3+, 4+ chì mửc độ ngưng kết; - : không ngưng kết; ( ): khi có tác dụng của IgG s.au: Staphylococcus aureus s.ep: Staphylococcus epìdermidis SNC: Staphylococcus negative congulase s[r]
Trang 1Ú N G D Ụ N G IG G T R O N G N G H IÊ N c ứ u Đ Ặ C T ÍN H L E C T IN VÀ
P H Â N L O Ạ I T Ụ C Ẩ U K H U Ẩ N
B ù i P h ư ơ n g T h u ậ n
K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N
M ở đ ầ u
M ột tro n g n h ữ n g ứng dụng thự c tế của láp globulin m iễn dịch IgG là để tách và nghiên cứu đặc tín h của các hợp c h ấ t sinh học n hư các glycoprotein, đặc biệt là lectin Nhờ vào k h ả n ăng gây ngưng k ế t và k ế t tủ a chọn lọc, lectin đ ang được sử dụng nhiều trong nghiên cứu t ế bào và miễn dịch, để xác dịnh nhóm m áu [2,4,5] N hững k ế t q u ả nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy IgG có tương tác với lectin từ sam biên và m ột sô lectin thực vật T rong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét ảnh hưởng của IgG lên phản ứng gây ngưng kết tế bào vi khuẩn của lectin, nhằm mở rộng kh ả n ăn g ứng dụng IgG và lectin trên thực tế
Chi tụ cầu k h u ẩ n (Staphylococcus) bao gồm nhiều tác n h â n gây bệnh cho ngưòi và
động vật Thưòng chúng được chia làm hai loại dựa trên k h ả n ă n g làm đông h u yết tương
(phán ứng coagulase): loại dương tính, chủ yếu là Staph, aureus (tụ cầu vàng) gây bệnh nhiều n h ất, còn loại ám tính là các loài tụ cầu trắ n g (trong đó có Staph, negative coagulase (SNC) và Staph epiderm idỉs) ít gây tác hại hơn Tuy nhiên, cách ph ân chia này không
chính xác và có khi gáy nhẩm lẫn Do vậy, việc tìm ra m ột phương thức nh ận biết nhanh, nhạy những khác biệt cơ b ản của hai loài tụ cầu này để phân loại chúng có ý nghĩa lớn trong thực tế
N g u y ê n liệ u v à p h ư ơ n g p h á p
N guyên liêu:
-Dịch chiết lectin thô được chuẩn bị từ các m ẫu thực v ậ t (hoa, quả, h ạt) bằn g dung dịch đệm PBS [2]
- Các chủng vi khuẩn Staphylococcus (do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp)
được nuôi cấy, xử lý, tạo huyền dịch và điều chỉnh đến độ đục thích hợp ỏ bước sóng 540 nm trên m áy đo quang phổ
- Chê phẩm LgG và h u yết tương (tách từ m áu người b ình thư òng do T ru n g tâm huyết học v à truyền m áu T ru n g ương cung cấp)
P hư ơ n g p h á p n g h iê n cứ u
■ Xác đ ịnh k h ả n ăn g gây ngưng k ế t t ế bào vi k h u ẩ n của lectin [1]:
- Sử dụng kỹ th u ậ t ELISA [3] để nghiên cứu tương tác giữa IgG với lectin và vi khuẩn
K ế t q u ả , t h ả o l u ậ n
1- T ác d ụ n g c ủ a IgG lê n p h ả n ứ ng g â y n g ư n g k ế t t ế bào vi k h u ẩ n c ủ a lec tin a- H oạt tín h gã y ngưng kế t t ế bào vi kh u ẩ n của lectin
Một sô lectin biểu hiện kh ả n ăn g gây ngưng k ế t không chỉ trê n t ế bào hồng cầu, mà
cả trê n t ế bào vi k h u ẩn Đặc tín h n ày có những ứng dụng r ấ t q u a n trọ n g tro n g nghiên cứu miễn dịch v à trong địn h loại vi sinh v ật [1,6] C húng tôi đã sử dụng các vi k h u ẩ n có ý nghía
về m ặt dịch tễ đan g được q u an tâ m là sáu chủng tụ cầu vàn g Staph, aureus (S au) 4, 15,
16, 17, 25923 và 29213,; bốn chủng tụ cầu trắ n g là SNC 20 và 19, Staph, epiderm is (s ep)
21, Staph, xy lu su s (S xy) để nghiên cứu tương tác lectin - vi k h u ẩ n (kết quả ở h àn g trê n của
bảng 1) và tác dụng của IgG lên tương tác này (kết quả trong ngoặc đơn ở hàng dưới của bảng 1)
Trang 2Các số liệu th u được cho thấy có sự khác biệt giữa các m ẫu trong biếu hiện ho ạt tính lectin Các m ẫu từ đậu ván, đậu dải, đậu trạch lai, lá và h ạ t hoè, hoa kim cúc, củ lay ơn đểu
