Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thường phun trên rau bằng phương pháp uplc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC HUỲNH THỊ HỒNG NGỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-HUỲNH THỊ HỒNG NGỌC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN

RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

KHOA DƯỢC

HUỲNH THỊ HỒNG NGỌC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN

RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS

Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất

Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Huỳnh Thị Hồng Ngọc

Luận văn Thạc sĩ Dược học – Khóa: 2016 – 2018

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS

Huỳnh Thị Hồng NgọcNgười hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân, PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ

Từ khóa: abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, ethyl,

chlorpyriphos-methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon, thuốc BVTV,LC-MS/MS, rau

Mở đầu: Rau ăn lá là nhóm nông sản được xếp vào nhóm nguy cơ bị nhiễm thuốc bảo vệ

thực vật nhiều nhất Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc BVTV không hợp lý đã gây nên hiệntượng dư lượng thuốc BVTV trong rau vượt mức quy định gây ảnh hưởng sức khỏe ngườitiêu dùng Hiện nay, nồng độ 0,01 mg/kg được xem là mức dư lượng tối đa cho phép (MRL)chung của những thuốc chưa có quy định Đây là mức giới hạn khá thấp đòi hỏi phươngpháp phân tích đủ nhạy Trong nước, các nghiên cứu về dư lượng thuốc BVTV trong rau quảbằng LC-MS/MS chủ yếu phân tích trên một nhóm, chưa có công bố về định lượng đồngthời 10 thuốc BVTV trên, đặc biệt trong mẫu rau

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Quy trình định lượng đồng thời abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphosethyl, chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam,trichlorfon trên mẫu rau ăn lá được thực hiện trên hệ thống ACQUITY UPLC H-CLASSSYSTEM (Waters) ghép đầu dò khối phổ Xevo TQ- Smicro (Waters) với bộ phận ion hóaphun điện tử Phương pháp xử lý mẫu bằng phương pháp QuEChERS đã tối ưu Quy trìnhđịnh lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC và EC-657/2002

Kết quả: abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl,

chlorpyriphos-methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon và nội chuẩnTPP và CPR d10 được ion hóa kiểu ESI với kỹ thuật ghi phổ MRM cho ra các mảnh mẹ vàmảnh con dùng cho định lượng Điều kiện sắc ký bao gồm cột Acquity UPLC® BEH C18(1,7µm, 2,1x 50 mm), pha động gồm: 5mm amonium acetat/ methanol và 5mm amoniumacetat/ 0,1% acid formic / nước theo chương trình gradient, tốc độ dòng 0,25 ml/phút Miềngiá trị của các thuốc BVTV nằm trong khoảng 5-200 ng/ml, r2 > 0,99 Giới hạn phát hiện từ0,03 đến 1 ng/ml, giới hạn định lượng từ 0,1 đến 5 ng/ml, tất cả đều thấp hơn giá trị MRL(0,01mg/kg hoặc 10 ng/ml) Độ thu hồi trong khoảng 74,47- 116,93% và RSD nhỏ hơn 16%.Các chỉ tiêu về tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác đều cho kết quả nằm trong giới hạn chophép

Kết luận: Đề tài đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình xác định dư lượng 10 thuốc

BVTV thường phun trên rau bằng phương pháp LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu và độchính xác cao Do đó phương pháp có thể ứng dụng để xác định các mẫu rau nhiễm dư lượngthuốc BVTV trên thị trường

Master’s Thesis – Academic course: 2016 - 2018

Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210

DETERMINATION OF POPULAR PESTICIDE RESIDUES IN VEGETABLES

BY LC-MS/MS

Huynh Thi Hong NgocSupervisor: Assoc Prof Nguyen Thi Ngoc Van, Assoc Prof Vo Thi Bach Hue

Keywords: : abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl,

chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon,pesticides, LC-MS/MS, vegetables

Introduction: Leafy vegetables contained the highest amounts of pesticide residues.

However, the use of pesticides unreasonable cause pesticide residues in vegetables above

the maximum residue limits (MRLs) can negatively affect human health A general default

MRL of 0.01 mg/kg applies where a pesticide is not specifically mentioned At this level,analytical methods must be sensitive enough to quantitate low levels In Viet Nam, there aresome studies analyzing pesticides residues by LC-MS/MS methods but mainly on one ortwo group There is no published quantitative information on these 10 pesticides, especially

in vegetables

Materials and methods: A method for quantification of abamectin, alpha-cypermrthrin,

acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb,fipronil, thiamethoxam, trichlorfon in leafy vegetables was been developed using AcquityUPLC H–Class system and Xevo TQ- Smicro mass spectrometer equipped with anelectrospray ionization source The modified QuEChERS procedure was used for samplepreparation The assay was validated in compliance with AOAC and EC guideline

Results: The detection of target compounds was done in multiple-reaction-monitoring(MRM) mode using a tandem mass spectrometry equipped with positive and negative ion-switching ESI source LC conditions: column Acquity UPLC® BEH C18 (1.7µm, 2.1x 50mm), mobile phase gradient mode including 5mm amonium acetat/ methanol và 5mmamonium acetat/ 0,1% acid formic/ water, flow rate of 0,25 ml/min This method wasvalidated base on AOAC and EC guideline, which met the requirements of widely linearityrange of 5-200 ng/ml and high correlation coefficient (r2 > 0.99), very good accuracy(recovery rate 74,47- 116,93%) and intra-day precision (RSD < 16%), typical LOD, LOQvalues of 0.03-1 ng/ml and 0.1- 5 ng/ml for 10 pesticides

Conclusion: A highly sensitive, specific, reproducible and rapid LC-MS/MS method forsimultaneous determination of 10 pesticides in leafy vegetables was successfully developedand validated This method can be useful for monitoring level of these pesticides invegetables

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 3

1.1.1 Một số khái niệm 3

1.1.2 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật 3

1.1.3 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm phospho hữu cơ 5

1.1.4 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm carbamat 9

1.1.5 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm pyrethroid 10

1.1.6 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm neonicotinoid 12

1.1.7 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm macrocyclic lacton 14

1.1.8 Một số thuốc thuốc BVTV trong nghiên cứu thuộc các nhóm khác 16

1.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV 18

1.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU QUECHERS 20

1.3.1 Giới thiệu phương pháp QuEChERS 20

1.3.2 Quy trình chung của phương pháp QuEChERS 20

1.3.3 Ứng dụng của phương pháp QuEChERS 21

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.1.1 Chuẩn đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu 25

2.1.2 Mẫu thử nghiệm 26

2.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 26

2.3 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Hóa chất, thuốc thử 26

2.3.2 Thiết bị, dụng cụ 27

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.4.1 Khảo sát tình hình sử dụng thuốc BVTV thường phun trên rau tại một số huyện ở tỉnh Vĩnh Long 27

2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích các thuốc BVTV thường phun trên rau 28

2.4.3 Thẩm định quy trình phân tích 32

2.5 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC MẪU RAU ĂN LÁ TRÊN THỊ TRƯỜNG 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV TRÊN RAU 37

3.1.1 Kết quả chủng loại thuốc trừ sâu đã sử dụng 37

3.1.2 Kết quả sự phối trộn thuốc BVTV của nông dân 38

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC THUỐC BVTV THƯỜNG PHUN TRÊN RAU 39

3.2.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký lỏng khối phổ 39

3.2.2 Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu 46

3.2.3 Thẩm định quy trình phân tích 48

3.3 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ PHÂN TÍCH MẪU RAU THU THẬP TẠI TỈNH

VĨNH LONG 59

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 61

4.1 THỰC TRẠNG SỬ DỤNG THUỐC BVTV TRÊN RAU MÀU 61

4.1.1 Về địa điểm khảo sát 61

4.1.2 Thuốc BVTV thường được nông dân sử dụng 61

4.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BVTV THƯỜNG PHUN TRÊN RAU 62

