Xây dựng quy trình định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp lc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ---PHẠM HOÀNG ANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-PHẠM HOÀNG ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN

TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-PHẠM HOÀNG ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN

TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN

PGS.TS PHAN THANH DŨNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Phạm Hoàng Anh

Ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất – Mã số: 8720210

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

Collagen là một loại protein cấu trúc phong phú nhất và có vai trò quan trọng trong

cơ thể động vật có vú Collagen được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như:

y học, dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm nên việc kiểm soát chất lượng collagen trongcác sản phẩm là điều cần thiết Tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu địnhlượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp LC-MS/MS Do vậy,cần nghiên cứu tìm quy trình định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS phù hợp đểxác định hàm lượng collagen có trong thực phẩm chức năng với yêu cầu dễ thực hiện,

độ nhạy cao và có khả năng ứng dụng tốt trên thực tế

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: các mẫu thực phẩm chức năng dạng rắn có chứa collagen Phương pháp nghiên cứu: định lượng collagen gián tiếp thông qua 4-hydroxyprolin,

không qua giai đoạn tạo dẫn chất Quy trình định lượng sử dụng kỹ thuật UPLC-MS/MS, nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) và kỹ thuật ghi phổ MRM Khảosát tìm điều kiện khối phổ và điều kiện sắc ký (pha tĩnh, pha động, chương trìnhgradient pha động, nồng độ đệm, nồng độ acid formic, tốc độ dòng, thời gian tái cânbằng cột) thích hợp để định lượng collagen Khảo sát tìm điều kiện thủy phân tối ưucho mẫu thử (nhiệt độ, thời gian, thể tích acid hydrocloric 6 N), sau đó được đemphân tích Thẩm định quy trình định lượng dựa trên quy định của AOAC và ICH

HILIC-Kết quả

Xác định được điều kiện khối phổ và điều kiện sắc ký thích hợp để định lượngcollagen trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HILIC-UPLC-MS/MS Quytrình thủy phân trong 6 giờ, nhiệt độ thủy phân 110 °C, thể tích acid hydroclorid 6 N

là 1 ml ứng với lượng cân 2 mg mẫu thử Quy trình thủy phân đạt được hiệu suất cao91,5% và được chứng minh có tính lặp lại, tính tuyến tính Quy trình đã được thẩmđịnh đạt tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng,miền giá trị Đã ứng dụng quy trình để định lượng collagen trong các mẫu thực phẩmchức năng trên thị trường

Kết luận

Đã xây dựng được quy trình định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằngphương pháp HILIC-UPLC-MS/MS với độ nhạy cao, có tính đặc hiệu và đơn giản.Quy trình đã được thẩm định và có khả năng ứng dụng trên thực tế để định lượngcollagen trong các mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường

Speciality: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210

A QUANTITATIVE METHOD FOR COLLAGEN

IN HEALTH SUPPLEMENTS BY LC-MS/MS

Pham Hoang Anh

Supervisor: Assoc Prof Dr NGUYEN THI NGOC VAN

Assoc Prof Dr PHAN THANH DUNG

Objects and method of study

Objects: solid health supplements containing collagen.

Method: quantitative analyze collagen through underivatised 4-hydroxyproline The

quantitative method uses HILIC-UPLC-MS/MS with electrospray ionization (ESI)and multiple reaction monitoring (MRM) transition to determine target substance.Optimize the mass spectrometry and liquid chromatography conditions (static phase,mobile phase, gradient program, buffer concentration, acid formic concentration,flow rate, re-equilibration for column) Investigate the optimum hydrolysisconditions for the sample (temperature, time, volume of acid hydrochloric 6 N).Validate of the quantitative method based on AOAC and ICH guidelines

Results

The method was optimized the mass spectrometry and liquid chromatographyconditions to determine collagen in health supplements by HILIC-UPLC-MS/MS.Hydrolyze 2 mg of sample in 6 hours, 110 ° C with 1 mL of acid hydrochloric 6 N.The hydrolysis process achieved a high efficiency of 91.5% and has beendemontrated repeatable, linear The method was validated for system suitability,specificity, linearity, repeatability, accuracy, analytical range It was applied themethod to quantify collagen in health supplements in market

