Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol – nước của cây cỏ sữa lá nhỏ theo định hướng hạ đường huyết

NGUYỄN THỊ THU NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT ETHANOL – NƯỚC CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ THEO ĐỊNH HƯỚNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC ĐÀ NẴNG,

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT ETHANOL – NƯỚC CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ THEO ĐỊNH HƯỚNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

ĐÀ NẴNG, NĂM 2017

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT ETHANOL – NƯỚC CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ THEO ĐỊNH HƯỚNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM VĂN VƯỢNG

ĐÀ NẴNG, NĂM 2017

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Bố cục đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 VÀI NÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ 4

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ 7

1.2.1 Nghiên cứu ở Việt Nam 7

1.2.2 Nghiên cứu trên thế giới 12

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ 16

1.3.1 Tác dụng hạ đường huyết 16

1.3.2 Tác dụng giảm đau 17

1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, kháng sinh, kháng viêm 17

1.3.4 Tác dụng chống oxy hóa, gốc tự do 17

1.3.5 Tác dụng trị giun 18

1.3.6 Tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng 18

1.4 CÔNG DỤNG CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ 18

1.5 MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT 19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Hoá chất – dung môi, thiết bị 21

2.1.3 Động vật thí nghiệm 22

2.2.1 Xác định các thông số hoá lý 23

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 25

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết 27

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HOÁ LÝ 29

3.1.1 Độ ẩm 29

3.1.2 Độ tro toàn phần 29

3.1.3 Hàm lượng kim loại nặng 30

3.2 KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ 31

3.2.1 Kết quả chiết xuất dược liệu 31

3.2.2 Kết quả thử tác dụng hạ đường huyết của cỏ sữa lá nhỏ 32

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 33

3.3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây cỏ sữa lá nhỏ 33

3.3.2 Kết quả định tính flavonoid trong các phân đoạn chiết bằng phản ứng hoá học 35

3.3.3 Xác định thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ trong các dung môi hữu cơ 36

3.3.4 Phân lập flavonoid từ cây cỏ sữa lá nhỏ 42

3.3.5 Nhận dạng hợp chất phân lập được 44

3.4 THẢO LUẬN 46

3.4.1 Về đối tượng nghiên cứu 46

3.4.2 Về các thông số hoá lý của cỏ sữa lá nhỏ 46

3.4.3 Về tác dụng hạ đường huyết của cây cỏ sữa lá nhỏ 48

3.4.4 Về thành phần hoá học cây cỏ sữa lá nhỏ 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

PHỤ LỤC

AAS Phương pháp phổ hấp thhụ nguyên tử (Atomic Absorption

Spectroscopy)

BP Dược điển Anh (British Pharmacopoeia)

CC Sắc ký cột (Column Chromatography)

13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 Nuclear

Magnetic Resonance Spectrometry)

d doublet

D/C Dịch chiết

dd doublet of doublet

DĐVN Dược điển Việt Nam

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

USP Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia)`

bảng

1.1 Sự khác nhau giữa cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L.) và cỏ

sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) về đặc điểm thực vật 5

1.2 Thành phần hóa học của cỏ sữa lá nhỏ trong các dịch chiết 15

2.1 Hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình chiết xuất và

2.2 Thiết bị sử dụng trong quá trình chiết xuất và phân lập 22 3.1 Kết quả xác định độ ẩm 29 3.2 Độ tro toàn phần của cỏ sữa lá nhỏ 30 3.3 Hàm lượng kim loại nặng trong mẫu cỏ sữa lá nhỏ 30

3.4 Kết quả hiệu suất chiết cỏ sữa lá nhỏ trong dung môi

3.7 Kết quả định tính flavonoid trong cao các phân đoạn chiết 36

3.8 Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ

trong dịch chiết n – hexane 38

3.9 Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ

trong dịch chiết CH2Cl2 39

3.10 Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ

trong dịch chiết EtOAc 40

3.11 Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ

trong dịch chiết nước 41 3.12 Số liệu phổ NMR của hợp chất ET1 44

hình

1.1 Cây cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) 4 1.2 Cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L.) 7 2.1 Cỏ sữa lá nhỏ đã xử lý 21 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn 37 3.2 Sơ đồ phân lập flavonoid tinh khiết 43 3.3 Cấu trúc hoá học của hợp chất ET1 45

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay, theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường Quốc tế, tính đến năm

2013, toàn thế giới có khoảng 382 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, và con số này có xu hướng tăng lên gấp đôi vào năm 2035, chi phí điều trị dành cho bệnh đái tháo đường ở nhóm bệnh nhân 20-79 tuổi trên thế giới đạt mức 548 tỷ USD [20] Hiện nay, trên thị trường các thuốc điều trị đái tháo đường chủ yếu có nguồn gốc tổng hợp hóa dược, việc nghiên cứu các thuốc mới có nguồn gốc từ thiên nhiên đã

và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm tìm kiếm các thuốc có tác dụng hỗ trợ cho bệnh nhân trong quá trình điều trị kéo dài, giảm tác dụng không

mong muốn, đồng thời giảm chi phí điều trị

Ở Việt Nam, cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L., họ Euphorbiaceae) mọc

hoang ở khắp nơi, ưa đất có sỏi, đá, thường thấy ở các kẽ gạch, sân xi măng, dọc đường xe lửa có dải những hòn đá vôi xanh Trên thế giới, cỏ sữa lá nhỏ cũng mọc hoang ở một số nước như Bangladesh, Ấn Độ Theo y học cổ truyền, cỏ sữa lá nhỏ được sử dụng để chữa lỵ, nhất là ở trẻ em [13]; tăng huyết áp, các bệnh lý về tim mạch và hội chứng khí hư; đái tháo đường và giảm đau… [32] Lá và hạt cỏ sữa lá nhỏ được sử dụng trong chứng rối loạn đường ruột ở trẻ em và là thuốc nhuận tràng [27] Đồng thời, hoạt tính kháng khuẩn của cỏ sữa lá nhỏ đã được phát hiện từ năm