4.2.1 Phương pháp phân tích bằng LC- MS/MS 62

4.2.2 Phương pháp xử lý mẫu 65

4.3 Kết quả thẩm định quy trình phân tích 68

4.3.1 Tính tương thích hệ thống 68

4.3.2 Tính đặc hiệu, chọn lọc 69

4.3.3 Tính tuyến tính 69

4.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 70

4.3.5 Độ đúng và độ thu hồi 70

4.4 Dư lượng của thuốc BVTV trong rau ăn lá 70

KẾT LUẬN 72

KIẾN NGHỊ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Chữ nguyên Ý nghĩa

2 AOAC Association of Official

8 CV Coefficient of variation Hệ số biến thiên

9 d-SPE Dispersive - Solid phase

extraction

Chiết phân tán pha rắn

10 ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

11 FAO Food and Agriculture

Organization

Tổ chức nông lương thếgiới

12 GC- MS/MS Gas Chromatography - Mass

Spectrometry/Mass Spectrometry

Sắc ký khí ghép đầu dòkết hợp 2 lần khối phổ

13 GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính

14 HPLC High Performance Liquid

16 IS Internal standard Chất chuẩn nội

18 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

19 LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

20 MRL Maximum residue limit Giới hạn dư lượng tối đa

21 PSA Primary secondary amine Amin thứ cấp

22 QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective,

Rugged, Safe

Nhanh, dễ dàng, rẻ, hiệuquả, ổn định, an toàn

23 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

26 TGCL Thời gian cách ly

27 TPP Triphenylphosphate Triphenyl phosphat

28 UPLC-MS/MS Ultra Performance Liquid

Chromatography - MassSpectrometry/MassSpectrometry

Sắc ký lỏng siêu hiệunăng ghép đầu dò kếthợp 2 lần khối phổ

29 WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Bảng phân loại thuốc BVTV theo nhóm độc 5

Bảng 1.2 Tình hình nhập khẩu hóa chất BVTV từ năm 2010- 2014 18

Bảng 1.3 Số lượng thuốc BVTV được phép sử dụng và cấm sử dụng ở 19

Bảng 1.4 Một số ứng dụng của phương pháp QuEChERS 22

Bảng 1.5 Một số nghiên cứu xác định dư lượng thuốc BVTV bằng phương pháp sắc ký lỏng trong nước và nước ngoài 23

Bảng 2.1 Thông tin về các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 2.2 Hóa chất, thuốc thử trong phân tích 26

Bảng 2.3 Thiết bị và dụng cụ sử dụng cho phân tích 27

Bảng 2.4 Điều kiện phân mãnh đề xuất cho các thuốc BVTV 28

Bảng 2.5 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion 33

Bảng 2.6 Pha dung dịch khảo sát tính tuyến tính 33

Bảng 2.7 Pha dung dịch để khảo sát độ đúng và độ chính xác 34

Bảng 2.8 Mã hóa mẫu 36

Bảng 3.1 Một số hoạt chất BVTV được sử dụng trong vùng khảo sát 37

Bảng 3.2 Tần suất và tỷ lệ phần trăm phối trộn thuốc BVTV (n =120) 38

Bảng 3.3 Các điều kiện MS trong LC-MS/MS để phân tích thuốc BVTV 39

Bảng 3.4 Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa 40

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát điều kiện pha động 42

Bảng 3.6 Chương trình gradient 46

Bảng 3.7 Kết quả tính tương thích hệ thống 49

Bảng 3.8 Tỷ lệ ion của các thuốc BVTV trong nghiên cứu 51

Bảng 3.9 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn của các chất 52

Bảng 3.10 Giá trị LOD và LOQ 54

Bảng 3.11 Kết quả độ đúng và độ chính xác của phương pháp 56

Bảng 3.12 Kết quả độ đúng và độ chính xác của phương pháp 57

Bảng 3.13 Kết quả độ đúng và độ chính xác của phương pháp 58

Bảng 4.1 Thời gian lưu, điều kiện MS/MS của một số thuốc BVTV rửa giải gần nhau

64

Bảng 4.2 %RSD diện tích pic của 10 thuốc BVTV 68

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của nhóm phospho hữu cơ 6

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của chlorpyrifos- ethyl 7

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của chlorpyrifos- methyl 8

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của trichlorfon 8

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của fenobucarb 10

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của alpha- cypermethrin 11

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của acetamiprid 13

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của thiamethoxam 13

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của abamectin 15

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của chlorantraniliprol 16

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của fipronil 17

Hình 1.12 Tóm tắt quy trình chiết của ba phiên bản phương pháp QuEChERS 21

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu dự kiến 30

Hình 3.1 Phổ MS ion phân tử của alpha- cypermethrin 40

Hình 3.2 Phổ MS ion phân mảnh của alpha- cypermethrin 41

Hình 3.3 Phổ MS ion phân tử của acetamiprid 41

Hình 3.4 Phổ MS ion phân mảnh của acetamiprid 41

Hình 3.5 Sắc ký đồ của 5 chất (abamectin, alpha- cypermethrin, acetamiprid, chlorpyrifos- ethyl, chlorpyrifos- methyl), chương trình gradient 6 44

Hình 3.6 Sắc ký đồ của 5 chất phân tích và nội chuẩn (chlorantraniliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon, TPP và CPR d10), chương trình gradient 6 45

Hình 3.7 So sánh hiệu suất chiết của 3 quy trình 46

Hình 3.8 So sánh hiệu suất chiết của C18 và GCB trong d- SPE 47

Hình 3.9 Dịch chiết sau khi xử lý theo quy trình có có GCB (trái) và có C18 (phải) 47

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn của chất chlorantraniliprol 50

Hình 3.12 Đường chuẩn alpha- cypermethrin truy xuất từ phần mềm Masslynx 4.1

53

Hình 3.13 S/N xác định LOD, LOQ của thiamethoxam tại 0,1 và 1 ng/ml 54

Hình 3.14 S/N xác định LOD, LOQ của thiamethoxam tại 0,3 và 1 ng/ml 55

Hình 3.15 Sắc ký đồ chlorantraniliprol trên mẫu A06 60

Hình 3.16 Sắc ký đồ chlorpyrifos- ethyl trên mẫu A02 60

Hình 4.1 Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau (fenobucarb và chlorantraniliprol) 64

Hình 4.2 Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau 65

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một quốc gia phát triển đi lên từ ngành nông nghiệp Trong suốt chiềudài phát triển của dân tộc, nông nghiệp luôn là ngành có đóng góp tích cực trong pháttriển kinh tế - xã hội của đất nước[17] Khí hậu ở Việt Nam là khí hậu nhiệt đới giómùa nóng ẩm quanh năm là điều kiện thuận lợi cho cho sự phát triển của cây trồng.Tuy nhiên, đây cũng là môi trường tốt cho sự phát sinh và phát triển của sâu bệnh, cỏdại gây hại cho cây trồng, đặc biệt là trên cây rau Theo chương trình giám sát quốcgia về tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trên rau quả từ 2008 đến năm 2012 cho thấy:nhóm rau ăn lá có nguy cơ nhiễm sâu bệnh cao hơn rau ăn quả, trong đó, những loạirau có nguy cơ cao gồm rau ngót, rau muống, cải xanh, đậu đỗ… [61] Với tâm lýmuốn phòng ngừa dịch hại, diệt sâu nhanh, gia tăng năng suất cây trồng nên ngườinông dân thường tăng liều lượng, sử dụng thuốc cực độc, thuốc giả, thuốc ngoài danhmục, không đạt tiêu chuẩn chất lượng, không rõ nguồn gốc để bảo vệ cây trồng Từ

đó, dẫn đến tình trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tùy tiện, không đúngloại thuốc, không theo khuyến cáo của cơ quan chức năng và không áp dụng kỹ thuậttheo phương pháp “4 đúng” Qua khảo sát của Cục bảo vệ thực vật tại một số địaphương cho thấy trên 30% lượng thuốc pha chế không đúng liều lượng và gần 3% sửdụng thuốc BVTV không nằm trong danh mục cho phép [60] Theo quy định, mỗiloại thuốc BVTV đều có giá trị giới hạn dư lượng tối đa (MRL), mức giới hạn này là

an toàn cho người sử dụng, từ việc lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các loạithuốc BVTV dẫn đến tồn dư BVTV trong sản phẩm tăng lên vượt quá MRL Khi đó,các thuốc BVTV sẽ gây ra các tác dụng không mong muốn cho người sử dụng, gâyngộ độc và có thể dẫn đến tử vong

Theo Tổ chức Y tế thế giới và Chương trình Môi trường Liên hiệp quốc đánh giá mỗinăm có khoảng 3 triệu nông dân ở các nước đang phát triển bị nhiễm độc trầm trọngbởi thuốc BVTV, trong số đó có khoảng 20.000 người chết [23] Do đó, việc xác định

dư lượng thuốc BVTV trong rau là việc làm hết sức cần thiết để xác định mức độ antoàn của rau và để ngăn chặn ảnh hưởng trên người, động vật và môi trường sống

Ở Việt Nam và các nước (Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản… ) đều có quy định mức dư lượngtối đa cho phép (MRL) của thuốc BVTV trên nhiều đối tượng khác nhau Tuy nhiên,nhiều thuốc hiện nay vẫn chưa có MRL trên các loại rau khác nhau[3],[67],[66], [68].

