Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi nấm trichoderma có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây cải bẹ xanh (brassica juncea) tại thành phố đà nẵng

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG TRƯƠNG THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI NẤM TRICHODERMA CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CẢI BẸ XANH BRASSICA JUNCEA TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG K

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

TRƯƠNG THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI NẤM

TRICHODERMA CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH

TRÊN CÂY CẢI BẸ XANH (BRASSICA JUNCEA)

TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÀ NẴNG, 6

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

TRƯƠNG THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI NẤM

TRICHODERMA CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH

TRÊN CÂY CẢI BẸ XANH (BRASSICA JUNCEA)

TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

N n SƯ PHẠM SINH HỌC

N ười ướng dẫn TS ĐỖ THU HÀ

NIÊN KHÓA 2012 – 2016

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 2

3.1 Ý NGHĨA KHOA HỌC 2

3.2 Ý NGHĨA THỰC TIỄN 2

CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 KHÁI QUÁT VỀ NẤM TRICHODERMA 3

1.1.1 Vị trí của chi Trichoderma trong hệ thống phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng của nấm Trichoderma 3

1.1.3 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma 4

1.1.4 Tình hình nghiên cứu về nấm Trichoderma trên thế giới và ở Việt Nam 6

1.1.5 Ứng dụng của nấm Trichoderma trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng 9

1.2 KHÁI QUÁT VỀ BỆNH THỐI CỔ RỄ TRÊN CÂY CẢI BẸ XANH (BRASSICA JUNCEA) DO NẤM FUSARIUM 11

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÂY CẢI BẸ XANH (BRASSICA JUNCEA) 12

1.4 SƠ LƯỢC VỀ VỊ TRÍ ĐỊA LÝ VÀ ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN, KINH TẾ XÃ HỘI XÃ HÒA PHONG, HUYỆN HÒA VANG, TP ĐÀ NẴNG 13

1.4.1 Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên 13

1.4.2 Điều kiện kinh tế xã hội 13

CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.3 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 14

2.3.1 Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa 14

2.3.2 Địa điểm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 15

2.3.3 Phạm vi nghiên cứu 15

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 16

2.4.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo xác định chủng nấm gây bệnh 21

2.4.4 Đánh giá hiệu quả phòng trừ nấm Fusarium của chế phẩm nấm Trichoderma thu được 22

2.4.5 Phương pháp xử lí số liệu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 25

3.1 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CHỦNG VI NẤM GÂY BỆNH THỐI CỔ RỄ TRÊN CÂY CẢI BẸ XANH (BRASSICA JUNCEA) 25

3.1.1 Phân lập chủng vi nấm gây bệnh trên cây cải bẹ xanh 25

3.2.2 Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với chủng nấm bệnh Fusarium – TL1 (gây bệnh thối cổ rễ) 34

3.3 KẾT QUẢ LÊN MEN XỐP CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG MẠNH VỚI CHỦNG NẤM BỆNH FUSARIUM – TL1 39

3.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHẾ PHẨM NẤM TRICHODERMA ĐỐI VỚI CHỦNG NẤM BỆNH FUSARIUM – TL1 41

3.4.1 Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma đối với nấm bệnh Fusarium – TL1 trên đĩa petri 41

3.4.2 Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma với chủng nấm Fusarium – TL1 gây bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh (Brassica juncea) 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

1 KẾT LUẬN 50

2 KIẾN NGHỊ 50

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác iả luận văn

TRƯƠNG THỊ HUYỀN

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn TS

Đỗ Thu Hà đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh – Môi trường – Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyển đạt kiến thức cho em trong 4 năm học