1988 [25]

Cây cỏ sữa lá nhỏ đã được các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu Theo Vũ Minh Trang, từ cặn chiết ethylacetate của lá cây cỏ sữa lá nhỏ thu hái ở Hà Nội đã phân lập được các chất: apigenin, quercetin, methyl gallate,

acid gallic và apigenin 7-O-D-glucopyranosid cùng với acid palmitic và

β-sitosterol [17] Bên cạnh đó, tác giả này cũng đã phân lập được một số thành phần dipeptide và glucoside từ lá cỏ sữa lá nhỏ, trong đó luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside là hợp chất chính có trong phần chiết nước [18] Một số kết quả nghiên cứu sơ bộ tại Việt Nam đã cho thấy cây cỏ sữa lá nhỏ có tác dụng hạ đường huyết [28] và được nhân dân sử dụng dưới dạng nước uống hằng ngày [13]

Với những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần

hóa học trong dịch chiết ethanol – nước của cây cỏ sữa lá nhỏ theo định hướng

hạ đường huyết” đã được lựa chọn

2 Mục tiêu nghiên cứu

1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cỏ sữa lá nhỏ thu hái tại huyện

Thăng Bình – tỉnh Quảng Nam

2 Xác định thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol – nước của cây cỏ

sữa lá nhỏ theo định hướng hạ đường huyết

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Toàn cây Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) được thu hái tại huyện

Thăng Bình – tỉnh Quảng Nam vào tháng 5 năm 2016

4 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với các phương pháp sau:

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu và các thông tin liên quan đến đề tài

- Tìm hiểu về các phương pháp thực nghiệm sử dụng trong quá trình nghiên cứu

- Xử lý các thông tin về lý thuyết có thể sử dụng được để đưa ra các vấn đề cần thực hiện trong quá trình thực nghiệm

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Lấy mẫu, xử lý và sơ chế mẫu

- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của cỏ sữa lá nhỏ:

- Xác định các nhóm hoạt chất trong các dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo qui trình phân tích thành phần hóa thực vật của bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

- Thử tác dụng hạ đường huyết trên chuột của dịch chiết cỏ sữa lá nhỏ

- Chiết tách, phân lập, tinh chế các chất trong cây cỏ sữa lá nhỏ bằng phương pháp chiết phân phân đoạn với các dung môi và sắc ký cột

- Xác định thành phần hóa học các chất dễ bay hơi trong dịch chiết của các phân đoạn bằng sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS

- Xác định cấu trúc hóa học của chất tinh chế được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS)

Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 VÀI NÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ

Cỏ sữa lá nhỏ có tên khoa học là Euphorbia thymifolia L., thuộc chi

Euphorbia L., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [5], [7], [13]

Hình 1.1 Cây cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.)

Cây thảo sống hằng năm hoặc lâu năm, có nhựa mủ trắng Thân và cành mảnh, mọc tỏa rộng trên mặt đất, màu tím đỏ, có lông rất nhỏ Lá mọc đối, hình bầu dục, dài 7 mm, rộng 4 mm, gốc và đầu tù, mép có răng cưa nhỏ, mặt dưới phủ lông mịn, gân chính và gân bên rõ, lá kèm nhỏ, hình dải Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành xim

ít hoa, tổng bao có cuống, phủ lông mịn, hình chuông, 5 thùy hình tam giác nhọn, 4 tuyến rất nhỏ, hình trái xoan, nhị nhiều, bao phấn nứt ngang, bầu có lông, cuống ngắn, vòi nhụy 3 rời nhau, uốn cong xuống dưới Quả nang, đường kính khoảng 1,5

mm, có lông nhỏ, hạt nhẵn, có 4 cạnh Cỏ sữa lá nhỏ còn được gọi là vú sữa đất, cẩm địa, thiên căn thảo, nhạ nậm mòn, chạ cam (Tày), nhả mực nọi (Thái) [5]

Cây ra hoa kết quả quanh năm, chủ yếu vào mùa hè – thu (tháng 5 – tháng 10) [7]

Cây ưa sáng và ưa ẩm, thường mọc thành đám nhỏ, lẫn trong các loại cỏ thấp, ở ven đường đi, vườn nhà, các ruộng cao, nương rẫy, đôi khi ở cả các kẽ nứt của sân gạch hay tường cao [13]

