạch điện và ghép lại với các hình dạng bất kỳ từ chúng Ngoài ra, đèn LED đã được ứng dụng trong thiết kế mã vạch, máy quét, hệ thống cáp quang truyền dữ liệu và trang thiết

bị trong y tế Trong giai đoạn này, sự cải thiện chất liệu tinh thể bao bên ngoài cho phép đèn LED phát ra ánh sáng màu vàng, xanh lá cây, da cam…và thay đổi các thông số của khung dẫn để nâng cao độ sáng hiệu quả nhưng các cấu trúc cơ bản của vật liệu bán dẫn vẫn không thay đổi Diode laser phát ra ánh sáng trong vùng quang phổ nhìn thấy đã được thương mại hóa ở những năm cuối của thập kỷ 80 Các nhà thiết kế đã sử dụng kỹ thuật tương tự sản xuất đèn LED có độ bền và cường độ ánh sáng cao Tuy nhiên, trong thời gian này, đèn LED phát ra ánh sáng xanh dương vẫn chưa được tạo ra Mãi đến năm

1993, Shuji Nakamura thuộc công ty hóa chất Nichia Nhật Bản lần đầu tiên giới thiệu đèn LED phát ra ánh sáng xanh Với phát minh trên, ông cùng với hai nhà khoa học khác là Isamu Akasaki và Hiroshi Amano đã đoạt giải thường Nobel vật lý năm 2014 Công nghệ chế tạo đèn LED xanh dương gặp rất nhiều khó khăn trong nâng cao dòng photo phát ra và chúng tương đối nhạy cảm với mắt người

Khi so sánh tuổi thọ đèn sợi đốt (1.000 giờ), đèn huỳnh quang (8.000 giờ), đèn LED có tuổi thọ dài rất đáng kể lên đến 100.000 giờ Ngoài tuổi thọ dài, đèn LED còn có nhiều ưu điểm hơn các nguồn chiếu sáng thông thường như kích thước nhỏ, phát ra bước sóng cụ thể, phát nhiệt thấp, điều chỉnh

được cường độ ánh sáng và chất lượng chiếu sáng, tiêu thụ điện năng thấp… Với những lợi thế trên, đèn LED ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn trong nông nghiệp, hỗ trợ tăng trưởng thực vật trong môi trường có kiểm soát như phòng nuôi cấy mô và buồng sinh trưởng (Growth chamber) Sử dụng cấu trúc bán dẫn phát quang có thể tiết kiệm điện năng đến 11% và giảm lượng khí thải CO2 từ 261 – 348 triệu tấn vào năm 2020 [66]

Đèn LED có thể kiểm soát được bức xạ phát ra và khắc phục được hầu hết những nhược điểm của một nguồn sáng thông thường nên là nguồn sáng đầy hứa hẹn để thay thế những thiết bị chiếu sáng truyền thống hiện nay trong nuôi cấy thực vật Ngoài đặc tính phát ra vùng quang phổ hẹp, ưu điểm chính của việc sử dụng đèn LED là có thể chọn lựa bước sóng phát ra phù hợp với đỉnh hấp thu của các chất thụ quan Từ đó, có thể nghiên cứu được đáp ứng của thực vật với từng vùng quang phổ Ánh sáng xanh dương (440 nm) là đỉnh hấp thụ của crytochrome và carotenoid, vùng ánh sáng đỏ (640 nm) là đỉnh hấp thụ của phytochrome và chlorophyll Hơn nữa, nguồn sáng này có khả năng điều chỉnh được cường độ chiếu sáng, cùng với việc điều chỉnh nồng độ CO2, độ ẩm tương đối, nhiệt độ có thể tối ưu hóa sinh trưởng phát triển của cây trồng trong nhà kính cũng như trong nuôi cấy mô [49]