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Trươn T ị Huyền

CFU : Colony Foming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

CT : Công thức

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long

ĐHQG – HCM : Đại học Quốc Gia – Hồ Chí Minh

Số hiệu

2.1 Thành phần môi trường lên men xốp 20

3.1

Đặc điểm biểu hiện bệnh, hình thái KL, bào tử và

cuống sinh bào tử của chủng nấm Fusarium – TL1

gây bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh

25

3.2 Đường kính của nấm bệnh Fusarium – TL1 trên

môi trường MT Czapeck, MT PDA và MT giá đỗ 27

3.3 Lây nhiễm chủng nấm bệnh Fusarium – TL1 phân

lập lên rau cải 28

3.4

Sự hiện diện của các chủng nấm Trichoderma trong

các mẫu trồng rau tại thôn Túy Loan, xã Hòa Phong,

huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

30

3.5 Sự phát triển của các chủng nấm Trichoerma sau 5

ngày nuôi cấy trên môi trường giá đỗ 30

3.6 Kết quả theo dõi mức đối kháng của các chủng nấm

Trichoderma đối với nấm bệnh Fusarium - TL 34

3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma

đối với nấm bệnh Fusarium – TL1 34

3.8 So sánh số lượng bào tử thu được trong 3 công thức

lên men tạo chế phẩm nấm Trichoderma 40

3.9 Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Fusarium – TL1

sau khi rắc chế phẩm nấm Trichoderma 41

3.10 Số lượng cây con mắc bệnh và chết ở 5 công thức

sau khi lây nhiễm nấm bệnh 45

2.4 Mô hình bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 1 24

2.5 Mô hình bố trí thí nghiệm giai đoạn 2 24

3.1 Bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh do chủng nấm

3.2

Hình ảnh khuẩn lạc, cuống bào tử và bào tử chủng

nấm bệnh Fusarium – TL1 sau 6 ngày nuôi cấy trên

môi trường PDA

27

3.3 Các triệu chứng bệnh khi lây nhiễm nấm Fusarium –

TL1 ở rau cải sau 5 ngày 29

3.4 Sinh khối và dịch bào tử nấm Fusarium – TL1 để lây

bệnh nhân tạo sau 6 ngày nuôi cấy 29

3.5 Hình ảnh KL các chủng nấm Trichoderma thuộc

nhóm 1 sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường giá đỗ 33

3.6 Hình ảnh KL một số chủng nấm Trichoderma thuộc

nhóm 2 sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường giá đỗ 33

3.7 Biểu đồ mức độ đối kháng của các chủng nấm

Trichoderma với nấm bệnh Fusarium 36

ngày nuôi cấy

3.9 Cuống sinh bào tử, bào tử và ống giống của chủng

3.10 Cuống sinh bào tử, bào tử và ống giống của chủng

3.11 Chế phẩm Trichoderma dạng bột sản xuất bằng

phương pháp lên men xốp theo công thức 2 40

3.12 Khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma

đối với nấm bệnh Fusarium – TL1 43

3.13 Rau cải sau 20 ngày trồng trong thùng xốp ở 5 công

thức thí nghiệm tại TP.Đà Nẵng 44

3.14 Hình ảnh lá cây cải bẹ xanh ở CT3 bị thối do nấm

Fusarium sau 10 ngày chủng bệnh 46

3.15 Hình ảnh thân cây cải bẹ xanh ở CT3 bị thối do nấm

Fusarium sau 10 ngày chủng bệnh 46

3.16 Cây cải bẹ xanh sau 10 ngày chủng nấm bệnh ở 5

công thức thí nghiệm 47

MỞ ĐẦU

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Khi xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu của con người về lương thực, thực phẩm đảm bảo chất lượng càng được nâng cao, đặc biệt là nhu cầu rau xanh sạch và an toàn trở nên rất cấp thiết Sự tăng trưởng của hóa học nông nghiệp và thâm canh sản xuất đang thay đổi rất nhiều đến điều kiện môi trường sinh thái tự nhiên Vì vậy, phương pháp đấu tranh sinh học đang là hướng mở tích cực cho nền nông nghiệp để bảo vệ cây trồng, nâng cao năng suất và phòng chống ô nhiễm môi trường, tạo điều kiện phát triển một nền nông nghiệp sạch và bền vững [9]

Nấm Trichoderma hiện diện trong đất, phát triển nhanh ở những nơi có

nhiều dinh dưỡng, chất hữu cơ và ngay ở những vùng rễ cây Ngoài khả năng phân giải các chất hữu cơ, cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, chúng còn là một tác nhân đối kháng lại nhiều loài nấm gây bệnh trên cây trồng tồn tại trong đất thông qua tác động của các hoạt chất kháng sinh Chính vì vậy, việc

khai thác tiềm năng của nấm Trichoderma như một tác nhân sinh học phòng

trừ bệnh hại cây trồng là khuynh hướng hứa hẹn đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm

Đà Nẵng là thành phố trực thuộc Trung ương phát triển theo hướng công nghiệp và dịch vụ, sản xuất nông nghiệp ngày càng thu hẹp do quá trình

đô thị hóa Tuy nhiên, không thể phủ nhận vai trò của sản xuất nông nghiệp trong phát triển chung của nền kinh tế Việc phát triển vành đai xanh với những vùng rau an toàn theo công nghệ hiện đại là cần thiết nhằm cung cấp nhu cầu rau xanh cho người dân thành phố và hướng đến sự phát triển nền nông nghiệp bền vững, cân đối

Từ những vấn đề trên, để góp phần phát huy lợi ích của nấm

Trichoderma trong việc phòng trừ các bệnh hại cây trồng do vi nấm gây ra, từ

đó góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tăng sản lượng nông

sản, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn các

chủng vi nấm Trichoderma có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây cải

bẹ xanh (Brassica juncea) tại thành phố Đà Nẵng”

- Đây là nguồn gen của các chủng nấm Trichoderma có khả năng kháng

nấm cao và là cơ sở khoa học để ứng dụng nấm đối kháng vào thực tiễn sản xuất rau sạch an toàn có hiệu quả

- Đưa ra môi trường thích hợp để lên men tạo chế phẩm góp phần tạo sản phẩm cải tạo đất, chống bệnh cho rau ứng dụng tại địa phương nhằm nâng cao năng suất thu hoạch và phát triển nông nghiệp bền vững

3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN

Sử dụng các chủng nấm Trichoderma để sản xuất các chế phẩm kháng

nấm trên rau, góp phần nâng cao năng suất cây trồng và xây dựng hệ thống rau sạch trên toàn thành phố dựa trên quan điểm sinh thái bền vững Đáp ứng một cách chủ động nhu cầu sử dụng rau sạch và an toàn của người dân

CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU

KHÁI QUÁT VỀ NẤM TRICHODERMA

1.1.1 Vị trí của c i Trichoderma tron ệ t ốn p ân loại

Trichoderma là giống nấm khá phổ biến trong tự nhiên, là một trong

những nhóm vi nấm có nhiều hệ thống phân loại khác nhau do có nhiều đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn chưa được viết đầy đủ

Hiện nay, ở Việt Nam nấm Trichoderma được phân loại thuộc ngành

nấm Mycota, lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, bộ nấm bông Moniliales, họ

Moniliaceae, chi Trichoderma Hệ thống phân loại này được chấp nhận và sử

dụng phổ biến [15]

Đặc điểm ìn t ái, sin trưởn của nấm Trichoderma

a Đặc điểm cấu tạo và hình thái

Trichoderma thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) Sợi nấm đa bào

có vách ngăn thủng lỗ đơn giản, phân nhánh phức tạp Nấm Trichoderma sinh

sản vô tính bằng bào tử đính (conidi) nằm trực tiếp trên sợi nấm, cuống conidi nhô lên trên bề mặt hệ sợi nấm, phân nhánh nhiều, các nhánh mọc đối xứng nhau Ở cuối nhánh phát triển thành một khối trong mang các bào tử trần liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành Bảo tử hình cầu, hình elip hoặc hình vuông kích thước khoảng (3 - 5µm) x (2 – 4µm), trong suốt hoặc có màu lục Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh đến lục đậm [34]