Conclusions

This study has developed a HILIC-UPLC-MS/MS method for the determination of4-hydroxyproline to quantification collagen in health supplements The methodshowed a high sensitivity, specificity and simple Also, the method was validated andwas applied to quantify collagen in health supplements in market

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN 3

1.2 SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC (HILIC) 7

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG GHÉP ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ HAI LẦN TỨ CỰC (LC-MS/MS) 10

1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID AMIN 12

1.5 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 32

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CỦA QUY TRÌNH THỦY PHÂN COLLAGEN 43

3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 49

3.4 PHÂN TÍCH MẪU THỰC 54

3.5 DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 54

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 59

4.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 59

4.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CỦA QUY TRÌNH THỦY PHÂN COLLAGEN 62

4.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 63

4.4 PHÂN TÍCH MẪU THỰC 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Dimethylamino-azobenzensulfonyl clorid

Thuốc thử azobenzensulfonyl clorid

bản V

Dược điển Việt Nam phiênbản V

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography - Massspectrometry

Sắc ký lỏng hiệu năng caoghép đầu dò khối phổ

HPLC-MS/MS High performance liquid

chromatography - Tandem massspectrometry

Sắc ký lỏng hiệu năng caoghép đầu dò khối phổ hai lần

tứ cực

liquid chromatography

Sắc ký pha đảo dùng cặp ion

spectrometry

Sắc ký lỏng ghép đầu dò khốiphổ

-Tandem mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép đầu dò khốiphổ hai lần tứ cực

chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

UPLC-MS/MS Ultra performance liquid

chromatography- tandem massspectrometry

Sắc ký lỏng siêu hiệu năngghép đầu dò khối phổ hai lần

tứ cực

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các pha tĩnh thông dụng trong HILIC 9

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng collagen 14

Bảng 2.3 Thông tin về mẫu thử 17

Bảng 2.4 Danh mục các thiết bị sử dụng 19

Bảng 2.5 Danh mục các hóa chất sử dụng 20

Bảng 2.6 Các thông số khảo sát nguồn ion hóa điện tử 20

Bảng 2.7 Thông số cột BEH HILIC và cột BEH Amide 21

Bảng 2.8 Chương trình gradient khảo sát pha động 22

Bảng 2.9 Chương trình gradient khảo sát thời gian tái cân bằng cột 24

Bảng 2.10 Giá trị của các yếu tố khảo sát điều kiện thủy phân 25

Bảng 2.11 Bảng mô tả thí nghiệm khảo sát điều kiện thủy phân 25

Bảng 2.12 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính lặp lại của quy trình thủy phân 26

Bảng 2.13 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính tuyến tính của quy trình thủy phân 27

Bảng 2.14 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion 29

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát điều kiện khối phổ 33

Bảng 3.16 Thông số MRM phát hiện trans-4-Hydroxy-L-prolin 33

Bảng 3.17 Kết quả tiêm lặp lại 6 lần trên hai loại pha tĩnh 34

Bảng 3.18 Kết quả tiêm lặp lại của hệ pha động 3 và 4 39

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát gradient hệ 4 39

Bảng 3.20 Kết quả so sánh chương trình gradient pha động và chế độ đẳng dòng

40

Bảng 3.21 Kết quả khảo sát nồng độ đệm 41

Bảng 3.22 Kết quả tiêm lặp lại 6 lần trên hệ 4.2 và hệ 4.3 41

Bảng 3.23 Kết quả tiêm lặp lại 10 lần trên hệ 4.2 và hệ 4.3 41

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát tốc độ dòng 42

Bảng 3.25 Kết quả khảo sát thời gian tái cân bằng cột 42

Bảng 3.26 Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân collagen 43

Bảng 3.27 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính lặp lại của quy trình thủy phân collagen

45

Bảng 3.28 Kết quả thủy phân 3 mẫu chuẩn collagen cùng nồng độ 46

Bảng 3.29 Kết quả thủy phân 6 mẫu chuẩn collagen riêng biệt 46

Bảng 3.30 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính tuyến tính của quy trình thủy phân collagen 47

