Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển của nấm vân chi (trametes versicolor) nuôi cấy trong môi trường dịch thể

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG _____________________ NGUYỄN THỊ THU TRANG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM VÂN CHI TRAME

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG _

NGUYỄN THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM VÂN CHI

(TRAMETES VERSICOLOR) NUÔI CẤY

TRONG MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG _

NGUYỄN THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM VÂN CHI

(TRAMETES VERSICOLOR) NUÔI CẤY

TRONG MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : ThS NGUYỄN THỊ BÍCH HẰNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả

trình bày trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thu Trang

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Bích Hằng - Cô giáo

đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận tốt

nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Sinh - Môi Trường, trường

Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những

năm tôi học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình, bạn

bè thân yêu đã luôn động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể

hoàn thành với kết quả tốt nhất

Xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thu Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về nấm vân chi và hệ sợi nấm vân chi 3

1.1.1 Giới thiệu về nấm vân chi: tên gọi và vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của nấm vân chi 4

1.1.3 Đặc tính sinh học của nấm vân chi 5

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm vân chi 5

1.2 Giá trị dược tính của nấm vân chi cũng như hệ sợi nấm 6

1.2.1 Tính chất dược học 6

1.2.2 Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi 7

1.2.3 Các giá trị khác của vân chi 12

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm vân chi 12

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất trên thế giới 12

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm ở Việt Nam 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi 21

2.2.2 Phương pháp tạo sinh khối nấm vân chi trong môi trường dịch thể 21

2.2.3 Định tính các dược chất có trong hệ sợi và quả thể nấm 22

2.2.4 Phương pháp định lượng polysaccharides (GLPs) 24

2.2.5 Kiểm tra khả năng thủy phân CMC (cacborn methyl cellulose) của nấm vân chi 24

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tơ nấm và quả thể vân chi 24

2.2.7 Xác định khả năng kháng oxi hóa của nấm linh chi 25

2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Quan sát hình thái quả thể 26

3.1.1 Hình thái cấu tạo quả thể 26

3.1.2 Hệ sợi nấm vân chi 26

3.2 Ảnh hưởng của môi trường lên sự tăng trưởng sinh khối của sợi nấm vân chi 27 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến sự sinh trưởng của sợi nấm vân chi 29

3.4 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng của sợi nấm vân chi 30

3.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự sinh trưởng của sợi nấm vân chi 31

3.6 Định tính các dược chất có trong hệ sợi nấm và trong quả thể nấm 33

3.6.1 Định tính alkaloid 33

3.6.2 Định tính saponin 33

3.6.3 Định tính acid hữu cơ 35

3.7 Kết quả định lượng polysaccharide 36

3.8 Kết quả kiểm tra khả năng thủy phân CMC của sợi nấm vân chi 37

3.9 Kết quả khả năng kháng oxy hóa của nấm vân chi 38

3.10 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nấm vân chi 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của môi trường lên sự tăng trưởng sinh khối

của sợi nấm vân chi

3.4 Tóm tắt kết quả khảo sát các hợp chất tồn tại trong quả

thể và hệ sợi nấm vân chi bằng phương pháp hóa sinh

38

3.6 Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết quả thể nấm vân

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.3 Nấm vân chi trong các môi trường khác nhau qua 10

3.4 Lượng sinh khối nấm thu nhận trên môi trường PG cải

3.5 Sinh khối nấm thu nhận trên môi trường PG cải tiến ở

các điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc 140 vòng/phút 35

3.10 Kiểm tra khả năng thủy phân CMC của sợi nấm vân chi 39

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Những năm gần đây, ngoài giá trị dinh dưỡng đã được biết đến từ rất lâu, nấm còn được đề cập đến như một nguồn dược liệu quý giá có khả năng chữa trị được

nhiều bệnh như nấm linh chi (Ganoderma lucidium), nấm hầu thủ (Hericium

enrinaceum) Khoa học phát triển, dược tính của nấm ngày càng được phát hiện

nhiều Nó có khả năng chữa trị các bệnh về tim mạch, ung thư, nâng cao sức đề kháng của cơ thể…

Nấm vân chi (Trametes versicolor (L.) Pilát) là một trong những loại nấm

dược liệu có giá trị rất cao, đã và đang được người tiêu dùng ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, các nước châu Âu, châu Mỹ… ưa chuộng Trong nấm vân chi có chứa các hợp chất polysaccharide liên kết với protein, gồm hai loại chính: PSP (polysaccharide peptide) và PSP (polysaccharide krestin) PSP và PSK có tác dụng

ức chế nhiều loại tế bào ung thư như các tế bào ung thư biểu mô (carcinoma), các tế bào ung thư máu (leukemia) Ở Nhật Bản, PSP chiết xuất từ nấm vân chi đã được chứng minh có khả năng kéo dài thời gian sống thêm 5 năm hoặc hơn cho các bệnh nhân ung thư thuộc nhiều thể loại: ung thư dạ dày, ung thư đại tràng, ung thư vòm họng, ung thư phổi và ung thư vú Trong Y học cổ truyền Trung Quốc, nấm vân chi được sử dụng để làm giảm trầm cảm, giảm đờm, chữa lành rối loạn phổi, tăng cường vóc dáng và năng lượng, có ích với các bệnh mãn tính

Nấm vân chi có giá trị và hoạt tính dược lý cao, do vậy các nhà nghiên cứu không ngừng tìm hiểu và nghiên cứu về nó Theo nhiều kết quả nghiên cứu thì nấm vân chi thường dùng làm thực phẩm ở dạng quả thể, nhưng hệ sợi cũng chứa đầy đủ

về số lượng và chất lượng các hoạt tính sinh học, dinh dưỡng và hương vị như quả thể [51], [55] Năm 2009, Lê Xuân Thám và cộng sự tiến hành nghiên cứu sự tích tụ Selenium trong sinh khối hệ sợi lên men của nấm vân chi Kết quả thu được cho thấy trên môi trường có Selenium bổ sung, mức tích tụ đạt tới 600 – 1500ppm Sự tích tụ này có quan hệ với nghiên cứu về cấu trúc các phức hợp polysaccharide và protein có hoạt tính sinh học cao [11] Năm 2015, Nguyễn Thị Ngần cùng cộng sự

đã phân lập thành công hai hợp chất oospolacton và oospoglycol thuộc loại

isocoumarin trong quả thể nấm vân chi Hai hợp chất này có nhiều ứng dụng trong y học, oospolacton có khả năng kháng khuẩn chủng gram (+), kháng nấm, kháng ung thư và oospoglycol ngoài kháng khuẩn như oospolacton còn có khả năng làm giảm đau cơ bắp [6] Việc nuôi cấy hệ sợi nấm lớn trên giá thể rắn là kỹ thuật phổ biến trong trồng nấm lấy quả thể Mặt khác hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy trong môi trường dịch thể như đã rất phổ biến đối với các loại nấm mốc và vi khuẩn Nuôi cấy lấy hệ sợi nấm rút ngắn thời gian, độ thuần cao, chất lượng tốt, giảm tỷ lệ nhiễm, không đòi hỏi khắt khe về điều kiện nhiệt độ như nuôi trồng quả thể nên thích hợp cho sản xuất và nuôi trồng giống nấm theo qui mô công nghiệp

Xuất phát từ cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng

của một số yếu tố đến sự phát triển của nấm vân chi (Trametes versicolor) nuôi cấy trong môi trường dịch thể” nhằm xác định các điều kiện nuôi cấy cho sự tăng

trưởng sinh khối sợi nấm tối ưu của nấm vân chi trong môi trường dịch thể

2 Mục tiêu của đề tài

Thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của sinh khối nấm vân chi trong môi trường dịch thể, đồng thời thử nghiệm và đánh giá một số hợp chất sinh học trong hệ sợi

