Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột nghệ vàng (curcuma longa l , zingiberaceae)

Phương pháp: đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng vàtối ưu hóa quy trình chiết curcuminoid xuất dưới sự hỗ trợ của phần mềm JMP 10.0, mô hình đáp ứng bề mặt B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-ĐOÀN XUÂN TUYỀN

XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID

TỪ DƯ PHẨM BỘT NGHỆ VÀNG

(Curcuma longa L., Zingiberaceae)

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất

Mã số: 8720210

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS VĨNH ĐỊNH

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện Luận văn

Đoàn Xuân Tuyền

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến Thầy PGS.TS Vĩnh Định

và Cô TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy luôn tận tâm chỉ bảo, góp ý và dành thời gian chỉnhsửa để em được hoàn chỉnh luận văn

Kính gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý Thầy Cô khoa Dược – Đại Học YDược thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô bộ môn Phân Tích – Kiểm Nghiệm đãdành trọn tâm huyết để truyền đạt kiến thức; hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt khóa học

Chân thành cảm ơn DS.CK1 Nguyễn Khắc Sơn – công ty TNHH THƯƠNG MẠI

VÀ DỊCH VỤ KHANG MINH (TP Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk) đã tài trợ thực hiệnnghiên cứu này

Xin cảm ơn Thầy TS Phan Văn Hồ Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về dụng cụ, cũngnhư giúp đỡ em và các bạn chủ động được thời gian trong suốt quá trình thực hiện đềtài tại phòng thí nghiệm

Cảm ơn các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn, các bạn DCQ2014 đã đồng hành.Cảm ơn tập thể lớp CH Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất (2017 – 2019); anh chị emKhoa Dược phẩm – Mỹ phẩm, Khoa Vi sinh – Đông Dược của Trung tâm Kiểmnghiệm Bình Dương luôn gắn bó, giúp đỡ trong suốt thời gian qua

Và bằng tất cả yêu thương, xin cảm ơn gia đình đã luôn động viên và đồng hành đặcbiệt là những giai đoạn khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn

Mặc dù đã rất cố gắng để thực hiện, song luận văn không tránh khỏi thiếu sót, rấtmong được sự góp ý của Thầy cô để luận văn được hoàn chỉnh hơn Một lần nữa, xintrân trọng cảm ơn!

(Curcuma longa L., Zingiberaceae)

Đoàn Xuân TuyềnNgười hướng dẫn khoa học: PGS TS Vĩnh Định

Đặt vấn đề

Thân rễ Nghệ vàng tươi (Rhizoma Curcumae longae) sau khi thu lấy tinh bột, phần

bã (dư phẩm) còn chứa nhiều curcuminoid Để tận thu nguồn dư phẩm trong việcchiết xuất curcuminoid, đề tài được thực hiện nhằm đánh giá hàm lượng; khảo sát cácyếu tố và tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm dưới sự hỗ trợ củaphần mềm JMP 10.0 Quy trình được ứng dụng để chiết xuất, tinh chế thucurcuminoid có hàm lượng cao và phân lập các thành phần tinh khiết

Đối tượng - phương pháp nghiên cứu

Đối tượng: curcuminoid trong dư phẩm của Nghệ vàng

Phương pháp: đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng vàtối ưu hóa quy trình chiết curcuminoid xuất dưới sự hỗ trợ của phần mềm JMP 10.0,

mô hình đáp ứng bề mặt Box-Behnken Sản phẩm sau khi chiết xuất được tinh chếđạt hàm lượng ≥ 95 % và phân lập các thành phần tinh khiết

Kết quả

Điều kiện tối ưu thu được để chiết curcuminoid từ dư phẩm: thời gian chiết trong môitrường kiềm 30 phút, nồng độ dung dịch natri hydroxyd 0,05 M và dịch kiềm đượcacid hóa đến pH 3 Kết quả chiết xuất đánh giá tính lặp lại của quy trình thu đượchàm lượng curcuminoid 7,26 ± 0,099 % phù hợp với giá trị dự đoán 7,31 %

Sản phẩm được tinh chế bằng methanol – nước (5:1) chứa hàm lượng curcuminoid95,1 %, phân lập 3 hợp chất tinh khiết được định tính và xác định hàm lượng CUR(98,1 %), DMC (99,1 %) và BDMC (98,5 %)

(Curcuma longa L., Zingiberaceae)

Doan Xuan Tuyen Supervisors: Assoc Prof Vinh Dinh

Background

Fresh turmeric root (Rhizoma Curcumae longae), after separating the starch, the

residue (residues) contain a lot of curcuminoid In order to utilize this source ofcurcuminoids extract, the study was conducted to evaluate the content; to investigatethe factors and to optimize the curcuminoids extraction from the residue under thesupport of JMP 10.0 software The process is applied to extract, refine curcuminoidwith high content and isolate the pure ingredients

Materials – Methods

Materials: curcuminoids in yellow turmeric powder residues.

Methods: evaluation of curcuminoids content in yellow turmeric powder residues,

investigating the factors affecting curcuminoids extraction and optimization ofextraction under the support of JMP 10.0 software, Box-Behnken surface responsemodel The product is purified with content ≥ 95% and isolated the pure ingredients

Result

The optimal conditions for curcuminoids extraction from residues: alkaline extractiontime: 30 minutes, sodium hydroxyde solution concentration: 0.05 M and acidificationpH: 3 The extracted results evaluate the repeatability of the proces to obtain acurcuminoid content of 7.26 ± 0.099% consistent with the predicted value of 7.31%.The product is refined by methanol – water (5:1) with curcuminoids content 95.1%,isolate 3 pure compounds that are qualitative and determine CUR (98.1%), DMC(99.1%) and BDMC (98.5%)

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ NGHỆ VÀNG 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT CURCUMINOID 7

1.3 TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CURCUMINOID 10

1.3.1 Phương pháp chiết xuất thường quy 10

1.3.2 Phương pháp chiết xuất kết hợp sử dụng tối ưu hóa bằng phần mềm 12

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CURCUMIN VÀ TINH CHẾ CURCUMINOID 16

1.4.1 Một số phương pháp phân lập curcumin 16

1.4.2 Một số phương pháp tinh chế curcuminoid 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU THỬ NGHIỆM 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.3.1 Thu thập và xử lý mẫu 19

2.3.2 Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm bột nghệ vàng 20

2.3.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid 22

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DƯ PHẨM BỘT NGHỆ VÀNG 29

3.2 TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID 32

3.2.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình 32

3.2.2 Kết quả tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phần mềm JMP 10.0 36

3.2.3 Đánh giá quy trình chiết xuất đã được tối ưu hóa 40

3.3 ỨNG DỤNG CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CURCUMINOID 42

3.3.1 Chiết xuất curcuminoid 42

3.3.2 Tinh chế sản phẩm 43

3.3.3 Phân lập các thành phần tinh khiết trong hỗn hợp curcuminoid 46

3.3.4 Đánh giá các chất đã phân lập 48

3.4 BÀN LUẬN 58

3.4.1 Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm bột nghệ vàng 58

3.4.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phần mềm JMP 10.0 59

3.4.3 Ứng dụng chiết xuất và phân lập curcuminoid 61

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

KẾT LUẬN 64

ĐỀ NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Từ nguyên Tiếng việt

BDMC Bisdemethoxycurcumin Curcumin III

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR Infrared Spectra Quang phổ hồng ngoại

UV - Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến

USP The United States

Pharmacopoeia

Dược điển Mỹ

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất curcuminoid 7

Hình 2.2 Cấu trúc của một số thành phần khác trong hỗn hợp curcuminoid 8

Hình 2.3 Cấu trúc dạng ceton (A) và enol (B) của curcuminoid 9

Hình 3.4 Một số bộ phận của cây Nghệ vàng và các mẫu thử 19

Hình 3.5 Mô hình tương quan giữa các yếu tố với hàm lượng curcuminoid 37

Hình 3.6 Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đối với hàm lượng curcuminoid 37

Hình 3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng curcuminoid 38

Hình 3.8 Mô hình đáp ứng bề mặt thể hiện bởi các yếu tố 39

Hình 3.9 Sự tương tác giữa các yếu tố 39

Hình 3.10 Các điều kiện tối ưu của quy trình 40

Hình 3.11 Sản phẩm kết tinh trong (A): methanol – nước (5 : 1) và (B): isopropanol – n-hexan (1 : 1,5) 45

