Nghiên cứu chiết tách chất azadirachtin từ hạt neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học

Tuy nhiên, để nâng cao năng suất, các nhà vườn vẫn sử dụng không có kiểm soát một lượng lớn phân bón vô cơ, chất kích thích tăng trưởng và các chất bảo vệ thực vật với mục tiêu nâng cao

ỨNG DỤNG LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng, Năm 2017

ỨNG DỤNG LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60.44.01.14

N ƣ ƣ d ọc PGS TS NGUYỄN BÁ TRUNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng, Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Cẩm An

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Phương pháp nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

6 Cấu tr c luận văn 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1 1 THUỐC TRỪ SÂU 5

1.1.1 Khái niệm 5

1.1.2 Phân loại 5

1 2 THUỐC TRỪ S U SINH HỌC 11

1.2.1 Định nghĩa và phân loại 11

1.2.2 Ưu và nhược điểm của thuốc trừ sâu sinh học 11

1.2.3 Tình hình nghiên cứu, sử dụng và quản lý thuốc trừ sâu sinh học ở Việt Nam 12

1.2.4 Một số chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gố từ thực vật 14

1.3 T C T Ừ N ỌC C N N C TỪ N 18

1.3.1 Giới thiệu về neem 18

1.3.2 Các thành phần chính chiết xuất từ cây neem 21

1.3.3 Thuốc trừ sâu sinh học từ chất azadirachtin chiết xuất từ nhân hạt neem 23

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU 26

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 26

2.1.1 Nguyên liệu 26

2.1.2 Hóa chất 26

2.2 P Ư N P P N N CỨ 27

2.2.1 Chiết tách azadirachtin 27

2.2.2 Phân tích azadirachtin bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp 30

2.2.3 Định lượng azadirachtin bằng phương pháp phân tích sắc kí lỏng cao áp 31

2.2.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của độ bền azadirachtin 32

2.2.5 Đánh giá hoạt tính tiêu diệt sâu của azadirachtin 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 X Y N Y T N P N T C Z C T N N P Ư N P P P N T C P C 34

3.1.1 Tối ưu hóa quá trình 34

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn 35

3.2 CHIẾT TÁCH AZADIRACHTIN TRONG NHÂN HẠT NEEM 37

3.2.1 Chiết tách bằng phương pháp p cơ học kết hợp với sử dụng dung môi h u cơ 37

3.2.2 Chiết tách bằng dung môi h u cơ 38

3.2.3 Phân tích đặc trưng của sản phẩm azadirachtin chiết tách 39

3.3 CÁC YẾU T ẢN ƯỞN ĐẾN ĐỘ BỀN CỦA AZADIRACHTIN 41

3.3.1 Ảnh hưởng của dung môi 41

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 43

3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ 44

3.4 Đ N K Ả NĂN ỆT SÂU BỌ 46

KẾT LUẬN VÀ IẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao)

3.1 Mối quan hệ gi a nồng độ và diện tích peak của mẫu

azadirachtin ứng thời thời gian lưu 6,89 ph t

36

3.2 Kết quả phân tích hàm lượng azadirachtin thực hiện theo 2 quy

trình

39

3.3 Phần trăm hao hụt của mẫu azadirachtin trong các dung môi theo

thời gian ở nhiệt độ phòng

42

3.4 Phần trăm hao hụt của mẫu azadirachtin theo thời gian ở các

nhiệt độ

43

3.5 Phần trăm hao hụt của mẫu azadirachtin trong dung môi

methanol theo thời gian ở nhiệt độ phòng

45

3.6 Thống kê thời gian gây chết 50% và 100% của các mẫu

azadirachtin ở các nồng độ thử nghiệm

47

lấy dầu kết hợp với chiết tách bằng dung môi h u cơ

29

2.2 Quy trình chiết tách azadirachtin bằng phương pháp chiết với

dung môi h u cơ

30

2.3 Các thiết bị trong hệ thống HPLC: 31 3.1 Sắc kí đồ HPLC của mẫu azadirachtin chuẩn 100 ppm trong

hệ dung môi pha động là Acetonitrile : H3PO4 0,1% ứng với tỉ

lệ 40 : 60 về thể tích

35

3.2 Đường chuẩn mô tả sự phụ thuộc nồng độ của azadirachtin

vào diện tích peak sắc kí

36

3.3 Phổ hồng ngoại IR của mẫu azadirachtin chiết tách bằng dung

môi h u cơ

40

3.4 Sắc kí đồ HPLC của mẫu azadirachtin 100 ppm chiết tách

bằng dung môi h u cơ trong hệ dung môi pha động là

Acetonitrile : H3PO4 0,1% ứng với tỉ lệ 40 V : 60 V

41

3.5 Phần trăm hao hụt của mẫu azadirachtin trong các dung môi

theo thời gian ở nhiệt độ phòng

42

3.7 Phần trăm hao hụt của mẫu azadirachtin trong dung môi

methanol theo thời gian ở nhiệt độ phòng

45

3.8 Biểu hiện sau say thuốc và chết khi xử lý với azadirachtin

nồng độ 100 ppm sau 1.5 giờ

46

3.9 Sự phụ thuộc của thời gian gây chết 50% và 100% vào nồng

độ của mẫu azadirachtin thử nghiệm

47

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọ đề tài

Ngành nông nghiệp đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự ổn định an ninh lương thực, hệ thống kinh tế, xã hội và môi trường toàn cầu Tuy nhiên, hoạt động nông nghiệp đã và đang đối mặt với nhiều thách thức như sự tàn phá của nấm,

cỏ dại, côn trùng, dẫn đến làm giảm đáng kể năng suất cây trồng Từ năm 1960 đến nay, nhiều loại chất hóa học đã được đưa vào sử dụng rộng rãi để diệt trừ sâu bệnh Việc sử dụng các loại thuốc hóa học ở thời kì đầu đã mang lại lợi ích to lớn là tiêu diệt sâu bệnh nhanh và rất có hiệu quả

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề được toàn xã hội quan tâm trong thời gian gần đây khi tình trạng ngộ độc thức ăn, chết do các bệnh liên quan đến dư lượng các hóa chất tồn lưu trong thực phẩm được tích lũy trong cơ thể trong thời gian dài Tuy nhiên, để nâng cao năng suất, các nhà vườn vẫn sử dụng không có kiểm soát một lượng lớn phân bón vô cơ, chất kích thích tăng trưởng và các chất bảo vệ thực vật với mục tiêu nâng cao năng suất cây và tăng độ “bắt mắt” cho nông sản sau thu hoạch, đặc biệt là các loại rau trồng ngắn ngày như cải, mồng tơi, đậu

… ậu quả để lại cho canh tác không bền v ng này là đất bị thoái hóa do ngưng trệ nhiều quá trình chuyển hóa xảy ra trong nước, đất do vi sinh vật thực hiện, tiêu diệt các động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), nguy cơ ngộ độc thực phẩm và ảnh hưởng nghiêm trọng k o dài đến sức khỏe của người tiêu dùng