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

đáp ứng nhu cầu của con người

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về nấm vân chi và hệ sợi nấm vân chi

1.1.1 Giới thiệu về nấm vân chi: tên gọi và vị trí phân loại

Vân chi có nhiều tên gọi rất khác nhau Tên tiếng Anh là Turkey tail (đuôi gà tây) Ở Trung Quốc, người ta gọi là “Yunzhi” có nghĩa là loại nấm có hình dạng như mây Người Nhật thì gọi là “Karawatake” do người ta hay tìm thấy chúng ở

những nơi gần bờ sông [16]

Vân chi có tên khoa học phổ biến hiện nay là Trametes versicolor sau một thời gian dài được nghiên cứu và đặt tên khác nhau Trametes versicolor (L.:Fr) Pilát, tức là loài Coriolus versicolori (L.:fr) Quesl, được chính Carl von Linnaeus tìm ra

và đặt tên đầu tiên: Boletus versicoler L (1753)

Sau đó Christiaan Hendrik Persoon (1805) lại xác định với tên Boletus

vulutinus Pers., và Elias Magnus Fries (1821) đưa vào chi Polyporus (với hai loài:

P versicoler Fr và P Vulutinus Fr) Lucien Quesslet (1886) lại đưa vào Coriolus

Sau 50 năm, Abert Pilát (1936) đề nghị và được đa số các nhà nấm học thống nhất xếp vào chi Trametes, họ polyporacea Các hệ thống phân loại về sau cũng phù hợp với quan điểm trên, nên hầu hết những tác giả gần đây đều sử dụng danh phát đã

chỉnh lý: Trametes versiclor [12]

Vân chi là một loài nấm lớn thuộc phân lớp Basidiomycetes gồm 22 000 loài

đã biết Nấm vân chi gây hoại sinh cây bệnh, cư trú trên gỗ đã chết, thuộc loại nấm gây mục trắng mạnh nhất, có thể phá hủy đồng thời tất cả các cấu tử gỗ (hemicellulose, cellulose, lignin), giúp phá vỡ các gốc cây già, cây chết, vì thế chất dinh dưỡng của cây sẽ trở về đất để tái sử dụng [16]

Vị trí phân loại nấm vân chi [5], [9], [14]

Bộ nấm lỗ : Aphyllophorales

Họ nấm nhiều lỗ : Polyporaceae

Chi : Trametes

Loài : Tramestes versicolor

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của nấm vân chi

Vân chi là loại nấm hàng năm, trưởng thành dạng quả giá, chất da, hóa gỗ, không cuống Mặt trên tán phủ lông dày, mịn, rất dễ biến đổi về mặt màu sắc Đảm quả khi non dạng u lồi tròn, sau phân hóa thành dạng bán cầu, khi già đảm quả có dạng thận, dạng quạt, thót dần lại ở phần gốc hay cũng có khi trải sát giá thể hay trải cuộn lại thành dạng vành với mép tán màu trắng – trắng kem [11] Nấm thường mọc thành tán dạng ngói lợp Mặt tán dễ thay đổi về màu sắc, đặc trưng bởi những vòng đồng tâm với màu sắc khác nhau, màu sắc từ trắng đến vàng nhạt, nâu nhạt, nâu rỉ

có sắc thái xanh đến đen

Kích thước thay đổi với đường kính tán trung bình cỡ 2 – 7 cm, dày cỡ 2,5 – 4

mm Thịt nấm mỏng, màu kem – hơi vàng, dày 0,6 – 2,5 mm, trên lát cắt hiển vi thấy rõ lớp sắc tố đen xanh đặc trưng bên dưới lớp lông [15] Tiếp xuống dưới là lớp bào tầng gồm các ống nấm dày cỡ 0,6 – 1,8 mm, miệng ống tròn, xẻ răng cưa, đôi khi có dạng nhiều gốc, có các gờ nổi gân, có 3 – 7 ống/mm, bề mặt phủ lông tơ rất mịn với đảm và bào tử dày đặc, màu trắng hơi vàng [41] Hệ sợi trimitic, sợi dinh dưỡng trong suốt, vách mỏng có khóa rõ ràng, đường kính cỡ 2,5 – 3,5 µm; sợi cứng ở vùng thịt nấm có vách rất dày, không thấy có vách ngăn tế bào, đường kính tới 6 – 12 µm, rất hiếm khi thấy phân nhánh, sợi bện cũng có vách dày, phân nhánh

rõ rệt, không thấy có vách ngăn ngang, đường kính nhỏ hơn 5,5 – 5,5 µm, không thấy có liệt bào, song thấy có cystidioles dạng fusoid, kích thước 20 x 5 µm, có khóa ở phần gốc Đảm bào hình chùy, có 4 tiểu bính (nơi đính của 4 bào tử), có khóa ở phần gốc Bào tử đảm hình trụ, hơi cong hình quả dưa gang, trong suốt, nhẵn, kích thước 5,5 x 2,5 µm [2] Đây còn là loài nấm gây mục trắng mạnh, mọc trên gỗ mục thành từng đám lớn, phân bố khắp thế giới, phân bố chi tiết mới được nghiên cứu ở một số vùng, chẳng hạn ở Châu Âu Ở Việt Nam cũng tìm thấy nấm này, nhất là vào mùa mưa Nhật, Trung Quốc và một vài nước khác đang trồng và

chiết xuất PSP, PSK từ nấm vân chi Ở Việt Nam, TS Lê Xuân Thám (Trung tâm kỹ thuật hạt nhân TP HCM) đã mang một giống chuẩn từ Nhật về, đây là loại mọc trên tai nấm có những vân đồng tâm nâu đen đến đen Hiện nay, giống này đang trồng thử trên Đà Lạt và cũng được Trung tâm nghiên cứu linh chi và nấm dược liệu TP HCM trồng thử nghiệm trong điều kiện khí hậu của thành phố, đã ra quả thể (tai nấm) tại TP HCM

1.1.3 Đặc tính sinh học của nấm vân chi

Chu trình sống của nấm vân chi: Đảm bào tử nảy mầm cho hệ sợi sơ cấp Hai sợi sơ cấp khác phối hợp cho hệ sợi thứ cấp Hệ sợi thứ cấp phát triển thành mạng

hệ sợi Trong điều kiện thuận lợi mạng hệ sợi sẽ kết hạch tạo tiền quả thể (nụ nấm)

Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm trưởng thành, các phiến dưới mũ mang các đảm vào sinh ra bào tử Đảm bào tử được phóng thích và chu trình lại tiếp tục [3], [9], [10]

Giai đoạn phát triển của hệ sợi nấm: Chu trình sống của nấm bắt đầu từ bào tử đảm nảy mầm cho hệ sợi nấm, sợi nấm lúc đầu nhỏ có đường kính khoảng 1,5–1,0

mm, về sau lớn dần lên đến kích thước đường kính 1,0 – 2,0 mm Sau quá trình tiếp hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp đơn nhân sẽ hình thành nên các sợi nấm thứ cấp song nhân Các sợi nấm tăng trưởng theo kiểu tạo ra các móc (clamp) và để lại dấu vết giữa các tế bào Khi gặp điều kiện bất lợi các sợi nấm song nhân có thể tạo ra các bào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúp sợi nấm sống sót qua các trường hợp bất lợi Bào tử màng dày, khi điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm tạo ra những sợi nấm mới Khi sợi nấm thứ cấp đã phát triển dày đặc trên cơ chất sẽ bắt đầu quá trình phân hóa để tạo ra quả thể Trước khi ra quả thể thì hệ sợi nấm phát triển sinh khối đến mức tối đa chuẩn bị cho quá trình ra quả thể Nhưng điều đặc biệt là trong hệ sợi nấm có đầy đủ về lượng cũng như về chất giống như quả thể, nó có thể phòng và chữa bệnh cho người, được sử dụng như một món ăn hay một chế phẩm sinh học [17] Trong giai đoạn phát triển hệ sợi, nấm cần các nguồn dinh dưỡng môi trường đảm bảo các nguồn cung cấp về C, N và khoáng [2]