Bảng 3.31 Kết quả tính tuyến tính của quy trình thủy phân collagen 47

Bảng 3.32 Kết quả hiệu suất quy trình thủy phân collagen 48

Bảng 3.33 Kết quả tính tương thích hệ thống 49

Bảng 3.34 Kết quả độ lặp lại 52

Bảng 3.35 Kết quả độ đúng 53

Bảng 3.36 Kết quả phân tích mẫu thực 54

Bảng 4.37 Yêu cầu của quy trình phân tích định lượng sử dụng đầu dò MS 63

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của collagen 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo: (A) trans-4-Hydroxy-L-prolin; (B) dạng ion lưỡng tính

của trans-4-Hydroxy-L-prolin; (C) dạng cation của trans-4-Hydroxy-L-prolin; (D) dạng anion của trans-4-Hydroxy-L-prolin 5

Hình 1.3 HILIC kết hợp nguyên lý của 3 kỹ thuật sắc ký lỏng 7 Hình 1.4 Cơ chế lưu giữ trong HILIC 8 Hình 1.5 Sơ đồ khối hệ thống LC-MS/MS: (1) Hệ thống sắc ký lỏng, (2) Nguồn ion

hóa, (3) Tứ cực thứ nhất, (4) Buồng va chạm, (5) Tứ cực thứ hai, (6) Bộ phận pháthiện và ghi nhận kết quả 10

Hình 1.6 Ảnh thực tế hệ sắc ký lỏng Acquity UPLC® H class (Waters) kết hợp đầu

dò TQ Detector 12

Hình 2.7 (A) Lọ chất chuẩn trans-4-Hydroxy-L-prolin; (B) Lọ chất chuẩn collagen

17

Hình 3.8 Phổ khối: (A) ion mẹ của trans-4-Hydroxy-L-prolin (m/z = 131,9); (B) 2

mảnh ion con của trans-4-Hydroxy-L-prolin (m/z = 85,9 và m/z = 67,7) 32

Hình 3.9 Sắc ký đồ khảo sát pha tĩnh: (A) cột BEH HILIC; (B) cột BEH Amide

Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát hệ 3: (A) gradient 1; (B) gradient 2; (C) gradient 3;

(D) gradient 4; (E) gradient 5 37

Hình 3.13 Sắc ký đồ khảo sát hệ 4: (A) gradient 1; (B) gradient 2; (C) gradient 3;

(D) gradient 4; (E) gradient 5 39

Hình 3.14 Đường chuẩn đánh giá tính tuyến tính của quy trình thủy phân collagen

do phần mềm MassLynx®4.1 xây dựng 47

Hình 3.15 Đường chuẩn đánh giá hiệu suất của quy trình thủy phân collagen do phần

mềm MassLynx®4.1 xây dựng 48

Hình 3.16 Sắc ký đồ tính đặc hiệu: (A) Mẫu trắng; (B) Mẫu chuẩn collagen; (C) Mẫu

chuẫn Hydroxy-L-prolin; (D) Mẫu giả lập; (E) Mẫu giả lập + chuẩn

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 44 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân 44 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của thể tích acid hydroclorid 6 N 45

MỞ ĐẦU

Protein cấu trúc là loại protein đóng vai trò rất quan trọng trong thành phần cấu tạocủa cơ thể, giúp hình thành cấu trúc của tế bào, mô và các cơ quan Một trong nhữngprotein cấu trúc quan trọng nhất, phong phú nhất trong cơ thể động vật có vú làcollagen Đối với da, collagen có vai trò liên kết và tạo sự đàn hồi Với cơ xươngkhớp, nó là thành phần cấu tạo và đảm bảo chức năng vận động của cơ thể Ngoài ra,collagen còn có vai trò quan trọng trong nhiều cơ quan khác như mạch máu, răng,tóc Trong cơ thể, collagen chiếm khoảng một phần ba lượng protein, ba phần tư trọnglượng khô của da và được tìm thấy có trong mô liên kết, mô cơ, xương, dây chằng,sụn, da, mạch máu, răng Cho đến nay, có 28 loại collagen khác nhau đã được xácđịnh [12], [14]

Collagen được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: y học, dược phẩm, mỹphẩm, thực phẩm Nhiều thực phẩm chức năng có chứa collagen với các dạng bàochế như viên uống, dung dịch uống nhằm giúp tăng độ đàn hồi của da Collagen cũng

là một thành phần có trong nhiều mỹ phẩm dùng cho da với nhiều cách sử dụng nhưtiêm vào lớp hạ bì, bôi hoặc đắp lên da, tắm, ngâm Bên cạnh đó, collagen còn được

sử dụng trong công nghệ thực phẩm như là chất đông, chất gây lắng trong sản xuấtbánh kẹo, sản xuất sữa, sản xuất đồ uống, chế biến thịt