Hình 3.12 Cột sắc ký rửa giải các phân đoạn trong hỗn hợp curcuminoid 46

Hình 3.13 Tinh thể hình thành trong các phân đoạn PĐ1, PĐ3, PĐ5 47

Hình 3.14 Tinh thể PĐ1, PĐ3, PĐ5 dưới kính hiển vi 48

Hình 3.15 SKLM các chất phân lập trong 3 hệ dung môi dưới ánh sáng thường 48 Hình 3.16 Phổ UV-Vis của CUR đối chiếu và PĐ1 49

Hình 3.17 Phổ UV-Vis của DMC đối chiếu và PĐ3 49

Hình 3.18 Phổ UV-Vis của BDMC đối chiếu và PĐ5 50

Hình 3.19 Công thức cấu tạo của CUR, DMC và BDMC 54

Hình 3.20 Sắc ký đồ, đường bình đồ của PĐ1 55

Hình 3.21 Sắc ký đồ, dường bình đồ của PĐ3 56

Hình 3.22 Sắc ký đồ, đường bình đồ của PĐ5 57

Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng quát chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột nghệ vàng 22

Sơ đồ 3.2 Quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tính chất vật lý đặc trưng của curcuminoid 9

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống 29

Bảng 3.3 Kết quả xây dựng đường tuyến tính 30

Bảng 3.4 Tóm tắt kết quả định lượng curcuminoid trong các mẫu T1, T2, T3 30

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát dung dịch kiềm 32

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natri hydroxyd 32

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát dung dịch acid để acid hóa 33

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH dịch kiềm sau khi acid hóa 33

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết trong môi trường kiềm 34

Bảng 3.10 Kết quả ảnh hưởng của thời gian lắng tủa 34

Bảng 3.11 Kết quả định lượng curcuminoid theo mô hình Box-Behnken 36

Bảng 3.12 Kết quả chiết xuất curcuminoid theo điều kiện tối ưu hóa 41

Bảng 3.13 Kết quả chiết xuất curcuminoid 42

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát một số dung môi hòa tan loại tạp 43

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng curcuminoid trong sản phẩm 44 Bảng 3.16 Hàm lượng curcuminoid của sản phẩm kết tinh trong hỗn hợp methanol - nước (5 : 1) và hỗn hợp isopropanol – n-hexan (1 : 1,5) 45

Bảng 3.17 Kết quả khai triển sắc ký 47

Bảng 3.18 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết chất PĐ1, PĐ3, PĐ5 bằng SKLM 49

Bảng 3.19 Các nhóm chức của PĐ1, PĐ3 PĐ5 suy ra từ phổ IR 50

Bảng 3.20 Phổ 1H-NMR (DMSO – d6, 500 MHz) của PĐ3 so với TLTK 51

Bảng 3.21 Phổ 13C-NMR (DMSO – d6, 125 MHz) của PĐ3 so với TLTK 52

Bảng 3.22 Phổ 1H-NMR (DMSO – d6, 500 MHz) của PĐ5 so với TLTK 53

Bảng 3.23 Phổ 13C-NMR (DMSO – d6, 125 MHz) của PĐ5 so với TLTK 53

Bảng 3.24 Kết quả xác định hàm lượng của PĐ1 56

Bảng 3.25 Kết quả xác định hàm lượng của PĐ3 56

Bảng 3.26 Kết quả xác định hàm lượng của PĐ5 57

MỞ ĐẦU

Thân rễ nghệ vàng (Rhizoma Curcumae longae) và các chế phẩm từ dược liệu này

được sử dụng rất nhiều trong y học cũng như trong đời sống Curcuminoid là mộttrong những hoạt chất chiết xuất từ nghệ được báo cáo có nhiều tác dụng dược lý nhưkháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư [16], [17], [27], [42], [46].Các sản phẩm có thành phần curcuminoid được sử dụng để điều trị các bệnh viêmgan, rối loạn kinh nguyệt, động kinh [41]; ứ máu và giảm đau [12], …

Qua chuyến tham quan thực tế cơ sở sản xuất các thành phẩm từ nghệ vàng tại thànhphố Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk; củ nghệ tươi sau khi thu hoạch được làm sạch, chovào máy xay, xay nhuyễn, vắt lấy nước, để lắng, phần lắng bên dưới được rửa 4 - 5lần với nước thu tinh bột Phần bã là một trong các nguồn dư phẩm còn lại sau khitách lấy tinh bột chưa được tận dụng Do tính chất của curcuminoid không tan trongnước nên chắc chắn sẽ còn lại trong bã này

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu chiết xuất curcuminoid; phần lớn sử dụng dungmôi hữu cơ: methanol, ethanol, ethyl acetat, aceton [17], [34], [32], [38] Kỹ thuậtchiết xuất thường gặp: soxhlet [19], siêu âm [32], vi sóng [16], CO2 siêu tới hạn [27].Trong các dung môi, ethanol được báo cáo cho hiệu suất chiết xuất cao và thân thiệnvới môi trường Tuy nhiên, ethanol là dung môi hòa tan rất tốt các chất hữu cơ nênsản phẩm có nhiều tạp chất, và để thu sản phẩm có hàm lượng curcuminoid cao đòihỏi nhiều bước tinh chế phức tạp

Ngoài ra, tính chất hóa học của curcuminoid cho thấy có thể chiết bằng dung môikiềm sau đó tủa lại trong môi trường acid [3]

Từ thực tế yêu cầu và những lập luận trên, đề tài:

“Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid

từ dư phẩm bột nghệ vàng Curcuma longa L., Zingiberaceae”

được thực hiện

Mục tiêu của đề tài:

1 Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm

2 Tối ưu hóa quy trình quy trình chiết xuất “curcuminoid”

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất

- Tối ưu hóa quy trình dưới sự hỗ trợ của phần mềm JMP 10.0, mô hình đápứng bề mặt Box-Behnken

3 Ứng dụng:

- Chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bằng quy trình tối ưu đã thu được

- Phân lập các thành phần tinh khiết trong hỗn hợp curcuminoid

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tên khoa học

Nghệ vàng có tên khoa học là Curcuma longa L hay Curcuma domestica Val., thuộc

họ Gừng Zingiberaceae [3]

Bộ phận dùng

Bộ phận dùng làm thuốc: Thân rễ được gọi là Khương hoàng (Rhizoma Curcumae

longae) và rễ củ gọi là Uất kim (Radix Curcumae longae) [2].

Thân rễ thu hoạch vào tháng 8 – 9, cắt bỏ hết rễ, thân rễ để riêng Muốn bảo quản lâuphải đồ hoặc hấp từ 6 – 12 (giờ), để ráo nước, phơi nắng, sấy khô [2], [3]

Trong y học cổ truyền nghệ được chế biến thành các dạng: thái phiến; sao với giấm;phiến sao vàng; chế với giấm và phèn chua [3]

rễ nghệ có tác dụng giảm đau trong viêm có mủ Trong y học Trung Quốc, nghệ dượcdùng làm thuốc kích thích, bổ, giảm đau, cầm máu, được chỉ định trong loét dạ dày,tiểu ra máu, Dùng ngoài chữa vết thương, trĩ, viêm da và nấm tóc [3]

Những công dụng có được ở trên do hoạt tính dược lý của nhiều thành phần trongnghệ, trong đó nổi bật là hợp chất curcuminoid với các tính chất:

a) Hoạt tính chống oxy hóa

Curcuminoid có khả năng chống oxy hóa, đã được báo cáo vào năm 1975 Hợp chấtnày hoạt động như một chất dập tắt các gốc tự do, bảo vệ huyết sắc tố khỏi quá trình

anion superoxid, H2O2 và gốc nitrit bởi các đại thực bào được hoạt hóa, có vai tròquan trọng trong phản ứng viêm [17], [41].