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm vân chi

Nấm vân chi ngoài sử dụng trực tiếp nguồn cacbon chủ yếu trong các loại

đường glucose, saccharose, maltose, tinh bột, pectin,… để tổng hợp năng lượng và hình thành các hợp chất quan trọng thì còn cần bổ sung thêm nitơ Đạm thích hợp cho nấm chủ yếu ở dạng hữu cơ như: pepton, protein, acid amin, ngoài ra có thể hấp thụ ure, muối amon, sulphate amon Nitơ không được quá nhiều làm cho sợi nấm mọc nhiều khó hình thành thể quả Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1 Giai đoạn hình thành thể quả, tỉ lệ là 30/1 hoặc 40/1

Nhu cầu dinh dưỡng khoáng của nấm gồm các nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg,

K Nguồn vi lượng đó chỉ thêm trong quá tình nuôi cấy giống mẹ, còn khi trồng thì chúng có trong nước và nông sản phẩm Để sợi nấm phát triển tốt nhất cần bổ sung thêm vitamin B1 với lượng 100µg/l Giá trị pH thích hợp cho sợi nấm phát triển trong môi trường lỏng là 6-7 Ở pH = 8, nấm mọc rất chậm

Các thông số môi trường cơ bản cho sự phát triển của nấm vân chi:

- Nhiệt độ sợi nấm phát triển tốt nhất: 30 ± 10C

- Độ ẩm cơ chất: 65 – 70%

- Độ ẩm không khí: ≥80%

- Độ pH acid yếu

- Độ thông thoáng trung bình

1.2 Giá trị dƣợc tính của nấm vân chi cũng nhƣ hệ sợi nấm

1.2.1 Tính chất dược học

Đã có hơn 400 nghiên cứu về thành phần hoá học, dược lý lâm sàng nấm vân chi công bố khắp thế giới Trong cuốn “Dược vật học” đời nhà Minh (Trung Quốc) ghi lại rằng: “Nấm vân chi đen và lục bồi bổ khí huyết, tăng năng lượng cuộc sống,

có tác dụng làm vững gân cốt Nếu dùng vân chi trong một thời gian dài sẽ làm cho con người cảm thấy khoẻ mạnh, yêu đời, sôi nổi và sống lâu hơn” Vân chi được dùng dưới dạng trà có tác dụng hạ thấp lượng cholesterrol máu, áp suất máu, chống chứng rối loạn nhịp tim, điều khiển nồng độ đường trong máu [2]

Ở châu Á, nấm được dùng chung với các thành phần thảo mộc khác để chữa trị ung thư Các báo cáo từ những năm 1960 đã cho thấy lợi ích về sức khỏe trong điều trị ung thư dạ dày khi uống trà “Saruno-koshikake” có chứa nấm vân chi Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm này có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng

khối u [42] Ngày nay, vân chi được sử dụng như một loại dược liệu trong hỗ trợ điều trị ung thư Các biệt dược bào chế từ loài nấm này đứng đầu trong 10 loại thuốc chống ung thư được tiêu thụ mạnh nhất hiện nay tại thị trường Nhật Bản, với doanh số năm 1991 đạt tới 358 triệu USD, vượt xa cả Tamoxifen, Interferon, Cis- Platin

Ở Nhật, năm 1987, PSK-chất trích từ vân chi chiếm 1/4 thị phần dược phẩm trị ung thư (Fukushima, 1989) Ở Trung Quốc, vân chi được sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư và cũng được dùng để trị bệnh viêm gan mãn tính, viêm nhiễm đường hô hấp, viêm cơ quan bài tiết và cơ quan tiêu hoá [59] Ngoài ra trong các bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc, vân chi được dùng để tăng cường hiệu quả cho hệ miễn dịch, loại bỏ độc tố cơ thể, giảm đờm, tăng năng lượng và làm tinh thần sảng khoái, kéo dài tuổi thọ, hạ nhiệt do vân chi có tính hàn, vị ngọt Trong điều trị ung thư, khi sử dụng kết hợp PSP, PSK (hợp chất trích từ nấm) với hoá trị hay xạ trị sẽ làm tăng tỉ lệ sống còn của bệnh nhân ung thư và làm giảm các triệu chứng do hoá trị hay xạ trị gây ra Các hợp chất trích từ vân chi rất an toàn khi sử dụng, không có phản ứng phụ, không độc [8]

Một số biệt dược của nấm vân chi: Vân chi, Lục bảo Vân chi, (PSK) VPS – Coriolus versicolor, Coriolus-VPS®, PSK®, Yunzhi Polysaccharide peptide (Trade mark Qing Kang), PSP polysaccharide-peptide (Landford)

1.2.2 Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi

Vào khoảng năm 1965, ở Nhật, một kỹ sư hoá học đã khám phá ra thành phần trị ung thư của nấm vân chi sau khi ông quan sát thấy người hàng xóm mắc bệnh ung thư hiểm nghèo đã được chữa khỏi sau khi sử dụng vân chi Điều này đã dẫn đến sự khám phá ra PSK (polysaccharide Kureha) Sau đó, hợp chất PSP (polysaccharide peptide) - chất có cấu tạo gần giống PSK cũng đã được phân lập lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 1983 Các chất này đều được xem là những chất kích thích hệ miễn dịch và có hoạt tính kháng ung thư, thúc đẩy quá trình sản xuất tế bào miễn dịch, giảm nhẹ các triệu chứng do hoá trị, xạ trị, giảm đau, chống viêm nhiễm [49]

Dịch trích polysaccharide peptide từ nấm (thuật ngữ gọi là proteoglycan) là

những chuỗi polypeptide hay những phân tử protein nhỏ gắn kết chặt với các chuỗi polysaccharide β-D-glucan, là thành phần hiệu quả trong chữa trị các chứng ung thư: dạ dày, thực quản, ruột kết và ung thư ngực… Polysaccharide được tìm thấy trong các vách tế bào không tiêu hoá được của vân chi có cấu trúc 3 chiều với các chuỗi bên (chuỗi đường mạch thẳng) mọc nhánh xung quanh cấu trúc trục chính (lõi protein hay polypeptide), các chuỗi bên có chức năng sinh học hay hoạt tính miễn dịch cho phép sự tương tác giữa các chuỗi nhánh bên với các thụ thể trên các tế bào miễn dịch khác nhau Thụ thể cho β-glucan được tìm thấy trên nhiều tế bào khác nhau: Tế bào tự sát thương (NK), tế bào bạch cầu trung tính, tế bào bạch cầu đơn nhân to, đại thực bào và tế bào lympho B, lympho T Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng β-1,3-glucan là chất kích hoạt hệ miễn dịch chống ung thư tự nhiên ở người và phần glucan có thể kích ứng sự co lại của khối u [42] Theo các nhà khoa học thì chỉ

có polysaccharide nối với peptide mới tạo ra hiệu quả kháng ung thư Các thành phần này không bị ảnh hưởng bởi quá trình tiêu hoá nên có hiệu quả khi uống

- Thành phần các yếu tố có trong dịch trích: Carbon: 40,5%; Hydrogen: 60,2%; Nitrogen: 5,2%; Oxygen: 47,5%