Do đó, nồng độ 0,01 mg/kg được xem là giá trị MRL chung của những thuốc chưa

có MRL [33] Đây là mức giới hạn khá thấp, đòi hỏi các phương pháp phân tích đủ

độ nhạy cần thiết Phân tích đa dư lượng thuốc BVTV thường gặp nhiều khó khăn docác thuốc này có tính chất khác nhau về độ phân cực, tính bay hơi, độ tan…dẫn đếnquy trình xử lý mẫu thường khó đạt độ thu hồi khi thẩm định quy trình

Năm 2003 phương pháp QuEChERS (viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Effective,Rugged và Safe) đã được Anastassiades và cộng sự lần đầu tiên giới thiệu và xâydựng để phân tích dư lượng các thuốc BVTV trong rau quả [22]và những năm gầnđây phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân tích dưlượng thuốc BVTV

Có nhiều phương pháp hiện đại để phân tích được thành phần dư lượng thuốc trừ sâu

có trong thực phẩm nói chung và rau củ nói riêng Tuy nhiên phương pháp sắc kýlỏng siêu hiệu năng ghép với đầu dò khối phổ (UPLC- MS/MS) với độ tin cậy, độchính xác, độ nhạy, tính đặc hiệu rất cao và khả năng phân tích nhanh ngày càng được

sử dụng rộng rãi và phổ biến

Nhằm góp phần nâng cao chất lượng nông sản, kết hợp khai thác sử dụng hiệu quả

một số kỹ thuật hiện đại và các thiết bị phân tích tiên tiến, đề tài “ Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thường phun trên rau bằng phương pháp UPLC-MS/MS ” được thực hiện với các mục tiêu như sau:

1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu để phân tích thuốc bảo vệ thực vật thường phuntrên rau

2 Thẩm định quy trình xác định dư lượng các loại thuốc bảo vệ thực vật thườngphun trên rau bằng phương pháp UPLC- MS/ MS

3 Ứng dụng quy trình đã thẩm định để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vậttrong rau trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT

1.1.1 Một số khái niệm

Thuốc BVTV còn gọi là thuốc trừ dịch hại hoặc sản phẩm nông dược, bao gồm những

chế phẩm dùng để phòng trừ, tiêu diệt các sinh vật gậy hại hoặc các sinh vật mangmầm bệnh cho thực vật Ngoài ra, các loại thuốc kích thích sinh trưởng, giúp câytrồng đạt năng suất cao cũng là một dạng của thuốc BVTV [4], [17]

Độc tính dư lượng: theo quy định của Tổ chức Lương Nông Thế Giới (FAO) thì dư

lượng thuốc BVTV là những chất đặc thù tồn lưu trong lương thực và thực phẩm,trong sản phẩm nông nghiệp và trong thức ăn vật nuôi do sử dụng thuốc BVTV gâynên [4]

Giới hạn tối đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật (Maximum Residue Level - viết tắt

là MRL) là hàm lượng tối đa của một tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm(đơn vị tính: mg/kg thực phẩm) [3] Từng loại thuốc đối với từng loại nông sản đềuđược quy định mức dư lượng tối đa cho phép mà không gây hại đến cơ thể con người

và vật nuôi khi ăn nông sản đó [4]

Thời gian cách ly (Preharvest interval, PHI) khoảng thời gian ngắn nhất từ khi phun

thuốc lên cây cho đến khi thuốc phân hủy đạt mức dư lượng tối đa cho phép, gọi làthời gian cách ly Trong thực tế, thời gian cách ly được quy định là từ ngày phunthuốc lần cuối lên cây trồng cho đến ngày thu hoạch nông sản làm thức ăn cho người

và vật nuôi, được tính bằng ngày [4]

1.1.2 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật

Có nhiều cách phân loại thuốc BVTV tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng

1.1.2.1 Phân loại theo đối tượng phòng trừ

- Thuốc trừ sâu (insecticides)

- Thuốc trừ nấm (fungicides)

- Thuốc trừ chuột (rodenticides)

- Thuốc trừ ốc sên (molluscicides)

- Thuốc trừ nhện (acaricides)

- Thuốc trừ vi khuẩn (bactericides)

- Thuốc diệt trứng sâu bọ, ve bét ( Ocvicides)

- Thuốc phá vỡ quá trình sinh trưởng, các quá trình sống khácMcủa côn trùng(insect growth regulators)

- Thuốc thúc đẩy quá trình phát triển, ra hoa, nẩy mầm, ra quả của thực vật(plant growth regulators).[1], [6]

1.1.2.2 Phân loại theo nhóm độc

Hầu hết thuốc BVTV đều độc với con người và động vật máu nóng ở các mức độkhác nhau Độ độc của thuốc BVTV có thể chia làm hai loại: độ độc cấp tính và độđộc mãn tính

❖ Độ độc cấp tính của thuốc BVTV

Thuốc xâm nhập vào cơ thể gây nhiễm độc tức thời gọi là nhiễm độc cấp tính Độctính của thuốc BVTV được thể hiện bằng LD50 (Lethal dose 50) là liều lượng cầnthiết gây chết 50% cá thể thí nghiệm và tính bằng đơn vị mg hoạt chất/kg thể trọng.Loại thuốc có trị số LD50 càng thấp là thuốc có độ độc tính cấp càng cao [4]

Căn cứ vào độ độc cấp tính của thuốc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân chia cácloại thuốc thành 5 nhóm độc khác nhau là nhóm Ia ( rất độc), Ib (độc cao), II (độctrung bình), III (ít độc) và IV (rất ít độc) [58]

Bảng 1.1 Bảng phân loại thuốc BVTV theo nhóm độc

Nhóm Mức độ độc LD 50 trên chuột (mg/kg cân nặng)

Đường uống Đường ngoài da

1.1.2.3 Phân loại thuốc BVTV theo thành phần hóa học

Căn cứ vào bản chất hóa học các loại thuốc BVTV được phân chia thành các nhómkhác nhau

- Nhóm thuốc có nguồn gốc thảo mộc

- Nhóm thuốc sinh học

- Nhóm thuốc vô cơ

- Nhóm thuốc clo hữu cơ

- Nhóm thuốc phospho hữu cơ

- Nhóm thuốc carbamat

- Nhóm thuốc pyrethroid (Cúc tổng hợp)

- Nhóm thuốc neonicotinoid

- Nhóm thuốc BVTV khác

1.1.3 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm phospho hữu cơ

1.1.3.1 Đặc điểm thuốc BVTV nhóm phospho hữu cơ [4], [6], [12], [15], [16]

Thuốc BVTV phospho hữu cơ là các hợp chất trong thành phần hóa học có chứaphosphor (P), là dẫn xuất của các ester trung tính hay amid của acid phosphoric

Tùy theo sự thay thế các O bởi S, N và gốc ester hay amid mà có thể chia thành một

số nhóm nhỏ như: phosphat, phosphorothionat, phosphorothiolat,phosphorothionothiolat, phosphorodithiolat, phosphoroamidat, phosphoroamido-thionat, phosphoroamidothiolat