1.1.2 Ứng dụng của đèn LED trong sản xuất

Nuôi cấy mô là sự phát triển của các mô thực vật hoặc các tế bào trong một môi trường có kiểm soát (một môi trường sinh trưởng lý tưởng, nơi được

vô trùng với vi sinh vật và các chất ô nhiễm khác), được sử dụng rộng rãi trong khoa học thực vật và một số ứng dụng thương mại Môi trường được kiểm soát cho nuôi cấy mô tế bào thực vật thường không khí được lọc, nhiệt

độ ổn định, nguồn ánh sáng ổn định, và các môi trường nuôi cấy trở thành công thức (chẳng hạn như dung dịch nuôi cấy hoặc môi trường thạch) Vi nhân giống, một hình thức nuôi cấy mô thực vật, được sử dụng rộng rãi trong

lâm nghiệp và trồng hoa, nó cũng được sử dụng cho các loài cây quý hiếm hoặc có nguy cơ tuyệt chủng cần được bảo tồn

Nuôi cấy mô và các ngành công nghiệp nhân giống từ lâu đã được sử dụng nguồn ánh sáng nhân tạo cho sản xuất Những nguồn ánh sáng bao gồm: huỳnh quang (TFL), đèn sodium cao áp (HPS), kim loại bóng đèn halogen (MHL) và đèn sợi đốt v.v… Trong số đó, TFL đã được phổ biến nhất trong ngành công nghiệp phòng nuôi cấy mô Tuy nhiên, việc sử dụng của TFL tiêu thụ 65% tổng số điện trong một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, đó là chi phí cao nhất Kết quả là các ngành công nghiệp liên tục tìm kiếm các nguồn ánh sáng hiệu quả hơn Sự phát triển của LED độ sáng cao là một nguồn ánh sáng đầy hứa hẹn cho sự phát triển của thực vật trong môi trường được kiểm soát Trong những năm gần đây, với các kỹ thuật cải tiến của đèn LED, một

số lượng lớn các công bố thực hiện trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau

để chứng minh đèn LED sẽ trở thành nguồn chiếu sáng trong các phòng nuôi cấy mô Các công bố đều tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED đơn

lẻ hay kết hợp lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của cây trồng Sự gia tăng các chỉ tiêu sinh trưởng như khối lượng tươi, khối lượng khô được ghi nhận khi cây nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng LED xanh và LED đỏ kết hợp tốt hơn so với LED đơn lẻ [36], [39], [40], [50], [57] Khối lượng tươi và khô của cây bông vải cao nhất khi được nuôi cấy dưới điều kiện LED xanh và LED đỏ kết hợp với tỉ lệ 1:1 Kết quả tương tự được ghi nhận trên đối tượng cây Cúc trong nghiên cứu của Kim và đồng tác giả (2004) [36]

1.2 Vai trò của nguồn chiếu sáng đến sự phát triển của cây giống in vitro

Chất lượng ánh sáng (chất lượng quang phổ), số lượng (photon thông lượng) và thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng sâu sắc đến sự phát triển và phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy [25], [58] Ánh sáng là yếu tố quan trọng trong sự sinh trưởng của thực vật: ánh sáng tác động đến quá trình quang hợp, quang phát sinh hình thái (hiện tượng đóng mở khí khổng, ưu thế ngọn, ra

hoa…) và đáp ứng hướng sáng Sự đáp ứng này phụ thuộc vào cường độ ánh sáng, chất lượng ánh sáng (quang phổ ánh sáng, quang kì, hướng chiếu sáng)

và thời gian chiếu sáng [60] Việc nắm vững tác động của ánh sáng đến quá trình sinh lý thực vật có thể điều khiển được sự sinh trưởng và phát triển của

cây trồng trong nhà kính cũng như trong điều kiện in vitro Nhiều nghiên cứu

cho thấy ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hình thái cây nuôi cấy mô Trong giai đoạn tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần 1.000 lux Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần nhiều ánh sáng, cường độ ánh sáng cao từ 3.000 – 10.000 lux để kích thích cây chuyển

từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng [2]