Phân bố: Chi Euphorbia L có mức độ đa dạng cao về thành phần loài cũng

như dạng sống Trên thế giới, hiện nay có khoảng 650 loài, bao gồm cây thảo sống một năm hoặc nhiều năm và cây bụi Chúng phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ẩm Ở Việt Nam có 24 loài, trong đó gần 10 loài được dùng làm thuốc Cây cỏ sữa lá nhỏ mọc rải rác khắp các tỉnh đồng bằng, ven biển, hải đảo, trung du và miền núi ở nước ta Độ cao cây phân bố giới hạn thường dưới 500m Đây là loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á như: Ấn Độ, Campuchia, Lào, Malaysia, Indonesia, Philippines, Brunei, Thái Lan, Trung Quốc và Việt Nam Cây

cũng được ghi nhận mọc ở một số nước vùng Nam Mỹ [5]

Ở Việt Nam còn có một cây mang tên cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L hay

Euphorbia pilulifera L.) phân bố tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh, từ đồng

bằng đến miền núi, trừ vùng núi cao lạnh Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc trên đất ẩm, còn tương đối màu mỡ, lẫn với các loài cỏ khác trên bãi hoang, vườn nhà hay ruộng đồng hoa màu Tuy nhiên, so với cỏ sữa lá nhỏ thì nơi mọc và khả năng chịu hạn của cỏ sữa lá to bị hạn chế hơn [5] Từ các đặc điểm

vi phẫu, đặc điểm bột dược liệu của cỏ sữa lá to và cỏ sữa lá nhỏ, Nguyễn Thu Hằng tiến hành so sánh sự khác nhau giữa hai loài này về các đặc điểm hiển vi Kết quả được trình bày ở Bảng 1.1 [12]

Bảng 1.1 Sự khác nhau giữa cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L.) và cỏ sữa lá nhỏ

(Euphorbia thymifolia L.) về đặc điểm thực vật

Vi phẫu thân Tỷ lệ trên bán kính mô mềm

ruột Khoảng 1/3 Khoảng 2/1

Vi phẫu lá Lông che chở ở biểu bì dưới Có Không có

Đặc điểm Cỏ sữa lá to Cỏ sữa lá nhỏ

Vi phẫu lá Bó libe gỗ ở phiến lá Không có Có 2 – 3 bó

thành bó

Chia thành 2 –

3 bó có kích thước không đều

Bột dược

liệu

Lông che chở Có Không có

Tế bào mô cứng Có Không có

Từ Bảng 1.1 cho thấy ở vi phẫu thân cỏ sữa lá to, mô mềm ruột chiếm phần lớn diện tích (tỷ lệ trên bán kính mô mềm vỏ/mô mềm ruột là 1/3), trong khi đó ở vi phẫu thân cỏ sữa lá nhỏ, mô mềm vỏ chiếm phần lớn diện tích (tỷ lệ trên bán kính

mô mềm vỏ/mô mềm ruột là 2/1) Ở vi phẫu phiến lá, cỏ sữa lá to có lông che chở ở biểu bì dưới và không có các bó libe gỗ phụ, còn ở phiến lá cỏ sữa lá nhỏ, không có lông che chở nhưng có 2 – 3 bó libe gỗ phụ có cấu tạo tương tự bó libe gỗ ở gân chính Libe gỗ chia thành 2 – 3 bó kích thước không đều ở vi phẫu rễ cỏ sữa lá nhỏ

là đặc điểm khác biệt so với cỏ sữa lá to (libe gỗ không chia bó) Sự hiện diện của lông che chở và tế bào mô cứng ở bột cỏ sữa lá to là đặc điểm khác biệt so với cỏ sữa lá nhỏ Từ sự phân tích trên cho thấy có thể phân biệt sự khác nhau rõ ràng giữa

cỏ sữa lá to và cỏ sữa lá nhỏ dựa trên các đặc điểm vi phẫu và bột dược liệu

Như vậy, nghiên cứu của Nguyễn Thu Hằng [13] về đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá và đặc điểm bột dược là những dữ liệu quan trọng làm cơ sở cho việc nhận biết, tránh nhầm lẫn và tiêu chuẩn hóa bột dược liệu nhằm nâng cao giá trị sử dụng của hai loài cỏ sữa ở Việt Nam

Hình 1.2 Cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L.)

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ

1.2.1 Nghiên cứu ở Việt Nam

Theo nghiên cứu của Đỗ Huy Bích và cộng sự cho thấy bộ phận trên mặt đất

của cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) mọc hoang ở Việt Nam có epitaraxerol,

quercetin 3-β-galactoside và alcol Lá và thân có flavonoid cosmosiin Rễ có alcol myricylic, taraxerol và tyrucalol Bên cạnh đó, cỏ sữa lá nhỏ chứa tinh dầu màu xanh, mùi đặc biệt, vị kích ứng Thành phần gồm cymol, carvacrol, limonen, sesquiterpen và acid salicylic [5]

Năm 2011, Vũ Minh Trang và cộng sự [17] đã chiết và phân lập đƣợc các thành phần phenolic chính từ phân đoạn chiết EtOAc của phần trên mặt đất cây cỏ

sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) thu hái tại Hà Nội Tên và công thức cấu tạo

- Apigenin (3), Quercetin (4), Apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside (5),

- Asperglaucide (1), Aurantiamide (2),

NHO

O

HN

OR

và β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside (3)

O H

Lớp nước được phân tách bước đầu bằng sắc ký cột với Diaion HP-20, sau

đó rửa giải với MeOH/H2O 40% và MeOH/H2O 60%, tiếp tục phân tách cho hợp

chất luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside (4)

O

OOH

OH

OHO

OOH

HOH2CHOHO

Trong các hợp chất được phân lập, các hợp chất dipeptide (1), (2), (3) và (4) là

các thành phần hóa học mới được phát hiện trong cây cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia

thymifolia L.)