Cơ chế tác động: các thuốc nhóm phospho hữu cơ kết hợp với men chlolinesterase

(ChE) tạo thành phức có tác dụng bất hoạt men ChE, nên không thể phân giảiacetylcholin Khi ChE bị bất hoạt, làm ứ động acetylcholin, gây rối loạn dẫn truyềncholinergic, làm ức chế dẫn truyền các xung thần kinh tới các tế bào cơ, tuyến, não

và hạch Ngộ độc thuốc nhóm phospho hữu cơ có các triệu chứng như: nhức đầu,choáng váng, cảm giác nặng đầu, nhức thái dương, giảm trí nhớ, dễ mệt mỏi, ngủkhông ngon giấc, ăn kém ngon Ở một số trường hợp, có rối loạn tinh thần và trí tuệ,giật nhãn cầu, run tay và một số triệu chứng rối loạn thần kinh khác

Các thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ có phổ tác dụng rộng (ngoài tác dụng trừsâu, nhiều thuốc trong nhóm còn có tác dụng đồng thời là thuốc trừ nhện và tuyếntrùng) Thuốc có tác dụng nhanh và mạnh đến côn trùng bằng con đường tiếp xúc, vịđộc Nhiệt độ môi trường tăng cao, hiệu lực của thuốc cũng tăng lên

Các thuốc trong nhóm độc với động vật máu nóng (hầu hết thuộc nhóm độc II, một

số thuộc nhóm độc Ib) rất độc với cá và mật ong, dễ gây hại các loại ký sinh thiênđịch và các sinh vật hoang dã, khá an toàn với thực vật Do có độ độc cao với sinh

vật không phải đối tượng phòng trừ, đặc biệt với động vật có vú, nên phạm vi sử dụngcủa thuốc này cũng dần bị thu hẹp.

1.1.3.2 Một số thuốc BVTV thuộc nhóm phospho hữu cơ trong nghiên cứu

❖ Chlorpyrifos- ethyl [2] , [4],[35],[69] , [66]

- Tên IUPAC: O, O-diethyl O-(3, 5, 6-trichloropyridin-2-yl) phosphorothioat

- Công thức phân tử: C9H11Cl3NO3PS

- Khối lượng phân tử: 350,57 g/mol

- Công thức cấu tạo

O

C2H5

C2H5

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của chlorpyrifos- ethyl

- Tính chất: dạng tinh thể màu trắng, rất ít tan trong nước, tan trong aceton,benzen, chloroform, ethanol, methanol và nhiều dung môi hữu cơ khác Điểm nóngchảy 41 oC, dễ phân hủy trong môi trường kiềm và nhiệt độ cao

- Độ độc: thuộc nhóm độc II, LD50 qua miệng 96- 270 mg/kg LD50 qua da 2.000mg/kg Giới hạn tối đa dư lượng (MRL) hoạt chất Chlorpyrifos- ethyl với rau ăn lá0,05 mg/kg, đậu bắp 0,5 mg/kg , cà rốt 0,1 mg/kg, khoai tây 2 mg/kg Thời gian cách

ly (TGCL) 14 ngày

- Công dụng và cách dùng: tác động tiếp xúc, vị độc và xông hơi Phổ tác dụngrộng, hiệu lực trừ sâu nhanh Dùng để phòng trừ sâu đục thân, đục quả, sâu ăn lá, rệphại rau, sâu xanh, rệp hại bông,…

- Tên thương mại: Acetox 40EC, Killray TSC 600WP, Minifos 480EC, Lionsuper 750EC, Andotox 600EC, Super Kill Plus 550EC,…

❖ Chlorpyrifos- methyl [2],[4],[35],[69],[66]

- Tên IUPAC: O, O-dimethyl O-(3, 5, 6-trichloropyridin-2-yl) phosphorothioat

- Khối lượng phân tử: 322,52 g/mol

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của chlorpyrifos- methyl

- Tính chất: dạng tinh thể màu trắng, rất ít tan trong nước, tan trong aceton,benzen, chloroform, ethanol, methanol và nhiều dung môi hữu cơ khác Dễ phân hủytrong môi trường kiềm và nhiệt độ cao

- Nhóm độc nhóm II, LD50 qua miệng 1100 – 2250 mg/kg, LD50 qua da > 2000mg/kg Giới hạn tối đa dư lượng (MRL) hoạt chất chlorpyrifos- methyl trên rau ăn lá,rau củ 0,05 mg/kg, đậu bắp 0,5 mg/kg, cà chua 1 mg/kg, khoai tây 0,01 mg/kg [3].TGCL 7 -10 ngày

- Sử dụng: thuốc có tác dụng tiếp xúc, vị độc và xông hơi Phổ tác dụng rộng,phòng trừ nhiều loại sâu đục thân, sâu ăn lá, rầy nâu, rầy xanh, bọ xít hại lúa,…

- Tên thương mại: Monttar 7.5EC, Sieusao 40EC, Taron 50EC,…

❖ Trichlorfon [2], [4]

- Tên IUPAC: Dimethyl (2,2,2- trichloro- 1 hydroxyethyl) phosphonat

- Công thức phân tử: C4H8Cl3O4P

- Khối lượng phân tử: 257,42 g/mol

- Công thức cấu tạo

- Tính chất: dạng tinh thể không màu, rất ít tan trong nước, tan trong benzen,ethanol, methanol và nhiều dung môi hữu cơ khác Không tan trong dầu hỏa và ănmòn kim loại.

- Theo thông tư 03/2018/TT-BNNPTNT về việc ban hành danh mục thuốc bảo

vệ thực vật được phép sử dụng, cấm sử dụng tại Việt Nam, hoạt chất trichlorfon thuộcdanh mục cấm sử dụng tại Việt Nam.[2]

1.1.4 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm carbamat

1.1.4.1 Đặc điểm thuốc BVTV nhóm carbamat

Thuốc BVTV nhóm carbamat là các ester của acid carbamic (H2N-COOH) và dẫnxuất của acid carbamic như carbaryl, carbofuran, fenobucarb,… Hiện nay, người ta

đã tổng hợp được trên 1000 hợp chất carbamat, trong đó có 35 loại dùng để trừ sâu.[4]

Cơ chế tác động: thuốc BVTV nhóm carbamat tương tự như nhóm phospho hữu cơ

tác động trực tiếp vào men cholinesterase Sự khác nhau cơ bản về cơ chế của 2 nhómnày là ở chỗ: quá trình phosphoryl hoá men ChE của thuốc lân hữu cơ là nó gắn nhanhvào các nhóm hoạt động có trong men Do đó, thuốc nào gắn vào các gốc hoạt độngcủa men thì thuốc đó càng độc Triệu chứng ngộ độc bao gồm nhức đầu, choáng váng,dễ mệt mỏi, ngủ không ngon giấc, ăn kém ngon, chóng mặt [12], [15]

Phổ tác động hẹp hơn so với các thuốc nhóm phospho và nhóm clo hữu cơ Thuốc tácđộng nhanh nhưng hiệu lực ngắn Không tồn tại lâu trong môi trường, tương đối ítđộc đối với động vật máu nóng, nên hiện nay được dùng thay thế cho các nhóm lânhữu cơ và nhóm clo Dễ bị phân hủy bởi acid và kiềm.[6], [16]

1.1.4.2 Một số thuốc BVTV nhóm carbamat trong nghiên cứu

❖ Fenobucarb [4], [69], [2], [66]

- Tên hóa học : 2- (1- methylpropyl) phenyl methylcarbamate

- Công thức phân tử: C12H12NO2

- Khối lượng phân tử: 207,27 g/mol

- Công thức cấu tạo

CH3

O N

O

CH3

H

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của fenobucarb

- Tính chất: dạng tinh thể màu trắng, rất ít tan trong nước, tan trong aceton,benzen, toluen, hexan và nhiều dung môi hữu cơ khác Bền ở điều kiện bình thường

- Nhóm độc nhóm II, LD50 qua miệng 340- 410 mg/kg, LD50 qua da 4200 mg/kg.Giới hạn tối đa dư lượng (MRL) hoạt chất fenobucarb chưa có quy định cho từng đốitượng nên mặc định là 0,01 mg/kg (theo quy định của Châu Âu EC 396/2005) TGCLvới cà, dưa 3 ngày, lúa 7 ngày, chè 21 ngày