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng ánh sáng đèn LED trong nuôi cấy in

vitro

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nhut và đồng tác giả (2003a) đã chứng minh được cây dâu tây in vitro

phát triển tốt nhất khi được nuôi cấy với nguồn chiếu sáng đèn LED (70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh) với cường độ chiếu sáng là 60 µmol/m2.s [45]

Nhut (2005) đã chứng minh được cây con Lan Ý được nuôi cấy trong hộp CP-RW (Culture Pack – Rockwool), sục khí CO2 (3.000 μmol.mol-1), có

hệ thống nuôi cấy sử dụng đèn LED và film thoáng khí thích hợp trong vi nhân giống cây Lan Ý và cho chất lượng cây tốt nhất [46]

Tanaka và đồng tác giả (1998) đã chứng minh được sự sinh trưởng của Cymbidium có thể được cải thiện sinh trưởng khi được nuôi cấy bằng phương pháp quang tự dưỡng không bổ sung đường dưới sự chiếu sáng của đèn LED ( ánh sáng LED đỏ và ánh sáng LED xanh kết hợp) [62] Wang và cộng sự (2001) đã chứng minh trong nuôi cấy lông rễ của cây Artemisia annua L cho thấy sinh khối lông rễ và hàm lượng artemisia dưới ánh sáng đỏ cao hơn 17% đến 67% so với dưới ánh sáng trắng [70] Linan và đồng tác giả (2002) đã

nghiên cứu về sự phát sinh hình thái và sự sinh trưởng của vẩy củ Lilium với nguồn chiếu sáng đèn LED đỏ, LED xanh và LED đỏ kết hợp với LED xanh [40] Gần đây, trong nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006) cũng cho thấy với nguồn chiếu sáng đèn LED cây nho tăng khả năng sinh trưởng và tổng hợp carbohydrate [31]

Trong năm 2012, Huiminli và cs cũng đã nghiên cứu về những tác động của nguồn ánh sáng khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và chất lượng của cây

cải Bắp Trung Quốc (Brassica campestris L.) Tác động của các nguồn ánh

sáng khác nhau (màu xanh, màu xanh kết hợp với màu đỏ, màu đỏ), đèn huỳnh quang, ánh sáng mặt trời, sự tăng trưởng và hàm lượng vitamin C, protein hòa tan, sucrose, đường, tinh bột và nồng độ sắc tố trong không gian của cây Bắp cải Cho ra kết quả khối lượng khô của chồi và khối lượng khô của rễ cao nhất trong cây con trồng dưới ánh sáng đèn LED màu đỏ với ánh sáng yếu Khối lượng tươi của rễ cô tinh bột cao nhất dưới đèn LED màu đỏ Hàm lượng chlorophyll và vitamin C cao nhất là dưới đèn LED màu xanh Đèn LED màu xanh cộng với màu đỏ hỗ trợ tăng trưởng sinh sản ở cây Bắp cải Trung Quốc, nguồn ánh sáng có thể được lựa chọn để đáp ứng các yêu cầu của giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật [33]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong năm 2014, Nguyễn Bá Nam và cs đã nghiên cứu trong đèn LED với sự phối trộn giữa hai LED xanh và LED đỏ với các tỉ lệ lần lượt: 100% LED đỏ; 90% LED đỏ kết hợp với 10% LED xanh; 80% LED đỏ kết hợp với 20% LED xanh; 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh; 60% LED đỏ kết hợp với 40% LED xanh; 50% LED đỏ kết hợp với 50% LED xanh được sử dụng để chiếu sáng bổ sung vào ban đêm nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng và phát triển của ba giống Cúc (Đóa vàng, Sapphire

và Kim cương) được trồng trong nhà kính Đèn compact 3U được sử dụng làm nghiệm thức đối chứng Kết quả cho thấy, tỉ lệ 70% LED đỏ kết hợp với

30% LED xanh phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Cúc giống Sapphire và Kim cương Trong khi đó, tỉ lệ 60% LED đỏ kết hợp với 40% LED xanh phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Cúc giống Đóa vàng Kết quả này có thể khẳng định, đèn LED thích hợp để thay thế đèn compact 3U trong việc chiếu sáng cây Cúc trồng trong nhà kính [5]