Kubicek và Harman đã mô tả chi tiết 33 loài nấm thuộc chi

Trichoderma, ông cho rằng: tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích

thước khác nhau Trong đó, một số loài Trichoderma đã được ứng dụng trong

phòng trừ sinh học [44]

b Sự sinh trưởng của nấm Trichoderma

Trichoderma có khả năng sử dụng nguồn hỗn hợp cacbon và nitơ

Nguồn cacbon và năng lượng Trichoderma sử dụng được là monosaccharit và

disaccharit, cùng với hỗn hợp polysaccharit, purin, axít amin, tanmin, andehit,và axít hữu cơ Đặc biệt là axít béo, methanol methylamine và NH3 là

nguồn đạm bắt buộc phải có trong nuôi trường nuôi cấy Trichoderma [23]

3 Cơ c ế đối k án của nấm Trichoderma

Cơ chế đối kháng giữa nấm Trichoderma đối với các loại nấm gây bệnh

được phân loại như sau:

- Kí sinh lên cơ thể của nấm bệnh

- Tiết ra các chất kháng nấm bệnh

- Cạnh tranh dinh dưỡng, không gian sống với nấm bệnh

- Thúc đẩy sự phát triển và gia tăng sức đề kháng của cây trồng

Cơ chế đối kháng có thể là một trong những cơ chế này hoặc bao gồm tất

cả cơ chế trên [40], [56]

Một vấn đề quan trọng trong sự hình thành cơ chế đối kháng đó là: tùy thuộc vào dòng VSV đối kháng, nguồn gốc của chúng và điều kiện môi trường, vì thế khi chọn một tác nhân sinh học nên quan tâm đến hướng áp dụng và nguồn gốc của mầm bệnh [45]

* Cơ c ế ký sinh lên nấm bệnh

Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng ký sinh gồm 4 giai đoạn

+ Giai đoạn 1: sự tăng trưởng có tính hướng hóa, trong giai đoạn này tác nhân kích thích hóa học từ nấm gây bệnh hấp dẫn nấm đối kháng

+ Giai đoạn 2: sự nhận dạng đặc hiệu của nấm đối kháng lên bề mặt tế bào nấm gây bệnh

+ Giai đoạn 3: sự tấn công và xoắn vòng của sợi nấm Trichoderma

xung quanh vật chủ

+ Giai đoạn 4: sự bài tiết các enzim phân giải vách tế bào chất Hệ enzim phân giải vách tế bào bao gồm chitinaza, glucanaza, proteaza [36]

* Cơ c ế tiết chất kháng sinh

Các chủng Trichoderma sản xuất đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp

dễ bay hơi và không bay hơi, một vài chất loại này ức chế VSV khác mà không có sự tương tác vật lí Chất ức chế được coi là chất kháng sinh Các

chủng Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi trường

cũng tác động vào sự sản xuất cả về chất lượng và số lượng Hơn nữa các kháng sinh đặc hiệu tác động vào các tác nhân gây bệnh khác nhau thì khác nhau [45]

Nấm Trichoderma cho lượng enzim chitanaza cao, chitinaza có chức

năng chính là khả năng phân hủy chitin, đây là yếu tố quan trọng trong hoạt động ký sinh nhằm đối kháng các loài nấm gây bệnh thực vật [45] Hoạt động kháng nấm của chitinaza được tăng cường bởi sự trợ lực của kháng sinh

Enzim chitinaza của nấm Trichoderma được xem là enzim có hoạt tính kháng

khuẩn mạnh nhất Hoạt động của chitinaza phối hợp mạnh mẽ với các hợp chất có liên quan đến việc kiểm soát sinh học Sự phối hợp này đã dẫn đến sự tăng cường hoạt động thủy phân và ức chế ngay cả trong trường hợp các enzim này có hoạt tính thấp hay không có hoạt tính khi chúng được sử dụng riêng [52], [53]

Bên cạnh sự tác động qua lại trong quần thể giữa nấm đối kháng và

nấm bệnh, trong hoạt động sống nấm Trichoderma sinh sản ra các enzim phân

hủy glucoza, xenluloza làm chất hữu cơ có trong đất được phân hủy nhanh hơn tạo điểu kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt [4]

* Cơ c ế cạn tran din dưỡng và không gian sống

Sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng được xem là cơ chế hữu hiệu khi sử

dụng nấm Trichoderma trong kiểm soát nấm bệnh

Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đưa ra khái niệm cạnh tranh khai thác và cạnh tranh cản trở vào tương tác giữa quần thể nấm Sự cạnh tranh cản trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi VSV này giới

hạn VSV khác do sự tương tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác loài [45]

Nấm Trichoderma có thể ức chế hoặc làm giảm sự phát triển của mầm

bệnh cây trồng thông qua việc cạnh tranh với không gian, cơ chất enzim, chất dinh dưỡng và oxi [31] Với bản chất phát triển nhanh và khả năng sinh

trưởng tốt trên nhiều loại cơ chất khác nhau nấm Trichoderma chính là những

VSV chiếm lĩnh môi trường sống trong đất rất hiệu quả và có khả năng thay thế cho các VSV có khả năng xâm chiếm kém hơn [39] Sự cạnh tranh dinh

dưỡng cũng được xem như cơ chế hữu hiệu khi sử dụng nấm Trichoderma

trong kiểm soát nấm bệnh Tuy nhiên, khả năng xâm chiếm của chúng bị ảnh hưởng rất lớn bởi những nhân tố môi trường đất như pH, nhiệt độ,… [29]

* T úc đẩy sự phát triển v ia tăn sức đề kháng của cây trồng

Nấm Trichoderma thúc đẩy sự phát triển của cây trồng thông qua việc

kích thích trực tiếp sự hấp thu các chất dinh dưỡng của chúng hoặc tiết các chất chuyển hóa có khả năng đẩy nhanh sự phát triển của cây trồng như các hoocmon tăng trưởng [37] Với bản chất đối kháng nấm bệnh trên cây trồng

của hầu hết các loài Trichoderma, nhận thấy có thể thúc đẩy sự phát triển của

cây trồng một cách dán tiếp thông qua việc ức chế các mầm bệnh và làm tăng

sự biến dưỡng của cây trồng [43]