Năm 2013, Nguyễn Khoa Hạ Mai và cộng sự tiến hành nghiên cứu tổng hàm lượng polyphenol của một số cây thuốc ở An Giang bằng phương pháp trắc quang

với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho thấy lá cây cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia

L.) là một trong những mẫu cho tổng hàm lượng polyphenol cao [14]

Năm 2014, Nguyễn Xuân Hải và cộng sự [11] đã phân lập và xác định cấu trúc được 12 hợp chất polyphenol từ cao EtOAc của cây cỏ sữa lá nhỏ thu hái tại

An Giang:

OHO

- Gallic acid (11),

- Methyl gallate (12)

Các hợp chất polyphenol này lần đầu tiên được phân lập từ chi Euphorbia

Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất này cho thấy

các hợp chất (1), (2), (4), (5), (6) và (10) có giá trị IC50 < 100 µM, mạnh hơn chất đối chứng dương acarbose (IC50 là 214,5 µM) Trong đó, hợp chất (1) có hoạt tính

mạnh nhất với giá trị IC50 là 16,1 µM

Enzyme α-glucosidase với những tên gọi khác như: maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, α-D-glucosidase, α-1,4-glucosidase, maltase-glucoamylase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-glucosidase hydrolase, thuộc nhóm enzyme hydrolase xúc tác cho các phản ứng thủy phân [39] Enzyme α-glucosidase

có vai trò xúc tác cho phản ứng chuyển oligosaccharide thành các phân tử đường nhỏ hơn để được hấp thu vào máu thông qua cơ chế cắt đứt liên kết α-D-1,4 glucose đầu không khử Cụ thể, khi thức ăn là các carbohydrate được đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của các enzyme trong hệ tiêu hóa là α-amylase tuyến nước bọt và tuyến tụy, carbohydrate được thủy phân thành các phân tử đường nhỏ hơn như dextrin, maltotriose, maltose Hỗn hợp này sau đó được thủy phân bởi các enzyme α-glucosidase ở màng ruột non, enzyme α-glucosidase trong lysosyme và sucrase-isomaltase thành glucose và được hấp thu vào máu [6] Như vậy, bằng cách ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase có thể làm giảm sự thủy phân carbohydrate và

làm chậm quá trình hấp thu glucose vào máu giúp kiểm soát lượng glucose trong máu sau ăn Đặc biệt, các chất ức chế enzyme α-glucosidase còn có có ưu điểm vượt trội là không gây hạ đường huyết nên an toàn cho bệnh nhân Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase có nguồn gốc từ thảo dược vẫn tiếp tục thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới bởi những ưu điểm vốn có của nó như ít tác dụng phụ, giảm giá thành

Như vậy, từ kết quả nghiên cứu của Nguyễn Xuân Hải và cộng sự [11] cho thấy một số hợp chất polyphenol của cây cỏ sữa lá nhỏ có tác dụng làm chậm quá trình tiêu hoá và hấp thu carbohydrate do ức chế enzyme α-glucosidase

Cùng năm 2014, Nguyễn Thị Tuyết Lan [28] phân lập được 1 flavonoid từ

cao chiết EtOAc của cây cỏ sữa lá nhỏ là quercetin-3-O-arabinofuraroside

1.2.2 Nghiên cứu trên thế giới

Năm 1990, Lee SH và cộng sự [29] đã phân lập được acid isomallotinic và

O

O H

H

OH

O

H H O

H OH

H H O O

Đây là một tannin thủy phân mới ngoài 15 tannin đã đƣợc biết đến Đồng thời, các tác giả này cũng đã kết luận rằng cỏ sữa lá nhỏ có một lƣợng lớn phenolic

Năm 2007, Nadkarni KM và Nadkarni AK [33] đã phân lập đƣợc những hợp chất sau:

- Vitamin C (5),

O

OHO

OH

HO

HOH

Năm 2009, Sandeep R.Kane và cộng sự [40] đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết ethanol 90% từ cỏ sữa lá nhỏ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (ether dầu hỏa, diethyl ether, ethyl acetate và n-buthanol) thu đƣợc các thành phần nhƣ trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của cỏ sữa lá nhỏ trong các dịch chiết