ít tác dụng lẽn vi k h u ẩn (với số chủng bị ngưng k ết tôi đa chỉ là 10%) tu y có kh ả n ăn g gây ngưng kết hồng cầu m ạnh Ngược lại, m ẫu từ h ạ t móng bò đỏ, h ạ t gội tía và củ m ã th ầy (có hoạt tín h gây ngưng k ế t hồng cầu r ấ t th ấp ) lại tác d ụ n g lẽn h ầ u h ế t (từ 80- 100%) sô chủng
tụ cầu th ử nghiệm
Một sô lectin có tác dụng liên k ế t chọn lọc với tụ cầu vàng, điển h ình )à lectin từ h ạ t
dậu ván (với chủng s au 17), h ạ t đ ậu ngự (với mức độ ngưng k ế t khác b iệt rõ rệ t và giảm dần giữa 5 chủng đầu: từ (3+) với s a u 4 đến (+) với s a u 25923), h ạ t n h ã n Ngược lại,
một số lectin khác l ạ i gây ngưng k ế t r ấ t đặc hiệu các chủng tụ cầu trán g , ví d ụ n h ư lectin từ hoa, lá và đặc biệt rõ là chê phẩm lectin vô hoè với mức độ ngưng k ết giảm dần từ (4+) với
s.ep 21 xuống (2+) với S N C 19 và (+) với s xy , hay n h ư lectin h ạ t hoè có tác dụng p hân loại đặc hiệu hẹp khi gây ngưng k ế t tối đa (4+) và duy n h ấ t ch ủ n g s x y Do vậy, có th ể sử dụng
nhũng lectin này dể p hân b iệt giữa h a i loài tụ cầu, th ậ m chí giữa các ch ủ n g trong từ ng loài
B ả n g 1 Tác dụng của IgG lên h o ạt độ gây ngưng k ế t t ế bào tụ cầu của lectin TT
Lectin
(OD)90nm trong
s.au
4 S.au15 s.au16 s.au 17 29213s.au 25923s au SNC19 SNC 20 s.ep21 s.xy
3 Hat dàu dái
Ghi chú' + 2+ 3+, 4+ chì mửc độ ngưng kết; - : không ngưng kết; ( ): khi có tác dụng của IgG s.au: Staphylococcus aureus s.ep: Staphylococcus epìdermidis
Trang 3Sự khác n hau trong h o ạ t tín h gáy ngưng kết tẽ bào vi k h u ẩn của các loại lectin cho thấy có sự không đổng n h ấ t vể th ụ th ể (các đường - tru n g tám tương tác với lectin), hoặc về
th à n h phần và kiểu liên k ế t củ a th ụ thể với các gốc oligosaccharide và polypeptide có trên
bê m ặt các chủng Staphylococcus Chính vì có khả n ăng n hận b iết sự sai khác này mà lectin
đã trớ th àn h m ột công cụ đắc lực trong n hận dạng và định loại vi sinh vật, th ay th ế cho các phương pháp phân loại phức tạ p và tốn kém thưòng dùng [1,6]
b-Tác d ụ n g của IgG
B áng 1 củng cho th ấy IgG có những tác dụng khác n h a u lên p hản ứng ngưng k ế t giữa lectin với tế bào lụ cầu T rong 21% trường hợp, hoạt độ gáy ngưng k ế t của lectin lên tê bào
tụ cầu bị giám, cho thấy có tá c dụng ức chẽ của IgG (so vái 75% sô m ẫu bị ức chê hoạt độ gây ngưng kết hồng cầu) H iện tượng này có thể do tru n g tâm liên k ế t saccharide của lectin
bị IgG phong toả nên khõng tiệp'xúc được với trung tâm tương tác với lectin trên bể m ặt tế bào dần đến m ất kh ả n ăng gâỹ-ĩigưng kết t ế bào
Điểu khá lý th ú là IgG còn làm tán g phản ứng ngưng k ế t của lectin vối m ột sô chủng
tụ cầu vàng, như trưòng.hợp của lectin từ h ạ t móng bò đỏ với các chủng s a u 4, 29213 và
17, h u y ết th anh sam với s a u 29213 và 17, m ẫu h ạ t vải vối s a u 4 Đặc biệt, lectin từ một
số m ầu chi biếu hiện khả n ăng gãv ngưng k ế t tê bào tụ cầu vàng khi có IgG: m ẫu h ạ t dành
d ành với s a u 17, m ẫu đ ậu dải vói s a u 16, m ẫu củ lay ơn với s a u 15 và 29213 .H iện