4 Tìn ìn n iên cứu về nấm Trichoderma trên t ế iới v ở Việt

Nam

a Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nấm Trichoderma được quan sát và mô tả đầu tiên bởi Person ex Gray

năm 1801 Sau đó, hầu hết các nghiên cứu về sự phân bố của nấm

Trichoderma trong đất đều gắn liền với khả năng đối kháng của nó

Năm 1984, Hardar và cs công bố nấm Trichoderma sp được sử dụng rộng rãi trong phòng trừ sinh học để quản lý bệnh hại do R solani gây ra Nấm Trichoderma sp tấn công trực tiếp và tiết ra enzim phân hủy chitin của

nấm gây hại, giúp cây trồng kháng lại bệnh Khi dung dịch huyền phù nấm

Trichoderma hazianum vào trong đất làm tăng sự nảy mầm, tăng khả năng ra

hoa, tăng sinh khối và chiều cao cây bắp, ớt, hoa cúc, cà chua, thuốc lá Nòi

T1290 của nấm T.hazianum còn làm tăng 66% số chồi và rễ cây bắp ngọt

trong nhà lưới so với đối chứng [46], [51]

Năm 2000, Okigbo và Ikediugw cho biết những loài Trichoderma sp

có hệ sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh học chống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lí bệnh hại sau thu hoạch [19]

Năm 2006, Ayed và cs [8] cho thấy T.harzianum, T.virens, T.viride có thể làm giảm hơn 40% khả năng sinh trưởng của nấm Fusarium f.sp.tuberose

gây bệnh héo vàng trên khoai tây

Năm 2009, Cicero Jayalakshmi và cs [48] nghiên cứu ảnh hưởng của

enzim thủy phân nấm T.hazianum L1 đối với cơ chế tự bảo vệ ở cây đậu xanh chống lại bệnh héo vàng do nấm Fusarium oxysporum f.sp gây nên, thấy rằng

hoạt động của enzim trong dịch chiết rễ tăng mạnh, các chất ức chế như chymotrypsin và trypsin được sản sinh

Năm 2011, Irina S Druzhinina cho biết những tiến bộ gần đây trong sinh thái học phân tử và gen về nấm Trichoderma đã chỉ ra rằng sự tương tác của Trichoderma sp với động vật và thực vật đã có nhiều tiến hóa hơn với các hình thức khác nhau kí sinh trên nấm [59]

b, Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nấm Trichoderma bắt đầu được nghiên cứu từ những năm

1987 [7]

Năm 1996, Tạ Kim Chi ở viện công nghệ sinh học của trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia Hà Nội đã mô tả vai trò của nấm

Trichoderma trong đề tài “ Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt

côn trùng gây hại ở Việt Nam và khả năng ứng dụng” [3]

Năm 1997, Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Thị Hương Giang vào đã mô

tả vai trò của nấm Trichoderma trong tác phẩm “ Bảo vệ cây trồng bằng các

chế phẩm vi nấm” [23]

Năm 1998, trên tạp chí bảo vệ thực vật, tác giả Nguyễn Thị Thuần đã

công bố hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại

cây trồng [25]

Năm 2001, Đỗ Tấn Dũng và các cộng tác viên đã tiến hành mô tả đặc tính sinh học và khả năng phòng chống một số bệnh nấm hại rễ cây trồng cạn

của nấm đối kháng Trichoderma viride trên Tạp chí Bảo vệ thực vật [4]

Năm 2011, Đào Thị Hồng Xuyến, Trương Trọng Ngôn, Dương Minh báo cáo đề tài “ khảo sát sự đa dạng di truyền và khả năng tiết emzyme β-1,3-

glucanase của các chủng nấm Trichoderma có triển vọng trên đất trồng cam

quýt và dứa” ở Hội thảo Quốc gia về Bệnh hại thực vật Việt Nam lần 10, Hà Nội, 20 – 22/7/11 [3]

Năm 2012, Bùi Văn Công, Nguyễn Văn Tiên, Nguyễn Thị Tú đã tiến

hành nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma viride phòng trừ nấm

Rhizoctonia solani gây bệnh lỡ cổ rễ và Sclerotium rolfsii gây bệnh héo gốc

mốc trắng vùng rễ cây khoai tây, lạc, đậu tương tại khu vực Gia Lâm, Hà Nội cho thấy dịch nuôi cấy có hiệu quả tốt trong phòng trừ bệnh cũng như năng suất khoai tây tăng 9,7%, đậu tương tăng 12,2%, lạc tăng 15,6% so với ruộng không xử lý chế phẩm [28]

Tại khu vực miền Trung cũng đã có nghiên cứu về đặc điểm phân bố

cũng như khả năng đối kháng của nấm Trichoderma Phạm Thanh Hòa (2012) nghiên cứu thành phần của nấm Trichoderma trên các loại đất khác nhau tại

Thừa Thiên Huế và Quảng Trị [10] Nguyễn Thị Thiên Hằng (2012) nghiên

cứu sự phân bố và động thái của nấm Trichoderma trong đất trồng rau, màu tại thành phố Đà Nẵng, tiến hành thử nghiệm khả năng kháng nấm Fusarium

gây bệnh héo vàng và colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây cà chua cho

kết quả tốt [9]

Năm 2013, Phạm Thị Lịch, Phạm Thanh Thủy đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng

Trichoderma.sp [14]

Năm 2014, Trịnh Thị Bé Tiên nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và ứng

dụng một số chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh héo vàng trên cây chuối (Musa Paradislacal.) [22]