Cơ chế chống oxy hóa của curcumin gồm một hay nhiều bước sau: trung hòa các gốc

tự do; tương tác với các tác nhân oxy hóa và ngăn cản chúng phát triển; kết hợp vớioxy và làm giảm khả năng phản ứng oxy hóa; ngăn cản các enzym oxy hóa nhưcytochrom P450; tạo phức hay phá hủy tính oxy hóa của các ion kim loại [19]

b) Hoạt tính bảo vệ thần kinh

Curcumin được chứng minh có tác dụng bảo vệ thần kinh bằng cách tăng sự tăng sinh

và di chuyển của các tế bào Schwann; có tác dụng giống như thuốc chống trầm cảmthông qua sự ức chế biểu hiện gen cytokin ở vỏ não trước và đồi hải mã của chuột khi

bị gây stress nhẹ mãn tính [31]

c) Hoạt tính kháng viêm, kháng virus, vi khuẩn và ký sinh trùng

Trong quá trình viêm nhiễm, cơ thể sinh ra một chất giống hormon là acidarachidonic Acid arachidonic dưới tác dụng của enzym cyclooxygenase sẽ bị chuyểnhóa thành: prostaglandin làm giãn mạch máu, gây mẫn đỏ, trương phồng, đau nhức;thromboxan ngăn quá trình cung cấp máu và năng lượng cho tế bào; leukotrien làmtăng khả năng thấm qua mạch làm trương phồng mô dẫn đến quá trình viêm [40]

Sự liên quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính của curcuminoid đã được nghiên cứucho thấy sự hiện diện của liên kết đôi ở C3,4 và C3”,4” và nhóm OH ở C8,8” trên vòngbenzen tạo ra hoạt tính kháng viêm cho hợp chất này Do vậy, curcuminoid có khảnăng ngăn cản enzym cyclooxygenase và lipoxygenase làm giảm viêm từ sự chuyểnhóa acid arachidonic [16]

Hỗn hợp curcuminoid và từng thành phần riêng lẻ đều có hoạt tính kháng khuẩn,kháng nấm, trong đó curcuminoid > DMC > BDMC > CUR [1]

Curcumin ức chế sự tích hợp HIV-1 cần thiết cho sự nhân lên của virus và ức chế ánhsáng cực tím gây ra biểu hiện gen HIV Do đó, curcumin và các chất tương tự có thể

có tiềm năng phát triển thuốc mới chống lại HIV [17]

d) Hoạt tính chống đông máu

Hoạt tính chống đông máu của CUR và DMC được thể hiện qua tác dụng ức chế yếu

tố hoạt hóa X và tạo thrombin trong quá trình đông máu; chưa ghi nhận hoạt tínhchống đông máu của BDMC Về cấu trúc hóa học, CUR và BDMC chỉ khác nhau sựthay thế nhóm ortho–methoxy ở vị trí 3 của nhóm phenyl, nhưng hoạt động chốngoxy hóa rất khác nhau Sự tương tác liên kết hydro giữa –OH phenol và các nhómortho–methoxy trong curcumin ảnh hưởng đến năng lượng liên kết -OH và sự linhđộng nguyên tử H của các gốc tự do, do đó curcumin trở thành một chất dập tắt gốc

tự do tốt hơn so với BDMC [22]

e) Ngăn cản và điều trị ung thư

Curcuminoid ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trìnhhình thành và phát triển khối u [41]

Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do

và bị biến đổi thành các tế bào ung thư Curcuminoid có thể ngăn chặn quá trình nàybằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa như: gốc hydroxyl OH+, gốc peroxyl ROO+, nitricoxid NO và peroxynitrit ONO– Curcuminoid được chứng minh có khả năng ức chế

sự phát triển và di căn đối với một vài loại tế bào ung thư Khả năng làm giảm quátrình di căn này còn phụ thuộc vào nguồn gốc và loại khối u [30]

f) Hoạt tính bảo vệ gan

Curcumin có thể bảo vệ gan thông qua việc chống nhiễm trùng, chống oxy hóa, ứcchế xơ hóa và các yếu tố gây tổn thương gan: ức chế sao chép của vius HCV bằngcách hoạt hóa heme oxyase–1; bảo vệ gan của bệnh nhân tiểu đường thông qua điềuhòa chu trình chết tế bào qua trung gian nội bào gan (Afrin và cộng sự, 2015) Kếthợp Curcumin và N–acetyl cysteine giúp cải thiện tổn thương gan và thận do quá liềuacetaminophen (Kheradpezhouh và cộng sự, 2010) [31]

Thành phần hóa học của nghệ

Thân rễ nghệ vàng có chứa curcuminoid (2 – 8 %); tinh dầu (3,0 – 5,0 %) màu vàng

Tinh dầu:

Tinh dầu là thành phần hóa học có hoạt tính, tạo hương thơm cho nghệ Thành phầncủa tinh dầu nghệ chủ yếu các hợp chất sesquiterpen ceton: arturmeron, α–turmeron,β–turmeron và curlon [3]

Nhiều hợp chất terpen khác cũng được xác định trong tinh dầu nghệ là α và β pinen,camphen, limonen, terpinen, caryophyllen, borneol, isoborneol, camphor, eugenol,cineol, curzerenon và curcumen [3]

Các hợp chất flavonoid:

Flavonoid và glycosid của chúng đã được các nghiên cứu gần đây tìm thấy từ thân rễnghệ Đến nay, 18 flavonoid được phân lập và định tính, trong đó có 1 flavanonol, 5flavon và 11 flavonol Phần aglycon của chúng bao gồm: luteolin, apigenin, quercetin,kaempferol và myricetin [31]

Chất nhựa dầu (oleoresin):

Oleoresin là hỗn hợp các hợp chất được chiết xuất bằng dung môi từ nghệ, gồm có:curcuminoid, dầu dễ bay hơi, chất béo và chất dẻo không bay hơi [35]

Curcuminoid là một trong các thành phần có hoạt tính chính từ chất nhựa dầu củanghệ Đến nay, 50 curcuminoid đã được xác định bao gồm 3 nhóm cấu trúc:curcuminoid mạch thẳng, curcuminoid vòng và dạng kết hợp với monoterpen hoặcsesquiterpen; trong đó, dạng mạch thẳng phổ biến nhất [31] Cấu trúc, tính chất củahợp chất này sẽ được trình bày ở mục 2.2

Các thành phần khác:

Một số thành phần khác cũng đã được phân lập từ nghệ bao gồm: phenol, acid hữu

cơ, các alcaloid, steroid và polysaccarid Ngoài ra còn có nhiều chất chuyển hóa thứcấp: monoterpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, và các sản phẩm liênhợp curcuminoid với monoterpen, sesquiterpen, phenolic, flavonoid, saccharid,steroid, alcaloid [31]

Hỗn hợp curcuminoid là một trong các hoạt chất chính được chiết xuất từ nghệ; baogồm 3 nhóm cấu trúc: curcuminoid mạch thẳng chiếm tỷ lệ lớn, curcuminoid vòng vàdạng kết hợp với monoterpen hoặc sesquiterpen [31].

Curcuminoid trên thị trường thường chứa 3 thành phần chính: curcumin còn gọi làcurcumin I chiếm 77 % (1), demethoxycurcumin hay curcumin II chiếm 17 % (2) vàbisdemethoxycurcumin còn gọi là curcumin III chiếm 3 % (3) Các curcuminoid cócông thức cấu tạo được thể hiện ở hình 2.2 [15]

Curcumin (CUR): [1,7–bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-dien-3,5-dion],

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất curcuminoid

(1) Curcumin, (2) Demethoxycurcumin, (3) Bisdemethoxycurcumin

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của một số thành phần khác trong hỗn hợp curcuminoid

(A) Curcumalongin A; (B) Curcumalongin B; (C) Curcumalongin C;

(D) Dihydrocurcumin; (E) Terpecurcumin A

Curcuminoid thường tồn tại ở 2 dạng là ceton và enol Dạng enol có hệ thống liênhợp và có khả năng hấp thụ UV-Vis ở 410 – 430 nm [39].

Hình 2.3 Cấu trúc dạng ceton (A) và enol (B) của curcuminoid

Hợp chất curcuminoid tan trong các dung môi dicloromethan, aceton, ethyl acetat,ethanol, methanol, isopropanol, …; ít tan trong pentan, hexan, cyclohexan và hầu nhưkhông tan trong nước; tan trong kiềm, tạo dung dịch màu đỏ rồi ngã tím [25], [44].Tính chất vật lý của hợp chất này được trình bày ở bảng 2.1 [1]

Bảng 2.1 Tính chất vật lý đặc trưng của curcuminoid

Hình dạng Tinh thể hình kim Tinh thể hình kim Tinh thể hình kim

Dao động co dãn của liên kết C–H của C lai hoá sp3 (nhóm thế alkyl) trong vùng từ

2950 – 2850 cm-1 được sử dụng để phân biệt CUR và DMC với BDMC [13], [34]

Các phương pháp chiết xuất curcuminoid từ nghệ đã được công bố khi curcumin lầnđầu tiên được phân lập năm 1815 và cấu trúc hóa học được xác định năm 1973 [36].Đến nay, các phương pháp chiết xuất hoạt chất này đã được cải tiến và vẫn còn đangđược quan tâm.