Nguyễn Thanh Phương và cs (2014) nghiên cứu về tác động của phổ ánh sáng trên các loại bình nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của giống cẩm chướng Hồng Hạc đã được tiến hành trong giai đoạn nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh Kết quả chỉ ra trong giai đoạn nhân nhanh, sử dụng bình trụ nút bông hoặc túi nilon thoáng khí để nuôi cấy cho chất lượng cây giống tốt nhất Đèn LED 13R-4B-3W cho cây sinh trưởng chiều cao tốt, tuy nhiên đèn LED 17R-3B lại có tác dụng kích thích cây tăng số lá, số chồi cao hơn và cho chất lượng cây giống tốt (nuôi cấy cây trong bình trụ nút bông đạt 21,53 lá/cây, số chồi là 5,67 chồi/cây Khi nuôi cấy trong túi nilon thoáng khí đạt 26,60 lá/cây và cho số chồi là 7,30 chồi/cây) Bên cạnh đó, đèn LED 17R-3B cũng cho chất lượng cây nhân giống tốt hơn ở các công thức đèn khác Trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, sử dụng bình trụ nút bông hoặc túi nilon thoáng khí để nuôi cấy kết hợp với sử dụng đèn LED 13R-4B-3W là tốt nhất (Chiều cao cây khi nuôi cấy trong bình trụ nút bông đạt 4,74 cm, nuôi cấy trong túi nilon thoáng khí là 5,13 cm Số lá/cây đạt 11,73 lá trong bình trụ nút bông và đạt 12,20 lá trong túi nilon thoáng khí) Ngoài ra, đèn LED 13R-4B-3W còn làm tăng chất lượng cây giống so với các loại đèn khác trên tất cả các loại bình nuôi [7]

Nguyễn Bá Nam và cs (2014) đã nghiên cứu về một hệ thống đèn LED mới được tạo ra, sự kết hợp giữa công nghệ chiếu sáng LED và truyền điện không dây được thực hiện và ứng dụng trong nghiên cứu sinh trưởng cây Dâu tây, qua đó, nó có thể tiết kiệm không gian nuôi cấy Hệ thống bao gồm hai bộ phận: (1) Mạch phát: Mạch biến đổi từ trường thành điện trường Nhiệm vụ

của mạch phát là biến đổi các tín hiệu điện áp đầu vào thành các tín hiệu ở các tần số mong muốn và bức xạ các tín hiệu này ra bên ngoài; (2) Mạch thu: Mạch thu từ trường và biến đổi thành điện năng tiêu thụ Mạch thu có nhiệm

vụ bắt được chính xác các từ trường đang được bức xạ bên ngoài, chuyển chúng lại thành năng lượng điện để đưa ra tiêu thụ Mạch thu gồm: Mạch cộng hưởng LC cộng hưởng tín hiệu phát và tải mạch là bảng mạch đèn LED được lắp đặt với 29 LED (20 LED đỏ : 9 LED xanh, tương ứng với tỉ lệ R:B ~ 7:3) Kết quả thí nghiệm cho thấy, cây Dâu tây sinh trưởng dưới hệ thống mới

có khả năng tăng trưởng tốt hơn với các chỉ tiêu khối lượng tươi (1,02 g), khối lượng khô (59,75 mg), chiều cao cây (6,67 cm), giá trị SPAD (48,05) so với đèn huỳnh quang và tương đương dưới các hệ thống chiếu sáng LED khác [4]

