ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Sau khi thu thập thông tin lâm sàng, nghiên cứu tiến hành lấy 2 mL máu tĩnh mạch ngoại biên, bảo quản trong ống chống đông EDTA Mẫu máu này được chuyển đến Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh trong vòng 12 giờ và được giữ ở nhiệt độ +4°C để phân tích.
72 giờ kể từ thời điểm rút máu.
Nghiên cứu tách chiết DNA từ mẫu máu sử dụng bộ kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification (Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, Hoa Kỳ).
2.2.3 Định gen bằng kỹ thuật Sanger Sequencing
Thiết kế mồi cho PCR và sequencing
Cặp mồi khuếch đại vùng mang đa hình đơn của các gen được thiết kế bằng phần mềm CLC Main Workbench v5.5, với các mồi được lựa chọn dựa trên vị trí có các vùng đặc trưng.
GC tương tự nhau để có cùng nhiệt độ bắt mồi.
Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu
Gen Đoạn mồi Trình tự (5’ >3’)
Thiết lập điều kiện PCR
Mỗi ống PCR có thể tích 15 μl bao gồm: 1,5 μl PCR buffer 10X, 1,5 μl dNTP 2,5mM, 0,75 μl mỗi mồi xuôi và ngược (10nM/μl), 0,1 μl TaKaRa Taq TM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2 μl genomic DNA (20-50 ng/μl) và 8,4 μl nước cất 2 lần khử ion Để kiểm soát ngoại nhiễm, các phản ứng luôn có một chứng âm không chứa DNA.
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra và tinh sạch trước khi tiến hành phản ứng chu trình giải trình tự bằng BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) theo cả hai chiều xuôi và ngược cho mỗi đoạn cần đọc Sau đó, sản phẩm được kết thúc.
3500 (Applied Biosystems, Mỹ) Kết quả được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench v5.5
2.2.4 Định gen bằng kỹ thuật ASO-PCR
Sau khi xác định kiểu gen cho chứng âm và chứng dương trong kỹ thuật ASO-PCR bằng Sanger Sequencing, tiến hành thực hiện phản ứng ASO-PCR và phân tích kết quả điện di.
Y đức
Nghiên cứu sẽ chỉ được thực hiện sau khi bệnh nhân nhận được tư vấn đầy đủ và ký vào đồng thuận tham gia Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu bất kỳ lúc nào.
− Việc thăm khám và lấy 2 mL máu tĩnh mạch không làm nặng thêm tình trạng bệnh và không ảnh hưởng đến quá trình điều trị.
− Thông tin được bảo mật và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu
− Đề cương nghiên cứu được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
KẾT QUẢ
Phát hiện các đa hình đơn bằng giải trình tự Sanger
Để thiết kế và chuẩn hóa phản ứng ASO-PCR nhằm phát hiện các điểm đa hình đơn, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi xuôi và ngược của gen AGT và AGTR1 để giải trình tự DNA qua kỹ thuật Sanger Kết quả Sanger cho thấy hai loại biến thể đồng hợp tử TT và dị hợp tử MT ở gen AGT, trong khi đó, ở gen AGTR1, có hai loại biến thể đồng hợp tử AA và dị hợp tử AC Những kết quả này được sử dụng làm chứng dương cho phản ứng ASO-PCR.
Hình 3.1: Điểm đa hình đơn M235T trên gen AGT
Chuẩn hóa điều kiện ASO-PCR
Sau khi có chứng dương, chúng tôi chuẩn hóa điều kiện ASO-PCR để phát hiện các điểm đa hình gen Trong phản ứng, chúng tôi sử dụng hai cặp mồi: cặp mồi thứ nhất kiểm tra chất lượng DNA và hiệu quả của phản ứng PCR, trong khi cặp mồi thứ hai phát hiện các điểm đa hình đơn Trình tự và tỉ lệ giữa các mồi được trình bày trong bảng 1, 2 và 3.
Bảng 3.1: Trình tự và tỉ lệ mồi thực hiện phản ứng ASO-PCR phát hiện điểm đa hình đơn M235T trên gen AGT
Tên Trình tự mồi Chiều dài
Hình 3.2: Điểm đa hình đơn A1166C trên gen
Bảng 3.2: Trình tự và tỉ lệ mồi thực hiện phản ứng ASO-PCR phát hiện điểm đa hình đơn A1166C trên gen AGTR1
Tên Trình tự mồi Chiều dài (bp)
Bảng 3.3: Trình tự thực hiện phản ứng PCR phát hiện biến thể I/D (rs1799752) của gen ACE
Tên Trình tự mồi Chiều dài (bp)
ACE-F 5’- ACTCTGTAAGCCACTGCTGG-3’ Biến thể DD: 206
Biến thể II: 510 Biến thể ID:206 và 510 ACE-R
Chúng tôi đã thiết lập chu trình nhiệt cho 3 gen AGT, AGTR1, ACE thông qua quá trình chuẩn hóa điều kiện Chu trình bắt đầu ở 98°C trong 3 phút, sau đó lặp lại 40 chu kỳ với các bước 98°C trong 20 giây và 56°C trong 20 giây.
Quá trình phản ứng bắt đầu ở nhiệt độ 72°C trong 30 giây, tiếp theo là 72°C trong 2 phút Mỗi phản ứng đều có chứng âm không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm Kết quả điện di được trình bày trong hình 3, 4 và 5.