1.3.1 Phương pháp chiết xuất thường quy

Chiết bằng phương pháp Soxhlet:

- Curcuminoid thu được từ bột nghệ với hiệu suất 10,66 % và độ tinh khiết 96,38 %sau khi chiết bằng ethanol 95 % trong hệ thống soxhlet (thời gian chiết 3 giờ; tỷ lệdược liệu/dung môi 1:16) và kết tinh lại trong hỗn hợp (methanol : nước) [1]

- Bột nghệ được chiết xuất bằng các dung môi lần lượt là methanol, aceton, ethylacetat và cloroform (tỷ lệ 6 g/250 ml) trong 7 giờ Sản phẩm thu được có hiệu suất5,6; 4,6; 4,5; và 4,3 (%) Trong số các dung môi, methanol cho sản phẩm có hàmlượng curcuminoid quy về curcumin cao nhất (12,39 %) [28]

- Bột nghệ được chiết xuất bằng các dung môi aceton, cloroform, hexan, methanol,ethyl acetat và hỗn hợp hexan – methanol trong 6 giờ Aceton được lựa chọn với hiệusuất 3,49 % và hàm lượng curcuminoid trong sản phẩm thu được cao (43,5 %) [37]

- Bột nghệ (15 g) được chiết với aceton ở 60 oC trong 8 giờ, hiệu suất sản phẩm 8,29

%, hàm lượng curcuminoid quy về curcumin so với dược liệu là 6,9 % [38]

Chiết bằng phương pháp ngâm:

- Curcuminoid được chiết từ bột nghệ (100 g) đã loại tinh bột bằng phương phápngâm lạnh với dung môi aceton trong 4 giờ, sau đó được loại tạp bằng hỗn hợpdicloromethan – xăng công nghiệp (1 : 1) Sản phẩm thu được có hàm lượngcurcuminoid 86,69 %, hiệu suất 6,38 % [6]

- Bột nghệ khô (3 g) được chiết xuất với ethanol 70% (30ml) trên máy lắc với tốc độ

210 vòng / phút, ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày và lọc thu dịch chiết; tiến hành lặp lại

việc chiết xuất đến khi dịch lọc nhạt màu Dịch lọc được thu hồi dung môi và xácđịnh hàm lượng curcuminoid bằng HPLC (12,39 %) [46].

- Bột nghệ được ngâm 5 giờ trong ethanol 95 % (tỷ lệ dược liệu/dung môi là 50:700),lọc và thu hồi dung môi Kết quả hiệu suất chiết curcuminoid 14,87 % với hàm lượngCUR, DMC, BDMC trong sản phẩm lần lượt là 22,6; 17,6; 13,1 (%) [26]

- Curcuminoid được chiết xuất từ bột nghệ bằng phương pháp hầm 4 giờ trong dungdịch natri hydroxyd 0,025 N (tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1:100), hàm lượng quy vềcurcumin được xác định 7,26 % bằng quang phổ tử ngoại khả kiến [12]

Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm:

- Bột nghệ (20 g) được chiết xuất bằng siêu âm trong thời gian 5 phút ở 21 ± 2 oC;dung môi sử dụng: ethanol hoặc aceton (tỷ lệ dược liệu – dung môi là 1: 3) Hàmlượng curcuminoid trong dịch chiết quy về curcumin thu được từ quy trình đối vớiethanol (32,85 %) và aceton (60,0 %) [47]

- Bột nghệ (0,5 g) đã được chiết bằng siêu âm (ở công suất 90 W, tần số 37 kHz) với

10 ml aceton và trong thời gian 30 phút và nhiệt độ 35 °C Hiệu suất 5,72 % và hàmlượng curcuminoid quy về curcumin là 3,92 % so với dược liệu [38]

- Dư phẩm bột nghệ (20 g) được nhóm nghiên cứu chiết với sự hỗ trợ của siêu âmtrong ethanol 96 % với thời gian 15 phút, sau đó thu hồi dung môi để được cao cồn

Sản phẩm này sau đó được phân tán trong nước (1:10) và lắc phân bố với n-hexan để

loại các tạp chất kém phân cực Dịch chiết nước sau đó được làm lạnh, thu kết tinhcurcuminoid Kết quả thu được curcuminoid với hiệu suất 2,47 % [9]

Chiết với dung môi dưới áp suất cao (Accelerated Solvent Extraction): Curcuminoid

từ bột nghệ được chiết xuất bằng 3 dung môi: aceton, ethanol và ethyl acetat Dungmôi sau ki tiếp xúc dược liệu, được tăng áp suất lên 1500 psi, sau đó gia nhiệt 50 oCtrong thời gian 10 phút và thu dịch chiết Dịch chiết được thu hồi dung môi và bảoquản ở - 20 °C cho đến khi phân tích Hiệu suất chiết cao nhất thu được trong ethanol(8,4 %), tiếp theo là ethyl acetat (7,4 %) và aceton (6,6 %) Hàm lượng curcuminoid

Chiết CO 2 lỏng siêu tới hạn:

- Cột chiết xuất (150 × 15 mm) được nhồi 10 g bột nghệ khô; CO2 siêu tới hạn đượctruyền qua cột chiết Sau khi áp suất và tốc độ dòng chất lỏng đạt đến giá trị mongmuốn, van sáu cổng được bật để CO2 siêu tới hạn được truyền qua bộ chiết; bắt đầuchu kỳ chiết xuất Đầu tiên, chiết ngâm 60 phút sau đó cho CO2 di chuyển liên tục

300 phút để thu dịch chiết Sản phẩm chiết được cân bằng áp suất môi trường Kếtquả sau 240 phút chiết động, hàm lượng curcuminoid trong dịch chiết thu được là69,36 % và không đổi khi kéo dài thời gian chiết 360 phút [47]

Chiết với sự hỗ trợ enzym: 1 g bột nghệ được hòa với 100 ml nước, sau đó bổ sung

50 ml dung dịch đệm pH 5 có chứa α-Amylase và amyloglucosidase được sử dụngcho quá trình thủy phân carbohydrat Bình được niêm phong bằng bông và lá nhôm,lắc trong tủ ấm (lắc 130 vòng / phút, nhiệt độ 65 °C, trong 6 giờ) Sau khi xử lýenzym, phần lắng xuống được tách ra, sấy khô ở 60 °C trong 6 giờ và sau đó đượcchiết xuất curcumin bằng 10 ml aceton trong 4 giờ Hiệu suất thu được 6,27 %, hàmlượng curcuminoid quy về curcumin là 4,1 % so với dược liệu [23]

Qua các tài liệu đã tham khảo, curcuminoid từ nghệ thường được chiết bằng soxletvới ưu điểm dược liệu được tiếp xúc với dung môi mới liên tục nên hiệu suất chiếtcao nhưng thời gian chiết thường kéo dài (4 – 7 giờ) Siêu âm giúp rút ngắn thời gianchiết (5 – 15 phút) Tuy nhiên, các phương pháp này phù hợp nghiên cứu trong phòngthí nghiệm và ngâm là phương phù hợp áp dụng vào thực tế sản xuất

1.3.2 Phương pháp chiết xuất kết hợp sử dụng tối ưu hóa bằng phần mềm

1.3.2.1 Sơ lược về tối ưu hóa

Tối ưu hoá là quá trình tìm kiếm điều kiện tốt nhất (điều kiện tối ưu) của hàm số đượcnghiên cứu Đây là quá trình xác định cực trị của hàm hay tìm điều kiện tối ưu tươngứng để thực hiện một quá trình cho trước Tối ưu hoá rất quan trọng và cần thiết trongphân tích số học và những ứng dụng toán học khác, trong ngành công nghiệp cơ bản,ngành kỹ thuật, công nghiệp dược phẩm Một vấn đề kinh tế, vật lý hay hoá học đều

thống này là cần thiết để có thể đạt được một kết quả lý tưởng nhất Nói chung, hiệnnay mọi thứ đều được tối ưu hoá: hoạt động của một động cơ, đầu tư kinh tế, nhữngphản ứng hoá học; quy trình chiết xuất, định lượng [4].