Năm 2014, Nguyễn Thanh Sang và cs cũng đã nghiên cứu về tác động của các điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự nhân chồi; sinh trưởng, phát

triển và tổng hợp chlorophyll a và b của cây cúc in vitro Các đốt thân và các

chồi đỉnh cúc được nuôi cấy dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau bao gồm LED đỏ, LED xanh, LED vàng, LED xanh lá cây, LED trắng và LED đỏ kết hợp với LED xanh theo nhiều tỷ lệ khác nhau (10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 và 90:10) Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường nhân chồi cho thấy chiều dài lá, chiều rộng lá, khối lượng tươi và khối lượng khô của chồi đạt tốt nhất ở 50% LED đỏ và 50% LED xanh Sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo cây cho thấy khối lượng tươi, khối lượng khô, chiều dài lá và chiều rộng lá của cây đạt tốt nhất ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh Bên cạnh đó, hàm lượng chlorophyll a và chlorophyll b của cây đạt cao nhất ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh Như vậy, kết quả từ nghiên cứu cho thấy khả năng nhân chồi tốt nhất là các đốt thân được nuôi cấy ở 50% LED đỏ và 50% LED xanh và sự hình thành cây tốt nhất là các chồi đỉnh nuôi cấy ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh [8]

1.4 Giới thiệu về lan gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume)

1.4.1 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố

Cây lan gấm thuộc: bộ lan (Orchidales) và họ lan (Orchidaceae), lớp thực vật một lá mầm Tên đồng nghĩa: Haemaria discolor (Ker Gawl.) Blume

[13]

Cây cao 10 - 25 cm, gốc thẳng, thân dài, hơi mọng nước, phần gốc bò tạo thành thân rễ, phần đỉnh đứng, ít lá, lá hầu như tập trung ở phần đỉnh thân, xếp xoắn, có bẹ ở gốc, cuộn [18], [51] Lá có màu đỏ nhạt ở phân rìa mép, càng về phía mép thì màu đỏ càng nhạt đi [18] Lá thường có màu xanh rất đậm hoặc nâu với các gân màu bạc, vàng hoặc hồng, thuôn dài, hình elip Cụm hoa ở đỉnh, chùm có ít đến nhiều hoa Hoa khá nhỏ, lộn ngược, nhuốm màu trắng với đỏ, cam, bao phấn màu vàng sáng, lá đài rời [18] Cánh môi không có cựa, không linh động, vặn một cách không đối xứng Khối phấn chia làm hai, mềm, có chuôi, có gót dính đầu nhụy không chia thùy rõ rệt [27], [51]

Cây lan gấm thường sinh sống ở khu vực ẩm ướt dọc theo các thung lũng trong rừng lá rộng thường xanh, trên vùng đất có nhiều mùn lá rụng, lớp đất

đá có phủ rêu [23] Thông thường, lan gấm sinh sống ở độ cao 200 – 1500 m [26], [27]

Lan gấm phân bố ở một số nước châu Á như Mianma, Trung Quốc, Thái Lan, Malaixia, Indonexia Tại Việt Nam, lan gấm phân bố chủ yếu tại một số địa phương như Lào Cai (Sa Pa), Vĩnh Phúc (Tam Đảo 3), Hà Tây (Ba Vì), Thừa Thiên – Huế (Bạch Mã), Đà Nẵng, Quảng Nam (Cù Lao Chàm), Khánh Hòa (Phú Hữu), Đăk Lắc, Lâm Đồng (Baika, Đà Lạt), Ninh Thuận (Cà Ná), Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu (Côn Đảo) [1]

1.4.2 Công dụng của cây lan gấm

Sản phẩm quan trọng của cây là lá, một loại dược liệu quý có nhiều công dụng như chữa lao phổi khạc ra máu, thúc đẩy tuần hoàn của hệ thần kinh,

chữa các vết thương bị cắn bởi côn trùng… [1], [22], [47], [67] Chiết xuất từ

lá thu được các hợp chất như asparagine, glutamine, histidine, serine và threonine Cây cũng được làm cảnh vì lá và hoa đẹp [1]