Do vậy, trong nh ng năm gần đây, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp h u

cơ bền v ng, trong đó có việc tăng cường sử dụng phân bón h u cơ thay thế cho phân bón vô cơ, sử dụng các loại thuốc trừ sâu sinh học (chế phẩm sinh học) trong canh tác cây trồng đang là xu hướng chung của toàn cầu, trong đó có nước ta Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học, có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra (thường

là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (là chất độc hoặc dầu thực vật) Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia thành hai nhóm chính là:

- Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus

- Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ hoặc dầu thực vật

Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi trường, bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng gi a thiên địch

và sâu hại) nên ít gây tình trạng bùng phát sâu hại trở lại, mau phân hủy trong tự nhiên nên thời gian cách ly ngắn, thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè… Tuy vậy, sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn Nhưng so với các ưu điểm to lớn thì các nhược điểm trên đây của thuốc sinh học là rất nhỏ và hoàn toàn

có thể khắc phục được

Cây Neem (xoan chịu hạn) có tên khoa học Azadirachtindirachta indica A

Juss, thuộc họ xoan (Meliaceae), có nguồn gốc từ Ấn Độ Neem loài cây ưa sáng,

mọc nhanh, có thể sinh trưởng ở nh ng vùng đất không màu mỡ, đất pha cát, chịu được khí hậu khắc nghiệt lên đến 50o

C Thành phần hóa học trong neem rất phong phú với nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao nên lá, nhựa thân cây, hạt neem được sử dụng rộng rãi làm thuốc ch a bệnh, thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc thực vật, phân bón

Theo báo cáo kết quả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, có rất nhiều thành phần hoạt chất trong cây neem, tuy nhiên chỉ có vài hoạt chất là có tác dụng trừ sâu như: Azadirachtin từ A – L, Salannin, Nimbin, Nimbidin, Meliantriol

…, trong đó nhiều nhất là azadirachtin Azadirachtin có khả năng tiêu diệt nhiều loại côn trùng bọ trĩ/l a, chè; sâu cuốn lá/lúa, nhện đỏ/chè, rầy xanh/chè, bọ xít muỗi/chè, bọ nhảy/bắp cải, sâu xanh bướm trắng/bắp cải … bằng cách gây ngán ăn của côn trùng, ngăn cản lột xác, làm trứng không nở [5]

Nhu cầu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học hiện nay là rất lớn để phục vụ cho nhu cầu nông nghiệp h u cơ bền v ng, vì vậy với mục tiêu xây dựng quy trình chiết tách có hiệu quả azadirachtin từ hạt neem ứng dụng trong sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ thực vật, chúng tôi lựa chọn

đề tài: “Nghiên cứu chiết t t z r t n từ hạt neem để ứng dụng làm

thuốc trừ sâu sinh học”

2 Mục đíc ê cứu

Xây dựng quy trình chiết tách có hiệu quả azadirachtin từ nhân của hạt neem, đánh giá độ bền của azadirachtin để từ đó ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học cho cây trồng ăn lá

4 1 P ƣơ p áp ê cứu lý thuyết

- Thu thập các tài liệu, thông tin liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu của đề tài

để đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu neem trong nước và trên thế giới, từ đó xây dựng ý tưởng cho nghiên cứu;

- Phân tích nh ng tài liệu đã công bố trong và ngoài nước để xây dựng nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Phổ hồng ngoại được sử dụng để định tính cấu trúc của azadirachtin

- Phương pháp xử lý thống kê để đánh giá hiệu quả tiêu diệt côn trùng của chế phẩm azadirachtin

5 Ý ĩ khoa học và thực tiễn củ đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 1 THUỐC TRỪ S U

1.1.1 á ệm

Thuốc trừ sâu là một loại chất được sử dụng để chống côn trùng Chúng bao gồm các thuốc diệt trứng và thuốc diệt ấu trùng để diệt trứng và ấu trùng của côn trùng

Đến nay, đã có nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau được sử dụng trong canh tác nông nghiệp ở quy mô sản xuất lớn cũng như quy mô hộ gia đình Việc sử dụng thuốc trừ sâu được cho là một trong các yếu tố chính giúp tăng sản lượng nông nghiệp trong thế kỷ 20 Tuy nhiên, gần như tất cả các loại thuốc trừ sâu đều có nguy

cơ làm thay đổi lớn các hệ sinh thái, thậm chí nhiều loại thuốc trừ sâu còn tích tụ lại trong chuỗi thức ăn, gây độc hại nghiêm trọng đến sức khỏe của con người qua nhiều thế hệ

1.1.2 P â ạ

Dựa trên nguồn gốc, người ta chia thuốc thành 2 loại: Thuốc trừ sâu có nguồn gốc tổng hợp và thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ thiên nhiên

a Thuốc trừ sâu có nguồn gốc tổng hợp

- Nhóm thuốc gốc Clo hữu cơ (CHC):

Các thuốc C C dùng để trừ côn trùng, hiện nay phần lớn thuốc nhóm này đã

bị cấm do tính tồn lưu quá lâu trong môi trường mà điển hình là DDT, Chlordane, Toxaphene, Dieldrin, Aldrin, Endrin [3][6]

Một số vẫn còn dùng rất giới hạn như ifocol và ethoxychlor Phần lớn các CHC khó phân hủy trong môi trường và tích lũy trong mô mỡ của động vật

Các CHC gồm nh ng hợp chất aryl, carbocyclic, heterocyclic có khối lượng phân tử khoảng 291-545 đơn vị carbon CHC có thể được chia ra làm 5 nhóm: (1) DDT và các chất tương tự; (2) BHC; (3) Cyclodiens và các hợp chất tương tự; (4) Toxaphene và các chất tương tự; (5) cấu trúc khép kín của Mirex và Chlordecone

C C gây độc thần kinh, tuy nhiên cũng có một số khác biệt về triệu chứng

gi a hai nhóm: (1) DDT và nh ng chất tương tự với nó gây ra sự run rẫy nhẹ lúc mới bị tr ng độc và gia tăng đến co giật; (2) các chất còn lại như lindane, aldrin, dieldrin, endrin, toxaphene và nhiều hợp chất có liên quan gây ra triệu chứng co giật ngay từ đầu.[6]

Mức kích thích thần kinh là liên quan trực tiếp với nồng độ của thuốc có trong

mô thần kinh Thông thường, các hậu quả tác động của thuốc có thể phục hồi khi nồng độ của CHC trong mô thần kinh chưa vượt quá ngưỡng tới hạn chịu đựng Hầu hết các CHC có thể đi xuyên qua da, cũng như qua hệ hô hấp và hệ tiêu hóa Mức hấp thu qua da khác biệt tùy theo chất, chẳng hạn DDT hấp thu qua da kém, còn Dieldrin lại hấp thu qua da rất mạnh Thông thường, nồng độ CHC có trong không khí dưới ngưỡng cho phép do áp suất hơi của nó thấp

C C làm thay đổi các tính chất điện của cơ thể và hoạt động của các enzyme

có liên quan đến màng tế bào thần kinh, gây ra biến đổi trong vận chuyển ion Na+

và K+ qua màng tế bào Có thể có cả sự nhiễu loạn vận chuyển Ca2+ và hoạt tính của enzyme Ca2+-ATP và enzyme phosphokinase Cuối cùng, CHC gây chết do sự dừng

hô hấp

- Nhóm thuốc gốc phospho hữu cơ (LHC):