- Thành phần hoá học dịch trích: Hydrate carbon: 42 – 43 % (91 – 93 % chuỗi beta - glucan chứa các polymer có glucose); Protein: 28 – 35 %; Khoáng: 6 – 7 %; Ẩm độ:

7 – 7,6 %, phần còn lại là đường tự do và aminoacid

Hoạt chất cơ bản chính là polysaccharides liên kết protein có hoạt tính chống

sự sinh sản của HIV và đặc biệt có hoạt tính chống khối u ác tính Tháng 5-1987, hoạt chất PSK được bán ra thị trường với tên thương mại là Krestin sản xuất chủ yếu từ sản phẩm lên men hệ sợi nấm bởi công ty Sonkyo (Nhật Bản) Các phân đoạn polysaccharides tinh chế chủ yếu từ phức β-glucan-protein với đầu nối β-1,6; β-1,3 và β-1,4 có trọng lượng phân tử khoảng 100.000 Da, được đựng trong các gói nhỏ, mỗi gói chứa 1g hoạt chất Giá bán mỗi gói là 1000 yên Nhật (khoảng 10 USD) dùng để uống, điều trị ung thư phổi, ngực và các bệnh về đường tiêu hóa

1.2.2.1 Hiệu quả của PSP chiết tách từ nấm vân chi

Các nghiên cứu về dược lý đã chứng minh rằng PSP ảnh hưởng mạnh mẽ đến sức khỏe và năng lượng, được xem là loại chất cảm ứng điều hoà sinh học mới PSP

không gây hại đối với các tế bào bình thường, có khả năng phân biệt giữa tế bào thường và tế bào ung thư và tiêu diệt chúng mà không gây bất cứ sự thay đổi hay tạo độc tố trên tế bào (Mei-po Yang, Hong Kong University) Tỉ lệ phần trăm bệnh nhân trải qua thử nghiệm hiệu quả của PSP trong các giai đoạn II và III cho thấy tỉ

lệ sống còn gia tăng đáng kể so với nhóm đối chứng: 90 – 97 % đối với ung thư dạ dày, 82 – 87 % đối với ung thư thực quản, 70 – 86 % đối với ung thư phổi PSP là

chất đầy tiềm năng và hiệu quả trong điều trị ung thư [44]

- PSP gia tăng chức năng miễn dịch của cơ thể bình thường

+ Tăng sự biểu hiện của gen Interleukin-6 (IL-6) trong các tế bào lympho máu ngoại vi (PBL) ở người và do đó sản xuất ra IL-6 và cũng hoạt hoá tế bào bạch cầu

để gia tăng quá trình sản xuất interferon α và γ lên gấp 2 – 4 lần

+ Gia tăng mạnh mẽ chỉ số thực bào, trị số HC50, kháng thể ở chuột, tăng PBL từ phase G1 đến phase S, thúc đẩy sự phát sinh PBL

+ Thúc đẩy sự phát sinh tế bào lympho T và tế bào tiền tế bào T ở tuyến ức và lách, tăng cường hoạt tính tế bào lympho B

- PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do khối u gây ra ở động vật

+ Làm ngưng quá trình tiêu biến của tuyến ức ở chuột mang bệnh Sarcoma + Trung hoà sự trương phồng của gan khi mắc bệnh ung thư cổ trướng Ehrlich Chống lại quá trình ức chế kháng thể của tế bào ung thư Sarcoma ở chuột + Tăng giá trị bổ thể huyết thanh C3 trong chuột mắc bệnh Sarcoma

- PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do tác dụng của các hoá dược trong điều trị ung thư

+ Ức chế quá trình tiêu biến tế bào bạch cầu do cyclophosphamine (CPA) gây

ra và rút ngắn thời gian phục hồi tế bào bạch cầu

+ Chống lại quá trình ức chế của CPA trên IL-2 và tế bào T tự sát thương Phục hồi lại phản ứng mẫn cảm loại chậm bị ức chế bởi CPA

+ Dùng kết hợp với các phương pháp hoá trị và xạ trị sẽ làm giảm các tác dụng phụ của hoá dược và có hiệu quả cao hơn

- PSP ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở người và động vật thí nghiệm + PSP (50 mg/kg, ip hoặc po) có thể ức chế sự phát triển của Sarcoma 180 ở

chuột PSP (100 µg/ml) có thể ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid của tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich

+ Ức chế sự phát triển tế bào ung thư bạch cầu P388, tế bào u tủy, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư phổi Lewis ở chuột Nó có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư dạ dày, ung thư tuyến phổi ở người, ung thư tế bào bạch cầu đơn nhân

to, ung thư mô bạch huyết ở da Nó cũng gây ra sự tiêu biến tế bào ung thư và sự tích tụ NST mà không tạo ra bất kỳ độc tố nào trên tế bào fibroblast hay tế bào chủ + Huyết thanh bạch cầu (ALS) có thể được trung hoà Hoạt tính kháng khối u của PSP có liên quan với sự gia tăng tế bào lympho T Tăng sự sản xuất các hợp chất nitơ trung gian, anion superoxide và yếu tố gây hoại tử ung thư

- Một số hiệu quả khác của PSP

+ Cải thiện sự thèm ăn của chuột khi dùng kết hợp với CPA Giảm phản ứng đau của động vật khi chịu các tác nhân kích thích như điện, acid acetic, nước nóng + Ức chế hệ thần kinh trung ương và giảm hoạt tính tự phát của chuột Tăng khả năng chịu đựng trong điều kiện thiếu oxy đối với chuột thí nghiệm

+ Biểu hiện khả năng ức chế sự tương tác giữa HIV-1 gp120 và làm bất động thụ thể CD4 (IC50=6,25µg/ml), ức chế enzyme glycohydralase gắn với sự glycosic virus và làm giảm độc tố tế bào Do đó hướng sắp tới PSP sẽ được nghiên cứu để

tạo thành tác nhân kháng virus in vivo Ngoài ra, PSP còn được ứng dụng trong

chữa trị các bệnh viêm nhiễm virus và bệnh gan

1.2.2.2 Hiệu quả sử dụng PSK trong nấm vân chi

Năm 1971, hơn 200 dược chất hoá lý có khả năng kháng khối u được chọn lọc bởi các nhà nghiên cứu Nhật, PSK là liệu pháp chữa trị tốt nhất vì nó bảo vệ hệ miễn dịch bằng cách trung hoà các thuốc hoá trị và các quá trình gây độc của tế bào ung thư

- PSK có khả năng tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch Khi PSK được dùng kết hợp với phương pháp xạ trị thí nghiệm trên chuột, người ta quan sát thấy có sự hồi phục hệ miễn dịch thể dịch đã suy yếu Các nghiên cứu trên động vật xác nhận thêm rằng PSK cảm ứng tế bào T diệt và phục hồi lại các thông số miễn dịch bị suy yếu trong khi đó sẽ ức chế các hợp chất gây ức chế

miễn dịch [43]

- PSK ngăn chặn các phản ứng phụ khi dùng kết hợp với các tác nhân hoá trị như 5-FU (5-fluorouracil), doxorubicin, cyclophosphamide (CPA), tegafur, cis-Blastin và mitomycin-C (MMC) để chữa trị ung thư, gia tăng khả năng sống còn của các bệnh nhân ung thư dạ dày ở các giai đoạn III và IV [43]

- PSK kích ứng sự biểu hiện cytokine trong các tế bào máu đơn nhân vùng

ngoại vi in vitro Sự biểu hiện gen TNF-α (yếu tố gây hoại tử khối u) và

interleukin-8 (IL-interleukin-8) được cảm ứng mạnh ở những người tình nguyện khoẻ mạnh và những bệnh nhân ung thư dạ dày khi dùng PSK, mặc dù đáp ứng của mỗi người mỗi khác