1.3.2.2 Tối ưu hóa quy trình bằng phần mềm:

Ngày nay, người ta thường đề cập tới phương pháp kết hợp giữa lý thuyết và thựcnghiệm Việc tối ưu hay dự đoán lý thuyết được dựa trên mô hình nhân quả xây dựng

từ dữ liệu thực nghiệm Nghiên cứu lý thuyết thường có tác dụng định hướng banđầu, giảm khối lượng công việc, rút ngắn thời gian cho nghiên cứu thực nghiệm Bêncạnh đó, thực nghiệm có tác dụng trở lại, bổ sung cho kết quả theo lý thuyết, xác định

rõ hơn cơ chế của hiện tượng [23]

Phần mềm JMP và mô hình đáp ứng bề mặt Box – Benhken:

Phần mềm JMP của viện nghiên cứu Statistical Analysis System - Đại học NorthCarolina cung cấp một loạt các công cụ tiêu chuẩn dùng cho phân tích thống kê, quyhoạch thực nghiệm và kiểm tra chất lượng chỉ trong một phần mềm duy nhất [39].Trong phần mềm JMP có công cụ thiết kế thí nghiệm DOE (design of experiments)giúp thực hiện các thí nghiệm không bị trùng lặp, tiết kiệm thời gian và chi phí đồngthời xác định được sự ảnh hưởng của các yếu tố lên phản ứng hay thí nghiệm nào đó

Có rất nhiều mô hình nhỏ thuộc phương pháp thiết kế bề mặt đáp ứng, phổ biến là

mô hình hybrid, mô hình thiết kế đa hợp trung tâm, mô hình Box-Behnken [23]

Mô hình đáp ứng bề mặt Box-Behnken là những cấu trúc đối xứng trong đó mỗi thínghiệm được tạo ra bởi 3 yếu tố, trong đó số thí nghiệm ở trung tâm sẽ đặc biệt đượclặp lại nhiều hơn Mỗi yếu tố hay các biến độc lập được đặt tại một trong ba giá trịbình đẳng với nhau, thường được mã hóa như −1, 0, +1 Mô hình này không có điểmđỉnh trên hình khối mà chỉ là các dãy yếu tố, có lợi trong trường hợp cần tránh cácđiểm mà cần cân nhắc các điều kiện kỹ thuật Ưu điểm: tiết kiệm thời gian, giảm sốđơn vị thí nghiệm cần thiết và kết quả được chấp nhận về mặt thống kê [23]

1.3.2.3 Ứng dụng tối ưu hóa trong chiết xuất, định lượng

Thuật ngữ tối ưu hóa đã được sử dụng phổ biến trong hóa học phân tích như là mộtphương tiện để tìm kiếm các điều kiện tốt nhất cho một quy trình [18]:

- Tối ưu hóa quy trình thủy phân flavonoid toàn phần trong lá Trinh nữ hoàng cungbằng phần mềm JMP, sử dụng mô hình đáp ứng bề mặt Box – Benhken Điều kiệnthủy phân tối ưu trong quá trình flavonoid toàn phần từ lá TNHC cho hiệu suất thủyphân Quercetin và kaempferol cao nhất là nhiệt độ thủy phân 850C, nồng độ HCl12,5%, thời gian thủy phân 5 giờ Kết quả thu được hàm lượng (mg / 100g bột láTNHC) đối với quercetin là 22,14 và Kaempferol là 24,92 [14]

- Phần mềm Design – Expert phiên bản 7.1 trial được sử dụng hỗ trợ cho việc tối ưuhóa phương pháp ngâm có gia nhiệt để chiết xuất pectin từ vỏ chuối Kết quả điềukiện tối ưu để chiết xuất pectin là nhiệt độ 90 oC, thời gian 60 phút, nồng độ acidcitric 9 % với hàm lượng pectin thu được là 13,4 % [9]

- Quá trình trích ly quercetin từ vỏ hành tím bằng siêu âm được tối ưu hóa theo môhình bề mặt đáp ứng đối với các biến gồm thời gian trích ly 22,9 – 37,1 (phút) vànồng độ ethanol 57,9 – 72,1 (%) Điều kiện tối ưu thu được: từ 15 g mẫu vỏ hành tímsấy khô, thời gian siêu âm 31,55 phút và nồng độ ethanol 66,21 %; hàm lượngquercetin tương ứng: 4,26 mg quercetin equivalent/g [11]

Đến nay, việc ứng dụng tối ưu hóa với sự hỗ trợ của công cụ thống kê bằng phầnmềm để chiết xuất, định lượng các hợp chất đã trở nên phổ biến; giúp giảm thiểu chiphí và thời gian thực nghiệm

1.3.2.4 Một số công trình nghiên cứu chiết xuất curcuminoid từ Nghệ với sự hỗ trợ của phần mềm tối ưu hóa

- Phần mềm Design Expert 7.0, mô hình bề mặt đáp ứng và phân tích phương sai(ANOVA) được sử dụng nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ngâm và xácđịnh thông số tối ưu để chiết xuất curcumin Điều kiện tối ưu tìm được: thời gianchiết 12 giờ, tốc độ khuấy 30 vòng/phút, tỷ lệ dược liệu/dung môi (1 : 6), nhiệt độ 80

- Từng yếu tố riêng lẻ được khảo sát và lựa chọn 3 yếu tố nồng độ ethanol, tỷ lệ dượcliệu/dung môi và thời gian vi sóng đã được chọn để tối ưu hóa Thuật toán vectơ hồiquy hỗ trợ (SVR) và phương pháp đáp ứng bề mặt, mô hình thiết kế đa hợp trung tâm(CCD) được sử dụng để thiết kế và tìm kiếm các điểm tối ưu của mô hình Các thông

số tối ưu thu được của quy trình chiết xuất bằng vi sóng: nồng độ ethanol 69 %, tỷ lệdược liệu/dung môi (1 : 21), thời gian chiết là 55 giây Tổng lượng curcuminoid chiếtđược là 28,97 mg cho mỗi gam bột nghệ [49]

- Yücel Başpınar và cộng sự (2017) đã sử dụng phần mềm Minitab, phương pháp bềmặt đáp ứng và mô hình thiết kế đa hợp trung tâm để tối ưu hóa điều kiện chiết xuấtcurcumin từ củ nghệ Thông số tối ưu cho việc chiết xuất curcumin: thời gian chiết

15 giờ, nồng độ ethanol 70 % và tỷ lệ dược liệu/dung môi là (1 : 20) [48]

- Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột Nghệ bằng phươngpháp ngâm dưới sự hỗ trợ của phần mềm JMP 10.0, mô hình đáp ứng bề mặt Box-Behnken đã được nhóm nghiên cứu báo cáo Điều kiện tối ưu thu được: thời gianchiết 15 phút, 500 ml dung dịch natri hydroxyd 0,07 M và 400ml dung dịch acidtartaric 0,1 M Sản phẩm được được định lượng bằng quang phổ UV-Vis cho tổnghàm lượng 7,46 % [7]

Như vậy, sự hỗ trợ của phần mềm trong việc tối ưu hóa các điều kiện chiết xuấtcurcuminoid được xem xét, lựa chọn phù hợp với điều kiện thực tế của nghiên cứu.Trong đề tài, phần mềm JMP 10.0 mô hình đáp ứng bề mặt Box-Benhken được lựachọn giúp giảm thiểu số thí nghiệm (15 thí nghiệm), giảm thời gian và chi phí nhưngvẫn đáp ứng yêu cầu về mặt thống kê

1.4.1 Một số phương pháp phân lập curcumin

Đến nay, các thành phần tinh khiết từ hỗn hợp curcuminoid được phân lập ở quy môphòng thí nghiệm chủ yếu dùng sắc ký cột, pha tĩnh thường là silicagel hoặc SephadexLH-20 Dung môi rửa giải là các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần [43]

Sắc ký cột cổ điển, pha tĩnh silicagel, dung môi rửa giải là hỗn hợp cloroform –methanol với độ phân cực tăng dần, các phân đoạn thu được được kiểm tra bằngSKLM (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi khai triển: cloroform – methanol(95 : 5) Tổng hàm lượng curcuminoid được định lượng bằng quang phổ UV-Vis ởbước sóng 420 nm Các thành phần riêng lẻ thu được từ sắc ký cột được hòa tan trongmethanol và đun nóng Sau khi hòa tan hoàn toàn, thêm cloroform đến tỷ lệ methanol– cloroform (5 : 2) và giữ ở 5 °C qua đêm Các tinh thể được tách ra bằng cách lọc.Kết quả cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm thu được 84 – 86 (%) [20]

Hỗn hợp curcuminoid được tinh chế bằng cách kết tinh trong methanol – nước (5 : 1)

để tách riêng kết tinh curcumin Nước còn lại được thu hồi dung môi và tiếp tục phânlập bằng sắc ký cột với dung môi rửa giải là dicloromethan và pha tĩnh silica gel 60Gtẩm natri hydrophosphat và dicloromethan Mỗi phân đoạn được kiểm tra bằngSKLM (hệ pha động dicloromethan – methanol (99 : 1), pha tĩnh silicagel 60G) Độtinh khiết của từng thành phần được xác định bằng HPLC ở bước sóng 425nm và đonhiệt nóng chảy Kết quả tinh thu được curcumin có hàm lượng cao (92,2 %), vớilượng nhỏ DMC và hầu như không còn BDMC trong hỗn hợp [34]