Đây là nhóm thuốc h u cơ quan trọng nhất hiện dùng LHC do Lange và Von Kreuger tìm ra vào đầu nh ng năm 1930 (dimethyl và diethyl phosphorofluoridate) Đến năm 1936, erhard chrader chủ trì một dự án nghiên cứu và tìm ra nhiều chất khác như dimefox, octamethyl pyrophosphoramidate và tetraethyl pyrophosphate Đến nay đã có hàng ngàn chất thuộc nhóm LHC đã được tổng hợp và thương mại hóa, khoảng 100 chất khác nhau được sử dụng làm thuốc trừ sâu

Hầu hết các LHC là nh ng ester có cấu tr c như sau:

RO O(S)

P

‟ X

trong đó : R: methyl hoặc ethyl

‟: alkoxy, alkyl, aryl, amino hoặc các amino có nhóm thế X: nhóm có thể thay đổi

O mang nối đôi có thể thay thế bởi S

Các LHC khác nhau nhiều do sự thay đổi của nhóm X Thực tế, hầu hết các LHC dùng hiện nay có cấu trúc:

RO O(S)

P

RO X

trong đó: R: methyl hoặc ethyl

X: thay đổi, thông thường X là dẫn xuất của alkoxy; phenoxy; thioalkyl hoặc các chất thơm dị nhân

Các LHC chứa liên kết P=O (phosphate) hoặc P=S (phosphorothionate), trong

đó P= khá bền v ng với sự thủy phân so với P=O, bởi vậy chúng có khả năng diệt côn trùng hiệu quả hơn Tuy nhiên, tác động của nó lên enzyme cholinesterase yếu

và cần phải được hoạt hóa để trở thành P=O vốn có hoạt tính chống enzyme cholinesterase mạnh mẽ

Độc tính của C đối với côn trùng và người là do ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE) - enzyme xúc tác phản ứng thủy phân acetylcholine (ACh) Vì vậy, ACh sẽ tích tụ lại ở nh ng khớp thần kinh (synap thần kinh), tiết muscarin và nicotin, từ đó sinh ra kích thích cơ và hệ thần kinh phế vị

- Nhóm thuốc gốc carbamate h u cơ:

Đây là nhóm thuốc được dùng rộng rãi bởi vì tương đối rẻ tiền, hiệu lực cao

mà ít tồn lưu trong môi trường Thuốc là dẫn xuất của acid cabamic có chứa các nhóm phụ dithiocarbamates và thiocarbamates mang lưu huỳnh

Thuốc diệt côn trùng carbamate có nguồn gốc tự nhiên là chất physostigmine hoặc eserine Năm 1925, tedman và arger đã xác định cấu trúc của

physostigmine là một loại alcaloid có trong cây đẫu Calabar, Physostigma

venenosum Đây là một chất co đồng tử mạnh và có hoạt tính tiết acetylcholine,

physostigmine và các chất tương tự với nó

Năm 1954, ysin giới thiệu este carbamate đầu tiên được dùng làm chất diệt côn trùng Ông cũng đã mô tả tính chất nhiều loại este dimethylcarbamate au đó, các phenyl N-methylcarbamate mang nhóm thế được nghiên cứu nhiều để đem vào

sử dụng trong nông nghiệp Đến năm 1985 có 25 chất este carbamate được đưa vào

Thuốc carbamate gây tổn thương hệ thần kinh và một số khác rất độc cho động vật có vú bao gồm cả con người Thuốc nhóm này không tích lũy trong mô

mỡ, do vậy tính độc của ch ng thường ngắn và sinh vật có thể phục hồi Các thuốc Carbamate thông dụng như: carbaryl ( evin), aldicarb (Temik) và methomyl (Lannate, Nudrin)

Cũng giống như HC, các thuốc diệt trùng carbamate ức chế hoạt động của enzyme acetylcholinesterase Nhiều carbamate có độ độc cấp tính rất cao đối với động vật Aldicarb, cũng như carbofuran có độ độc cấp tính cao nên thường được dùng ở thể hạt để bón vào đất Tuy vậy, nhìn chung các thuốc trong nhóm này vẫn ít độc hơn nhóm C, cơ thể có khả năng phục hồi sau khi bị ngộ độc carbamate

- Các thuốc nhóm Pyrethrin và dẫn xuất Pyrethroids:

Pyrethrin là một cặp hóa chất h u cơ tự nhiên có khả năng diệt sâu bọ có hiệu lực Pyrethrin I và pyrethrin II về mặt cấu trúc là các este liên quan với nhau với nhân là cyclopropane Chúng chỉ khác nhau bởi trạng thái ôxi hóa của một nguyên

tử cacbon Chúng là các chất lỏng nhớt rất dễ bị oxy hóa để trở thành không hoạt hóa Pyrethroid là este của pyrethrin

Các pyrethrin được tìm thấy trong hạt của một số loại cây thường xanh như

cúc Dalmatia (Chrysanthemum cinerariaefolium) và c c a Tư (Chrysanthemum

coccineum) cũng như một số loài khác thuộc chi này như C balsamita và C

marshalli, và được trồng ở quy mô thương mại để sản xuất thuốc trừ sâu Các

pyrethrin là các chất có độc tố thần kinh, chúng tấn công hệ thần kinh của các loài sâu bọ Khi ở hàm lượng không đủ gây tử vong cho côn trùng, chúng vẫn có tác dụng xua đuổi côn trùng Ch ng cũng có hại đối với cá, nhưng là ít độc hại hơn đối với động vật có vú và chim so với nhiều loại thuốc trừ sâu tổng hợp khác (liều LD50

ở chuột là trên 2.000 mg/kg thể trọng) Chúng là các chất không bền v ng và dễ bị phân hủy sinh học, cũng như dễ dàng bị phân hủy dưới tác động của ánh sáng hay oxy nên được coi là thuộc nhóm thuốc trừ sâu an toàn nhất để sử dụng với các loại cây trồng cung cấp lương thực Đối với người, pyrethrin có tác động kích thích mắt,

da và hệ hô hấp.[1][20]

Khi ở lượng không đủ gây tử vong cho sâu bọ, chúng vẫn có tác dụng xua đuổi côn trùng Ch ng cũng có hại đối với cá, nhưng là ít độc hại hơn đối với động vật có vú và chim so với nhiều loại thuốc trừ sâu tổng hợp khác Liều LD50 ở chuột

là trên 2.000 mg/kg thể trọng.[32]

Chúng là các chất không bền v ng và dễ bị phân hủy sinh học, cũng như dễ dàng bị phân hủy dưới tác động của ánh sáng hay ôxy Ch ng được coi là thuộc số các thuốc trừ sâu an toàn nhất để sử dụng với các loại cây trồng cung cấp lương thực

b Nhóm thuốc có nguồn gốc sinh học

Trong nhóm này có: kháng sinh, vi sinh, thuốc có nguồn gốc từ thực vật, chất dẫn dụ (pheromone), hormone thực vật

- Chất kháng sinh: Là chất tiết ra từ các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn)

có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế các vi sinh vật khác Thuốc kháng sinh penicilline

dùng để trị bệnh nhiễm khuẩn, được ly trích từ nấm Penicillium sp Streptomycine

được dùng để trị bệnh nhiễm khuẩn ở người, động vật và thực vật; có thể được sản xuất bằng phương pháp tự nhiên hay nhân tạo Ngoài ra còn rất nhiều loại kháng sinh khác được phát hiện và đưa vào sử dụng