Chính vì được sử dụng rộng rãi nên việc kiểm soát chất lượng collagen trong các sảnphẩm là điều cần thiết Tuy nhiên, DĐVN V và một số Dược điển tham chiếu như

BP năm 2017, USP 40 năm 2017 không có chuyên luận collagen [1], [42], [43] Một

số phương pháp được sử dụng để phân tích xác định collagen như: kiểm tra nhiệt độbiến tính, định lượng bằng phương pháp đo quang, phương pháp quang phổ hồngngoại và phổ biến nhất là sắc ký lỏng Tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứuđịnh lượng collagen trên nền mẫu thực phẩm chức năng áp dụng phương pháp LC-MS/MS Do vậy, cần nghiên cứu tìm quy trình định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS phù hợp để xác định hàm lượng collagen có trong thực phẩm chức năng vớiyêu cầu có tính đặc hiệu, độ nhạy, độ chính xác cao, đơn giản và có khả năng ứngdụng tốt trên thực tế

Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình

định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp MS/MS” Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là:

LC-1 Tìm điều kiện sắc ký định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phươngpháp LC-MS/MS

2 Tìm điều kiện tối ưu để thủy phân collagen trong thực phẩm chức năng

3 Thẩm định quy trình định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phươngpháp LC-MS/MS

4 Ứng dụng quy trình đã thẩm định để xác định hàm lượng collagen có trong một sốchế phẩm thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN

Collagen là một loại protein cấu trúc có trong cơ thể động vật Nghiên cứu của M.D.

Shoulders và cộng sự cho thấy collagen là protein phong phú nhất, chiếm ba phần tư

trọng lượng khô của da và chiếm khoảng một phần ba lượng protein trong cơ thể độngvật có vú [36] Collagen được tìm thấy có trong da, mô cơ, xương, dây chằng, sụn,mạch máu, răng và đóng vai trò thực hiện một loạt các chức năng sinh học quan trọng

ở những nơi mà nó có mặt mặc dù tỷ lệ phân bố của collagen ở các mô và cơ quan làkhông giống nhau Cho đến nay đã xác định được 42 gen mã hóa cho 28 loại collagenkhác nhau trong đó collagen type I được tìm thấy nhiều nhất ở động vật [14], [16]

1.1.1 Thành phần, cấu trúc và chức năng của collagen

Thành phần

Collagen được tạo thành từ các acid amin, trong đó đặc biệt là hàm lượng của prolin

và 4-hydroxyprolin cao hơn so với các loại protein khác Theo nghiên cứu của M.E.

Nimni và cộng sự [26], acid amin có trong collagen người nhiều nhất là glycin chiếm

khoản 33%, tiếp theo là prolin và 4-hydroxyprolin mỗi acid amin chiếm khoản 10%.Một số acid amin khác cũng được tìm thấy trong collagen là alanin, acid glutamic,acid aspartic, 3-hydroxyprolin, arginin, serin, threonin, lysin, leucin, isoleucin,tyrosin, phenylalanin, methionin, histidin [26]

Cấu trúc

Phân tử collagen là một protein dạng sợi gồm ba chuỗi polypeptid α Các chuỗi nàyphân biệt với nhau về thành phần và tỷ lệ acid amin Cấu trúc của chuỗi polypeptid α

đặc trưng bởi sự lặp lại của các bộ ba acid amin là (Gly-X-Y)n Thông thường X là

prolin và Y là 4-hydroxyprolin Bộ ba acid amin (Gly-Pro-Hyp) là loại phổ biến nhấttrong collagen, chiếm khoản 10% [26] Trong không gian, mỗi chuỗi polypeptid αđược sắp xếp theo đường xoắn ốc về bên trái Sau đó, ba chuỗi xoắn polypeptid α sẽliên kết với nhau nhờ các liên kết hydro và xoắn về bên phải Sự xoắn theo hai chiềunày tạo nên cấu trúc bền vững của collagen Nhiều phân tử collagen kết hợp với nhauthành sợi nhỏ collagen (microfibril), nhiều sợi nhỏ kết hợp với nhau tạo thành sợi

collagen (fibril) và nhiều sợi collagen kết hợp với nhau tạo thành bó sợi collagentham gia vào chức năng liên kết của collagen (fiber).