tượng này không th ấy có ờ các chủng tụ cầu trắng, và cũng khác với th ử nghiệm trẽn hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu với các ch ấ t ức chế thông thường (như các loại đường đơn) Do vậy, có thê sử dụng IgG phôi hợp với m ột số lectin để n h ận dạng các chủng tụ cầu vàng Đồng thời điều này còn gợi ra rằ n g phải chảng IgG tự nó cũng có k h ả năn g gây ngưng kết tẽ bào tụ cầu vàng? Đê khảng đ ịnh giá th iết này, chúng tôi tiến h à n h khảo s á t khả nảng lương tác của IgG và t ế bào vi k h u ẩ n bằn g ELISA là một kỹ th u ậ t r ấ t n hạy và ít chịu ản h hưdng của yếu tô chủ quan
2- N g h iê n cứ u tư ơ ng tá c củ a IgG với lec tin và vi k h u ẩ n b a n g k ỹ t h u ậ t E L ISA
a ■ Tương tác IgG-lectin
Sô' đo độ h ấp th u q u an g (OD490nm) trên bảng 1 (ỏ phía dưới tên các lectin) biểu th ị mức
độ b ắ t giữ k h án g th ể IgG của các m ẫu lectin khi được sử dụng làm k h án g nguyên gắn bàn Tác dụng m ạnh n h ấ t là của m ẫu h u yết th an h sam (OD = 0,921), tiếp theo là m ẫu h ạ t gội tía (OD = 0,269), đậu trạc h lai (OD = 0,131) trong khi các m ẫu h ạ t đậu dải và củ lay ơn không nh ận b iết được IgG Có th ể th ấy sự tương đồng của các k ết q u ả này với tác dụng ức chế của IgG lên tương tác lectin - tụ cầu M ẫu h ạ t gội tía có mức b ắ t giũ IgG cao n h ấ t (vối
OD = 0,269), đồng thòi có k h ả n ă n g ngưng k ế t nhiều chủng tụ cầu n h ấ t (8/10), thì 7 trong sô'
8 p hản ứng tương tác lectin -tụ cầu này đã chịu tác dụng kìm hãm m ạnh n h ấ t của IgG (phản ứng ngưng kết giảm từ 4+ xuô'ng (+) và thậm chí là (-)) Tương tự như vặy là các kết
quả của m ẫu mă th ầy với s a u 17 và 25923, huyết th a n h sam với S C N 20 và s ep
Trang 4Tiếp theo, để nghiên cứu tác dụng trự c tiếp của IgG lên t ế bào tụ cầu, chúng tôi đ ã cài tiến kỹ th u ậ t ELISA b ăng cách sử dụng chính các vi k h u ẩn n ày làm k h á n g nguyên gắn bản
B ả n g 2 Tương tác IgG - tụ cầu trong xét nghiệm ELISA (OD.ig0nm )
4
s a u 15 S a u l6 s au
17
s a u 25923
s a u 29213 SNC 19 SNC s.ep
s.xy
Huyết tương 0,848 0,836 0,446 0,800 1,086 0,632 0,028 0,060 0,027 0/138
Ghi chú: s.au: Staphylococcus aureus s.ep: Staphylococcus epidermidis SNC: Staphylococcus negative congulase s.xy: Staphylococcus xylusus
SỐ liệu trê n bảng 2 cho th ấy có sự khốc b iệt rõ rà n g giữa hai loài tụ cầu th ử nghiệm Các chủng tụ cầu vàng b ắt giữ r ấ t tốt IgG: kết quả cao n h ấ t là của Sta p h , aureus lõ (OD = 1,069), còn th ấp n h ấ t là của Staph, aureus 17 (OD = 0,592) T rong khi đó, vói tụ cầu trắn g chí có Staph E p iderm idis kết hợp được với IgG nhưng ỏ m ức độ th ấ p hơn nhiều (OD =
0,112), các chủng còn lại tác dụng r ấ t yếu Các k ết quả so s á n h th u dược khi SÜ dụng huyết tương người (với toàn bộ các lóp Ig và protein tạp khác) làm k h án g th ể cũng khá tương đồng, thậm chí còn cho th ấy sự khác b iệt rõ rệ t hơn giữa h ai loài tụ cầu, và đơn giản hơn nhiều vì không cần phải tin h ch ế IgG Nguyên n hân của sự sai khác giữa hai loài tụ cầu có
th ể là do protein A (m ột k h án g nguyên bề m ặt đặc trứ ng của th à n h t ế bào tụ cẩu vàng có
k hả năn g k ế t hợp với vùng Fc của IgG) có trê n bể m ặt Sta p h , aureus đã n h ặ n biết và liên
kết với IgG Vặy giả th iế t về sự tương tác giữa trự c tiếp giũa IgG với các chủng tụ cầu vàng nghiên cứu đã được k h ăn g định là đúng Đồng thời cũng có th ể r ú t ra k ế t lu ận là do tụ cầu trắn g không tác d ụ n g với IgG, nên trê n bề m ặt của chúng kh ông có protein A K ết luận này
là phù hợp vái k ế t quả nghiên cứu điều tra protein A ỏ các ch ủ n g tụ cẩu trắ n g mà chúng tôi
đã tiến hành