Ethanol steroid, tannin, flavonoid, sugar

Ether dầu hỏa steroid

Diethyl ether steroid, flavonoid

Ethyl acetate tannin, flavonoid

n-buthanol tannin, flavonoid

Năm 2011, Prasad K và Bisht G [37] đã xác định đƣợc sự có mặt của 30 hợp chất và 79,89% tinh dầu trong cao chiết n-hexan và CH2Cl2 phần trên mặt đất của

cỏ sữa lá nhỏ bằng sắc kí khí với các thành phần chính của tinh dầu là acid hexadecanoic (33,03%), phytol (10,36%) và acid tetradecanoic (6,58%) Ngoài ra, các hợp chất monoterpene, sesquiterpene, diterpene lần lƣợt chiếm tỉ lệ 8,28%, 2,86% và 8,28% so với tổng hàm lƣợng tinh dầu chiết tách đƣợc Bên cạnh đó, phần trên mặt đất của cây này có các chất chống oxy hóa nhƣ β-carotene, phenolic, vitamin C, tannin, chlorophyll A, chlorophyll B Đồng thời, các nguyên tố vô cơ cũng đƣợc tìm thấy nhƣ K, N, Na, Ca, P, S, Fe, Li, Cu, Mn, Zn

n-Năm 2012, Hussain R và cộng sự [22] đã phân lập đƣợc 2 dẫn xuất mới của acid cinnamic là thymofolinoates A và B từ phân đoạn chiết chloroform của

Euphorbia thymifolia L Ngoài ra, các tác giả đã lần đầu tiên phân lập đƣợc các

hợp chất p-hydroxy acid cinnamic, hydroxy-6,7,8,4'-tetramethoxy flavone, và

5-hydroxy-3', 4', flavone 6,7,8-pentamethoxy từ loài Euphorbia thymifolia này

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ

1.3.1 Tác dụng hạ đường huyết

Năm 2011, Pooja và cộng sự nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cỏ sữa

lá nhỏ trên chuột theo mô hình gây tăng đường huyết bằng Streptozotocin với đường tiêm phúc mạc ở liều 60 mg/kg cân nặng Kết quả nghiên cứu cho thấy khi

sử dụng dịch chiết methanol của cỏ sữa lá nhỏ với liều 400 mg/kg cân nặng thì có hiệu quả hạ đường huyết đáng kể so với liều tương ứng khi sử dụng dịch chiết nước của cỏ sữa lá nhỏ đã chiết phân đoạn với ether dầu hỏa, chloroform và methanol Tuy nhiên, các tác giả này chưa khẳng định được chính xác thành phần hóa học nào trong cỏ sữa lá nhỏ có hoạt tính hạ đường huyết [35]

Năm 2012, Rahmatullah M và cộng sự thử tác dụng hạ đường huyết trên chuột của dịch chiết methanol từ cỏ sữa lá nhỏ theo mô hình gây tăng đường huyết bằng uống glucose với liều 2 mg/kg cân nặng Kết quả cho thấy dịch chiết này làm giảm đáng kể nồng độ glucose trong huyết thanh phụ thuộc vào liều dùng (p < 0,05) Trong đó, liều 400 mg/kg cân nặng làm giảm 60,5% lượng glucose trong huyết thanh trong khi thuốc glibenclamid làm giảm 48,6% lượng glucose trong huyết thanh khi dùng với liều 10 mg/kg cân nặng [39]

Năm 2013, Hoàng Lê Sơn và cộng sự đã bước đầu đánh giá hoạt tính hạ đường huyết của cây cỏ sữa lá nhỏ Theo kết quả nghiên cứu, chiết xuất của cỏ sữa

lá nhỏ có thể làm giảm đường huyết tới 48% ở chuột tiểu đường gây ra bằng STZ/NAD và 43,8% ở chuột tiểu đường gây ra bởi Monosodium glutamate (bột ngọt) Nghiên cứu này đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc kết hợp giữa đông và tây y

1.3.2 Tác dụng giảm đau

Năm 2012, Rahmatullah M và cộng sự [39] nghiên cứu tác dụng giảm đau của cỏ sữa lá nhỏ trên mô hình gây đau bằng cách tiêm acid acetic 1% vào phúc mạc bụng của chuột với liều 10 ml/kg cân nặng Kết quả cho thấy khi sử dụng dịch chiết methanol với liều 400 mg/kg cân nặng thì ức chế được 40,9% số cơn đau quặn Trong khi sử dụng thuốc giảm đau aspirin với liều 200 mg/kg cân nặng thì ức chế 49% tổng số cơn đau

1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, kháng sinh, kháng viêm

Theo nghiên cứu của Khan NH và cộng sự năm 1988 [25], dịch chiết EtOAC

và CHCl3 của cỏ sữa lá nhỏ có hoạt tính kháng lại vi khuẩn Escherichia coli và

Shigella flexneri trong thử nghiệm in vitro

Theo nghiên cứu trên in vitro của Yang CM và cộng sự năm 2005 [43], dịch

chiết EtOAc từ cỏ sữa lá nhỏ làm giảm đáng kể sự lây nhiễm virus HSV-2 với nồng

độ 0,4 μ/ml

Năm 2007, Khar CP [26] cho rằng hoạt tính kháng sinh của cỏ sữa lá nhỏ là

do các alkaloid trong cây này

Năm 2008, Mon M và cộng sự [31] ghi nhận hoạt tính kháng nấm và kháng

lại vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus pumilis, Bacillus subtilis của dịch

chiết ethanol từ cỏ sữa lá nhỏ

Năm 2012, Nagaraju G và cộng sự [34] cho thấy khi sử dụng dịch chiết ethanol từ cỏ sữa lá nhỏ với liều 100 mg/kg cân nặng có tác dụng giảm phù nề đáng

kể khi so sánh với thuốc indomethacin (10 mg/kg)

1.3.4 Tác dụng chống oxy hóa, gốc tự do

Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong cơ thể, trong đó có ung thư Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc – hóa chất, căng thẳng thần kinh, … [10]