- Thuốc gốc thực vật: Một số thực vật có chứa các chất độc đối với côn trùng

và các động vật khác, chẳng hạn như hoa thủy c c (chrysanthemum) dùng để chiết

trích pyrethrum, rễ dây thuốc cá dùng để trích ra rotenone, một số cây họ Huệ dùng

để chiết trích sabadilla và hellebore Chất ryania được trích từ một loài thực vật ở Nam Phi, nicotine được trích từ thuốc lá; strychnine trích từ cây mã tiền ở Ấn Độ, Srilanka, Úc và khu vực Đông ương

- Các chất điều hòa sinh trưởng côn trùng (Insect Growth Regulator = IGR): là

nh ng chất được dùng để biến đổi sự sinh trưởng và phát triển của côn trùng Các hormone tự nhiên do chính côn trùng tiết ra điều khiển sự biến đổi trong vòng đời của chúng Các IGR này hiện nay được tổng hợp nhân tạo để bắt chước hoặc ngăn trở tác động của các hormone tự nhiên Ch ng ngăn cản côn trùng tăng trưởng hoặc rút ngắn vòng đời của côn trùng bằng cách th c đẩy nhanh quá trình lão hóa của chúng

- Các vi sinh vật: Một số chủng vi sinh vật được phối trộn với các chất khác

để tạo thành sản phẩm phòng trị dịch hại Người ta đã dùng nhiều chủng của vi

khuẩn khác nhau để ứng dụng làm thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis được

dùng để tạo ra các chế phẩm (Dipel, Thuricide, Centari ) tiêu diệt nhiều côn trùng

trong Bộ Cánh vảy Vi khuẩn Agrobacterium radiobacter được dùng để trừ vi khuẩn gây bướu trên nhiều loại cây (thường do Agrobacterium tumefaciens) gây ra NPV (nuclear polyhedral virus) được dùng để trừ sâu xanh (Heliothis armigera) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) Nấm Beauveria bassiana được dùng để trừ

một số loài côn trùng Thuốc gốc vi sinh ngày càng được ưa chuộng vì ch ng ít độc đối với người và các sinh vật có lợi, cũng như tính chuyên hóa đối với các loại dịch hại Ngoài các VSV xuất hiện trong tự nhiên được sử dụng làm thuốc trừ sâu, còn

có các VSV vật được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền hiện đại

Pheromones: Đây là nh ng hóa chất đặc biệt do sinh vật tiết ra để kích thích hành vi của nh ng sinh vật khác cùng một loài Các loại pheromones côn trùng nhân tạo được dùng trong phòng trừ dịch hại để giám sát sinh hoạt của côn trùng cũng như định thời gian sử dụng các loại thuốc Các loại pheromone thường được dùng chung kết hợp với bẫy dính, nó cũng đóng vai trò quan trọng trong việc giám sát hoạt động của côn trùng trong nh ng chương trình phòng trừ dịch hại tổng hợp

và để giám sát tính kháng thuốc của côn trùng

1 2 THUỐC TRỪ S U SINH HỌC

1.2.1 Đị ĩ và p â ạ

Như đã trình bày ở trên, thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra (thường là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (là chất độc hoặc dầu thực vật)

Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể được chia thành hai nhóm chính như sau:

- Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus

- Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ hoặc dầu thực vật

1 2 2 Ƣu và ƣợc đ ểm củ t uốc trừ sâu s ọc

Thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt sâu nhanh, nhưng có nhược điểm quan trọng là có độ độc cao với người và các động vật có ích (trong đó

có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trường Vì vậy, do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con người và yếu tố sinh thái môi trường, các thuốc trừ sâu hóa học cần được hạn chế sử dụng, dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu sinh học

o với thuốc trừ sâu hóa học, ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học

là ít độc với người và môi trường Các chế phẩm vi sinh vật dùng làm thuốc trừ sâu

và hợp chất có nguồn gốc từ thực vật hầu như không độc với người và các sinh vật

có ích, vì thế bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng gi a thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại ên cạnh đó, thuốc trừ sâu sinh học ít để lại dư lượng độc tố trên nông sản nên ít độc với người và mau phân hủy trong tự nhiên, nên phù hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè… Như vậy, muốn có nông sản sạch và an toàn cho người sử dụng

và môi trường, sử dụng các thuốc trừ sâu sinh học là một giải pháp tốt nhất

Ngoài ra, các yếu tố phong ph , đa dạng, nguồn khai thác rất dễ dàng và hầu như vô tận của các vi sinh vật và thực vật, cũng như tính đơn giản của việc chế tạo

đã th c đẩy việc ứng dụng trừ sâu sinh học ngày càng được ứng dụng nhiều trong thực tế, đặc biệt là các loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ thực vật Nông dân có thể đập nát mẫu thực chất có chứa hoạt chất, ngâm chiết trong trong nước/dung môi

h u cơ để thu nhận hoàn toàn hoạt chất, sau đó phun trực tiếp lên cây bệnh

ên cạnh nh ng ưu điểm nổi bậc trên, một số thuốc trừ sâu sinh học, như các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so với thuốc hóa học Việc bảo quản và khả năng tạo hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn so với thuốc trừ sâu hóa học Nhưng so với các ưu điểm to lớn của ch ng thì các nhược điểm nêu trên của thuốc trừ sâu sinh học là rất nhỏ và hoàn toàn có thể khắc phục được Vì vậy, thuốc trừ sâu sinh học ngày càng được khai thác sử dụng rộng rãi và là xu thế tất yếu trong canh tác nông nghiệp h u

cơ hiện nay

1.2.3 Tì ì ê cứu, sử dụ và quả ý t uốc trừ sâu s ọc ở

V ệt N m

Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) sinh học đã được quan tâm nghiên cứu, đưa vào sử dụng tại Việt Nam từ đầu nh ng năm 80 của thế kỷ trước và đã mang lại hiệu quả tích cực, giảm một phần ô nhiễm môi trường do thuốc BVTVcó nguồn gốc hóa học gây ra Đặc biệt, từ năm 1990 trở lại đây, việc nghiên cứu, ứng dụng thuốc BVTV sinh học đã được quan tâm và có nh ng kết quả khởi đầu.[13]

- Thuốc BVTV có nguồn gốc thảo mộc

Với hệ thực vật phong phú với nhiều loại cây có dầu, tinh dầu chứa các chất

có hoạt tính sinh học cao là nguồn nguyên liệu sẵn có để tạo ra nhiều sản phẩm thuốc BVTV sinh học có giá trị sử dụng cao Đây là lợi thế quan trọng giúp phát triển các thuốc BVTV sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp bền v ng

- Thuốc BVTV có nguồn gốc vi sinh

ĩnh vực thuốc BVTV vi sinh có sản phẩm t được sử dụng từ lâu trong lĩnh vực nông nghiệp và sát trùng tại gia (phòng trừ muỗi) Đã có nhiều cơ quan nghiên cứu công nghệ lên men và phân lập thành công các độc tố tinh thể khác nhau như a,

b, g, d-endotoxin, từ đó tạo ra các sản phẩm thương mại cung cấp cho thị trường

Các thuốc nguồn gốc virus có nhóm sản phẩm chiết từ virus đa nhân diện nucleo polyhedrosis virus (NPV)[28] Đây là lọai virus chọn lọc, chỉ lây nhiễm và diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) rất hiệu quả trên bông, đậu đỗ, ngô, hành, nho…