Hình 3.3: Kết quả điện di gen AGT
Kết quả khảo sát điểm đa hình đơn trên mẫu bệnh nhân bằng kỹ thuật ASO-PCR
Ứng dụng kỹ thuật ASO-PCR đã được xây dựng ở trên, chúng tôi tiến hành khảo sát tần số kiểu gen trên 100 bệnh nhân: bao gồm 50 bệnh nhân tăng
Hình 3.4: Kết quả điện di gen AGTR1
Hình 3.5: Kết quả điện di gen ACE allele của các biến thể gen AGT M235T, ACE I/D và AGTR1 A1166C được trình bày ở bảng 3
Bảng 3.4 Tần số kiểu gen của các gen hệ renin – angiotensin
BÀN LUẬN
Bệnh lý tim mạch, đặc biệt là tăng huyết áp, đang trở thành mối lo ngại lớn cho sức khỏe ở các nước đang phát triển Tăng huyết áp là nguyên nhân chính gây ra bệnh tật và tử vong do biến cố tim mạch, nhưng có thể phòng ngừa Nghiên cứu về các yếu tố di truyền, đặc biệt là đa hình nucleotide đơn (SNPs), đang thu hút sự chú ý với tiềm năng cá thể hóa điều trị và cải thiện khả năng đáp ứng với thuốc của từng bệnh nhân Tăng huyết áp là bệnh lý đa gen, chịu ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường Hiện tại, khoảng 150 gen đã được xác định liên quan đến tăng huyết áp, trong đó angiotensinogen (AGT), enzyme chuyển đổi angiotensin-1 (ACE), và thụ thể Angiotensin típ 1 (AGTR1) là những gen quan trọng trong hệ thống renin-angiotensin (RAS).
Nghiên cứu ban đầu của Jeunemaitre và cộng sự đã chỉ ra vai trò tiềm năng của gen AGT trong tăng huyết áp, với hai phân tích tổng hợp tại Trung Quốc xác nhận rằng alen T của đa hình AGTM235T liên quan đến tăng huyết áp nguyên phát Tuy nhiên, Niu và cộng sự không tìm thấy mối liên hệ giữa tăng huyết áp nguyên phát và đa hình AGTM235T, ngay cả khi phân tích theo độ tuổi, giới tính và mức độ nghiêm trọng Tương tự, nghiên cứu của Caulfiels cũng không phát hiện mối liên quan này Ngược lại, nghiên cứu của Mohana cho thấy nguy cơ cao hơn mắc bệnh tăng huyết áp ở phụ nữ mang biến thể AGTM235T (OR = 2.82; 95% CI 1.22-6.49; p=0.012).
Nghiên cứu cho thấy có sự tương quan giữa tăng huyết áp và các kiểu gen AGT MT và TT ở các nhóm dân số như người Malaysia, người Hán, nam giới ở Uzbekistan và Hồng Kông Tuy nhiên, không có mối liên quan đáng kể giữa tăng huyết áp và kiểu gen này ở Anh và người da trắng.
ACE is a key enzyme in the renin-angiotensin system, facilitating the conversion of angiotensin I to angiotensin II The ACE gene, which encodes the ACE protein, is located on chromosome 17q23 and consists of 26 exons.
Nghiên cứu về đa hình chèn/xóa (I/D) trong intron 16 của gen ACE đã chỉ ra sự hiện diện của ba kiểu gen: DD (đồng hợp tử xoá), II (đồng hợp tử chèn) và ID (dị hợp tử) Phân tích tổng hợp từ 41 nghiên cứu liên quan đến 4708 ca bệnh và 5368 ca chứng trong dân số Trung Quốc cho thấy không có mối liên quan thống kê giữa đa hình ACE I/D và yếu tố nguy cơ tiểu đường típ 2 (T2DM) trong các mô hình di truyền Mặc dù một số nghiên cứu, như của Zarouk, đã chỉ ra rằng kiểu gen DD và alen D có liên quan đến tăng huyết áp và T2DM ở bệnh nhân Ai Cập, nghiên cứu của Zhou lại cho thấy tần số kiểu gen ID và DD tăng ở nhóm chứng so với nhóm bệnh Tuy nhiên, kết luận rằng đa hình gen ACE I/D không phải là yếu tố nguy cơ của T2DM trong dân số vẫn được khẳng định qua các nghiên cứu trước đó.
Một nghiên cứu cắt ngang đã chỉ ra mối liên hệ giữa tăng huyết áp và tiền sử gia đình ở người da trắng, nhưng kết quả vẫn gây tranh cãi với một số nghiên cứu ủng hộ và một số khác thì không Gần đây, có nghiên cứu cho thấy biến thể gen có thể giải thích tình trạng tăng huyết áp quá mức ở người Mỹ gốc Phi, trong khi một nghiên cứu khác phát hiện chỉ số huyết áp thấp hơn ở những người mang kiểu gen đồng hợp tử CC.
Nghiên cứu tổng kết mối tương quan giữa các biến thể gen RAS ở các chủng tộc khác nhau cho thấy sự khác biệt theo độ tuổi, giới tính và đặc điểm dân số Chúng tôi đã phát triển quy trình xác định các biến thể AGT M235T, ACE I/D, AGTR1 A1166C để khảo sát mối liên hệ giữa các biến thể này với bệnh tim mạch và phản ứng với thuốc điều trị, tạo nền tảng cho các nghiên cứu quy mô lớn hơn trong tương lai.