- Sử dụng: thuốc có tác dụng tiếp xúc, vị độc Phổ tác dụng rộng, dùng để phòngtrừ các loại sâu ăn lá,, có hiệu quả với các loại rầy, rệp như rầy nâu, rầy hại thuốc lá,bông, cà phê,cây ăn quả

- Tên thương mại: Abasba 50EC, Anba 50 EC, Super Kill 50 EC, …

1.1.5 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm pyrethroid

1.1.5.1 Đặc điểm thuốc BVTV nhóm pyrethroid [12], [15]

Trong hoa Cúc (Chrysanthemum cinerariaefolium và C roseum) có chứa 6 este củaacid cyclopropane carboxylic là pyrethrin I, cinerin I, Jasmolin I (gọi làChrysanthemat) và pyrethrin II, cinerin II, Jasmolin II ( gọi chung pyrethrat), rất độcvới côn trùng và nhện

Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của pyrethrin có trong cây cúc có tác dụng sát trùng,người ta đã tổng hợp và phát triển thành nhóm thuốc trừ sâu pyrethroid (cúc tổnghợp) Phổ tác dụng rộng, tác động nhanh, tác động lên hệ thần kinh, gây thiếu oxycôn trùng Không tồn tại lâu trong môi trường, dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ và ánhsáng, nên các hoạt chất nhóm pyrethroid ít độc với môi trường và và động vật máunóng Ít tan trong nước, dễ tan trong mỡ và dung môi hữu cơ

Dựa vào cấu trúc phân tử người ta chia pyrethroid thành 2 dạng khác nhau:

- Dạng Pyrethroid I ( không có nhóm α- cyanopyrethroid) gồm: Allethrin,Tetramethrin., Resmethrin, Permethrin , Kadethrin, Phenothrin, ……, gây bồn chồn,run toàn thân tương tự như ngộ độc DDT

- Dạng Pyrethroid II: (có nhóm α- cyanopyrethroid) gồm: Cypermethrin,Deltamethrin, Fenvalerat, … , gây quằn quại, run toàn thân, tiết nhiều nước bọt, cửđộng rời rac và chết

Các chất nhóm pyrethroid là các chất độc đối với dẫn truyền thần kinh do tác dụngluôn giữ kênh Na+ mở trong màng tế bào thần kinh gây ảnh hưởng đến sự dẫn truyềncác xung thần kinh làm mất cảm giác, tê liệt, ở liều cao có thể gây tử vong Khi tiếpxúc trong thời gian dài có thể gây ngộ độc gan Các chất này thường ít độc qua đườngtiếp xúc và qua hô hấp Liều độc của các chất nhóm pyrethroid cũng thấp hơnnhiều loại thuốc BVTV khác

1.1.5.2 Một số thuốc BVTV nhóm pyrethroid trong nghiên cứu

❖ Alpha- cypermethrin [2], [4], [69]

- Công thức hóa học: C22H19Cl2NO3

- Khối lượng phân tử: 416,3 g/mol

- Tên hóa học theo IUPAC: : gồm 2 chất (S)- phenoxyphenyl)methyl] 3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-dimethyl cyclopropan-1-carboxylat và (R) )- α-cyano-(3-phenoxyphenyl)methyl] 3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-dimethyl cyclopropan-1-carboxylat

α-cyano-(3 Công thức cấu tạo:

CH3

H3C Cl

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của alpha- cypermethrin

- Alpha- cypermethrin là thuốc trừ sâu nhóm pyrethroid, là hỗn hợp của 2 dồngphân racemic Thuốc kỹ thuật ở dạng tinh thể, nhiệt độ nóng chảy > 80 oC Không tantrong nước (ở 25 C), tan nhiều trong n- hexan (6,5 µg/l ở 21

21 oC), methanol (21,3 µg/l ở 21 oC), isopropanol (9,6 µg/l ở 21 oC), tương đối bềntrong môi trường trung tính và acid, thủy phân trong môi trường kiềm.

- Alpha- cypermethrin thuộc nhóm độc nhóm II (WHO ), LD50 qua miệng 79mg/kg, LD50 qua da > 2000 mg/kg Ít độc với cá, độc với ong Giới hạn dư lượng tối

đa của alpha- cypermethrin trên rau ăn lá, rau họ đậu 0,07 mg/kg, đậu bắp 0,5 mg/kg,rau củ 0,01 mg/kg [3]

- Sử dụng: thuốc có tác dụng tiếp xúc và độc vị, phổ tác dụng rộng, dùng đểphòng trừ các loại sâu ăn lá và chút chích cho lúa, rau và cây ăn quả và cây côngnghiệp như sâu cuốn lá, sâu xanh, dòi đục lá, đục quả,…

- Tên thương mại: Sieublack, Vitashield gold 600EC, Spaceloft 300EC,VK.sudan,…

1.1.6 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm neonicotinoid

1.1.6.1 Đặc điểm thuốc BVTV nhóm neonicotinoid

Nhóm neonicotinoid là nhóm thuốc trừ sâu tổng hợp dựa vào cấu tạo chất nicotin cótrong cây thuốc lá và thuốc lào Thuốc có phổ tác dụng rộng Một số chất hiện đang

sử dụng như imidacloprid, acetamiprid, thiamethoxam,…

Gần đây, một số nước hạn chế sử dụng những chất của nhóm này vì có nhiều bằngchứng cho thấy nguy cơ gây hội chứng CCD (rối loạn sụt giảm bầy đàn) đối với ongmật Nguyên nhân là do các chất này phá huỷ hệ thống miễn dịch tự nhiên của ongmật nhạy cảm với nhiều trường hợp nhiễm trùng gây chết [36] Hiện nay, ở Việt Namcác chất này vẫn được phép sử dụng làm thuốc BVTV trong nông nghiệp [2]

1.1.6.2 Một số thuốc BVTV nhóm neonicotinoid trong nghiên cứu

- Công thức cấu tạo

NCl

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của acetamiprid

- Acetamiprid là thuốc trừ sâu nhóm neonicotinoid, thuốc kỹ thuật dạng bột rắn,điểm nóng chảy 98,9 °C, trọng lượng riêng 1,33 g/cm3 Tan ít trong nước, tan trongcác dung môi hữu cơ như aceton, chloroform, hexan

- Acetamiprid thuộc nhóm độc II (WHO), LD50 qua miệng 314 - 417 mg/kg

LD50 qua da >2000 mg/kg Giới hạn tối đa dư lượng (MRL) hoạt chất acetamipridvới rau củ 0,2 mg/kg, đậu bắp 0,2 mg/kg TGCL 10 ngày

- Sử dụng: thuốc có tác dụng tiếp xúc, vị độc, có khả năng nội hấp Phổ tác dụngrộng, diệt trừ được các sâu non bộ cánh cứng, cánh vảy, phòng trừ bọ trĩ, rầy,rệp…cho các loại rau, lúa, dưa, ngô và cây ăn quả

- Tên thương mại: Newtoc 250EC, Actatoc, Raysuper 30EC, Sếu đỏ 3EC,Sieuray,

❖ Thiamethoxam [2], [3], [4]

- Công thức hóa học: C8H10ClN5O3S

- Khối lượng phân tử: 291,7 g/mol

- Tên hóa học theo IUPAC: methyl-1,3,5-oxadiazinan-4-ylidene(nitro)amine

(EZ)-3-(2-chloro-1,3-thiazol-5-ylmethyl)-5 Công thức cấu tạo:

NO

- Tính chất: thuốc kỹ thuật dạng rắn, màu nâu sáng, trọng lượng riêng 0,47 g/cm3(20 °C) mùi hôi nhẹ Điểm nóng chảy 139 oC, tan trong nước 4,1 g/l ở 25 °C Tannhiều trong dung môi hữu cơ như aceton, methanol, acetonitril.