5 Ứn dụn của nấm Trichoderma tron lĩn vực bảo vệ t ực vật

v cải t iện năn suất cây trồn

a Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật

Một trong những nghiên cứu ứng dụng của nấm Trichoderma sp được

quan tâm nhiều nhất là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng với một số nấm bệnh ở thực vật [32], [33] Các nhà nghiên cứu đã sử

dụng nhiều loại Trichoderma sp khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm gây

bệnh sau:

- Armillaria mellea: mục rễ ở cao su, cây rừng, thông [58]

- Colletotrichum: gây thán thư trên cây cà chua, cây tiêu [49], [50]

- Phytophthora sp.: mục rễ, hỏng trái ở cây ca cao [31]

- Pythium sp.: gây úng thối ở thuốc lá, đậu [57]

- Rhizoctonia sp.: gây mục rễ, thân và hạt [20]

Hiện nay, các chủng nấm Trichoderma sp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thương mại, với thành phần chính là

Trichoderma sp kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh trên cây trồng Ở

Mỹ, người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống để tăng tính kháng bệnh của cây trồng [53], [55] Ngoài ra, ở New Zealand áp dụng phun

bào tử nấm Trichoderma lên khắp cánh đồng trước khi sản xuất nhằm tăng

khả năng đề kháng của cây trồng đối với các loại nấm bệnh gây hại [41]

Trong nước, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm

Trichoderma để xử lý đất trước khi gieo trồng hoặc trộn nấm mốc vào phân

chuồng hoai mục trước khi bón ruộng 5 – 10 ngày có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp, hại lúa [9]

Trichoderma còn được nghiên cứu để phân hủy các chất ô nhiễm như T.harzianum có thể phân hủy các hợp chất cloroguaiacol, thuốc trừ sâu DDT,

trong 24 giờ có thể phân giải 60% thuốc diệt cỏ Durion trong đất…

Trichoderma reesei RUT – 30 được nghiên cứu để xử lý chất thải đô thị, phân

hủy rơm rạ [17]

Ngoài ra, có rất nhiều nghiên cứu về nấm Trichoderma với khả năng

kích thích sinh trưởng, sản xuất enzim, ứng dụng trong công nghệ chuyển gen tạo giống cây trồng có khả năng kháng bệnh… [11], [21], [37]

b Trong lĩnh vực cải thiện năng suất cây trồng

Hiện nay, các nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới – thực chất là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có tác dụng phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh nấm sương mai, bệnh đốm nâu…, hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzim của các nấm gây bệnh này, đồng thời đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn [24]

Một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy nếu ngô có Trichoderma

harzianum T–22 kí sinh ở rễ thì cần lượng đạm ít hơn 4% so với rễ không có

T-22 Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và sự ra hoa

Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và

Trichoderma koningii kích thích sự nảy mầm và tăng trưởng của cây Đối với

các hoa được trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy nhanh sự ra

hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa; cải thiện cấu trúc

và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của VSV nốt sần cố định đạm trong đất, duy trì sự cân bằng của các VSV hữu ích trong đất; bảo toàn và

tăng độ phì nhiều, dinh dưỡng cho cây trồng Trichoderma harzianum phân

giải từ xenluloza có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh dưỡng và kích thích sinh trưởng của cây Ngoài ra, để tăng đề kháng của cây

trồng, một số chủng Trichoderma harzianum còn có thể xâm nhập vào mô tế

bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh trên cây trồng [9]

Như vậy, các chủng nấm Trichoderma sp trong các chế phẩm phân

hữu cơ vi sinh không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả

mà còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên

Tương tự, có nhiều gen được tạo dòng từ Trichoderma sp., mở ra một

hướng đi mới trong công tác bảo vệ mùa màng, sản xuất các cây lương thực

an toàn và gần gũi với thiên nhiên, tạo ra các cây chuyển gen có khả năng chống chịu bệnh tốt [58]

1.2 KHÁI QUÁT VỀ BỆNH THỐI CỔ RỄ TRÊN CÂY CẢI BẸ XANH

(BRASSICA JUNCEA) DO NẤM FUSARIUM

Nấm Fusarium thuộc họ Tuberculariceae, bộ Moniliales, lớp Nấm bất

toàn (Deuteromycetes) [30] Đây là loại nấm có thành phần loài rất phong phú

và đa dạng Loài nấm này gây hại nhiều loại cây trồng trên tất cả các bộ phận đặc biệt bộ phận gốc và rễ của cây

Tản nấm có màu trắng phớt hồng, sợi nấm đa bào, không màu Sinh sản

vô tính hình thành ra hai loại bào tử lớn và bào tử nhỏ Bào tử lớn đa bào, thường có 3 ngăn ngang, hơi cong một đầu thon nhọn, một đầu có hình bàn chân nhỏ, kích thước từ 30 – 50 x 3,5 – 5,5µm Bào tử nhỏ đơn bào hình trứng hoặc hình bầu dục hình thành trên bọc giả đính trên cành bào tử phân sinh trên sợi nấm, bào tử lớn hình thành từ cành bào tử phân sinh nhiều nhánh

xếp thành tầng Nấm có thể sinh ra bào tử hậu hình cầu, vỏ dày, màu nâu nhạt, kích thước 9 - 10µm

Nấm phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ từ 25 – 300C Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện ấm và ẩm Nguồn bệnh có thể tồn tại trong đất, trong tàn dư cây bệnh

Các biện pháp hóa học, luân canh rất khó có hiệu quả diệt nấm gây bệnh Biện pháp hiệu quả nhất là chọn giống chống bệnh Người ta đã tìm ra một loại protein dùng trong việc chọn giống một số nấm gây bệnh trong đó có

nấm Fusarium sp và đã thông báo về việc sử dụng axit fusaric để chọn giống

chủng 1 của nấm gây bệnh

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÂY CẢI BẸ XANH (BRASSICA JUNCEA)

Cây cải bẹ xanh (Brassica juncea) là một loài thực vật thuộc họ Cải

(Brassicaceae) Loài của miền nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, có nhiều ở vùng Trung Á Ở nước ta, cây được trồng phổ biến khắp cả nước [18]