Kếl quả th ử nghiệm còn cho th ấ y có th ể dựa vào mức độ tương tá c của các tê bào tụ cầu trực tiếp gắn bản trong kỹ th u ậ t ELISA cải tiến vổi IgG đê p hân b iệ t hai loài tụ cầu vàng và trắn g , cũng như để phản b iệt giữa các chủng khác n h a u của tụ c ầ u vàng Bên cạnh
dó, việc nghiên cứu ản h hư âng của IgG đến ho ạt tính gây ngưng k ế t t ế bào vi khuẩn của lectin bằng kỹ th u ậ t k ế t tủ a m iễn dịch và kỹ th u ậ t ELISA đ ã cho n h ữ ng k ế t quả tương dồng Điểu này cho th ấy kỹ th u ậ t m iễn dịch tuy đơn giản n h ư ng hoàn toàn đán g tin cậy, rấ t phù hợp cho các nghiên cửu đặc tín h của lectin (như tương tác lectin- IgG- vi khuẩn), n h ấ t
là trong điều kiện tra n g th iết bị còn h ạ n chê n h ư ỏ Việt nam
K ế t lu ậ n
IgG có khả năn g kìm hãm ho ạt độ của 72% số m ẫu lectin trong p h ả n ù ng gây ngưng kết hồng cầu và 21% sô m ẫu trong ph ản ứng gây ngưng k ế t tụ cầu
Có th ể sử d ụ n g kỹ th u ậ t ELISA cải tiế n bằn g gắn bản trự c tiếp vi kh u ẩn , các lectin đặc hiệu và kháng th ể IgG (riêng rẽ hoặc kết hợp vối n hau) để ph án b iệt các chủng tụ cầu vàng và tra n g th ử nghiệm
Trang 5So với kỹ th u ậ t ELISA, kỹ th u ậ t kết tủ a miễn dịch đ ạ t độ chính xác tương đương, nhưng đơn gián và đõ tốn kém hơn, th u ậ n tiện cho nghiên cứu đặc tính của lectin (như tương tác lectin -(IgG)- vi khuẩn)
T À I L IỆ U TH A M K H Ả O
1 Doyle R.J., Introduction to lectin and their interaction with microorganisms Lectin - microorganism interactions (eds Doyle R.J and Slifkin M M ), Marcel Dekker Publisher,
Inc, New York, 1994
2 Goldstein I.J., & Poretz R D., Isolation and chemical properties of lectins The lectins: properties, functions, and applications in biology and medecine (eds Liener 1 E., Sharon N
and Goldstein I.J.) Academic Press, Orlando, 1986
3 Engvall E., Perlm ann p., Enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA), Quantitative
assay of immunoglobulin G"- Immunochemistry, New York, 8 1971, pp 871- 873.
4 Kilpatrick D c , Handbook o f anim al lectins: properties and biomedical applications, John
Wiley & sons Publisher, LTD, New York, 2000
5 Peum ans w J and Van Damme E J M., Lectins as plant defense proteins, Plant Physiology, New York, 109, 1995, pp 347- 352.
6 Slifkin M., Application of lectin in clinical bacteriology, Lectin ■ microorganism interactions,
(eds Doyle R.J and Shfkin M M.) Marcel Dekker Publisher, Inc, New York, 1994 VNU JOURNAL OF SCIENCE N at S ci & Tech T XX Np2AP, 2004
ủhg dung IgO tmnÿ n g 11 1C II cứu tlàc lính leclin vã 177
S T U D Y O N T H E IG G E F F E C T S O N L E C T I N A C T I V I T Y A N D T H E
S T A P H Y L O C O C C U S I D E N T I F I C A T I O N
B u i P h u o n g T h u a n
D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U
The study revealed th a t 21% vegetal lectin sam ples with Staphylococcus
a gglutinating activity are inhibited by IgG, compare w ith 72% for th e hum an red blood cells
a gglutinating activity Beside th e modified ELISA assay (using directly bacteria to coat the
p late wells), th e lectins w ith proper specificities an d IgG can be used (separately or
combined w ith each other) for th e recognition of Staphylococcus aureus Strains, based on
th eir ability to ag g lu tin ate selectively cells
In com parison with ELISA assay, im munoprecipitaion m ethods provide similarly exact re su lts, b a t are sim pler and less expensive, t h a t is su itable for th e lectin characterization stu d ie s (as th e interactions between lectins- (IgG)- bacteria)