- Thuốc BVTV có nguồn gốc hóa sinh

Bao gồm các chất có tác dụng dẫn dụ, xua đuổi, triệt sản hoặc điều khiển sinh trưởng côn trùng Ch ng dùng để phòng trừ gián tiếp côn trùng gây hại với liều lượng rất nhỏ

Ưu điểm lớn của các hợp chất này là hạn chế tối đa ảnh hưởng của thuốc độc tới môi trường Đây là một hướng nghiên cứu hiện đại và đầy triển vọng của ngành BVTV trên thế giới cũng như ở Việt Nam.[8]

Metyl eugenol là chất dẫn dụ sinh dục đối với ruồi vàng hại cam được Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam nghiên cứu và sản xuất đầu tiên vào nh ng năm 70-80 của thế kỷ trước, đi từ eugenol có trong tinh dầu hương nhu [7][16]

Trong số các chất dẫn dụ sinh dục, các pheromon là nhóm chế phẩm sinh học được sử dụng hiệu quả trong BVTV, kiểm dịch thực vật và dự báo dịch hại Đến nay, trên thế giới đã nghiên cứu và tổng hợp được hơn 3.000 hợp chất pheromon sinh dục, dẫn dụ nhiều lọai côn trùng khác nhau Tuy nhiên, do cấu trúc phân tử hoạt chất phức tạp và yêu cầu độ tinh khiết cao của sản phẩm nên việc tổng hợp

ch ng đòi hỏi trình độ và thiết bị tiên tiến Vì vậy, loại hợp chất này thường có giá thành cao, phạm vi áp dụng hạn chế

Ngoài ra, xu hướng hiện nay còn sử dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên làm phụ gia trong gia công thuốc VTV Đó là các chất hoạt động bề mặt ( Đ ), dung môi, chất mang, chất chống lắng, chống đông, chất bảo quản … trong đó chất

Đ , dung môi, chất mang chiếm thành phần đáng kể trong sản phẩm Các chất

Đ có nguồn gốc lignin tự nhiên có đặc tính ưu việt như: đa tác dụng (thấm ướt, phân tán, chống đông, tạo chelat cho phân bón qua lá ), có thể sử dụng để gia công nhiều dạng sản phẩm khác nhau và rất an toàn cho môi trường vì có độ độc thấp đối với người, không gây cháy lá, có khả năng phân hủy sinh học Mặt khác,

do giá rẻ và sẵn có nên gần đây đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng lignin làm chất Đ trong gia công một số thuốc BVTV dạng phân tán trong nước với kết quả rất khả quan và thân thiện với môi trường Bên cạnh đó, còn một số phụ gia khác như chất mang từ bentonit, dung môi ít độc… cũng đã được nghiên cứu sử dụng trong gia công và ứng dụng có kết quả

1 2 4 Một số c ế p ẩm t uốc trừ sâu s ọc có uồ ố từ t ực v t

a Cây ng ể

Nghể là cây mọc tự nhiên ở vùng đồi, bãi, ruộng cao trong mùa mưa ở các tỉnh miền núi (hình 1.1) Trong cây nghể có 7 - 15% chất ypetin và Persicarin Đây là loại chất độc thực vật, có hiệu lực trừ sâu chủ yếu qua tiếp x c, đường ruột Chế phẩm trừ sâu từ cây nghể có thể trừ được nhiều loại sâu miệng nhai và chích h t như: rệp muội, nhện đỏ, sâu ăn lá; có độ độc trung bình với người và động vật máu nóng; nhanh phân giải trong cơ thể và môi trường sống; không để lại tồn dư trong nông sản thực phẩm, do đó thuốc trừ sâu thảo mộc chế biến từ cây nghể được các cơ quan chức năng khuyến khích sử dụng để sản xuất nông sản an toàn

Hình 1.1 Cây ng ể (Polygonum y rop per)

Cách chế biến: 1 kg thân, lá cây nghể tươi thái nhỏ hoặc 0,3 kg thân lá cây nghể khô + 0,2 kg vôi cục, ngâm với 10 lít nước ấm 30 – 35o

C trong 24 giờ, lọc lấy nước pha loãng với 10 - 15 lít nước lã sạch có cho thêm 200ml chất bám dính (hoặc 0,2% xà phòng bột) để phun Hiệu lực của thuốc trừ sâu chế biến từ cây nghể cao khi nhiệt độ môi trường trên 30oC và giảm khi nhiệt độ xuống thấp hơn 20o

Thuốc được chế biến bằng cách ngâm 1kg thuốc lá, thuốc lào khô (lá hoặc cọng, cành, thân) đã được thái nhỏ với 10 dung dịch nước vôi ở 30-35o

C trong 24 giờ, lọc lấy nước, pha loãng với nước lã sạch 5-20 lần có thêm 200 ml chất bám dính (hoặc dung dịch 0,2% nước rửa ch n)

Hiệu lực của thuốc Nicotin cao thì nhiệt độ môi trường trên 30°C và giảm khi nhiệt độ môi trường thấp hơn 20°C ản phẩm thuốc trừ sâu chế biến bằng thuốc lào, thuốc lá không diệt được sâu hại ở pha trứng, pha trưởng thành iệt mạnh sâu khi mới nở, tuổi nhỏ (tuổi 1-3), nên cần phải điều tra tuổi của sâu hại cụ thể trước khi phòng trừ mới đạt hiệu quả trừ sâu cao

Hình 1.2 Cây t uố l (Nicotiana tabacum)

c Cây t uố ( ây mật)

Cây thuốc cá (hình 1.3) hay còn gọi là dây mật có tên khoa học là Derris

elliptica Benth ễ cây thuốc cá có chứa rotenon (C23H22O6) với hàm lượng cao và nhiều hợp chất có tính chất diệt côn trùng tương tự rotenon gọi là rotenoit, nhưng có độc lực thấp hơn, dl – toxicanol, tephrosin deleguin và ellipton eleguin là đồng phân của rotenon Tephrosin và toxicanol là dẫn xuất hydroxy của deleguin Ngoài

ra, rễ còn chứa saponin, resin và tanin ễ cây thuốc cá được dùng duốc cá và làm thuốc trừ sâu trong nông nghiệp

Thuốc được điều chế bằng cách ngâm rễ tươi 3kg đã giã nát trong 10 lít nước trong 16 – 24 giờ, lọc bỏ bã, đem phun Có thể thái rễ thành miếng, phơi khô, rồi giã nhỏ, dùng dưới dạng thuốc bột hoặc trộn với nước xà phòng thành dạng s a

Hình 1.3 Cây t uố (Derr s ell pt Bent )

d Cây ủ đậu

Cây củ đậu hay còn gọi là cây đậu thự, tên khoa học: Pachyrhizus erosus (L)

urb, abaceae (hình 1.4) Cây được trồng khắp mọi nơi, củ được sử dụng để làm

thực phẩm, có thể ăn sống, có xào chín Củ đậu còn được dùng để đắp mặt hay giã nhỏ lấy nước bôi lên mặt dưỡng da và ch a mụn trứng cá