Hình 1.1 Cấu trúc của collagen

Ngoài ra, các phân tử collagen còn có thể liên kết ở dạng không tạo thành bó sợi fibrillar collagen) Dạng cấu trúc này có thể là dạng mạng (collagen type IV), mạng

(non-6 cạnh (collagen type VIII, X), dạng sợi với hai đầu có hình dạng mỏ neo (collagentype VII), dạng sợi với hai đầu tròn xếp chồng lên nhau (collagen type VI) [12], [14]

Chức năng

Chức năng quan trọng nhất của collagen là chức năng cơ học, đó là khả năng duy trìmột hình dạng trong giới hạn hoạt động bình thường của cơ quan hoặc mô dưới tácđộng bên ngoài Ví dụ như sự thay đổi lớn về kích thước của tử cung trong thai kỳ,khả năng chịu áp lực cực lớn của động mạch, tác dụng của sụn giúp giảm chấn động

và cọ xát giữa hai đầu xương khi cử động khớp… đều có được nhờ vào chức năng cơhọc của khung collagen

Ngoài ra, collagen còn có chức năng lưu trữ năng lượng ở lớp da, các dây chằng vàgân Chức năng này giúp tạo cho da khả năng hấp thụ và phân tán năng lượng khi cólực tác động vào, giảm tác động của lực hấp dẫn khi cơ thể vận động Một chức năngkhác của collagen là khả năng thay đổi kích thước và tính chất cơ học của các tế bào,như trong trường hợp các tế bào da và tử cung phải thay đổi kích thước, hình dạng vàtính chất cơ học để thích nghi với sự lớn lên từng ngày của bào thai

Sợi collagen

Phân tửcollagen

Chuỗi polypeptid α

Sợi nhỏ collagen

Bó sợi collagen

Chuỗi xoắn ba

1.1.2 Hydroxyprolin

Hydroxyprolin là một dẫn xuất acid amin không thiết yếu được hình thành trong quátrình biến đổi protein sau dịch mã Nó đóng vai trò ổn định cấu trúc xoắn của collagenbằng cách tạo liên kết hydro với các acid amin khác Trong collagen, hydroxyprolinđược tìm thấy có 2 đồng phân là 4-hydroxyprolin và 3-hydroxyprolin, tuy nhiên hàmlượng của 3-hydroxyprolin là rất thấp, khoản 0,2% [26] Ngoài collagen, 4-hydroxyprolin cũng được tìm thấy trong elastin nhưng với tỷ lệ thấp hơn nhiều Tronghỗn hợp đồng lượng của collagen và elastin, 4-hydroxyprolin từ collagen chiếm93,2% và 4-hydroxyprolin từ elastin đóng góp 6,8% [39]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo: (A) trans-4-Hydroxy-L-prolin; (B) dạng ion lưỡng

tính của trans-4-Hydroxy-L-prolin; (C) dạng cation của trans-4-Hydroxy-L-prolin;

(D) dạng anion của trans-4-Hydroxy-L-prolin.

4-hydroxyprolin

Danh pháp IUPAC: (2S,4R)-4-hydroxypyrrolidin-2-carboxylic acid

Công thức phân tử: C5H9NO3

Khối lượng phân tử: 131,131 g/mol

Tính tan: rất tan trong nước, hơi tan trong rượu, không tan trong ether [18]

pKa: pKa1 = 1,82 pKa2 = 9,65

(B) (A)

Điểm đẳng điện: pHi = 5,73

4-hydroxyprolin có dạng tinh thể không màu, phân tử có tính quang hoạt Trong tự

nhiên, 4-hydroxyprolin tồn tại ở dạng l-hydroxyprolin, hay

trans-4-Hydroxy-L-prolin Đây cũng là dạng sử dụng có sẵn trên thị trường [18] Ở điểm đẳng điện (pH

= pHi), 4-hydroxypolin tồn tại ở cả 3 dạng cation, anion và ion lưỡng tính và khả nănghòa tan là thấp nhất Ở pH ≤ pKa1, 4-hydroxyprolin chuyển hoàn toàn thành dạngcation Ở pH ≥ pKa2, 4-hydroxyprolin chuyển hoàn toàn thành dạng anion