- Có tác dụng ngăn chặn sự phát triển khối u in vitro

PSK gia tăng khả năng sống còn, ức chế sự hình thành và di căn của các tác nhân gây ung thư hoặc các khối u tạo ra do phóng xạ PSK cũng ức chế sự phát triển trở lại sau hậu phẫu hoặc sự di căn các tế bào khối u ở các mẫu động vật thí nghiệm,

cơ chế là ngăn chặn sự xâm nhập, di chuyển, phát triển và gắn kết với các tế bào màng trong Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tác động hỗ trợ hiệu quả giữa PSK và liệu pháp sinh học gồm vaccine L1210 gắn với concanavalin A (lectin gây phân bào) và kháng thể đơn dòng chống lại các tế bào ung thư ruột kết

Thí nghiệm của Pang ZJ và CS đã chứng minh PSK cải thiện hoạt tính enzyme glutathione peroxidase thông qua sự cảm ứng dịch mã sự biểu hiện của mRNA

- PSK có khả năng ngăn chặn bệnh AIDS

Bên cạnh hiệu quả chống ung thư, PSK còn có khả năng ngăn chặn bệnh AIDS Bệnh AIDS là một trong những bệnh nguy hiểm và hiện nay trên thế giới số người mắc bệnh AIDS ngày càng gia tăng trong khi chưa tìm được những phương thức điều trị phù hợp Tuy PSK không phải là một loại dược liệu có khả năng điều trị một cách triệt để bệnh này nhưng PSK đã góp phần ngăn chặn sự nhân lên của virus HIV trong tế bào, hạn chế phần nào sự phá hỏng hệ thống miễn dịch do virus HIV gây ra PSK có vai trò như một tác nhân sinh học gây ức chế enzyme phiên mã ngược, mà enzyme phiên mã ngược đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép thông tin di truyền của virus HIV Do đó PSK đã góp phần ngăn chặn giai đoạn nhiễm HIV dương tính sang giai đoạn mắc bệnh AIDS, và kéo dài thời gian

sống cho những bệnh nhân này [52]

- PSK cũng có tính kháng sinh mạnh, hiệu quả trên Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Cryptococcus neoformans, Psedomonas aeruginosa, Candida albicans và một số loại vi trùng khác gây bệnh ở người

1.2.3 Các giá trị khác của vân chi

Nấm vân chi sản xuất ra các enzyme phá gỗ như: laccaza, mangan peroxidaze (MnP), lignin peroxidaze (LnP) Các enzyme này đang được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực tẩy trắng bột cellulose Laccaza từ nấm vân chi có thể phân huỷ một phần hợp chất clo của CPC, có thể declo hoá nhiều hợp chất clophenol do đó được dùng trong xử lý chất thải, khử màu chất thải từ khâu tẩy trắng [11]

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm vân chi

Nấm vân chi là một loại nấm dược liệu nổi tiếng của y học cổ truyền phương Đông về nhiều đặc tính dược lý ưu việt và rất đáng quan tâm Tiềm năng sử dụng nấm vân chi trong điều trị lâm sàng, đặc biệt với các bệnh hiểm nghèo như ung thư, HIV… rất lớn Do vậy, đây là loại nấm rất được ưa chuộng và quan tâm nghiên cứu trên nhiều khía cạnh khác nhau Các nghiên cứu về việc ứng dụng nấm dược liệu vân chi không dưới 400 công trình đã được đăng trên các tạp chí quốc tế [30] Dưới

đây là một số công trình tiêu biểu trong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất trên thế giới

1.3.1.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống nấm dịch thể nuôi trồng nấm vân chi

Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong nông nghiệp nói riêng đang là một trong các vấn đề được nhiều nước trên thế giới quan tâm Công nghệ lên men đã được áp dụng trên qui mô công nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm y học, thực phẩm, tận thu sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất của các loài cây thuốc, nhân sâm… để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh hoặc sản xuất thuốc kháng sinh và một số sản phẩm khác Phương pháp này đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng trong công nghệ nhân giống nấm ăn - nấm dược liệu nhằm rút ngắn thời gian, tiết kiệm diện tích và kinh phí trong sản xuất nấm [22]

Giống nấm dịch thể là loại giống được nuôi dưỡng trong môi trường lỏng, đảm bảo các điều kiện về dinh dưỡng, nhiệt độ, độ thông thoáng, thời gian nuôi, tạo điều kiện để sợi nấm sinh trưởng mạnh trong môi trường dịch thể tầng sâu Công nghệ này cho phép thu được một lượng lớn sinh khối sợi nấm để làm giống cấp 1, giống cấp 2 và có thể trực tiếp làm giống thương phẩm giống cấp 3 Công nghệ trên còn được áp dụng trong việc tách chiết sinh khối sợi nấm dùng để sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng, gia vị, nước uống, mỹ phẩm… trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm Phương pháp lên men dịch thể đã được ứng dụng để sản xuất các giống nấm ăn và nấm dược liệu [32], [35], [41]

Theo Liu và Cộng sự (2010), phương pháp nuôi cấy truyền thống, giống nấm

ăn và nấm dược liệu đã được sản xuất trong các môi trường rắn sử dụng nguyên liệu tổng hợp có chứa nhiều lignocellulose, quá trình này thường kéo dài 2 -3 tháng để sản xuất ra đến quả thể Nuôi cấy trong môi trường dịch thể khác hẳn với nuôi cấy trên các cơ chất rắn vì nó đưa đến tiềm năng sản xuất giống nấm cao hơn trong một thời gian ngắn hơn với mực độ nhiễm bệnh ít hơn [41]

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, sợi nấm sinh trưởng trong môi trường dịch thể là phương pháp thay thế nhanh chóng để thu sinh khối sợi nấm với chất lượng phù hợp hơn [37]

Nghiên cứu ở Ấn Độ trên một chủng nấm vân chi đã chỉ ra rằng sinh khối sợi nấm vân chi thu được khi môi trường pH = 5 và pH = 6 là 2,99 g/l và 4,28 g/l Khi môi trường pH = 8 thu được sinh khối sợi là 1,97 g/l, môi trường pH = 9 sinh khối sợi thu được 1,62 g/l Tại nhiệt độ 300C, sinh khối sợi đạt được 4,32 g/l, tại 400C, sinh khối sợi nấm vân chi ghi nhận là thấp nhất đạt 1,72 g/l [49]

Trong nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh khối sợi nấm vân chi, các tác giả đã chứng minh rằng tất cả các nguồn cacbon hầu hết đều khuyến khích sợi nấm sinh trưởng, khi sử dụng cùng hàm lượng 1% fructose cho sinh khối đạt 5,41 g/l, bổ sung glucose đạt 5,54 g/l, bổ sung mannitol đạt 5,41 g/l, bổ sung glucose đạt 5,54 g/l, bổ sung mannitol đạt 5,53 g/l, bổ sung lactose cho thấp nhất 1,47 g/l [49]

Khi nghiên cứu tối ưu hóa nguồn cacbon và nguồn nitơ trong nuôi cấy giống nấm vân chi dịch thể, các tác giả đã bổ sung 8 nguồn cacbon khác nhau, kết quả khi

bổ sung maltose thu được sinh khối sợi nấm vân chi cao nhất là 8,6 g/l trong thời gian nuôi 7 ngày, kết quả cũng cho thấy nếu nuôi 14 ngày gấp 2 thời gian thì sinh khối có tăng nhưng không đáng kể, đạt 9,2 g/l Đồng thời, sau giai đoạn 7 ngày nuôi sợi thì giá trị pH của môi trường nuôi giống đo được là 2,92, kết thúc 14 ngày nuôi sợi giá trị pH tăng lên 4,39 [21]