ộ phận gây độc chính của cây củ đậu là ở lá và hạt Cả hai bộ phận này đều

có 2 hoạt chất rotenon và tephrosin Nh ng chất này rất độc với người, nếu ăn phải toàn thân co giật, đau bụng d dội, nôn mửa, đi ngoài, đường huyết tụt, loạn nhịp tim, mê man bất tỉnh và tử vong do suy hô hấp Thuốc được điều chế bằng cách giã hạt củ đậu, hòa với nước phun vào cây cối

có hại trong sản xuất nông nghiệp

Theo kinh nghiệm cổ truyền, người ta thường sử dụng nhân hạt neem nghiền nhỏ, ngâm trong nước để phun trực tiếp lên cây trồng Thuốc tác động đến côn trùng gây hại bằng cách gây sự ngán ăn, xua đuổi, ngăn sự lột xác của côn trùng, cũng như ngăn cản sự đẻ trứng, làm giảm khả năng sinh sản.[25][30]

Hình 1.5 Cây xoan (Melia azedarach)

f T uố trừ sâu có nguồn gố từ các cây gia vị

Các loại cây gia vị như n n, tỏi, gừng, riềng, ớt cũng được sử dụng rộng rãi trong dân gian và hộ gia đình để làm thuốc trừ sâu bằng cách nghiền hỗn hợp nh ng gia vị này và ngâm chiết trong dung dịch cồn ịch chiết trong cồn được pha với nước và phun trực tiếp vào cây trồng Thực tế cho thấy, dịch chiết từ các loại gia vị này có khả năng tiêu diệt và xua đuổi một số loại côn trùng Tuy nhiên, việc sử dụng gia vị thực phẩm có giá trị kinh tế cao dung làm thuốc trừ sâu là phương án khó được chấp nhận và triển khai rộng trong thực tiễn

1.3 THUỐC TRỪ S U SINH HỌC C NGUỒN GỐC TỪ NEEM

1.3.1 G t ệu về eem

Neem hay còn gọi Azadirachtind Dirakht (tiếng a Tư), DogonYaro (tiếng

Nigeria), Margosa, Neeb (tiếng Ả Rập), Nimtree, Nimba (tiếng Phạn), Vepu, Vempu, Vepa (Telugu), Bevu Kannada, Veppam (Tamil), ở Đông Phi, cây này

được gọi là Mwarobaini (Kiswahili), có nghĩa là cây 40;

Ở Việt Nam, cây neem còn có các tên gọi khác là sầu đông, xoan sầu đâu, xoan ăn gỏi, xoan trắng, xoan chịu hạn, xoan Ấn Độ Đây là một trong hai loài

thuộc chi Azadirachtindirachta, và sống ở các quốc gia như Bangladesh, Ấn Độ,

Myanma, và Pakistan, tại các khu vực nhiệt đới và bán nhiệt đới

Cây neem có tên khoa học là Azadirachtindirachta indica thuộc:

Hình 1.6 Cây neem trưởng t àn

Lá: chùm lá hình lông chim đối diện, dài từ 20-40 cm, trung bình có từ 20-31

lá, có màu từ xanh nhạt đến xanh đậm với chiều dài mỗi lá từ 3-8 cm Cuống lá ngắn

Hoa: màu trắng và thơm, hoa được bố trí nách lá, rủ xuống, dài được tới 25

cm oa lưỡng tính và hoa đực tồn tại trên cùng một cây

Quả uả có hình elip, nhẵn, dài 2,4-2,8 cm và rộng 1,0-1,5 cm Trước khi

trưởng thành, quả có màu xanh lá cây, sau đó chuyển sang màu vàng khi chín ạt được bao bọc bởi lớp vỏ hơi cứng, bên trong vỏ là nhân màu trắng được bao bọc bởi

lớp vỏ lụa có màu nâu đỏ Vỏ hạt dài 0,9-2,2 cm, rộng 0,5-0,8 cm; hạt nhân của nó dài 0,8-1,0 cm và rộng 0,4-0,5 cm (hình 7)

Cây bắt đầu đơm hoa, kết trái sớm là 2 năm, thông thường sau 3 đến 5 năm và đạt đến sản xuất tối đa của nó ở tuổi 10 năm Năng suất thu hoạch quả phụ thuộc nhiều vào thổ nhưỡng và điều kiện chăm sóc, trung bình khoảng 25 – 30 kg hạt khô cho mỗi cây trưởng thành

Hạt neem khi phơi khô Hạt neem khi tách vỏ

Hình 1.7 Hạt neem k ô và n ân ủ nó s u t vỏ

b Đ ều k ện tăng trưởng ủ ây neem

Neem phát triển nhanh chóng trong điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi Theo Radwanski (1977), 66% trong tổng số cây tăng trưởng trong ba năm đầu tiên

để đạt được một chiều cao 4 - 7 m, đạt chiều cao từ 5 đến 11 m t trong năm thứ năm Tuổi thọ của cây k o dài đến hai thế kỷ

Được biết đến với khả năng chống chịu hạn hán tốt, neem thường mọc ở vùng khô hạn và bán khô hạn với lượng mưa hàng năm từ 400 đến 1200 mm Neem cũng

có thể sinh trưởng phù hợp ở nh ng nơi có lượng mưa hàng năm là ít hơn 400 mm, sau đó phụ thuộc vào nguồn nước ngầm để sinh trưởng; trong các thời kỳ hạn hán nặng và k o dài, cây có thể rụng lá Neem cũng có thể sống ở nh ng nơi có lượng mưa lên đến 2500 mm mỗi năm nhưng với điều kiện phải thoát nước tốt, nếu không

1.3.2 Các t à p ầ c í c ết xuất từ cây eem

C t àn p ần ó ọ ín ó trong ây neem

Như đã trình bày trên, các bộ phận chính lá, hoa, hạt của neem đều có giá trị kinh tế cao do ch ng chứa nhiều hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học quý giá, cụ thể sau :

Lá cây Neem có chứa uercetin (flavonoid) và nimbosterol (β- sitosterol) cũng như liminoids (Nimbin và các dẫn xuất của nó) Quercetin (một flavonoid polyphenolic) được biết là có đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm Điều này cho thấy, lá Neem có thể dùng để ch a bệnh về da như viêm lo t và ghẻ imonoids như nimocinolide và isonimocinolide ảnh hưởng đến khả năng sinh sản ở ruồi nhà (Musca domestica) với liều khác nhau từ 100 tới 500 ppm Họ cũng cho thấy trong

lá Neem có tính chất gây đột biến trong muỗi (Aedes aegypti)

Tinh dầu trong hoa neem gồm các dẫn xuất sesquiterpene và có chứa nimbosterol và flavonoids như kaempferol, melicitrin oa cũng mang lại một chất sáp bao gồm một số axit béo như Behenic (0,7%), arachidic (0,7%), stearic (8,2%), palmitic (13,6%), oleic (6,5%) và linoleic (8,0%) Phấn hoa của cây neem

có chứa một số axit amin như acid glumatic, tyrosine, arginine, methionion, phenylalanine, histidine, acid arminocaprylic và isoleucine