1.4.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan gấm

Lan gấm là một loài cây dược liệu quý có ý nghĩa về khoa học và giá trị kinh tế Hiện nay, nhu cầu khai thác cây lan gấm để phục vụ cho mục đích chữa bệnh và xuất khẩu ngày càng tăng, làm cho nguồn cây này ngoài tự nhiên ngày càng cạn kiệt Với hiện trạng như trên, cây lan gấm đã được một

số nhà nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật in vitro

Chou và Chang (1999) đã nghiên cứu sinh lý về sự nảy mầm và phát triển cây con của lan gấm Hạt giống 30 - 45 ngày sau khi được thụ phấn và các bao nang còn nguyên vẹn được sử dụng làm mẫu nuôi cấy Sự nảy mầm của hạt giống và phát triển của cây con đạt tỷ lệ cao hơn trong môi trường MS

và ½ MS có bổ sung 2 - 3 ppm BA Sự tăng trưởng của cây con tốt nhất trên môi trường Hyponex 1 Theo nhận định của nhóm tác giả cho rằng đối với sự nảy mầm và phát triển cây con loài lan gấm thì môi trường Hyponex 3 có thể thay thế môi trường MS có bổ sung 2 – 3 ppm BA để tạo cây con hoàn chỉnh khỏe mạnh [19]

Nghiên cứu khác của Chou và cs (2001) về sự nảy mầm của hạt và sử dụng các loài nấm rễ cộng sinh trên lan gấm Trên môi trường MS bổ sung 20

và 30 g/l saccharose tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 34% Tuy nhiên, trên môi trường Hyponex 1 và Hyponex 3 tỷ lệ nảy mầm là 60 - 63% sau 60 ngày nuôi cấy Sinh trưởng của lan gấm trong nhà kính là tốt nhất tại nhiệt độ 30/25o

C Sử dụng kính hiển vi thông thường và điện tử quan sát thấy vỏ rễ lan gấm bị nhiễm các loại nấm rễ cộng sinh trên phong lan (OMF) và mang cấu trúc rễ lan điển hình của tolypophagy với hệ sợi nấm non và già hình cuộn Trong

bảy loài Rhizoctonia phân lập được thì chỉ có R.01 và R.02 thúc đẩy sự nảy

mầm của hạt, nhưng tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt tương ứng là 5% và 37% Theo

nhận định của các tác giả, hạt của lan gấm nên được nảy mầm cộng sinh trên môi trường Hyponex 3 có bổ sung thêm 20 g/l saccharose và thể chồi hay cây con nhỏ nên được nuôi cấy trên môi trường OMA có sự cộng sinh với R.01 và R.02 [20]

Năm 2004, Chou và cs tiếp tục nghiên khả năng nảy mầm của hạt khi lai

hai loài lan quý Anoetochilus formosanus (A) và Haemaria discolor (H) với

nhau Hai loài lan dược liệu này có thời gian ra hoa khác nhau đã được cảm ứng cho nở hoa cùng lúc bằng biện pháp điều khiển nhiệt độ và thời gian chiếu sáng trong nhà kính Tiến hành thụ phấn hai loài này sau đó thu hạt lai

F1 và đặt tên là HA (H discolor × A formosanus) và AH (A formosanus ×

H discolor) Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sau 50 ngày nuôi cấy hạt

không cộng sinh trên môi trường cho tỷ lệ nảy mầm của toàn bộ 4 loại (A, H,

HA, HA) cao hơn 70% Đối với hạt nảy mầm không cộng sinh trên môi

trường chỉ có MS + agar thì chỉ có chủng R02 phân lập từ Rhizoctonia (một

chi nấm sống cộng sinh với lan) là có sự nảy mầm cao hơn 80% [21]

Shiau và cs (2005) đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan gấm thông

qua sử dụng hạt Hạt được chứa trong các bao vỏ quả nang ở các độ tuổi khác nhau, sau khi khử trùng và được cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung 3% saccharose; 0,85% agar Sau khi hạt được nảy mầm, cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0,2% AC; 8 % bột chuối; 0,1 mg dm-3