- Độ độc: thuộc nhóm độc II, LD50 qua miệng 1563 mg/kg, LD50 qua da > 2000mg/kg Ít độc với cá và ong Giới hạn dư lượng tối đa của thiamethoxam trên rau ăn

lá 3 mg/kg, rau từ rễ và củ 0,3 mg/kg

- Sử dụng: thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc, khả năng nội hấp mạnh Phổtác dụng rộng, thuốc dùng để phòng trừ rầy nâu, bọ trĩ hại lúa, bọ phấn hại rau, càchua, dưa, sâu vẽ bùa hại cây có múi, bọ cánh cứng hại dừa

- Tên thương mại: Actara 25WG, Fortaras 25WG, Goldan 750WP, Sieu fitoc150EC,…

1.1.7 Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm macrocyclic lacton

1.1.7.1 Đặc điểm thuốc BVTV nhóm macrocyclic lacton [15]

Các hợp chất nhóm macrocyclic lacton là các sản phẩm được lên men tự nhiên từ các

loài vi khuẩn Streptomyces giống nấm Một số hợp chất đại diện của nhóm này gồm

abamectin, ivermectin, emamectin, spinosad…

Trước đây, tác dụng chính của các chất thuộc nhóm này là tác dụng diệt giun sán đốivới gia súc Hiện nay, các chất thuộc nhóm này được sử dụng để làm thuốc BVTVtrong nông nghiệp Các thuốc BVTV nhóm macrocyclic lacton thường được phối hợpvới các thuốc BVTV nhóm khác để tăng khả năng diệt trừ sâu hại

Các chất này ngăn cản sự dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh và tế bào cơ bằngcách tăng cường sự giải phóng và gắn acid γ-aminobutyric vào đầu tế bào thần kinhdẫn đến làm tăng ion Cl- vào trong tế bào làm tê liệt hệ thần kinh Các triệu chứngngộ độc cấp có thể gặp phải bao gồm hôn mê, giảm huyết áp, suy hô hấp và tử vong

1.1.7.2 Một số thuốc BVTV nhóm macrocyclic lacton trong nghiên cứu

❖ Abamectin [2], [4], [34]

- Công thức hóa học: Avermectin B1a C48H72O14

Avermectin B1b C47H70O14

- Khối lượng phân tử: Avermectin B1a 873.1 g/mol

Avermectin B1a 859,1 g/mol

- Tên hóa học theo IUPAC:

Avermectin B1a: [(S)-sec-butyl] 21,24-dihydroxy-5′,11,13,22-tetramethyl-2-oxo-(3,7,19-trioxatetracyclo [15.6.1.14,8.O20,24] pentacosa-10,14,16,22-tetraene)-6-spiro-2′-(5′,6′-dihydro-2′Hpyran)-12-yl2,6-dideoxy-4-O-(2,6-dideoxy-3-O-methyl-α-L-arabino-hexopyranosyl)-3-O-methyl-α-L-arabino-hexopyranosid

6′-Avermectin B1b: 21,24-dihydroxy-6′- isopropyl-5′,11,13,22-tetramethyl-2-oxo-(3,7,19-trioxatetracyclo[15.6.1.14,8.O20,24] pentacosa-10,14,16,22-tetraene)-6-spiro-2′-(5′,6′-dihydro-2′H-pyran)-12-yl 2,6- dideoxy-4-O-(2,6-dideoxy-3-O-methyl-α-L-arabino-hexopyranosyl)-3-O-methyl-α- L-arabino-hexopyranosid

(10E,14E,16E)-(1R,4S,5′S,6S,6′R,8R,12S,13S,20R,21R,24S) Công thức cấu tạo:

H OH

H

CH3

O O

O H

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của abamectin

- Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học nhóm Avermectin, là hỗn hợp củaAvermectin B1a (80%) và Avermectin B1b (20%), sản phẩm do quá trình lên men vi

khuẩn Streptopmyces avermitilis Thuốc kỹ thuật dạng bột rắn, màu vàng nhạt, nhiệt

độ nóng chảy 161,1- 169,4 oC; tỷ trọng 1,18 (ở 20 oC), tan ít trong nước, tan nhiềutrong dung môi hữu cơ như aceton, methanol, dichloromethan, hexan Bền trong môiR= -CH2CH3 (Avermectin B1a)

R= -CH3 (Avermectin B1b)

gamma aminobutyric acid (GABA) tại chỗ nối cơ thần kinh của côn trùng Thuốc làmcôn trùng ngừng ăn hoặc ngừng đẻ trứng ngay, chúng có thể chết sau vài ngày Hoạtchất abamectin có hiệu lực diệt sâu nhanh, mạnh, kéo dài và ít chịu tác động của điềukiện thời tiết.

- Thuốc ít hình thành tính kháng của dịch hại, ít gây độc cho người sử dụng

- Phổ tác động rộng, trừ được nhiều loài sâu miệng nhai, miệng chích hút thuộc

bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh đều như ruồi đục lá, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, nhện

- Abamectin thuốc nhóm độc nhóm II, LD50 qua miệng 300 mg/kg, LD50 qua da

> 1800 mg/kg, dễ kích thích da và mắt Tương đối độc với cá, ít độc với ong, mauphân hủy trong môi trường TGCL 5- 7 ngày Dư lượng cho phép đối với rau ăn lá0,05 mg/kg, đậu bắp 0,01 mg/kg [35]

- Tên thương mại: sixtoc, B thai 118EC, Siutox 25EC/ 50EC, Minifos 250EC,…

1.1.8 Một số thuốc thuốc BVTV trong nghiên cứu thuộc các nhóm khác

❖ Chlorantraniliprol [2], [3], [4], [69]

- Công thức hóa học: C18H14BrCl2N5O2

- Khối lượng phân tử: 483,15 g/mol

- Tên hóa học theo IUPAC: methyl-6'-(methylcarbamoyl)pyrazole-5-carboxanilide

3-bromo-4'-chloro-1-(3-chloro-2-pyridyl)-2' Nhóm hóa học: diamid

- Công thức cấu tạo:

N N Br

N Cl

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của chlorantraniliprol

- Tính chất: thuốc kỹ thuật dạng rắn, màu trắng, trọng lượng riêng 1,51 g/cm3.Điểm nóng chảy 209 oC, tan trong nước 1,02 mg/l ở 20 °C Tan nhiều trong dung môihữu cơ như aceton, methanol, ethyl acetat.

- Độ độc: thuộc nhóm độc nhóm III Giới hạn dư lượng tối đa củachlorantraniliprol trên rau ăn lá 20 mg/kg, rau từ rễ và củ 0,02 mg/kg

- Sử dụng: thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc, gây tê liệt hệ cơ, làm sâu hoạtđộng yếu ớt, ngừng ăn và chết sau 1- 2 ngày Thuốc dùng để phòng trừ sâu cuốn lá,sâu đục thân lúa, sâu tơ, sâu xanh hại cà chua, sâu đục quả đậu tương

- Tên thương mại: DuPontPrevathon 0.4GR, 5SC, 35WG, Virtako 300SC,…

❖ Fipronil [2], [4], [69], [66]

- Công thức hóa học: C12H4Cl2F6N4OS

- Khối lượng phân tử: 437,15 g/mol

- Tên hóa học theo IUPAC: trifluoromethylsulfinylpyrazole-3-carbonitrile

5-amino-1-(2,6-dichloro-α,α,α-trifluoro-p-tolyl)-4 Nhóm hóa học: Phenylpyrazole

- Công thức cấu tạo:

N N

F F N

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của fipronil

- Tính chất: thuốc kỹ thuật dạng rắn, không màu, trọng lượng riêng 1,71 g/cm3.Điểm nóng chảy 203 oC Tan rất ít trong nước, tan nhiều trong dung môi hữu cơ nhưaceton, methanol, hexan, toluen Thủy phân ở môi trường kiềm, bền vũng ở nhiệt độcao

- Độ độc: thuộc nhóm độc nhóm II LD50 qua miệng 77- 95 mg/kg, LD50 qua da

354 - 2000 mg/kg Độc với cá, rất độc với ong, mau phân hủy trong môi trường.TGCL 14 ngày Dư lượng cho phép đối với rau ăn lá, đậu bắp, khoai lang 0,005mg/kg