Adebayo và Ugwu (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng bổ sung tới sinh khối sợi nấm vân chi, thành phần môi trường cơ bản gồm MgSO4.7H2O (0,2 g); K2HPO4 (1,0 g); NH4SO4 (5,0 g); glucose (9,75 g); Cao nấm men (CNM) (3,0 g); peptone (1,0 g) và 1l nước cất, được bổ sung 9,75 g của mỗi nguồn carbon gồm: lactose, glucose, sucrose, mannitol, maltose, galactose, fructose, xylose, sorbitol và tinh bột Kết quả chỉ ra rằng nguồn carbon có ảnh hưởng lớn đến sinh khối sợi nấm vân chi, bổ sung các nguồn lactose, mannitol, maltose sinh khối thấp hơn các nguồn carbon còn lại, sự biến thiên của sinh khối sợi khi bổ sung các nguồn carbon này cũng rất khác so với các nguồn carbon cùng nghiên cứu Khi bổ sung các nguồn lactose, glucose, mannitol, maltose sinh khối tăng cực đại ở ngày thứ 4, giảm xuống cực tiểu ở ngày thứ 7, sau đó đến ngày thứ 14 sinh khối lại tăng gần như ngày thứ 4 Còn khi bổ sung nguồn carbon: sucrose, galactose, fructose, sorbitol và tinh bột, sinh khối tăng cực đại ở ngày thứ 7, sau đó giảm gần hết ở ngày thứ 14 Kết quả của các tác giả cho thấy nguồn nitơ và nguồn carbon ảnh hưởng lớn đến sinh khối sợi, đường cong sinh trưởng của giống không phải lúc nào cũng tuân theo qui luật tự nhiên mà nó phụ thuộc nhiều vào nguồn dinh dưỡng bổ sung [20] Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đạm đến sinh khối sợi nấm vân chi, Sukumar và Cộng sự (2008) cũng đã chứng minh khi bổ sung cùng hàm lượng 0,3% ammonium sulfate cho sinh khối sợi cao nhất là 4,16 g/l; bổ sung sodium nitrate cho sinh khối sợi đạt 3,54 g/l; bổ sung glycine cho sinh khối sợi 3,48 g/l [41] Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh khối sợi nấm vân chi cũng được các tác giả minh chứng, 10 nguồn nitơ được thử nghiệm trong quá trình nuôi cấy sinh khối nấm vân chi, kết quả cho thấy CNM và casein là 2 nguồn đạm khuyến khích sợi

tăng trưởng, CNM cho sinh khối sợi nấm vân chi cao nhất sau 7 ngày lên men, còn casein cho sinh khối sợi cao nhất sau 4 ngày lên men [20]

Nguồn nitơ cũng được các tác giả nghiên cứu bổ sung vào môi trường nuôi cấy sinh khối sợi nấm vân chi Kết quả cho thấy, trong 8 nguồn đạm bổ sung vào môi trường nuôi cấy thì gelatin cho sinh khối sợi cao nhất CNM cũng là nguồn đạm cho sinh khối sợi nấm vân chi cao đáng kể, đạt 8,6 g/l sau 7 ngày nuôi cấy; sau 14 ngày nuôi cấy sinh khối sợi không tăng mà giảm xuống còn 8 g/l pH của môi trường sau 7 ngày nuôi cấy đo được pH = 5,75 nhưng sau 14 ngày nuôi cấy môi trường có giá trị pH = 4,96 [21]

Nguồn acid amin bổ sung để sinh khối sợi sớm đạt cao nhất được các tác giả chứng minh bao gồm alanine, valine, aspatic, đây là các acid amin cho sinh khối sợi cao nhất ở ngày thứ tư, trong khi các acid amin khác cho sinh khối sợi thấp hơn và đạt cực đại ở thời gian dài hơn [20] Giống nấm vân chi ngoài mục đích thu sinh khối sợi và quả thể để làm thuốc nó còn được sử dụng trong nghiên cứu xử lý sinh học, sản xuất enzyme [53]

Kawai và Cộng sự (1995) đã tiến hành nghiên cứu thời gian hình thành quả

thể nấm hương (Lentinus edodes) khi sử dụng giống dịch thể Kết quả khi sử dụng

giống dịch thể để rút ngắn được thời gian ươm bịch và thời gian hình thành quả thể

từ 12 ngày xuống còn 9 ngày [35]

Yan và Cộng sự (2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nấm kim châm (Flammulina

velutipes) trên năm loại môi trường dịch thể khác nhau, kết quả cho thấy nấm kim

châm nuôi cấy trong môi trường gồm các thành phần: bột ngô 5%; malt 1%; CNM 0,5%; glucose 2%; KH2PO4 0,1%; MgSO4 0,05%; CaCO3 0,2%; vitamin B11mg cùng với điều kiện nhiệt độ 250C, chế độ lắc 180 vòng/phút, thời gian nuôi 6 - 7 ngày, kết quả thu được dịch giống nấm trong, màu vàng nhạt, mùi giống thơm, mật

độ khuẩn lạc cầu đều [56]

Jonathan và Cộng sự (2009) công bố một số kết quả nghiên cứu của họ về nuôi nấm trong môi trường dịch thể để thu sinh khối sợi, nhóm tác giả đưa ra một số kết luận về điều kiện thích hợp cho nấm mộc nhĩ sinh trưởng tốt trong môi trường

lỏng như: nguồn cacbon là 1,6% glucose; nguồn nitơ là 0,8% pepton; môi trường có giá trị pH = 6,5; nhiệt độ nuôi là 250C [32]

Liu và Cộng sự (2010) nghiên cứu môi trường dịch thể thích hợp để nuôi

giống nấm kim châm LP03, đưa ra các kết luận môi trường dịch thể nuôi cấy tốt

nhất gồm: pepton; glucose; bột ngô; MgSO4.7H2O; KH2PO4; vitamin B1, trong điều kiện nhiệt độ 25±30C và chế độ lắc 160 vòng/phút phù hợp cho sự phát triển sợi nấm, thu được giống nấm phát triển tốt, kích thước khuẩn lạc cầu đồng đều [41] Marquez-Rocha và Cộng sự (1999), nghiên cứu nuôi cấy giống dịch thể của nấm sò trong bioreactor, kết quả chỉ ra rằng bằng cách thay đổi tốc độ và cường độ sục khí thì tỷ lệ tăng trưởng và kích thước khuẩn cầu lạc thay đổi Quan sát thấy kích thước viên nhỏ hơn, dẫn đến tốc độ tăng trưởng cao hơn Để thúc đẩy tăng trưởng sợi nấm thì giống cần được phá vỡ dạng viên mịn, nhưng mặt khác phải giữ cân bằng giữa sự tăng trưởng và phân mảnh của sợi nấm [42]

Các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm trong nuôi cấy lỏng cho rằng giá trị pH tối ưu phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm cả chủng giống được nuôi cấy [55] Theo Lin (2006) thì pH ban đầu và nhiệt

độ tối ưu để nuôi sợi phụ thuộc vào loài và môi trường nuôi cấy, cả hai đều là yếu tố quyết định rất quan trọng đến sinh khối sợi nấm [40]

Đa số các giống nấm sinh trưởng tốt trong điều kiện pH từ 5 - 7, Shin và Cộng

sự (2007) đã chứng minh giá trị pH tối ưu cho nấm kim châm là 6,5 [48]; còn kết quả nghiên cứu của Hamedi và Cộng sự (2007) ghi nhận giá trị pH ban đầu tối ưu

của môi trường dinh dưỡng để sản xuất nấm mặt trời (Agricus blazei) tại giá trị pH