4-hydroxyprolin là một acid amin đặc trưng của collagen với hàm lượng từ 12-14%[26], [39] Do hàm lượng cao và tính đại diện đặc trưng nên 4-hydroxyprolin đã được

sử dụng để xác định lượng collagen có trong mô hoặc các mẫu sinh học [11], [30]

“Plasma expander” có chứa khoảng 3,5 – 5,5% collagen

- Đặc biệt trong kỹ thuật nội soi, collagen hydrolysat được ứng dụng để bôi trơn cácống nội soi, giúp dễ dàng đưa các ống này vào cơ thể bệnh nhân mà không gây đau

- Collagen được dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ tạo hình như bơm môi, căng da mặt

Trong dược phẩm:

Collagen được sử dụng khá nhiều nhờ các đặc tính kết dính, dẻo dai, được hấp thụ dễdàng vào trong cơ thể và không gây dị ứng

- Sản phẩm thủy phân của collagen là gelatin được sử dụng để sản xuất vỏ viên nang

- Là một chất keo bảo vệ các thành phần nhạy cảm khỏi tác động của sự oxy hóa ánhsáng, sự hấp thụ ẩm; tạo mùi vị trung hòa; là chất ổn định của hệ nhũ tương, hỗn dịch

- Là chất tạo bọt trong sản xuất chất bọt cầm máu

Trong thực phẩm:

Collagen được dùng làm nguyên liệu sản xuất nhiều loại thực phẩm chức năng đượcgiới thiệu giúp tăng độ đàn hồi cho da, căng mịn da, giảm vết nhăn, ngăn ngừa quátrình hình thành lão hóa da, giúp hỗ trợ cho tóc chắc khỏe và hạn chế rụng tóc Thựcphẩm chức năng collagen được bào chế ở nhiều dạng như viên uống, nước uống, bộtpha uống với thành phần đơn chất hay kết hợp với các chất khác

Collagen còn được dùng để làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, chất phụ gia trongsản xuất sữa, làm sạch rượu vang, bia và nước trái cây

1.2 SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC (HILIC)

Sắc ký lỏng tương tác thân nước (Hydrophilic

interaction chromatography - HILIC) là kỹ thuật

sắc ký lỏng cho khả năng lưu giữ và phân tách

hiệu quả các hợp chất phân cực và có tính thân

nước từ trung bình đến cao HILIC sử dụng các

pha tĩnh thân nước giống như sắc ký lỏng pha

thuận (NPLC) kết hợp với pha động là hỗn hợp

nước và dung môi hữu cơ phân cực thường được

sử dụng trong sắc ký lỏng pha đảo (RPLC) Hơn

nữa, HILIC còn có thể lưu giữ và tách các hợp

chất ion hóa mà thông thường phải sử dụng sắc ký trao đổi ion (IEC) hoặc sắc ký phađảo dùng cặp ion (IP-RPLC) [33] Hiện nay, HILIC cho thấy nhiều ứng dụng trongphân tích amino acid, peptid, carbohydrat, kháng sinh… [13], [23]

Cơ chế lưu giữ:

Khả năng tách trong HILIC dựa trên việc sử dụng pha tĩnh thân nước kết hợp với phađộng là hỗn hợp dung môi hữu cơ – nước với hàm lượng dung môi hữu cơ cao Cácnhóm chức thân nước trên bề mặt của pha tĩnh lưu giữ mạnh các phân tử nước từ phađộng, tạo thành một lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh Do đó, một chất phântích phân cực hòa tan trong pha động sẽ được phân bố và lưu giữ giữa hai pha lỏng:lớp nước hấp phụ cố định trên bề mặt của pha tĩnh và lớp pha động giàu dung môihữu cơ Ngoài ra sự lưu giữ còn có thể do liên kết hydro giữa các nhóm chức phâncực của chất phân tích và pha tĩnh, tương tác tĩnh điện trên các nhóm chức ion hóacủa chất phân tích và pha tĩnh, lực van der Waals giữa các phần kỵ nước của pha tĩnh(hoặc nhóm siloxan, ở nồng độ dung môi hữu cơ rất thấp) và phần không phân cựccủa chất phân tích cũng được ghi nhận [9], [33]

Hình 1.4 Cơ chế lưu giữ trong HILIC

Pha tĩnh:

Các vật liệu được sử dụng làm pha tĩnh trong HILIC có hai đặc tính Một là có tínhthân nước để tạo lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh, hai là có thể tương tác cụ thểvới chất phân tích góp phần vào việc lưu giữ Các pha tĩnh silica đã được sử dụng

Tương táctĩnh điện

Tương tácthân nước

Liên kết hydro

Pha độngvới lượngdung môihữu cơ cao

Lớp nước hấp

phụ trên bề

mặt pha tĩnh

rộng rãi trong phân tách HILIC Các nhóm silanol bề mặt đóng vai trò chính cho khảnăng hấp phụ nước của bề mặt silica Tuy nhiên, tính acid của các nhóm silanolthường dẫn đến kết quả pic bị kéo đuôi khi chất phân tích có tính base Vì vậy cácpha tĩnh silica dẫn xuất được tạo ra bằng cách gắn thêm các nhóm chức hóa học trên

bề mặt để khắc phục tình trạng này, như pha tĩnh silica dẫn xuất trung tính, cationhoặc anion và ion lưỡng tính (zwiterionic) [28] Hiện nay có rất nhiều loại pha tĩnhHILIC có sẵn trên thị trường như silica không dẫn xuất, silica dẫn xuất với các nhómchức có độ phân cực khác nhau như nhóm amin, diol, amide, cyano, sulfobetaine

Bảng 1.1 Các pha tĩnh thông dụng trong HILIC [9]

và nước là dung môi rửa giải mạnh nhất Thứ tự rửa giải tăng dần [9]:

tetrahydrofuran < acetone < acetonitrile < isopropanol < ethanol < methanol < nướcHàm lượng nước của pha động trong HILIC thường dao động từ 5 – 40% Hàm lượngnước cao hơn có thể làm giảm đáng kể hoặc thậm chí ngăn cản sự lưu giữ các chấttan phân cực Tuy nhiên, một lượng nhỏ nước (tối thiểu là 2%) bắt buộc phải có trongpha động để tạo thành một lớp giàu nước trên bề mặt của pha tĩnh phân cực, đảm bảokhả năng lưu giữ các chất phân tích phân cực [33] Bên cạnh tính chất hóa học củapha tĩnh, một số yếu tố liên quan đến pha động như bản chất của dung môi hữu cơ,

pH, độ mạnh và nồng độ dung dịch đệm, tính chất và nồng độ chất thêm vào, đều cóảnh hưởng đáng kể đến khả năng lưu giữ và rửa giải chất phân tích trong HILIC.Trong các hướng dẫn chung về HILIC, thành phần muối đệm được thêm vào phađộng để giảm hiện tượng kéo đuôi và/hoặc kém lưu giữ các chất phân tích Nhiềunghiên cứu cho thấy nếu không có muối đệm dẫn đến thời gian lưu dài hơn và cácđỉnh rất rộng trên cột amide, cyclodextrin, cyano, amino [9], [28] Do khả năng hòatan tốt trong dung môi hữu cơ, nên các dung dịch đệm dùng trong HILIC là muốiamoni của acid acetic, acid formic Chất thêm vào pha động có thể là acid formic,acid acetic, ammoni hydroxid, triethylamin Những muối đệm và các chất thêm vàonày có ưu điểm là dễ bay hơi kết hợp với pha động có thành phần dung môi hữu cơcao nên HILIC có thể dễ dàng kết hợp với đầu dò khối phổ trong LC-MS hoặc LC-MS/MS [23], [35]

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG GHÉP ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ HAI LẦN

TỨ CỰC (LC-MS/MS)

Hình 1.5 Sơ đồ khối hệ thống LC-MS/MS: (1) Hệ thống sắc ký lỏng, (2) Nguồn

ion hóa, (3) Tứ cực thứ nhất, (4) Buồng va chạm, (5) Tứ cực thứ hai, (6) Bộ phận

phát hiện và ghi nhận kết quả

Sắc ký lỏng là phương pháp sắc ký tách các chất dựa trên sự phân bố khác nhau củachúng giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau, trong đó pha động là một chất lỏng chảyqua pha tĩnh được giữ cố định [2].