Cây cải bẹ xanh là cây thân thảo, cao 40 - 60cm hay hơn, rễ trụ ít phân nhánh Lá mọc từ gốc, hình trái xoan, tù, có cuống lá có cánh với 1 - 2 cặp tai lá; phiến dài tới 1m, rộng 60cm, hơi hay có răng không đều; các lá ở thân tiêu giảm hơn; các lá phía trên hình dải - ngọn giáo dài 5cm, rộng 5-10mm [18]

Thành phần dinh dưỡng trong cải bẹ xanh gồm có: vitamin A, B, C, K, axit nicotic, catoten, abumin…, nên được các chuyên gia dinh dưỡng khuyên dùng vì có nhiều lợi ích đối với sức khỏe cũng như có tác dụng phòng chống bệnh tật [18]

Theo Đông y Việt Nam, cải bẹ xanh có vị cay, tính ôn, có tác dụng giải cảm hàn, thông đàm, lợi khí Phân thân, lá dùng làm rau ăn còn phần hạt có

vị cay, tính nhiệt, không độc, trị được các chứng phong hàn, ho đờm, hen, đau họng, tê dại, mụn nhọt [18]

Đối với những thực phẩm có màu xanh đậm như cây cải bẹ xanh

(Brassica juncea) thì hàm lượng vitamin cao, cung cấp nhiều axit folic cần

thiết cho tế bào máu Trong các loại rau họ Cải nói chung và cây cải bẹ xanh nói riêng rất giàu chất chống oxy hóa các mô tế bào Vì vậy cần cung cấp 200 – 300 gram trong khẩu phần ăn hàng ngày để đảm bảo sức khỏe và phòng chống một số bệnh tật [18]

4 SƠ LƯỢC VỀ VỊ TRÍ ĐỊA LÝ VÀ ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN, KINH

TẾ XÃ HỘI XÃ HÕA PHONG, HUYỆN HÕA VANG, TP ĐÀ NẴNG .4 Vị trí địa lý, điều kiện tự n iên

Xã Hoà Phong nằm ở trung tâm hành chính huyện Hoà Vang

- Phía đông giáp xã Hoà Tiến

- Phía nam giáp xã Hoà Khương

- Phía bắc giáp xã Hoà Nhơn

- Phía tây giáp xã Hoà Phú

Tổng Diện tích tự nhiên hơn 18.59 km2

có Quốc lộ 14 b, tuyến đường

14 g, tuyến đường ADB 5 chạy qua, đất đai ở xã Hòa Phong gồm các loại đất cát, đất phù sa, đất xám bạc màu Xã có địa hình tương đối bằng phẳng, ít chia cắt Nhìn chung, xã nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hai mùa rỗ rệt Với khí hậu này sẽ thuận lợi cho việc phát triển nhiều loại cây trồng

4 Điều kiện kin tế xã ội

Tổng dân số 16.259 khẩu, 4.140 hộ, trong đó có hơn 70% hộ sản xuất nông nghiệp Kinh tế chủ yếu dựa vào cây lúa nước, cây công nghiệp ngắn ngày và cây hoa màu Trong những năm gần đây, hoàn loạt diện tích đất canh tác không hiệu quả chuyển sang trồng rau, màu Các sản phẩm nông sản được đưa đến các chợ đầu mối trong trung tâm thành phố để tiêu thụ, mang lại thu nhập kinh tế khá cao cho người dân

CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Nấm Fusarium gây bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh (Brassica juncea)

phân lập được tại thôn Túy Loan, xã Hòa Phong, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

- Các chủng nấm Trichoderma phân lập được từ các mẫu đất trên đất

trồng rau tại thôn Túy Loan, xã Hòa Phong, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân lập và xác định chủng vi nấm Fusarium gây bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh (Brassica juncea) tại thôn Túy Loan, xã Hòa Phong, huyện

Hòa Vang, TP Đà Nẵng

- Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với vi nấm Fusarium gây bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh (Brassica juncea) tại thôn Túy Loan, xã Hòa Phong, huyện Hòa Vang, TP Đà

Nẵng

- Tiến hành lên men xốp và ứng dụng chế phẩm từ nấm Trichoderma tuyển chọn có khả năng đối kháng mạnh với chủng nấm bệnh Fusarium gây bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh (Brassica juncea)

3 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3 Địa điểm t u mẫu n o i t ực địa

- 30 mẫu đất các loại (thịt trung bình, thịt nhẹ, cát pha) được lấy tại vùng trồng rau của thôn Túy Loan, xã Hòa Phong, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

- Chủng vi nấm gây bệnh được phân lập từ 15 mẫu đất và 15 mẫu thân, lá ,

rễ cây cải bẹ xanh tại thôn Túy Loan, xã Hòa Phong, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

3 Địa điểm n iên cứu tron p òn t í n iệm

Phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh – Sinh lý thực vật của khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

Phòng thí nghiệm môi trường của khoa Môi trường, Trường Đại học Duy Tân

3.3 P ạm vi n iên cứu

- Xác định sự hiện diện của chủng vi nấm Fusarium gây bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh (Brassica juncea) tại thôn Túy Loan, xã Hòa Phong,

huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

- Phân lập các chủng nấm Trichoderma trong các loại đất trồng rau tại

thôn Túy Loan, xã Hòa Phong, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

- Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với vi nấm Fusarium gây bệnh thối cổ trên cây cải bẹ xanh (Brassica

 CT1: Cây cải bẹ xanh + Đất + Môi trường lên men xốp

 CT2: Cây cải bẹ xanh + Đất + Chế phẩm Trichoderma

 CT3: Cây cải bẹ xanh + Đất + Môi trường lên men xốp + Nấm bệnh

 CT4: Cây cải bẹ xanh + Đất + Chế phẩm Trichoderma + Nấm bệnh

 CT5: Cây cải bẹ xanh + Đất + Chế phẩm Trichoderma thị trường +

Nấm bệnh

2.3.4 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ tháng 5/2015 đến tháng 5/2016