Năm 2002, Lin CC và cộng sự [30] nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và gốc tự do của dịch chiết nước và các phân đoạn gồm MeOH, CHCl3, EtOAc, n-buthanol từ cỏ sữa lá nhỏ Nghiên cứu này cho thấy dịch chiết nước có hoạt tính phá hủy gốc hydroxyl và gốc peroxide

Năm 2005, Prabha T và Singh SK nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của

dịch chiết ethanol từ cỏ sữa lá nhỏ trên in vivo và in vitro bằng cách đánh giá hàm

lượng MDA trong não chuột Kết quả nghiên cứu cho thấy sự ức chế quá trình peroxide hóa của dịch chiết này tương đương hoạt tính của vitamin E [36]

Năm 2012, Nagaraju G và cộng sự [34] đã ghi nhận hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết ethanol từ cỏ sữa lá nhỏ

1.3.5 Tác dụng trị giun

Năm 2009, Kan SR và cộng sự [24] nghiên cứu hoạt tính trị giun Pheretima

posthyma và Ascaridia galli của dịch chiết methanol và dịch chiết nước của cỏ sữa

lá nhỏ Các tác giả nhận định rằng hoạt tính trị giun của cây này phụ thuộc vào nồng

độ của dịch chiết, đặc biệt với liều 100 mg/ml và có thể hợp chất tannin trong dịch chiết chi phối hoạt tính này

1.3.6 Tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng

Năm 2009, Kan SR và cộng sự [24] nhận định rằng dịch chiết ethanol của

Euphorbia thymifolia L có tác dụng lợi tiểu và nhuận tràng đáng kể, phụ thuộc vào

từng phân đoạn chiết và liều dùng

1.4 CÔNG DỤNG CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ

Theo kinh nghiệm sử dụng của nhân dân một số quốc gia trên thế giới và Việt Nam cho thấy cỏ sữa lá nhỏ là vị thuốc chữa lỵ rất phổ cập trong nhân dân, hay dùng nhất đối với trẻ em Hằng ngày dùng 15g đến 20g (có thể đến 50g) dưới dạng thuốc sắc

Ngoài công dụng chữa lỵ ở nước ta, cây cỏ sữa lá nhỏ còn được dùng ở nước khác làm thuốc diệt sâu bọ và duốc cá (Ấn Độ), giã đắp chữa bệnh ngoài da và vết thương (Malaysia, Ả Rập) [13]

1.5 MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

Sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thực vật trong phòng và chữa bệnh là thói quen, kinh nghiệm và truyền thống của người dân Việt Nam và một số nước trên thế giới Nghiên cứu về vấn đề sử dụng thảo dược thường xuyên cho bệnh nhân đái tháo đường ở Marốc đã cho thấy liệu pháp thực vật là kinh tế nhất và hiệu quả hơn thuốc hiện đại [6]

Một số cây đã và đang được nghiên cứu để chứng minh tác dụng hạ glucose

huyết như Mướp đắng (Mormordica charantia, họ Cucurbitaceae), Chuối hột (Musra barjoo Sieb, họ Musaceae), Thổ phục linh (Smilax glabra, họ Liliaceae), Hương nhu tía (Ocimum sanctum, họ Lamiaceae), Kha tử (Terminalia chebula, họ Combretaceae), Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides, họ Liliaceae), Tỏi (Allium

sativum, họ Liliaceae), Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata, họ Moraceae), Dừa cạn

(Catharanthus roseus, họ Apocynaceae), Lô hội (Aloe vera, họ Liliaceae), Cỏ mực (Eclipta alba, họ Asteraceae), Đơn kim (Bidens polisa var radiate, họ Asteraceae), Nhân sâm (Panax ginseng, họ Araliaceae), … Các nghiên cứu này đã cho thấy kết

quả hạ đường huyết khá khả quan, có thể dần dần đưa vào sử dụng trên lâm sàng [6], [7], [9], [13]

Qua tổng quan về tác dụng dược lý của cây cỏ sữa lá nhỏ cho thấy đây là dược liệu có nhiều tác dụng quý như: tác dụng giảm đau, tác dụng chống oxy hoá, tác dụng kháng viêm, tác dụng trị giun, …, đặc biệt là tác dụng hạ đường huyết Tác dụng này được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu và đã có nhiều công bố Mặt khác, theo kinh nghiệm dân gian, cây này cũng được nhân dân một số nước và Việt Nam sử dụng để phòng, hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường

Đồng thời, về thành phần hoá học cũng đã có những nghiên cứu cả trong và ngoài nước Việc sáng tỏ về thành phần hoá học giúp chứng minh thành phần nào

trong cây cỏ sữa lá nhỏ có tác dụng hạ đường huyết Bước đầu các nghiên cứu đã cho câu trả lời đó chính là các flavonoid

Theo hướng nghiên cứu này, các kết quả công bố chủ yếu là của các tác giả nước ngoài, các nghiên cứu ở Việt Nam vẫn còn hạn chế, đặc biệt là việc nghiên cứu thành phần hoá học theo định hướng hạ đường huyết Đây là cơ sở khoa học thực tiễn để chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu đề tài này

CHƯƠNG 2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là toàn cây Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.)