Trong nhân hạt neem có chứa glycerides như các hạt có dầu khác, tương ứng với thành phần axit oleic (50-60%), acid palmitic (13-15%), axit stearic (14-19%), acid linoleic (8-16%) và axit arachidic (1-3%)[23] Dầu ép hạt neem có màu nâu vàng, dầu không khô, hương vị cay và mùi khó chịu Ngoài ra, trong nhân hạt neem chứa một lượng đáng kể các chất gây đắng như azadirachtin, azadirachtindiradione, fraxinellone, Nimbin, salannin, salannol, vepinin, vilasinin … Trong số đó, azadirachtin đã chứng minh có hiệu quả trong tiêu diệt côn trùng và được sử dụng như là một loại thuốc trừ sâu sinh học hiệu quả đối với khoảng 300 loài côn trùng

và được báo cáo là không độc hại cho con người [15][22] Azadirachtin có mặt trong tất cả các bộ phận của cây, nhưng nồng độ cao nhất của nó là trong hạt của cây đã trưởng thành (0,2-0,6%)

b Azadirachtin

Azadirachtin có công thức phân tử C35H44O16 , dạng tinh thể rắn, nóng chảy

1600C Là một chất h u cơ phân cực Azadirachtin có khả năng hòa tan trong nước 0,26g/l, tan rất nhanh trong etanol, dietyl ete, axeton và chloroform, không tan trong n-hexane Azadirachtin có mùi tỏi, bền trong bóng tối ở nhiệt độ thường, dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao trong dung dịch có môi trường kiềm và axít.[10]14]

utterworth và organ là người đầu tiên phân lập azadirachtin từ hạt Neem vào năm 1968 và thiết lập công thức phân tử chính xác của azadirachtin là

C35H44O16 Đến năm 1971, họ đã phát triển một phương pháp đơn giản để cô lập azadirachtin bằng bằng sắc ký bản mỏng Nhưng mãi đến năm 1975, cấu trúc của nó mới được mô tả đầu tiên bởi nhóm nghiên cứu Nakanishi thông qua phương pháp phân tích NMR Cấu tr c ban đầu đưa ra vẫn còn một vài sai sót, sau đó bằng kĩ thuật nhiễu xại tia X, Ley, Kraus, Nakanishi đã đưa ra cấu trúc chính xác của azadirachtin.[17][31]

Công thức cấu tạo và tên hóa học theo P C như sau:

(2aR,3S,4S,4aR,5S,7aS,8S,10R,10aS,10bR)-10-acetoxy-3,5-dihydroxy- methanofuro [2,3-b]oxireno[e]oxepin-1a(2H)-yl]-4-methyl-8-{[(2E)-2-methylbut-2- enoyl]oxy}octahydro-1H-naphtho[1,8a-c;4,5 b’c’]difuran-5,10a(8H)-dicarboxylate

4[(1aR,2S,3aS,6aS,7S,7aS)-6a-hydroxy-7a-methyl-3a,6a,7,7a-tetrahydro-2,7-Azadirachtin thuộc nhóm limonid hiện diện trong nhân của hạt cây neem; là một tetranortriterpenoid oxy hóa cao với nhiều nhóm chức oxy hóa, bao gồm enol ether, acetal, hemiacetal và Oxirane tetra-thay thế, cũng như các este cacboxylic.[34][27]

1.3.3 T uốc trừ sâu s ọc từ chất azadirachtin c ết xuất từ â ạt neem

Trong số các triterpenoid chiết xuất từ cây neem có azadirachtin và các dẫn xuất của azadirachtin, nimbin, salannin, meliantriol, nimbidin gi vai trò chủ lực trong việc thể hiện hoạt tính sinh học ỗi loại côn trùng có phương thức và hiệu quả tác động là khác nhau Vì vậy, các dịch chiết từ cây neem có phổ tác động rộng Cho đến nay, các hoạt chât từ cây neem được báo cáo là có khả năng kiểm soát trên 400 loài sinh vật như: côn trùng, vi sinh vật (vi nấm, vi khuẩn, virus) gây bệnh thực vật, người và động vật Các hoạt chất từ cây neem được xác định là không độc đối với động vật có xương sống, vô hại đối với nhiều loài thiên địch và tác nhân thụ phấn trong tự nhiên Đây là cơ sở cho việc ứng dụng các dịch chiết từ cây neem để sản xuất thuốc trừ sâu và dược phẩm.[35][17]

Azadirachtin tấn công vào nguồn thức ăn côn trùng, rồi loạn chu kỳ sinh sản

và ảnh hưởng đến việc điều tiết tăng trưởng ột loạt các loài côn trùng sống bằng cây cỏ, sâu và động vật chân đốt, thủy sản được báo cáo là nhạy cảm đối với azadirachtin Azadirachtin không gây hại đến côn trùng có ích gi p thụ phấn cho cây Azadirachtin nhanh chóng bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, do

đó không tích tụ trong tự nhiên [24]

iệu quả tác động của neem với các loài côn trùng như sau:

Gây á ă :

à một trong nh ng tác động đặc trưng của các hoạt chất từ neem đối với côn trùng, trong đó azadirachtin được công nhận là chất gây ngán ăn mạnh nhất Tính

nhạy cảm của các loài côn trùng đối với hiệu quả gây ngán ăn của azadirachtin đã

được nghiên cứu nhiều Theo Mordue &Blackwell (1993), bộ epidoptera (bộ cánh vảy) nhạy cảm nhất trong khi đó các bộ Coleoptera ( ộ cánh cứng), Hemiptera ít

nhạy cảm với hiệu quả gây ngán ăn của azadirachtin ột số loài thuộc bộ epidoptera như loài châu chấu sa mạc bị ngán ăn khi xử lý azadirachtin ở nồng độ rất thâp 0,007ppm.[4][21]

Xu đuổi:

Các chất xua đuổi dễ bay hơi có khả năng tác động đến côn trùng từ xa qua hấp thụ quan hóa học khứu giác, một số khác chỉ gây được phản ứng chán ăn cho

côn trùng khi có sự tiếp x c qua thụ quan hóa học vị giác phân bố ở đốt râu, hốc

miệng, đốt bàn chân Khi đó, côn trùng sẽ ngừng ăn và di chuyển chỗ khác Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều loài côn trùng dễ dàng bị xua đuổi bởi các dịch chiết từ cây neem nhất là muỗi, châu châu và các loài rầy Tuy nhiên, một số khác lại tỏ ra k m mẫn cảm iệu quả xua đuổi muỗi của dầu neem được đánh giá rất

khả quan đối với một số loài muỗi truyền bệnh sốt r t như An.culicifacies,

An.stephensì, An Minimus, [26]

Ả ƣở đế p át tr ể và b ế t á :