Curcuminoid thô được rửa với n-hexan để loại béo trước khi phân lập qua cột Trên sắc ký cột, dung môi rửa giải đầu tiên là n-hexan, sau đó độ phân cực được tăng dần

bằng benzen và cuối cùng là ethyl acetat Kết quả thu được sau khi phân lập: với hệdung môi benzen – ethyl acetat (82 : 18) thu được curcumin, DMC được rửa giảitrong hệ benzen – ethyl acetat (70 : 30), BDMC ở benzen – ethyl acetat (58 : 42)

1.4.2 Một số phương pháp tinh chế curcuminoid

Một số phương pháp được tinh chế các thành phần tinh khiết từ hỗn hợp curcuminoid:

- Tinh chế hỗn hợp curcuminoid bằng sắc ký cột với hệ dung môi là cloroform –methanol (99 : 1) và HPLC điều chế (cột RP-C18), pha động acetonitril – acid acetic0,03 % (50 : 50), tốc độ dòng 3,0 ml/ phút, thu được curcumin tinh khiết 99,12 % [5]

- Dung dịch mẹ có chứa 3 thành phần CUR, DMC, BDMC được phân lập bằng sắc

ký cột với pha động là hỗn hợp cloroform – methanol và pha tĩnh silicagel Mỗi phânđoạn rửa giải được đánh giá bằng kỹ thuật LC_MS, các tinh thể được định tính bằngnhiễu xạ tia X, đo điểm chảy và phân tích nhiệt trọng lượng Kết quả đã thu được cáchợp chất tinh khiết CUR (100 %), DMC (98,6 %), BDMC (98,3 %) [27]

- Kết tinh lại là một trong những phương pháp để tinh chế các hợp chất Cả tạp chất

và hợp chất được hòa tan trong dung môi thích hợp, hợp chất mong muốn có thể đượctách ra khỏi dung dịch dưới dạng kết tủa hình thành khi ở trạng thái bão hòa [29]

- Curcumin tinh khiết thu được bằng phương pháp kết tinh lạnh dựa vào độ tan khácnhau trong isopropanol Curcuminoid thô qua bốn lần kết tinh lạnh liên tiếp đã đượcnghiên cứu và kết quả cho thấy mỗi bước kết tinh, các điều kiện khác nhau ảnh hưởngđến độ tinh khiết của tinh thể cũng như kích thước và hình dạng tinh thể [43]

- Hỗn hợp sau khi chiết được tinh chế bằng hỗn hợp dicloromethan – xăng côngnghiệp (1 : 1), để lạnh qua đêm thu kết tủa Kết tủa được rửa hai lần với mỗi 10 mlxăng công nghiệp, sấy khô được curcuminoid thô Curcuminoid thô sau đó được hòatan trong ethyl acetat, đun, lọc nóng qua than hoạt, thu hồi dung môi và dùng đồng

thể tích n-hexan để kết tinh 48 giờ, thu được curcuminoid tinh khiết (hiệu suất 4,5%,

hàm lượng 95,03 %) [6]

- Một số dung môi khác nhau và hỗn hợp các dung môi này đã được thử để kết tinh

curcuminoid, loại bỏ tinh dầu, các chất bay hơi Hỗn hợp isopropanol : n-hexan (1:

1.5) nóng được tìm thấy là dung môi kết tinh tốt nhất, sản phẩm được kiểm tra bằngSKLM và quang phổ hồng ngoại Tổng hàm lượng curcumin của bột curcuminoid

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là hỗn hợp curcuminoid từ dư phẩm bột Nghệ vàng

Chất đối chiếu: được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Tp HCM gồm:

- Curcumin (QT 209 050317, HLNT: 94,9 %), bảo quản 2 – 8 oC, tránh ánh sáng

- Curcumin II (QT 209B 020918, HLNT: 87,7 %), bảo quản 2 – 8 oC, tránh ánh sáng

- Curcumin III (QT 209C 020918, HLNT: 90,0 %), bảo quản 2 – 8 oC, tránh ánh sáng

Nguyên vật liệu thử nghiệm: thân rễ nghệ vàng và bột dư phẩm (số lô 210418) do

công ty Khang Minh, Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk cung cấp vào tháng 4 năm 2018

Dung môi - hóa chất: acetonitril, methanol, nước cất đạt tinh khiết dùng cho sắc ký

lỏng Các hóa chất kali hydroxyd, natri hydroxyd, amoni hydroxyd, acid acetic, acid

tartaric, acid hydrocloric, n-hexan, cloroform, dicloromethan đạt tinh khiết phân tích.

Một số thiết bị nghiên cứu chính:

- Cân phân tích Mettler Toledo (max 120 g, min 0,1 mg, e = 1 mg, d = 0,1 mg),

- Hệ thống quang phổ tử ngoại khả kiến Hitachi U-3900,

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi CM 5000 đầu dò PDA,

- Hệ thống quang phổ hồng ngoại FTIR Shimadu IRAffinity – 1S,

Các thực nghiệm được thực hiện tại:

- Bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm, khoa Dược, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh,

- Khoa Dược phẩm – Mỹ phẩm, Trung tâm Kiểm Nghiệm Bình Dương

2.3.1 Thu thập và xử lý mẫu

Mẫu thử được xử lý như sau:

- Mẫu đối chứng (T1): thân rễ nghệ tươi được rửa sạch, thái lát mỏng, phơi âm canđến khô, xây thành bột và rây qua rây cỡ 2 mm

- Mẫu giả lập (T2): thân rễ nghệ tươi được rửa sạch, xay, phân tán trong nước, khuấymạnh để tách tinh bột Loại bỏ phần nước chứa tinh bột Vắt lấy bã, phơi âm can đếnkhô, rây qua rây cỡ 2 mm

- Mẫu thử (T3): mẫu dư phẩm bột nghệ vàng do cơ sở sản xuất cung cấp, xay đếnkích thước 2mm

(A) (B)

Hình 3.4 Một số bộ phận của cây Nghệ vàng và các mẫu thử

(A): toàn cây trên mặt đất; (B): Hoa nghệ vàng; (C): thân rễ cắt ngang;

(D): bột nghệ - T1; (E): mẫu dư phẩm giả lập - T2; (F) mẫu dư phẩm thực tế - T3

Mục đích xử lý các Mẫu T1 và Mẫu T2:

- Mẫu T1: đánh giá hàm lượng curcuminoid trong nguyên liệu gốc là bột nghệ.

- Mẫu T2: so sánh với hàm lượng curcuminoid có trong mẫu T3 để đánh giá chất

lượng nguồn dư phẩm do công ty cung cấp

(Mẫu thử T3 thu được từ thực tế sau quá trình điều chế tinh bột: củ nghệ tươi đượclàm sạch, cho vào máy xay nhuyễn, vắt lấy nước, để lắng, phần lắng bên dưới đượcrửa 4 - 5 lần với nước thu tinh bột; phần bã là nguồn dư phẩm còn lại sau khi tách lấytinh bột chưa được sử dụng)

Các mẫu thử sau khi xử lý được tiến hành xác định sự giảm khối lượng do làm khôbằng phương pháp sấy, khối lượng mẫu thử là 1 gam, sấy ở 105 oC trong 4 giờ [2]

Yêu cầu: độ ẩm không quá 12 % [2].

2.3.2 Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm bột nghệ vàng

Các mẫu thử T1, T2, T3 được tiến hành đánh giá đánh giá các chỉ tiêu định tính bằngSKLM, tro toàn phần, tro không tan trong acid, chất chiết được trong dược liệu theohướng dẫn của Dược điển Việt Nam V [2]

Yêu cầu: các mẫu thử đạt các chỉ tiêu trên theo yêu cầu của Dược điển.

Điều kiện sắc ký: theo điều kiện sắc ký đã thẩm định và công bố của tài liệu [13]:

- Pha động: acetonitril - acid acetic 2 % (45 : 55)

Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác khoảng 5 mg curcumin vào bình định mức 10

ml, thêm methanol, siêu âm 5 phút, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều,được dung dịch C1 có nồng độ CUR khoảng 500 μg/ml Tiến hành tương tự để cócác dung dịch DMC (C2) và BDMC (C3) có nồng độ khoảng 500 μg/ml Pha loãng

các dung dịch C1, C2, C3 bằng methanol để có các dung dịch đối chiếu hỗn hợp cónồng độ CUR 15 – 150 (μg/ml), DMC và BDMC có nồng độ từ 5 – 50 (μg/ml).

Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống: tiến hành sắc ký một dung dịch chuẩn, hệ số

đối xứng của pic chính không được lớn hơn 1,5; độ phân giải giữa các pic không nhỏhơn 1,5 và độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu, của diện tích pic đáp ứng từ 6lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %

Xây dựng đường tuyến tính: Tiến hành sắc ký các dung dịch đối chiếu, ghi nhận diện

tích pic, thiết lập đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Đánhgiá tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa các thông số bằng công cụData analysis trong Microsoft Excel (hệ số tương quan R2 ≥ 0,995) [23]

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 100 mg các mẫu T1, T2, T3 cho vào bình định

mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml methanol, siêu âm 15 phút Thêm methanol vừa đủđến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 μm

Tiến hành sắc ký các dung dịch thử Hàm lượng các thành phần CUR, DMC, BDMCtrong mẫu được tính toán dựa vào phương trình tuyến tính

Yêu cầu: - Các dung dịch mẫu thử T1, T2, T3 cho các pic chính có tín hiệu thời gian

lưu tương ứng với các dung dịch đối chiếu CUR, DMC, BDMC

- Tổng hàm lượng CUR, DMC, BDMC tính trên dược liệu khan và tham

khảo mức giới hạn hàm lượng theo USP [44]

Dựa vào kết quả định tính, định lượng curcuminoid trong T1, T2, T3; so sánh cácmẫu để chứng minh nguồn dư phẩm bột nghệ đang bỏ đi chứa hàm lượng curcuminoidđáng được quan tâm khai thác để từ đó khảo sát và tối ưu hóa quy trình chiết xuấtcurcuminoid từ nguồn nguyên liệu này

2.3.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid

2.3.3.1 Quy trình chiết xuất dự kiến

- Mẫu nghiên cứu được sử dụng để khảo sát và tối ưu hóa quy trình chiết xuấtcurcuminoid là mẫu giả lập dư phẩm bột nghệ vàng (Mẫu T2)

- Nguyên tắc: trong cấu trúc curcuminoid chứa các nhóm -OH phenol, có thể tham

gia phản ứng với dung dịch kiềm tạo muối phenolat hòa tan tốt trong nước

- Quy trình chiết xuất dự kiến: mẫu thử được kiềm hóa, lọc lấy dịch lọc Dịch lọc sau

đó được acid hóa đến pH acid để curcuminoid kết tủa, giữ yên ở nhiệt độ 2 – 8 oC.Lọc tủa, thu được curcuminoid thô Quy trình được mô tả ở Sơ đồ 2.1

- Khối lượng mẫu được sử dụng cho mỗi khảo sát dự kiến là 0,2 g

- Đánh giá: hàm lượng curcuminoid chiết được từ quy trình được xác định bằng

phương pháp HPLC được mô tả ở mục 2.2.2

2.3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất dự kiến:

Mục đích: tìm ra khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết bằng

phương pháp thực nghiệm Thay đổi các giá trị cho yếu tố khảo sát, cố định các yếu

tố còn lại

Theo sơ đồ 2.1, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất curcuminoid,trong đó đề tài dự kiến khảo sát một số yếu tố: loại kiềm, nồng độ kiềm, loại acid, pHacid hóa dịch kiềm, thời gian chiết, thời gian lắng tủa

Đánh giá: sau khi chiết theo quy trình được mô tả ở Sơ đồ 2.1, hòa tan toàn bộ sản

phẩm trong methanol, lọc qua màng 0,45 μm Sắc ký các dung dịch theo điều kiệnsắc ký được mô tả ở mục 2.2.2 [13]

Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quy trình dựa trên hàm lượng curcuminoidchiết được

a) Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch kiềm

Các dung dịch kiềm được sử dụng khảo sát là natri hydroxyd 0,1 M; kali hydroxyd0,1 M; amoni hydroxyd 0,1 M

Mẫu thử được chiết với 20 ml mỗi dung dịch kiềm trong 30 phút, lọc lấy dịch Dịchlọc được acid hóa bằng acid hydrocloric 0,1 M đến pH 3, để lắng 2 giờ , lọc lấy kếttủa Tiến hành đánh giá ảnh hưởng của loại dung dịch kiềm

b) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch kiềm

Từ khảo sát dung dịch kiềm ở trên, chọn dung dịch kiềm cho hàm lượng curcuminoidchiết được cao nhất

Khảo sát với dãy nồng độ 0,01; 0,025; 0,05; 0,075 và 0,1 (M) của dung dịch kiềm đãlựa chọn

Tiến hành chiết xuất, đánh giá ảnh hưởng của nồng độ dung dịch kiềm, cố định thờigian chiết 30 phút, dịch kiềm được acid hóa đến pH 3 bằng acid hydroclorid 0,1 M,hỗn hợp được để lắng 2 giờ và lọc lấy sản phẩm

c) Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch acid

Hỗn hợp curcuminoid kết tủa trong môi trường trung tính và acid [41] Vì vậy dịchchiết trong natri hydroxyd 0,1 M (thời gian chiết 30 phút) được acid hóa bằng cácdung dịch acid hydrocloric; acid acetic; acid tartaric cùng nồng độ 0,1 M đến pH 3.Hỗn hợp được để lắng 2 giờ và lọc lấy sản phẩm

Tiến hành chiết xuất và đánh giá ảnh hưởng của loại acid đến quy trình chiết

d) Khảo sát pH của quá trình acid hóa dịch kiềm

Mẫu thử được chiết trong 30 phút với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M Dịch kiềmđược acid hóa tạo kết tủa curcuminoid được khảo sát để tìm pH phù hợp Dãy pHdung dịch sau khi acid hóa được khảo sát là 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 Hỗn hợp được đểlắng 2 giờ và lọc lấy sản phẩm

Tiến hành chiết xuất và đánh giá ảnh hưởng của pH acid hóa dịch kiềm đến quy trình

e) Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết trong môi trường kiềm

Hỗn hợp curcuminoid tan nhưng phân hủy theo thời gian trong môi trường kiềm [41].Mẫu thử được chiết với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M Thời gian chiết được khảosát: 15; 30; 45; 60; 75; 90 (phút) Dịch kiềm được acid hóa bằng acid hydro cloridđến pH 3, để lắng 2 giờ, lọc thu sản phẩm

Tiến hành chiết xuất và đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiết đến quy trình chiết

f) Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắng tủa

Mẫu thử được chiết trong 30 phút với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M Dịch kiềmđược acid hóa bằng acid hydroclorid đến pH 3, để lắng 2 – 8 (oC) và lọc thu sản phẩm.Thời gian lắng tủa được khảo sát ở 2; 4; 8; 16 (giờ)

Tiến hành chiết xuất và đánh giá ảnh hưởng của thời gian lắng tủa đến quy trình chiết

Từ các kết quả khảo sát các yếu tố theo mục a đến f, đánh giá mức độ ảnh hưởng của

mỗi yếu tố và chọn 3 yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến quy trình chiết curcuminoid.Lựa chọn vùng giá trị của mỗi yếu tố để đưa vào tối ưu hóa bằng phần mềm

2.3.3.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phần mềm JMP sử dụng mô hình đáp ứng bề mặt Box - Behnken

Từ kết quả phần 2.2.3.2, mã hóa các yếu tố ở 3 mức độ thấp, vừa, cao (-1; 0; +1)

Sử dụng phần mềm JMP 10.0, phương pháp đáp ứng bề mặt và bố trí 15 thí nghiệmtheo mô hình Box – Behnken với 3 lần lặp lại tại giá trị trung tâm

Tiến hành thực nghiệm 15 thí nghiệm được bố trí bởi phần mềm sẽ thu được kết quảhàm lượng curcuminoid tương ứng

Các dữ liệu thực nghiệm được đưa vào xử lý bằng phần mềm JMP 10.0 Mối tươngquan giữa các yếu tố với quy trình chiết xuất được xác định thông qua kết quả thựcnghiệm được xử lý để có điều kiện chiết xuất tối ưu

Kết quả tối ưu được kiểm tra bằng 6 thí nghiệm với các điều kiện thu được

Xử lý thống kê để đánh giá tính lặp lại của quy trình (RSD < 2 %) Sự khác nhau giữakết quả thực nghiệm và dự đoán được kiểm tra bằng thử nghiệm t (t-test) [8]

Từ đó, đề xuất quy trình chiết xuất curcuminoid tối ưu

2.3.4 Ứng dụng chiết xuất, phân lập curcuminoid từ dư phẩm

2.3.4.1 Chiết xuất curcuminoid:

- Mục đích: chiết xuất curcuminoid từ các mẫu dư phẩm theo quy trình chiết xuất tối

ưu để có nguồn nguyên liệu cho việc phân lập các thành phần tinh khiết

- Mẫu thử: mẫu T2 và T3.

- Chiết xuất: tiến hành chiết curcuminoid theo quy trình tối ưu trên 100 g mẫu thử.