được thu hái ở khu vực huyện Thăng Bình – Quảng Nam vào tháng 05 năm 2016

Nguyên liệu sau khi thu hái được rửa sạch, phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 60°C trong tủ sấy Shellab có quạt thông gió Sau khi sấy khô, nguyên liệu được bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát

Hình 2.1 Cỏ sữa lá nhỏ đã xử lý

2.1.2 Hoá chất – dung môi, thiết bị

Các hoá chất – dung môi, thiết bị sử dụng trong đề tài được trình bày trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2

Bảng 2.1 Hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình chiết xuất

và phân lập

1 n-hexane TCCS Trung Quốc

2 Ethyl acetate TCCS Trung Quốc

3 Dichloromethane TCCS Trung Quốc

5 Methanol TCCS Trung Quốc

TT Tên hóa chất – dung môi Tiêu chuẩn Nguồn gốc

6 Natri hydroxyd TCCS Trung Quốc

7 Ammoniac TCCS Trung Quốc

8 Silica gel G (60 - 200μm) TCCS Đức

9 Bản mỏng silica gel GF 254 TCCS Đức

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong quá trình chiết xuất và phân lập

1 Quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS ZEEnit 700 Đức

2 Máy sắc ký khí khối phổ GC-MS 7890A – 5975C

Aglilent Hoa Kỳ

3 Máy cô quay chân không

Heidolph Laborota 4001 efficient

7 Cân phân tích PS 750/C/1 Ba Lan

8 Bếp cách thủy Trung quốc

9 Cột sắc ký cổ điển Việt Nam

Một số dụng cụ khác như: micropipet, bình định mức, bình lắng gạn, cốc sứ, bình tam giác có nút mài, các loại pipet, phễu lọc, …

2.1.3 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng dòng Swiss trưởng thành, không phân biệt giống, trọng lượng 20,0  2,0 g do Ban Cung cấp động vật thí nghiệm – Học viện Quân y cung cấp, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

- Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

- Trường Đại học Duy Tân

- Học viện Quân y

- Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2

- Viện Hoá sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

m0: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g)

m1: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu

Từ khối lượng cỏ sữa lá nhỏ trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm trung bình theo công thức 2.1 và 2.2

b Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu

 Cách tính hàm lượng tro

%A = x 100% (2.3)

%ATB = (2.4) Trong đó

m0: Khối lượng mẫu trước khi tro hoá(g)

m1: Khối lượng tro (g)

 Cách tiến hành

Cân khoảng 2g mẫu cỏ sữa lá nhỏ đã được sấy khô, cho vào cốc sứ đã sấy khô đã biết chính xác khối lượng Đặt cốc sứ có chứa cỏ sữa lá nhỏ lên trên bếp điện tiến hành tro hoá mẫu, tiếp tục cho mẫu vào lò nung và nung ở 6000

C khoảng 3 giờ đến khi thu được tro có dạng bột mịn, màu trắng Dùng kẹp mài lấy cốc sứ ra khỏi lò nung và cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lượng Đưa mẫu vào lò nung tiếp 30 phút, lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm và cân, tiến hành quá trình trên cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hoặc sai số không quá 0,5 mg thì dừng quá trình tro hoá [3]

Từ đó tính được hàm lượng tro trung bình trong cỏ sữa lá nhỏ khô theo công thức 2.3 và 2.4

c Xác định hàm lượng một số kim loại nặng bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử (AAS)

 Cơ sở của phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS

Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) là một kỹ thuật phân tích mới được phát triển mạnh mẽ và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học, kỹ thuật ở các nước phát triển

Cơ sở lý thuyết của phép đo là sự hấp thụ năng lượng ánh sáng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của

nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ theo định luật hấp thụ ánh sáng Lambert - Beer

Mẫu được nguyên tử hóa bằng phương pháp ngọn lửa, với hỗn hợp khí đốt là

C2H2 – không khí Định lượng bằng phương pháp lập đường chuẩn

 Cách tiến hành

Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức bằng nước cất và xác định hàm lượng cadimi, arsen, thủy ngân, chì

bằng phương pháp phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học

- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ chính theo phương pháp phân tích sàng lọc các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong cây bằng phản ứng hoá học theo quy trình phân tích hoá thực vật của bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh [2]

+ Điều kiện chạy máy sắc ký khí – khối phổ (GC-MS):

* Chế độ chia dòng: không chia (Splitless)

* Chế độ phân tích: full Scan

* Khoảng phân tích khối: 50 – 500 (m/z)

+ Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI – MS) được đo trên máy MS LTQ Obitrap XLTM (USA) tại Khoa Hoá học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR đo trên máy: Bruker Avance AM500 FT – NMR (Hàn Quốc) tại Viện Hoá học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn là

TMS (Tetramethyl Silan)

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết

- Chuẩn bị dịch chiết:

Toàn cây cỏ sữa lá nhỏ sau khi thu hái được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô

ở 600C được sử dụng làm mẫu nghiên cứu

Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh dùng dung môi ethanol 96%, ethanol 80%, ethanol 50%:

+ Cân khoảng 0,5 kg mẫu, làm ẩm bằng 500 ml dung môi, nén chặt khoảng

30 phút Thêm dung môi vào đến cách dược liệu khoảng 3 cm, ngâm lạnh trong 48 giờ, thu dịch chiết lần 1 Tiếp tục thêm dung môi cho ngập dược liệu, ngâm lạnh trong 24 giờ, thu dịch chiết lần 2 Tiến hành tương tự như lần 2, thu dịch chiết lần 3

Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng (đun sôi) dùng dung môi nước cất:

+ Cân khoảng 0,5 kg mẫu, làm ẩm bằng 500 ml nước cất, nén chặt khoảng

30 phút Thêm nước cất vào đến cách dược liệu khoảng 3 cm, đun sôi trong 4 giờ, thu dịch chiết lần 1 Tiếp tục thêm nước cất cho ngập dược liệu, đun sôi trong 2 giờ, thu dịch chiết lần 2 Tiến hành tương tự như lần 2, thu dịch chiết lần 3

Dịch chiết của từng dung môi được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi được cao 5:1

+ Cao chiết dùng dung môi ethanol 96% ký hiệu là Cao chiết ET1

+ Cao chiết dùng dung môi ethanol 80% ký hiệu là Cao chiết ET2

+ Cao chiết dùng dung môi ethanol 50% ký hiệu là Cao chiết ET3

+ Cao chiết dùng dung môi nước cất ký hiệu là Cao chiết ET4

Sau đó pha hỗn dịch các cao chiết ET1, ET2, ET3, ET4 với nước cất tỉ lệ 1:1, sử dụng NaCMC 0,5% để ổn định hỗn dịch Dùng hỗn dịch các cao chiết này

để đánh giá tác dụng hạ đường huyết

- Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết:

+ Đánh giá tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết dược liệu trên mô hình chuột tăng đường huyết thực nghiệm bằng STZ (tiêm màng bụng liều 400 mg/kg

thể trọng) Sau khi tiêm màng bụng dung dịch STZ (400 mg/kg) 72 giờ, tiến hành định lượng glucose trong máu lúc đói của chuột bằng phương pháp enzyme glucose oxidase với máy tự động và que thử Accu – chek Active (Roche), lựa chọn chuột có glucose máu  11 mmol/L cho thí nghiệm

+ Chuột tăng glucose máu thực nghiệm được chia thành các lô, mỗi lô 10 con: Lô chứng trắng uống dung dịch NaCMC 0,5% Lô chứng dương uống gliclazid (20 mg/kg thể trọng) Các lô thử uống hỗn dịch cao chiết dược liệu với liều tương đương 6g dược liệu khô/kg thể trọng chuột [36]

+ Cho chuột uống mẫu thử trong vòng 7 ngày (vào 8 giờ sáng mỗi ngày), trong 7 ngày đó cho chuột ăn uống bình thường So sánh sự thay đổi đường huyết của các lô thí nghiệm

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HOÁ LÝ

3.1.1 Độ ẩm

Mẫu cỏ sữa lá nhỏ đã phơi và sấy khô được tiến hành xác định độ ẩm Số lượng mẫu được lấy để xác định độ ẩm là 5 mẫu Độ ẩm được xác định là độ ẩm

trung bình của 5 mẫu

Kết quả xác định độ ẩm của mẫu cỏ sữa lá nhỏ nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.1

Kết quả xác định độ tro toàn phần trong mẫu cỏ sữa lá nhỏ nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Độ tro toàn phần của cỏ sữa lá nhỏ

Bảng 3.3 Hàm lượng kim loại nặng trong mẫu cỏ sữa lá nhỏ

STT Chỉ tiêu Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg g

1 Hg Không phát hiện (< 0,05) 0,050

3 Pb Không phát hiện (< 0,1) 2,000

Nhận xét: Đối chiếu kết quả phân tích hàm lượng kim loại nặng bằng

phương pháp AAS với quyết định số 46/2007/QD - BYT ngày 19/12/2007 của Bộ

trưởng Bộ Y tế về giới hạn tối đa ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm thì hàm

lượng các kim loại thuỷ ngân, asen, chì, cadimi trong mẫu nghiên cứu đạt tiêu chuẩn (< 1 mg/kg)

3.2 KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA CÂY CỎ SỮA

LÁ NHỎ

3.2.1 Kết quả chiết xuất dược liệu

Toàn cây cỏ sữa lá nhỏ được rửa sạch, thái nhỏ, phơi và sấy khô ở 500C Lấy 0,5 kg mẫu ngâm chiết với 2,5 lít ethanol 96% 3 lần, sau đó gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi được cao 5:1 thu được cao chiết ET1 Tiến hành tương tự với các dung môi ethanol 80%, ethanol 50% thu được cao chiết ET2, ET3

Lấy 0,5 kg mẫu chiết nóng với 2,5 lít nước cất 3 lần, sau đó gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi được cao 5:1 thu được cao chiết ET4

Cân khối lượng các cao chiết thu được, từ đó tính hiệu suất chiết của các dung môi Kết quả hiệu suất chiết cỏ sữa lá nhỏ trong dung môi ethanol – nước được trình bày ở Bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả hiệu suất chiết cỏ sữa lá nhỏ trong dung môi EtOH-H 2 O

STT Dung môi

Khối lượng dược liệu (g)

Khối lượng cao chiết (g)

Hàm lượng cao chiết (%)

Hàm lượng cao chiết trung bình (%)