= 7 [28] Kozhemyakina và Cộng sự (2001) chứng minh nấm kim châm có thể phát triển trong một loạt các giá trị pH ban đầu (từ 3 đến 7,5), tuy nhiên sản lượng tối đa của sinh khối sợi nấm đạt được khi pH ban đầu của môi trường tại 5 - 6,5 [36] Nghiên cứu trên nấm linh chi của Fang và Cộng sự (2002) đã cho thấy khi mật độ giống cấy tăng lên thì kích thước khuẩn lạc cầu giảm, với một lượng giống cấy 670 mg/l, thu được 68% các viên sợi có đường kính nhỏ hơn hơn 1,2 mm Tuy nhiên, khi cấy lượng giống 70 mg/l, thì thu được 91% các viên có đường kính lớn hơn 1,6

mm [23]

Theo Lee và Cộng sự (2004) thì cường độ sục khí ảnh hưởng rõ rệt đến hình thái khuẩn lạc cầu, nuôi trong điều kiện sục khí là 0,5 V/V/M, tốc độ cánh khuấy

100 vòng/phút, khuẩn lạc cầu có lông tua ngắn Nuôi trong điều kiện sục khí là 0,5 V/V/M, tốc độ khuấy 25 vòng/phút, khuẩn lạc cầu có hình viên tròn trơn, không có lông tua, nuôi trong điều kiện sục khí là 1,16 V/V/M, tốc độ khuấy 166 vòng/phút, khuẩn lạc cầu có tua dài [38]

Sự lưu thông dòng chảy của môi trường lỏng bị ảnh hưởng mạnh bởi sinh khối sợi nấm, khi cấy mật độ quá lớn dẫn đến sự gia tăng lớn về độ nhớt của môi trường trong quá trình lên men, gây ra khó khăn cho việc hấp thụ dinh dưỡng và trao đổi oxy Đối với các trạng thái, hình dạng sợi nấm tồn tại trong môi trường nuôi cấy, khi sợi nấm phát triển như dạng viên thì có xu hướng ít nhớt hơn so với phát triển dạng sợi mảnh phân tán [26]

Kỹ thuật lên men lỏng đã được phát triển cho một loạt các loại nấm và sử dụng nuôi cấy sợi nấm cho các ứng dụng khác nhau: ứng dụng nuôi cấy lỏng sau đó cấy trên nguyên liệu nuôi trồng là chất rắn để thu quả thể nấm và sinh khối sợi Nuôi cấy lỏng cho khả năng sản xuất sinh khối cao trong một không gian nhỏ gọn, thời gian ngắn hơn và có ít cơ hội ô nhiễm [24]

Trong những năm gần đây Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan và Đức là những nước có ngành công nghiệp sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu rất phát triển, đặc biệt có những bước tiến đáng kể trong nghiên cứu sử dụng công nghệ nhân giống nấm trong môi trường dịch thể Cùng với sự phát triển của khoa học, công nghệ nhân giống nấm lớn trong dịch thể ngày càng được hoàn thiện và xây dựng thành quy trình chuẩn ứng dụng khá phổ biến ở một số nước có ngành công nghiệp nuôi trồng nấm phát triển Hiện nay, có nhiều quy trình nhân giống nấm lớn khác nhau, phụ thuộc vào quy mô sản xuất và điều kiện kinh tế xã hội, trình độ công nghệ của từng nước Việc sử dụng phương pháp cấy giống dịch thể để sản xuất giống nấm ăn và nấm dược liệu để đạt được thành công với nhiều giống nấm khác nhau, từ kết quả thử nghiệm tại các phòng thí nghiệm cho thấy, đại đa số các hệ sợi nấm đều phát triền tốt trong điều kiện môi trường dịch thể thích hợp [29]

Các nước trên thế giới đã tập trung nghiên cứu về nấm vân chi từ rất lâu bởi công dụng tuyệt vời của loài nấm này, song hầu hết tập trung sâu vào nuôi cấy dịch thể để thu sinh khối sợi và tách chiết các hoạt chất sinh học Việc nuôi trồng thu quả thể ở loài nấm này rất ít nghiên cứu, kết quả nghiên cứu ở Mexico đã ghi nhận tốc

độ sinh trưởng của hệ sợi trong môi trường PDA (potato, dextro, agar) đạt 64 mm/7 ngày, tương đương với 380,9 µm/h Kết quả nuôi trồng nấm vân chi trên mùn cưa

gỗ sồi có bổ sung dinh dưỡng cho năng suất sinh học cao nhất 20,3%, kích thước quả thể 1,5 - 9,3 cm Năng suất sinh học chỉ đạt 3,2% khi trồng trên gỗ sồi không bổ sung dinh dưỡng và kích thước quả thể chỉ đạt 0,8 - 7,1 cm [27]

1.3.1.2 Một số công trình nhân giống và nuôi trồng nấm vân chi

Năm 1981, Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên đã dùng sản phẩm nuôi cấy chìm sợi nấm vân chi để chiết xuất polysaccharide nội bào, ngoại bào và phối hợp với Xí nghiệp Dược phẩm Trùng Khánh để sản xuất ra thuốc Vân Tinh dùng để điều trị viêm gan do virus HBV và ung thư gan nguyên phát, đã đạt được hiệu quả tốt

Năm 1989, Xưởng Đông dược Thượng Hải nuôi trồng nấm vân chi từ bã mía

và chiết xuất ra polysaccharide để tạo thành thuốc Vân Chi khuẩn dùng để điều trị

bệnh viêm gan B mãn tính

Công trình nghiên cứu sản xuất nấm vân chi thương mại từ quả thể hoặc sợi nấm trồng trên hợp chất rắn được thực hiện bởi Yadav và Tripathi vào năm 1991và Park cùng các cộng sự vào năm 1994, nghiên cứu thu sinh khối nấm trong lên men dịch thể do nhóm các nhà khoa học Yoshikumi (1978), Ueno (1980), Chen (1981), Zhou (1994), Cheng (1998), Wang (1996) thực hiện [31]

Năm 1993, các nhà sinh học ở Đại học Sư phạm Thượng Hải đã dùng phương

pháp nuôi cấy chìm để thu nhận sợi nấm vân chi sản xuất ra thuốc PSP ứng dụng

trong lâm sàng, phối hợp với các biện pháp phẫu thuật hoặc hóa trị để điều trị ung thư phổi, ung thư đường tiêu hóa và ung thư vú

Phương pháp lên men tầng sâu (nhân giống dạng dịch thể) được ứng dụng để sản xuất nhiều loại nấm ăn và nấm dược liệu [22] Hiện nay công nghệ nhân giống nấm dịch thể đã phát triển ở nhiều nước trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên

cứu đưa ra thành phần dinh dưỡng bổ sung tối ưu, tốc độ sục khí, ảnh hưởng cả pH môi trường đến sinh trưởng cuả hệ sợi, thuận lợi, khó khăn của việc nhân giống

nấm dịch thể [32], [41]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm ở Việt Nam

Nghiên cứu về nấm ăn và nấm dược liệu ở Việt Nam tập trung theo chuỗi từ nghiên cứu chuyên sâu đến sản suất các sản phẩm tăng cường sức khỏe để cung cấp cho thị trường, đi tiên phong phải kể đến Trung tâm nghiên cứu phát triển Nấm và sản phẩm sinh học - Công ty TNHH Nấm linh chi Công ty đã sản xuất thành công nhiều sản phẩm có tác dụng phòng chữa bệnh, tập trung sâu vào các công trình nghiên cứu khoa học để tạo ra các sản phẩm từ nấm linh chi như sản phẩm Sinh linh (bột sinh khối nấm linh chi), các sản phẩm từ bào tử nấm linh chi… Nấm vân chi, nấm đầu khỉ, nấm mặt trời… cũng là một trong những loại nấm dược liệu mà Công

ty đã nghiên cứu khép kín từ qui mô nhân giống đến các sản phẩm thuốc có giá trị tăng cường sức khỏe