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4 P ươn p áp t u mẫu ngoài thực địa

- Thu mẫu:

Để đảm bảo mẫu đại diện, các điểm lấy mẫu phải được phân bố ngẫu nhiên trong diện tích đất điều tra, theo phương pháp lấy điểm theo đường

chép [8]

Mẫu đất được lấy xa đường đi, lấy từ tầng canh tác bề mặt từ 5 – 20cm

ở các vị trí khác nhau ( 4 – 5 vị trí ) Chọn 1 ô vuông diện tích 1 m2 , xác định

4 điểm ở các góc vuông của ô và tâm của ô vuông

Đánh dấu địa điểm để tháng sau lấy tại những địa điểm này

Mẫu đất được lấy trên các vùng đất đã chọn trong 6 tháng, từ tháng 5/2015 đến tháng 12/2015, mỗi tháng lấy mẫu 1 lần Mẫu đất được bỏ trong túi nilon cột chặt để hạn chế sự thoát hơi nước làm giảm độ ẩm Các mẫu được phân lập ngay hay bảo quản trong tủ lạnh ở 40C, sau đó phân tích càng sớm càng tốt, tốt nhất là trước 24 giờ [5], [27]

4 P ươn p áp n iên cứu tron p òn t í n iệm

a Phương pháp phân lập

* Phân lập nấm Trichoderma

Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập Egorov

- Môi trường phân lập: môi trường PDA

- Cách tiến hành: Lấy 0,1 ml dịch mẫu cho vào các hộp lồng có chứa môi trường phân lập vô trùng Sau đó cùng que trang dàn đều giọt dịch trên mặt thạch Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri còn lại Đặt các đĩa petri trên ở nhiệt độ phòng, sau 3 – 5 ngày nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ đặc trưng của nấm

Trichoderma cấy truyền sang ống giống đến khi thuần chủng [15], [26]

* Phân lập mẫu cây bệnh

- Phân lập nấm bệnh từ đất

Tương tự như phân lập nấm Trichoderma

b Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

Số lượng tế bào sống trong các cơ chất phân lập trên môi trường sinh dưỡng đặc được biểu thị bằng đơn vị CFU (Colony Forming Unit), 1 UFU tương ứng với 1 khuẩn lạc phát triển từ 1 tế bào ban đầu của 1 loại vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng trong đĩa thạch [15] Tính số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g cơ chất theo công thức:

W: Trọng lượng khô của 1g mẫu

c Phương pháp giữ giống

Sử dụng phương pháp giữ giống của Egorov để bảo quản giống cho những nghiên cứu tiếp theo, tiến hành cấy truyền định kỳ 1 tháng 1 lần trên môt trường thạch nghiên Nuôi cấy ở tủ ấm 28 – 300

C trong 2 – 7 ngày, sau

đó để trong tủ lạnh ở 40C Trước khi mang ra sử dụng cần cấy truyền qua ống nghiệm mới đã có sẵn môi trường [8]

d Phương pháp thử tính đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm Fusarium gây bệnh thối cổ rễ trên cây cải bẹ xanh

- Môi trường thử đối kháng ( môi trường giá đỗ)

- Cách tiến hành: các chủng nấm Trichoderma sử dụng để thử nghiệm

khả năng đối kháng được nuôi thuần chủng trên môi trường giá đỗ sau 5 – 7 ngày [12], [26]

- Rót môi trường giá đỗ vào đĩa petri, để nguội và kiểm tra tạp nhiễm sau 24 giờ

- Kẻ một đường ở giữa ( phần đáy)

- Cấy nấm Trichoderma và chủng nấm bệnh đã được chọn trên 2 điểm

đối xứng nhau trên đường vừa kẻ như hình 2.1

Hình 2.1 Cách cấy nấm Trichoderma và nấm bệnh trên đĩa petri

Thí nghiệm được thực hiện với 2 công thức:

CT1: TR và NB cấy đồng thời

CT2: NB cấy độc lập (đối chứng)

Mỗi công thức được thực hiện với 3 lần lặp lại, mỗi đĩa petri là một công thức, ủ ở nhiệt độ 250C - 300C Theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển

của Trichoderma và chủng nấm gây bệnh thực vật

- Chỉ tiêu theo dõi: bán kính khuẩn lạc theo thời gian

- Quy ước về khả năng đối kháng của Trichoderma đối với các chủng

nấm bệnh [19]: sau khi tiến hành thử đối kháng, theo dõi các đĩa đã cấy cho

đến khi hai khuẩn lạc của Trichoderma và nấm bệnh tiếp xúc nhau Ghi nhận

kết quả đối kháng theo quy ước sau:

2+: bào tử nấm Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh

Hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bị ức chế và tàn lụi dần Hiệu quả ức chế từ

40 – 60%

3+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế > 60 – 80%

4+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế > 80 – 90%

5+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế > 90%

Trong đó: H: hiệu quả ức chế

d: đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh sau khi đạt hiệu quả đối kháng ở mức tối đa

dB: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh đối chứng

e Phương pháp lên men trên môi trường xốp

Chọn một số chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh đối với nấm Fusarium trên môi trường giá đỗ dùng để lên men xốp tạo chế phẩm

trong điều kiện phòng thí nghiệm [13]

- Môi trường lên men xốp có thành phần là cám và trấu theo 3 công thức được trình bày trên bảng 2.1:

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men xốp

Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3

20g cám gạo 15g cám gạo 10g cám gạo

10g trấu 15g trấu 20g trấu

Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện 3 lần Sau khi lên men xong,

đếm số lượng bào tử nấm Trichoderma bằng phương pháp Koch [9]

- Cách tiến hành: cân thành phần cơ chất theo đúng tỉ lệ, cho thêm vào 15ml nước cất, khử trùng các loại cơ chất ở nhiệt độ 1200