Cụ thể, mẫu được ngâm lạnh với dung dịch kiềm trong thời gian đã thu được từ quytrình tối ưu, lọc Dịch lọc được acid hóa đến pH tối ưu, tạo kết tủa Hỗn hợp được đểlắng 2 -8 (oC) trong thời gian thích hợp Lọc lấy tủa và sấy ở 50 oC

- Phân tích: hòa tan sản phẩm trong methanol, lọc qua màng lọc 0,45 μm Tiến hành

sắc ký các dung dịch và tính toán kết quả dựa vào đường tuyến tính

- Đánh giá: tính ứng dụng của quy trình được đánh giá thông qua hiệu suất và độ tinh

khiết của hỗn hợp curcuminoid chiết được

2.3.4.2 Tinh chế curcuminoid

Mục đích: thu hỗn hợp curcuminoid có hàm lượng ≥ 95 % [44].

Nguyên tắc: Curcuminoid được tinh chế từ sản phẩm curcuminoid thô bằng quá trình

hòa tan trong dung môi và phương pháp kết tinh để loại tạp

Mẫu thử: sản phẩm curcuminoid chiết được từ quy trình tối ưu hóa.

Phương pháp thực hiện:

- Phương pháp 1: Hòa tan curcuminoid thô trong dung môi, lọc lấy dịch Dịch lọc

được thu hồi dung môi đến cắn, sấy khô ở 50 oC thu sản phẩm

Trong phương pháp này, một số dung môi và hỗn hợp dung môi khảo sát được thamkhảo theo tài liệu [33]: methanol, ethanol, hỗn hợp isopropanol – n-hexan

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sản phẩm tinh chế khi thay đổi ở các mứcnhiệt độ 40, 50, 60 (oC)

- Phương pháp 2: Hòa tan curcuminoid thô trong dung môi đến khi dung dịch thu

được nhạt màu, lọc và thu hồi dung môi đến thể tích tương đương 1g curcuminoidthô trong 10 ml dung môi, làm lạnh để curcuminoid kết tinh Lọc kết tinh dưới ápsuất giảm, sấy khô ở 50 oC thu sản phẩm

Một số dung môi và hỗn hợp dung môi khảo sát được tham khảo theo tài liệu [33]:

ethanol – nước, methanol – nước, isopropanol, hỗn hợp isopropanol – n-hexan.

Đánh giá: Hòa tan sản phẩm trong methanol và tiến hành sắc ký các dung dịch theo

điều kiện HPLC mô tả ở mục 2.2.2 để xác định hàm lượng curcuminoid trong sảnphẩm tinh chế

Yêu cầu: hàm lượng curcuminoid ≥ 95 % [44].

2.3.4.3 Phân lập các thành phần tinh khiết trong hỗn hợp curcuminoid

Nguyên tắc: trên cột sắc ký, các thành phần trong hỗn hợp curcuminoid đã tinh chế

sẽ được phân tách khi được rửa giải bằng pha động có độ phân cực khác nhau

Mẫu thử: sản phẩm thu được sau khi tinh chế ở mục 2.2.4.2.

Tiến hành:

- Nạp chất hấp phụ vào cột sắc ký: silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 (mm) được hòa

trong dung môi n-hexan rồi cho từ từ vào cột sắc ký Sau đó, tiếp tục ổn định cột bằng

n-hexan.

- Hỗn hợp curcuminoid được nghiền trong silicagel thành hỗn hợp đồng nhất, cho từ

từ vào cột sắc ký, thêm một ít silicagel lên trên để bảo vệ mẫu tránh bị xáo trộn khi

bổ sung dung môi

- Tiến hành rửa giải bằng n-hexan, sau đó tăng dần độ phân cực bằng cách thêm dần

tỷ lệ cloroform để thu được các phân đoạn

- Thể tích hứng mỗi phân đoạn là 15 ml

Đánh giá:

- Các phân đoạn được kiểm tra bằng SKLM trên bản sắc ký tráng sẵn silica gel F254

Hệ dung môi khai triển: cloroform – acid acetic (90 : 10), phát hiện dưới ánh sángthường

- Các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau được gộp lại thành nhóm phân đoạn Các

nhóm phân đoạn được để bay hơi dung môi tự nhiên trong tủ có hệ thống hút khí độc

để sản phẩm kết tinh thu được chất tinh khiết

2.3.4.4 Đánh giá sản phẩm đã phân lập

a) Cảm quan:

Mô tả cảm quan, màu sắc của các sản phẩm tinh khiết đã phân lập

b) Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập bằng SKLM:

Sắc ký lớp mỏng các thành phần tinh khiết trong ba hệ dung môi có độ phân cực khácnhau, so sánh Rf với giá trị Rf các dung dịch đối chiếu CUR, DMC, BDMC

Yêu cầu: các chất tinh khiết phân lập được chỉ cho một vết chính trên sắc ký đồ, nếu

có vết phụ thì vết đó phải rất nhạt

c) Định tính và xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ

- Phổ UV-Vis: các chất phân lập được hòa tan trong ethanol để có nồng độ khoảng 2

μg/ml Đo phổ hấp thụ của dung dịch thu được trong khoảng bước sóng 800 – 200(nm) Ghi nhận bước sóng hấp thu cực đại λmax (nm) và so sánh với chất đối chiếutương ứng trong cùng dung môi

- Phổ IR: các chất phân lập được tiến hành đo phổ hồng ngoại trên vùng có số sóng

4000 – 400 cm-1 Ghi nhận các đỉnh hấp thu và so sánh với phổ hồng ngoại theo cácTLTK

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6, 500 MHz)của PĐ1, PĐ3, PĐ5

So sánh dữ liệu thu được với dữ liệu của của các TLTK, nếu trùng khớp thì kết luậncấu trúc, nếu là chất mới thì biện giải để xác định cấu trúc hóa học

2.3.4.5 Xác định hàm lượng bằng phương pháp HPLC:

Các thành phần tinh khiết được hòa tan trong methanol, sau đó tiến hành sắc ký theođiều kiện tham khảo tài liệu [13] và mô tả ở mục 2.2.2 Tính toán kết quả dựa theođường tuyến tính của chất đối chiếu đã xây dựng để xác định hàm lượng bằng HPLC

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Các mẫu thử nghiệm được đánh giá các chỉ tiêu định tính bằng SKLM, tro toàn phần,tro không tan trong acid, chất chiết được trong dược liệu và xác định hàm ẩm đạt theoyêu cầu của Dược điển Việt Nam V (độ ẩm < 12 %) Sau đó, các mẫu được định tính,định lượng curcuminoid bằng HPLC theo điều kiện sắc ký được mô tả ở mục 2.2.2

- Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống:

Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống khi tiêm 6 lần dung dịch đối chiếu E2

có nồng độ CUR (30,0 μg/ml), DMC (10,0 μg/ml) và BDMC (10,0 μg/ml) như sau:Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống (tham khảo phụ lục 1)

Lần Thời gian lưu (tR - phút) Diện tích pic (S – mAU x giây)

Nhận xét: các pic trên sắc ký đồ có giá trị RSD thời gian lưu và diện tích đều nhỏ

hơn 2% Các thông số còn lại đạt yêu cầu chung của phương pháp sắc ký:

- Hệ số đối xứng pic: As (CUR) =1,13; As (DMC) =1,13; As (BDMC) =1,11;

- Độ phân giải: Rs1 giữa BDMC và DMC =3,50; Rs2 giữa CUR và DMC = 3,50

Như vậy quy trình đạt tính thích hợp của hệ thống

- Xây dựng khoảng tuyến tính

Tiến hành pha hỗn hợp các dung dịch đối chiếu như mô tả ở mục 2.2.2, thu được cácdung dịch có tín hiệu diện tích pic được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả xây dựng đường tuyến tính

Dung

dịch

Nồng độ thực (μg/ml)

S pic ( mAU x giây )

Nồng độ thực (μg/ml)

S pic ( mAU x giây )

Nồng độ thực (μg/ml)

S pic ( mAU x giây )

Nhận xét: Có sự tương quan giữa nồng độ (μg/ml) và diện tích pic (mAU x giây) của

các thành phần CUR, DMC, BDMC trong khoảng tuyến tính đã thiết lập: CUR (15–150), DMC (5 – 50) và BDMC (5 – 50) Từ đó, hàm lượng curcuminoid trong cácmẫu thử T1, T2, T3 sẽ được tính toán dựa trên các phương trình hồi quy này

Bảng 3.4 Tóm tắt kết quả định lượng curcuminoid trong các mẫu T1, T2, T3 (n = 2)