TDZ; 1,0 mg

dm-3 NAA để tạo chồi và ra rễ cho cây Sau 4 tháng, chuyển sang trồng với giá thể dớn: vermiculite: đá trân châu, 96% cây con sống sót sau khi được chăm sóc ngoài nhà lưới [71]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguồn mẫu sử dụng trong nghiên cứu này là cây lan gấm

Nguyên liệu khi dùng là chồi của cây lan gấm (Ludisia discolour (Ker Gawler) Blume) nuôi cấy in vitro tại phòng Công nghệ sinh học, Khoa Sinh -

Môi Trường, trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng

Hình 2.1. Cây lan gấm

2.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát sự ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc (đèn LED) khác nhau trong

giai đoạn nhân nhanh chồi

Khảo sát sự ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc (đèn LED) khác nhau trong quá trình ra rễ của cây lan gấm

Đánh giá về chất lượng của cây giống trong giai đoạn vườn ươm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

Môi trường sử dụng trong thí nghiệm nhân nhanh chồi là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 3,0 mg/l BA (6-benzyl adenine), 0,4 mg/l NAA (α-naphthalen acetic acid), 30 /l sucrose, 9 g/l agar, 0,5 g/l than

hoạt tính Môi trường sử dụng trong thí nghiệm tạo rễ cây in vitro là môi

trường MS có bổ sung 0,1 NAA, 30 g/l sucrose, 9 g/l agar, 0,5 g/l than hoạt tính Tất cả các môi trường đều điều chỉnh về pH = 5,8 trước khi đi hấp khử trùng ở 121oC, độ ẩm trung bình khoảng 50 - 65% [9]

Các mẫu cấy được nuôi cấy trong bình thủy tinh loại 250ml với 40ml môi trường trong mỗi bình Mỗi nghiệm thức được cấy với 30 bình môi trường

Điều kiện nuôi cấy: các mẫu được nuôi cấy dưới ánh sáng huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 12giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, nhiệt độ

25 ± 2oC, độ ẩm trung bình khoảng 70 - 80%; các mẫu được nuôi cấy dưới ánh sáng đơn sắc và ánh sáng huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày [9]

Các thí nghiệm về ánh sáng được thiết lập thành 8 công thức như sau:

FL : Ánh sáng huỳnh quang (đối chứng);

100R : 100% ánh sáng LED đỏ;

90R:10B : 90% ánh sáng LED đỏ và 10% ánh sáng LED xanh;

80R:20B : 80% ánh sáng LED đỏ và 20% ánh sáng LED xanh;

70R:30B : 70% ánh sáng LED đỏ và 30% ánh sáng LED xanh;

60R:40B : 60% ánh sáng LED đỏ và 40% ánh sáng LED xanh;

50R:50B : 50% ánh sáng LED đỏ và 50% ánh sáng LED xanh;

100B : 100% ánh sáng LED xanh

Hình 2.2 Tủ nuôi cây có hệ thống đèn LED

2.3.2 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro cây lan gấm trong điều kiện ánh sáng đèn LED

Các đoạn thân có mắt lá dài khoảng 1cm được nuôi cấy trong môi trường nhân nhanh chồi Sau đó các bình nuôi cấy được nuôi cấy dưới 8 điều kiện chiếu sáng khác nhau trong 8 tuần Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra loại

ánh sáng thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi cây lan gấm in vitro

Các chỉ tiêu cần theo dõi: số chồi, chiều cao chồi, đặc điểm chồi sau 8 tuần nuôi cấy

2.3.3 Phương pháp tạo rễ in vitro cây lan gấm trong điều kiện ánh sáng đèn LED

Các chồi cây lan gấm thu được ở thí nghiệm 1 được cắt thành các chồi cao 2cm và cấy lên môi trường tạo rễ Sau đó, các bình nuôi cấy được nuôi cấy dưới 8 điều kiện chiếu sáng khác nhau trong 8 tuần Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra loại ánh sáng thích hợp cho quá trình tạo rễ cây lan gấm

in vitro

Các chỉ tiêu cần theo dõi: số rễ/chồi, chiều dài rễ sau 8 tuần nuôi cấy