C, áp suất 1atm, trong thời gian 30 phút Sử dụng các hộp xốp kích thức 15cm x 20cm để chứa sản phẩm lên men Cắt 10 khoanh thạch (đường kính 0.5cm) nấm

Trichoderma được chọn nghiền nát cho vào môi trường và trộn đều Ủ các

hộp xốp trong phòng kín cho đến khi bào tử nấm mọc xanh đầy mặt hộp đem

đi sấy khô ở nhiệt độ 250

C - 300C cho đến khi độ ẩm còn khoảng 12% cho vào máy xay nhuyễn và để vào bao ni lông giữ ở nhiệt độ phòng (250C)

* Phương pháp lây bệnh vào đất

- Chuẩn bị sinh khối nấm:

+ Ngâm hạt thóc trong nước sạch 12 – 14 giờ để hạt thóc ngấm nước Chắt bỏ phần nước, vớt thóc ra Sau đó luộc chín sao cho độ nở của hạt thóc khoảng 1/3, kiểm tra không còn lõi trắng ở giữa là đạt yêu cầu Để thóc nguội

và cho vào bình tam giác, làm nút bông và hấp thanh trùng ở chế độ

1210C/1,5 – 2 giờ

+ Cấy nấm bệnh vào môi trường hạt đã chuẩn bị

+ Nuôi sinh khối nấm bệnh ở 25 – 300C trong 7 ngày

- Trộn sinh khối nấm bệnh vào đất để trồng cây cải bẹ xanh

- Chuẩn bị lô đối chứng: không trộn sinh khối nấm bệnh vào đất

- Kiểm tra và so sánh những thùng cây cải bẹ xanh được lây bệnh với những thùng đối chứng Quan sát, ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng quan sát được trên vườn rau

* Phương pháp lây bệnh trên cây và lá

Chuẩn bị dịch bào tử bằng cách cạo các bào tử và sợi nấm ra khỏi đĩa cấy và cho vào môi trường PDA dạng lỏng Tiến hành nuôi cấy lắc trong 72 giờ với tốc độ 120 vòng/phút

- Phun dịch bào tử lên lá và thân cây cải bẹ xanh được lây bệnh

Đĩa khuẩn lạc nấm

Chế phẩm nấm

Trichoderma

dạng bột

- Phun nước vô trùng lên lá và thân cây cải bẹ xanh đối chứng

Sau đó, kiểm tra, so sánh cây cải bẹ xanh được lây bệnh với cây cải bẹ xanh đối chứng

2.4.4 Đánh giá hiệu quả phòng trừ nấm Fusarium của chế phẩm nấm Trichoderma thu được

- Trong phòng thí nghiệm trên đĩa petri

+ Nguyên tắc: lên men xốp thu nhận chế phẩm dạng bào tử đính có khả năng chống lại các loại nấm gây bệnh hại cây trồng Sau đó thử nghiệm khả năng chống lại các loại nấm bệnh trên môi trường tốt nhất

+ Cách tiến hành: chuẩn bị môi trường đối kháng (giá đỗ), hấp khử trùng trong 30 phút, để nguội 50 – 600

C rồi đổ 20ml vào đĩa petri vô trùng có kích thước bằng nhau (10cm) Các đĩa đối chứng: nấm bệnh được cấy một chấm ở giữa đĩa petri Các đĩa thí nghiệm: nấm bệnh được cây một chấm ở

giữa đĩa petri Sau đó 1 ngày, lấy chế phẫm Trichoderma rắc đều xung quanh

và cách nấm bệnh khoảng 0.5cm Mỗi công thức lặp lại 3 lần Các đĩa đối chứng và thí nghiệm được nuôi ở nhiệt độ 25 – 300C Quan sát đường kính khuẩn lạc nấm bệnh sau 24, 48, 72, 96, 120 giờ sau khi rắc chế phẩm

Hình 2.3 Cách cấy nấm bệnh và rắc chế phẩm Trichoderma trên đĩa petri

- Trên cây cải bẹ xanh (Brassica juncea)

NB

NB

TR

+ Nguyên tắc: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 công thức và lặp lại 3 lần Do thời gian có hạn nên chỉ tiến hành với 5 công thức sau:

CT1: Cây cải bẹ xanh + Đất + Môi trường lên men xốp

CT2: Cây cải bẹ xanh + Đất + Chế phẩm Trichoderma

CT3: Cây cải bẹ xanh + Đất + Môi trường lên men xốp + Nấm bệnh

CT4: Cây cải bẹ xanh + Đất + Chế phẩm Trichoderma + Nấm bệnh CT5: Cây cải bẹ xanh + Đất + Chế phẩm Trichoderma thị trường +

Nấm bệnh

+ Phương pháp tiến hành:

Rau được trồng trong các thùng xốp: xử lý đất, loại bỏ tạp chất, cho đất

vào thùng xốp (20kg/thùng), đập nhỏ, trọn đều chế phẩm nấm Trichoderma

(2kg/thùng) vào các thùng thuộc CT2, CT4 cung cấp độ ẩm cho nấm phát

triển, sau 24 giờ quan sát thấy nấm Trichoderma phát triển trên bề mặt thùng,

tiến hành gieo hạt, hạt cây cải bẹ xanh giống được gieo thành hàng trên thùng xốp (15 hạt/chậu) Sau khi gieo 15 ngày ( rau cải xuất hiện 5 – 6 lá thật), tiến

hành đưa chủng nấm Fusarium (gây bệnh thối cổ rễ) đã được nhân sinh khối

trên môi trường PDA (200ml/thùng) vào các thùng CT3, CT4, vị trí chủng bệnh cách gốc 0,5cm và sâu 0,5cm dưới mặt đất, cung cấp độ ẩm thường xuyên cho nấm bệnh phát triển, quan sát mức độ gây hại trên rau tại thời điểm

5 và 10 ngày sau khi lây nhiễm nấm bệnh

+ Sơ đồ thí nghiệm:

Giai đoạn 1: ( khi chưa chủng nấm bệnh)