- Sử dụng: thuốc có tác dụng tiếp xúc, vị độc, có khả năng nội hấp Phổ tác dụngrộng, dùng để phòng nhiều loại sâu đục thân, sâu ăn lá cho nhiều loại cây trồng nhưlúa, ngô, rau, cây ăn quả,…

- Tên thương mại: Again 50SC/ 800WG, Lexus 200FS/ 800WG, Ranger 0.3GR/5SC/ 800WG…

1.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV

Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật thuộc Bộ Nông nghiệp – phát triển nông thôn,trong những năm gần đây, hằng năm Việt Nam nhập khẩu và sử dụng khoảng 70.000– 100.000 tấn hóa chất thành phẩm để phục vụ sản xuất nông nghiệp Khối lượng vàchủng loại thuốc BVTV đã sử dụng tại nước ta cao gấp nhiều lần nhu cầu sử dụngcho sản xuất nông nghiệp [64]

Theo báo cáo của Tổng Cục môi trường đã thống kê số lượng nhập khẩu thuốc BVTV

từ năm 2010 đến 2014 thể hiện trong bảng 1.2 cho thấy số lượng thuốc BVTV nhậpkhẩu tăng dần qua các năm

Bảng 1.2 Tình hình nhập khẩu hóa chất BVTV từ năm 2010- 2014

Năm

Tổng khối lượng (Tấn thành phẩm)

Thuốc trừ sâu Thuốc trừ bệnh Thuốc trừ cỏ Tên

thành phẩm

Tỷ lệ

%

Tên thành phẩm

Tỷ lệ

%

Tên thành phần

Trong đó có một số thuốc độ độc cao, lạc hậu mà các nước tiến tiến trên thế giới đãhạn chế hoặc cấm sử dụng vẫn còn được sử dụng tại Việt Nam Do đó, các tổ chứcquốc tế như FAO, WHO và Ngân hàng Thế giới (WB) đều thống nhất rằng các sảnphẩm độc hại cần được loại bỏ khỏi nông dân sản xuất quy mô nhỏ, bởi đây là nhữngđối tượng thiếu kiến thức, thiếu dụng cụ phun thuốc, thiếu các thiết bị bảo quản, bảo

hộ để thực hiện đúng quy trình sử dụng sản phẩm.[62]

Qua rà soát, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã loại bỏ 1024 loại thuốcBVTV độc hại, làm ảnh hưởng đến môi trường, hệ sinh thái khỏi danh mục.[65].Thông tư 03/2018/ TT-BNNPTNT ngày 9 tháng 2 năm 2018 Ban hành danh mụcthuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng, cấm sử dụng tại Việt Nam [2] Bảng 1.3tổng hợp số lượng các hoạt chất dùng trong nông nghiệp theo 2 danh mục được phânloại dựa vào công dụng

Bảng 1.3 Số lượng thuốc BVTV được phép sử dụng và cấm sử dụng ở

Việt Nam năm 2018

Thuốc BVTV được phép sử dụng

Thuốc BVTV cấm sử dụng

3 Thuốc trừ bệnh 617 hoạt chất 6 hoạt chất

5 Thuốc điều hòa sinh trưởng 52 hoạt chất

-8 Thuốc dẫn dụ côn trùng 9 hoạt chất

-Ở nước ta đã có một số công trình khảo sát về tình hình sử dụng thuốc BVTV và ảnhhưởng của thuốc BVTV đến sức khoẻ người nông dân [19] Bên cạnh đó cũng có một

số nghiên cứu xác định dư lượng của thuốc BVTV bằng phương pháp sinh học và sắc

ký [7] Nồng độ Carbamate trong các mẫu khảo sát tại một số chợ, siêu thị, khu công

mức cho phép [63] Nghiên cứu của Bùi Thị Nga (2010) về hiện trạng sản xuất và lưutồn thuốc BVTV trong đất, nước trên rau xà lách xoong tại xã Thuận An, huyện BìnhMinh, tỉnh Vĩnh Long cho thấy các hộ trồng rau chủ yếu sử dụng các loại thuốc BVTVthuộc gốc Carbamate (0,8%), gốc Cúc gồm Cymethrin (14,4%) và Alphacymethrin(28,8%), gốc sinh học (56%) gồm Abametin và Pegasus, không có trường hợp nông

hộ sử dụng thuốc BVTV trong danh mục bị cấm Hàm lượng thuốc BVTV lưu tồntrong rau dao động trong khoảng 0,01-0,05 mg/kg (Alpha- cypermethrin), 0,23 - 0,99mg/kg (Cypermethrin) và nằm trong mức cho phép theo tiêu chuẩn FAO [10]

1.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU QUECHERS

1.3.1 Giới thiệu phương pháp QuEChERS

Năm 2003, Anastassiades và Lehotay giới thiệu một phương pháp mới để phân tích

dư lượng thuốc BVTV, sau này được gọi là QuEChERS (viết tắt của quick, easy,cheap, effective, rugged và safe) QuEChERS là một phương pháp phân tích đa dưlượng thuốc trừ sâu trong nhiều loại nền mẫu khác nhau, chỉ cần có khoảng 70- 100%nước trong thành phần (mẫu khô được cho thêm nước) [22]

Năm 2005, Lehotay và các cộng sự nghiên cứu thẩm định phương pháp này cho thấyphương pháp này cho kết quả tốt với 207 chất trong số 229 thuốc trừ sâu trong cácnền mẫu rau quả Tuy nhiên, độ thu hồi của những chất nhạy với pH bị ảnh hưởng rõrệt [47] Sau đó Lehotay thay đổi phương pháp gốc bằng cách sử dụng đệm acetat pH4,8-5,0 để tăng độ thu hồi của thuốc trừ sâu [48]

Phương pháp này sau đó đã được nghiên cứu trong 13 phòng thí nghiệm ở 7 quốc giađối với 30 thuốc trừ sâu và trở thành phương pháp chính thức của AOAC vào năm

2007 [24] Cùng thời gian đó, Anastassiades và cộng sự phát triển một phương phápQuEChERS khác sử dụng đệm citrat ở pH khoảng 5 Phương pháp này đã được thẩmđịnh liên phòng ở nhiều phòng thí nghiệm ở Đức và trở thành phương pháp Châu ÂuCEN 15662 [31]

1.3.2 Quy trình chung của phương pháp QuEChERS

Phương pháp QuEChERS dựa trên nguyên tắc chiết một lần bằng acetonitril (1 ml/1g mẫu) đã được ổn định pH và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng lỏng

nhờ muối magnesi sulfat (MgSO4) Quá trình làm sạch bằng chiết phân tán pha rắnd- SPE) được dùng để loại các acid hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờphối hợp chất hấp phụ PSA (Primary secondary amine), GCB (Graphitized carbonblack-than hoạt tính), C18 và MgSO4 được sử dụng khi cần thiết để lần lượt loại cácchất béo và clorophyl Dịch chiết được tách và phân tích bằng sắc ký khối phổ [22].

1.3.3 Ứng dụng của phương pháp QuEChERS

Có thể nói hiện nay, phương pháp QuEChERS đã trở thành một phương pháp hàngđầu trong phân tích thuốc BVTV trong nhiều nền mẫu khác nhau như rau quả, ngũ

Phân tíchGC-MS, LC-MS

Phân tíchGC-MS, LC-MS

Phân tíchGC-MS, LC-MS

+ 4 g MgSO4 ,

1 g NaCl,lắc mạnh, ly tâm

+ 150 mg MgSO4+ 50 mg PSAC18 và GCB(lựa chọn thêm)

+ 150 mg MgSO4+ 25 mg PSAC18 và GCB( lựa chọn thêm)

+ 10 ml ACN

+ nội chuẩn (IS)

lắc đều

+ 6 g MgSO4,1,5 g NaOAclắc mạnh, ly tâm

+ 4 g MgSO4, 1 g NaCl,

1 g Na3Citrat 2H2O,0,5 g Na2Citrat.1,5H2Olắc mạnh, ly tâm

+ 15 ml ACN/ 1%

acid acetic+ nội chuẩn (IS)lắc đều

+ 10 ml ACN+ nội chuẩn (IS)lắc đều

10 g mẫu/ ống lytâm 50 ml

Phương pháp gốc

Anastassiades 2003

Phương phápAOAC 2007.01

Phương pháp

EN 15662

Hình 1.12 Tóm tắt quy trình chiết của ba phiên bản phương pháp QuEChERS

1 ml dịch chiết 1 ml dịch chiết 1 ml dịch chiết

cốc, các sản phẩm thực phẩm khác Một số nghiên cứu đã công bố được trình bày ởBảng 1.4