Tác động của dịch chiết neem đối với sự phát triển và biến thái của côn trùng thường được biểu hiện qua các biến đổi như: giảm kích thước và trọng lượng, rút ngắn vòng đời, tạo ra trưởng thành biến dạng như cụt râu, cụt cánh hoặc cánh, râu, chân bị dị dạng [21] Kết quả thí nghiệm cho thấy Azadirachtin gây rối loạn sự phát

triển bình thường ấu trùng s lirura ở nồng độ 5-10 ppm trong vòng 48 giờ, hoặc vào ấu trùng s gragarìa một liều azadirachtin duy nhất (2-10 mmg/gam trọng

lượng cơ thể) làm ấu trùng chết nhiều và số sống sót ít tăng trọng

Làm ảm sức s sả ây vô s

ịch chiết từ neem có tác động ngãn chặn sự đẻ trứng và làm trứng không nở trên nhiều loài côn trùng Thí nghiệm của Yadav cho thấy số lượng trứng của các

loài mọt hại đậu Callosobruchus chinensis, C maculatus, c analis giảm có ý nghĩa

so với đối chứng khi xử lý hạt đậu nành bằng dầu neem nồng độ 50-500 ppm Đặc biệt 100% trứng không nở khi xử lý bằng dầu neem ở nồng độ 500ppm

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU

2 1 NGUYÊN LIỆU VÀ H A CHẤT

2.1.1 N uyê ệu

Nguyên liệu hạt Neem sử dụng trong nghiên cứu được thu hái tại vùng nguyên liệu huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận ở vụ thứ 2 vào tháng 11 Quả neem được

hái trực tiếp và chỉ chọn nh ng quả chín (màu quả chuyển từ màu xanh nhạt sang

màu vàng, thịt quả mềm có mùi thơm và vị ngọt) uả được ủ trong 24 giờ để mềm thịt quả, sau đó cho vào rổ chà nhẹ cho nát phần thịt quả, rửa sạch bằng nước nhiều lần, thu lấy phần hạt [17]

ạt được làm khô và phơi ở nơi râm mát có thổi quạt cho đến khô hoàn toàn, tránh phơi trực tiếp trên nền gạch dưới ánh nắng mặt trời Nh ng hạt được sử dụng trong nghiên cứu được lựa chọn kĩ, có kích thước đồng nhất và được bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát Ngay trước khi thực nghiệm, nhân hạt được bóc tách bằng tay, nghiền nhỏ ở nhiệt độ thấp để tránh làm nóng, gây hỏng mẫu

2.1.2 Hó c ất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu chiết tách azadirachtin là

nh ng hóa chất tinh khiết, có nguồn gốc xuất xứ từ Trung Quốc, được trình bày

ở bảng 2.1

Bảng 2.1 D n s ó t đượ sử ụng ết t azadirachtin

Tên hóa chất Công thức Độ t ết (%) Hãng sản xuất

n – Hexane C6H14 99,5 Trung Quốc Nước cất 2 lần H2O Việt Nam

Ethyl acetate CH3COOC2H5 98 Trung Quốc Tetraclorua cacbon CCl4 99 Trung Quốc Methanol CH3OH 99,5 Trung Quốc Sodium chloride NaCl 99 Trung Quốc Các hóa chất sử dụng cho đinh lượng azadirachtin trong mẫu nghiên cứu bằng phương pháp P C là nh ng hóa chất tinh khiết phân tích, đạt chuẩn sử dụng cho phân tích sắc kí, được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 D n s ó t đượ sử ụng để địn lượng Azadirachtin

2 2 PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU

2 2 1 C ết tác azadirachtin

Hạt neem (có hàm lượng nước là 7,8% và hàm lượng dầu 49,58%) được làm

khô, sấy trong điều kiện chân không ở nhiệt độ 35°C trong vòng 7-8 giờ đến khi độ

ẩm đạt 3 – 4% Tách vỏ để để thu phần nhân hạt, sau đó nghiền nhỏ đến kích thước (0,425-1,2 mm) uá trình chiết tách thu nhận azadirachtin được thực hiện theo 2 phương pháp: p cơ học loại dầu kết hợp với chiết tách bằng dung môi h u cơ và chiết tách hoàn toàn bằng dung môi h u cơ như trình bày theo sơ đồ hình 2.1 và 2.2 tương ứng

Phương pháp chiết tách bằng cơ học kết hợp với dung môi h u cơ được thực hiện như sơ đồ biểu diễn ở hình 2.1 Trước khi tách loại azadirachtin, hạt neem được p cơ học để loại phần lớn dầu ẫu rắn thu được tiếp tục chiết với các dung môi h u cơ để loại hoàn toàn dầu dư và các chất không mong muốn

Trong trường hợp loại dầu bằng dung môi h u cơ, 200 g mẫu hạt neem được nghiền nhỏ, sau đó ngâm trong dung môi n-hexane để loại phần dầu Mẫu rắn tiếp tục được ngâm chiết trong các dung môi khác nhau như quy trình được trình bày ở hình 2.2 với hệ dung môi được sử dụng lần lượt là hexane, methanol, carbon tetrachloride, ethyl acetate

ỗn hợp azadirachtin hòa tan trong dung môi ethyl acetate được tách loại ra khỏi nhau bằng phương pháp cô quay chân không ở áp suất thấp, phần rắn kết tinh thu nhận được cuối cùng chính là azadirachtin

Hình 2.1 Quy trìn ết t azadirachtin bằng p ương p p ép ơ ọ l y ầu

kết ợp vớ ết t bằng ung mô ữu ơ

Hữu cơ

(có thể loại bớt dung môi) bằng chưng cất)

Hạt neem

H2O ( 200- 400)

ầu

a l lạnh

Du dịc azadirachtindirachtin

Ethyl acetate

ỏng , nước (polysaccharide và protein) Du dịc ữu cơ

Bay hơi dung môi môimôi

ddAzadirachtindi rachtin

Hình 2.2 Quy trìn ết t azadirachtin bằng p ương p p ết vớ ung

mô ữu ơ

2.2.2 Phân tích azadirachtin bằ p ƣơ p áp sắc í ỏ c áp

Việc phân tích định tính, định lượng azadirachtin được thực hiện trên máy

phân tích sắc kí lỏng cao áp (High performance liquid chromatography - HPLC),

hãng Thermo Scientific Hệ thống HPLC có cấu tạo như được trình bày ở hình 2.3

Hạt neem (250)g

Hình 2.3 C t ết bị trong ệ t ống HPLC:

1 - Bình chứa dung môi pha động; 2 - Bộ phận khử khí; 3 - ơm cao áp; 4 -

Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay lấy mẫu tự động); 5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt; 6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu); 7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu

và điều khiển toàn bộ hệ thống; 8 – Thiết bị in d liệu

ẫu chuẩn được chuẩn bị bằng cách hòa tan Azadirachtin (Sigma Aldrich) trong dung môi methanol ỗn hợp được đồng nhất bằng siêu âm để đảm bảo toàn

bộ azadirachtin hòa tan hết và phân tán đều trong toàn bộ thể tích methanol ẫu được bảo quản trong ngăn mát ở 50C và pha loãng ở mỗi lần sử dụng Mẫu chuẩn

dư sau mỗi lần thí nghiệm đều được loại bỏ

2.2.3 Đị ƣợ azadirachtin bằ p ƣơ p áp p â tíc sắc í ỏ cao áp

a Đ ều kiện vận hành thiết bị HPLC

Azadirachtin được định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp với điều kiện như sau:

- Cột sắc ký : Thermo - Acclaim C18 (4,6mm x 150 mm, 3µm)

- ước sóng DAD : 210 nm

(5) (2) (3)

injecto r