Nấm vân chi là loại nấm có giá trị dược liệu cao, có hoạt tính chống khối u đạt 77,5%; đặc biệt có tác dụng tốt ngăn ngừa các loại ung thư đường hô hấp, đường tiêu hóa, ung thư vú, ung thư tử cung Thêm vào đó nấm vân chi còn có tác dụng chống viêm gan B mãn tính, tăng hệ thống miễn dịch của cơ thể; có tác dụng thu dọn gốc oxy tự do và trung hòa chất độc (kể cả gốc dioxin), ngăn ngừa đột biến gen Song song với việc nghiên cứu về tác dụng của nấm vân chi, công ty cũng đã nghiên cứu qui trình sản xuất các sản phẩm từ nấm vân chi, có 2 dạng sản phẩm chính từ nấm vân chi đó là bột sinh khối sợi và quả thể nấm vân chi Hiện tại, hàng năm công ty đã cung cấp cho thị trường khoảng 10 tấn sinh khối nấm và 2-3 tấn quả thể/năm Trung tâm nghiên cứu phát triển Nấm và sản phẩm sinh học - Công ty TNHH Nấm linh chi hiện là đơn vị độc quyền về sản phẩm sinh khối sợi nấm vân chi Việc nuôi trồng nấm vân chi đang chuyển giao cho nhiều cơ sở sản xuất, nguyên liệu sử dụng nuôi trồng là mùn cưa có bổ sung dinh dưỡng, nhiệt độ thích hợp nhất để quả thể nấm sinh trưởng phát triển từ 20 - 250C, quả thể sinh trưởng thích hợp nhất vào tháng 2 đến tháng 5 dương lịch [1]

Lê Thị Hoàng Yến và Cộng sự (2003) đã phân lập quả thể vân chi từ Trung Quốc, sau đó thử nghiệm trên môi trường lỏng cho kết quả thu được nấm vân chi sinh trưởng tốt nhất trên môi trường 20 g bột đậu tương; 20 g đường kính; 2,5 g (NH4)2SO4; 2 g CaCO3; 1 g MgSO4; sinh khối đạt 16,68 g/l Tác giả cũng nghiên cứu khả năng sinh trưởng của nấm vân chi trên môi trường xốp, kết quả chỉ ra nấm vân chi sinh trưởng tốt trên môi trường 80 g bã rượu; 18 g cám gạo; 1 g thạch cao; 1g CaCO3, sau 10 ngày hệ sợi vân chi đã sinh trưởng kín bình nguyên liệu, nhanh hơn so với môi trường khác từ 1- 10 ngày [19]

Kết quả nghiên cứu của tác giả Lê Võ Định Tường (2006) nuôi trồng chủng nấm vân chi du nhập từ Nhật Bản trên mùn cưa cao su, đạt năng suất 51,5 g/bịch Song nếu nuôi trồng trên nguồn nguyên liệu mùn cưa cao su chỉ thuận lợi ở miền Nam, việc nuôi trồng nấm trên mùn cưa cao su ở phía Bắc gặp nhiều khó khăn về giá đầu vào và việc chủ động nguyên liệu

Nói chung, ở nước ta có một số nhà khoa học tập trung nghiên cứu sâu về nấm

ăn, đặc biệt là nấm dược liệu (nấm linh chi, vân chi, nhộng trùng thảo…), hướng nghiên cứu đó được thực hiện nuôi cấy trong môi trường dịch thể nhưng chuyên sâu

về công nghệ tách chiết sinh khối sợi để tạo sản phẩm chức năng, việc nuôi trồng nấm để thu quả thể chủ yếu được sử dụng nguồn giống thể rắn (giống hạt) cho nên thời gian nuôi trồng thường kéo dài hơn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là nấm vân chi (Trametes versicolor) có nguồn gốc từ

Trung Quốc

- Nguyên liệu nghiên cứu là ống giống gốc do Trung tâm Ứng dụng Khoa học

và Công nghệ Lâm Đồng cung cấp

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 9/2015 đến tháng 5/2016 tại phòng

thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật và phòng thí nghiệm Vi sinh vật, khoa

Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng

2.2.1 Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi

2.2.1.1 Hình thái giải phẫu quả thể nấm

Quan sát hình dạng, màu sắc, kích thước của tất cả quả thể nấm vân chi Sau

đó cắt đôi quả thể và quan sát hình thái giải phẫu của chúng

2.2.1.2 Quan sát hệ sợi nấm

- Lấy một ít sợi nấm dàn đều trên lam kính

- Cố định sợi nấm trên lam kính bằng lamen

- Quan sát mẫu vật dưới vật kính 100x

2.2.2 Phương pháp tạo sinh khối nấm vân chi trong môi trường dịch thể

2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau lên sự tăng trưởng

sinh khối của nấm vân chi

Tiến hành khảo sát trên 5 loại môi trường dịch thể (loại bỏ agar) PG (cải tiến),

Chang, Agaricus, Raper, Czapek

Các môi trường khảo sát được cho vào các lọ thủy tinh 50 ml, hấp khử trùng ở

1210C, 1 atm trong 30 phút Cấy tơ nấm (lượng ban đầu như nhau ở tất cả các lô thí

nghiệm), nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng Sau 10 ngày thu sinh khối, sấy khô ở

500C, xác định trọng lượng của mẫu bằng cân phân tích

2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi lên sự tăng trưởng sinh khối nấm

Cấy tơ nấm (lượng ban đầu như nhau ở tất cả các lô thí nghiệm) vào 50ml dịch thể

đã hấp khử trùng (môi trường PG cải tiến) Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng Thu

sinh khối sau 5, 10, 15, 20, sấy khô ở 500C, xác định trọng lượng của mẫu bằng cân phân tích

2.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng sinh khối của nấm vân chi

Cấy tơ nấm (lượng ban đầu như nhau ở tất cả các lô thí nghiệm) vào 50ml dịch thể đã hấp khử trùng (môi trường PG cải tiến) và được điều chỉnh pH bằng HCl

0,1N và NaOH 0,1N có giá trị tương ứng là 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8

Nuôi cấy tĩnh cho nấm phát triển của điều kiện thích hợp Sau 10 ngày, thu sinh khối khô và xác định pH tối ưu cho sự phát triển của tơ nấm

2.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sự tăng trưởng sinh khối của nấm vân chi

Cấy tơ nấm (lượng ban đầu như nhau ở tất cả các lô thí nghiệm) vào 50ml dịch thể đã hấp khử trùng (môi trường PG cải tiến) Nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy ở tốc độ lắc 120, 140, 160 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp Sau 10 ngày thu sinh khối, sấy khô ở 500C, xác định trọng lượng của mẫu bằng cân phân tích

2.2.2.5 Phương pháp xác định sinh khối tươi và khô

Sử dụng loại giấy lọc có đường kính 12 mm, sấy và lọc ở nhiệt độ 1100C trong thời gian 4 giờ Cân các giấy lọc để biết khối lượng của chúng Dùng các giấy lọc

đó để lọc sinh khối từ các bình tam giác sau khi nuôi cấy Dùng phễu để đỡ tờ giấy lọc Sau khi chảy hết môi trường qua giấy lọc sẽ đem sấy sinh khối cùng giấy lọc Sấy ở nhiệt độ 50oC trong 18 giờ rồi đem để nguội trong bình hút ẩm trước khi cân Tính toán khối lượng sinh khối khô thông qua chênh lệch khối lượng

2.2.3 Định tính các dược chất có trong hệ sợi và quả thể nấm