Bảng 1.4 Một số ứng dụng của phương pháp QuEChERS

Chất

phân

tích

Nền mẫu

Xử lý mẫu

Phương pháp phân tích

Kết quả nguồn Năm,

52

thuốc

BVTV

Mậtong

Chiết: acetonitrilLàm sạch: MgSO4, PSA,C18

MS/MS

LC-RSD < 20%

R%: 34-96%

2016[28]

180

thuốc

BVTV

Nhođen

Chiết: ACN, đệm Citrat,Làm sạch: 0,5 g MgSO4,0,125 g PSA (0,25 g C18)

MS/MS

GC-RSD < 3- 19%

R%: < 70- 116 %

2014[57]

54

thuốc

BVTV

Tráicây vàrau

Chiết: ACN 1% acid aceticLàm sạch: 0,3 g MgSO4,0,1 g PSA (0,1 g C18)

MS/MS

LC-RSD < 1- 13,8%

R%:73,2- 134,3 %

2017[59]41

LC-RSD < 20%

R%: 71-119%

2014[54]

Trong những năm gần đây, các tác giả đều ứng dụng phương pháp QuEChERS và cóthay đổi một số điểm trong dung môi chiết hay trong bước làm sạch tùy thuốc BVTV

và nền mẫu Trong bước làm sạch dịch chiết, MgSO4 và PSA luôn được sử dụng, một

số tác giả phối hợp thêm GCB hoặc C18 để tăng hiệu quả chiết [20]

Các kết quả trên cho thấy phương pháp QuEChERS có thể ứng dụng với nền mẫu rauquả tươi để xác định thuốc BVTV, có độ thu hồi đáp ứng được yêu cầu trên nhiềuloại nền mẫu với nhiều thuốc BVTV Phương pháp có ưu điểm nhanh, dễ thực hiện,

ít tốn kém, hiệu quả tốt và ổn định với nhiều thuốc BVTV trên nhiều loại nền mẫu,

an toàn cho người phân tích

Tuy nhiên, phương pháp QuEChERS cần phải phối hợp với các kỹ thuật sắc ký có độnhạy và độ chính xác cao như GC- MS/MS hay LC- MS/MS Ảnh hưởng nền với một

số nền mẫu phức tạp còn lớn Để khắc phục vấn đề này, thông thường cần phải sửdụng đường chuẩn trên nền mẫu đối với các loại mẫu phức tạp [22]

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Bảng 1.5 Một số nghiên cứu xác định dư lượng thuốc BVTV bằng phương

pháp sắc ký lỏng trong nước và nước ngoài

Tác giả, năm Chất

phân tích

Nền mẫu Phương

pháp phân tích

Rau vàgừng

HPLCĐầu dò:

huỳnhquang

Độ thu hồi: 73- 95%

LOD: 0,51 – 5,0 ng/gLOQ: 1,69- 9,09 ng/g

Hoa quả

LC-MS/MS

Độ thu hồi: 87- 100,2%

LOD: 0,1- 0,2 ng/gLOQ: 0,4- 0,7 ng/g

Dượcliệu

MS/MS

MS/MS

LC-Độ thu hồi: 94- 102%

RSD < 10%

LOD: 0,006- 0,091 ng/gLOQ: 0,02- 0,314 ng/g

LC-MS/MS

Độ thu hồi: 59- 117 %RSD 4- 27 %

LOD: 0,03- 23,3 ng/gLOQ: 0,1- 78 ng/g

[43]

Rejczak T và

(2017)

30thuốcBVTV

HPLC-DAD

Độ thu hồi: 70-100 %RSD < 20 %

LOD: 0,01- 0,1 ng/gLOQ: 0,03- 1,08 ng/g

[51]

Jonghwa Lee

thuốcBVTV

Gạo, cam,rau

MS/MS

LC-Độ thu hồi: 70- 120 %RSD ≤ 20 %

LOQ: < 10 ng/g

[45]

Nhận xét: các nghiên cứu xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vât bằng phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được áp dụng từ rất lâu trên thế giới và ở Việt Nam

Ở Việt Nam phần lớn các nghiên cứu xác định dư lượng của thuốc BVTV này chỉđược thực hiện chủ yếu trên một nhóm thuốc BVTV Với sự phát triển cao của khoahọc công nghệ các loại thuốc BVTV ngày nay vô cùng phong phú và đa chủng loại.Trong thực tế sản xuất, để chống lại sự kháng thuốc của các loài địch hại, người nôngdân thường sử dụng cùng một lúc nhiều loại thuốc BVTV khác nhau, chẳng hạn đốivới thuốc BVTV người dân có thể sử dụng các loại thuốc lân hữu cơ, pyrethroid hoặccarbamat trong cùng một mùa vụ Vì vậy, việc xác định tồn dư các thuốc BVTV trongmôi trường ngày nay thường được phát triển theo hướng xác định đồng thời nhiềunhóm thuốc BVTV có thể có trong cùng một mẫu Điều này có một ý nghĩa lớn, đápứng yêu cầu thực tế và tiết kiệm được thời gian, hoá chất

Các nghiên cứu đa dư lượng thuốc BVTV hiện nay đã được thực hiện và công bố tạinhiều nơi trên thế giới Các nghiên cứu đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời vàichục đến hàng trăm thuốc BVTV thuộc các nhóm khác nhau Tuy nhiên, các nghiêncứu hiện nay, vẫn chưa có nghiên cứu thực hiện phân tích đồng thời 10 thuốc BVTV(abamectin, alpha- cypermethrin, acetamiprid, chlorpyrifos- ethyl, chlorpyrifos-methyl, chlorantraniliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon) trên nềnmẫu rau Do đó, đề tài cần được tiến hành được thực hiện để có biện pháp thích hợplàm giảm các tác hại đến sức khoẻ người dân trong vùng nghiên cứu và vùng có điềukiện tương tự

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Chuẩn đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu

Chất chuẩn đối chiếu: 10 chất abamectin, alpha- cypermethrin, acetamiprid,chlorpyrifos- ethyl, chlorpyrifos- methyl, chlorantraniliprol, fenobucarb, fipronil,thiamethoxam, trichlorfon và 2 nội chuẩn triphenyl phosphat (TPP) và chlorpyrifosd10 (CPR d10)

Bảng 2.1 Thông tin về các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu

TT Chất chuẩn Hãng cung cấp Độ tinh

khiết (%) Mã sản phẩm Số lô

1 Abamectin Dr.Ehrenstorfer 97,70 10001000 169575

2 Alpha- cypermethrin Dr.Ehrenstorfer 99,42 11890100 G122386

3 Acetamiprid Dr.Ehrenstorfer 99,72 10013000 G138925

4 Chlorpyrifos- ethyl Dr.Ehrenstorfer 99,89 11600000 G130559

5 Chlorpyrifos- methyl Dr.Ehrenstorfer 99,76 11601000 G125442

2.1.2 Mẫu thử nghiệm

Mẫu trắng: hỗn hợp 3 loại rau ăn lá sạch, không sử dụng thuốc trừ sâu bao gồm: cải

bẹ xanh, cải ngọt, cải xà lách xoong

Mẫu giả lập: thêm vào mẫu trắng dung dịch chuẩn nồng độ xác định

2.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Địa điểm nghiên cứu: Công ty trách nhiệm hữu hạn Warrantek số 44- 46Đường số 8, KDC 586, KV Thạnh Thuận, P Phú Thứ, Q Cái Răng, TP Cần Thơ

Amonium acetat (CH3COONH4) 98,0 Merck, Đức

Magnesi sulfat khan (MgSO4) 99,5 Merck, Đức

Natri acetat khan (CH3COONa) 99,0 Merck, Đức

Trinatri citrat dihydrat