1.3.1 Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) là kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏngđược hãng Waters phát triển và giới thiệu vào năm 2004 Kỹ thuật này đang đượcứng dụng ngày càng rộng rãi Ưu điểm của UPLC là tăng độ phân giải, tăng độ nhạy,tăng độ chọn lọc, độ nhạy, độ lặp lại cũng như độ tái lập, giảm thời gian phân tíchmẫu và giảm lượng dung môi sử dụng Sự tăng hiệu năng là do thay đổi về sự phântán nhờ sử dụng cỡ hạt pha tĩnh < 2 µm, tốc độ dòng thấp giúp giảm sự mở rộng dãi(giảm chiều rộng pic ở đáy) Đường kính trong của cột nhỏ, chiều dài ống mao quảngiảm, bộ phận kết nối thiết bị, thể tích tế bào dòng của đầu dò nhỏ là những yếu tốlàm giảm sự phân tán hệ thống Việc sử dụng UPLC sẽ giúp giảm chi phí cho một lầnphân tích nhờ thời gian phân tích ngắn, giảm lượng dung môi sử dụng, đồng thời kếtquả phân tích đáng tin cậy hơn

1.3.2 Khối phổ

Đầu dò khối phổ là đầu dò có độ nhạy cao và độ chọn lọc cao Ngoài thông tin sắc ký

đồ, khối phổ (MS) còn có thế cung cấp các thông tin về phổ khối lượng của từng chấtnên rất phù hợp để ứng dụng trong phân tích các chất trong nền mẫu phức tạp nhưthực phẩm (protein) [1] Khối phổ gồm có ba bộ phận chính là nguồn ion hóa, bộphân tích khối và bộ phận phát hiện Mẫu sau khi được chiết tách từ hệ thống sắc kýlỏng được đưa vào khối phổ, sau đó sẽ được ion hóa trong nguồn ion hóa rồi được

chuyển đến bộ phận phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z Các ion

được bộ phận phát hiện thu nhận, chuyển tín hiệu vào máy tính để xử lý

Một số cách tạo ion thường được áp dụng là: ion hóa phun điện tử (ESI); ion hóa hóahọc ở áp suất khí quyển (APCI); ion hóa hóa học (CI) và ion hóa bằng photon tại ápsuất khí quyển (APPI) Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI thường được sử dụngnhiều nhất trong LC-MS, LC-MS/MS

ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất dễ phân ly, tan trongdung dịch có khối lượng phân tử lớn [1] ESI có khả năng tạo thành ion dương hoặc

ion âm hoặc cả ion dương và ion âm tùy thuộc vào điện thế được áp vào ESI đượcxem là kỹ thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinhhọc như protein, peptide, nucleotide…

1.3.3 Sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép đầu dò khối phổ hai lần tứ cực MS/MS)

(UPLC-Sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép đầu dò khối phổ hai lần tứ cực (UPLC-MS/MS)được xem là một trong những công cụ phân tích mạnh nhất hiện nay cho độ nhạy cao(đến fg/ml), độ chính xác và tính đặc hiệu cao Kỹ thuật này được ứng dụng trongphân tích mẫu dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm, độc chất học, dược động học… đặcbiệt là phân tích mẫu protein trong thực phẩm do khả năng cung cấp nhiều thông tin

về hợp chất thông qua việc kiểm soát những ion mẹ, ion con, mảnh trung hòa

Hình 1.6 Ảnh thực tế hệ sắc ký lỏng Acquity UPLC® H class (Waters) kết hợp

với đầu dò TQ Detector

1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID AMIN

Phân tích acid amin là một kỹ thuật phân tích rất cần thiết và đã được nghiên cứu từlâu trên thế giới Phương pháp phân tích acid amin là phương pháp xác định thànhphần và hàm lượng các acid amin có trong protein và peptid Trong DĐVN V, phươngpháp phân tích acid amin được quy định tại phụ lục 10.11 [1]

Một yêu cầu quan trọng của việc phân tích acid amin là đảm bảo độ lặp lại của kếtquả Đánh giá tính lặp lại của kết quả bằng cách tiến hành đo mẫu dung dịch chuẩncác acid amin nhiều lần (6 lần hoặc nhiều hơn) [1]

Trước khi phân tích acid amin cần tiến hành thủy phân protein hoặc peptid thành cácacid amin Có nhiều kỹ thuật thủy phân, trong đó thủy phân bằng acid là phương phápthông dụng nhất Trong phụ lục 10.11 của DĐVN V nêu 11 kỹ thuật thủy phân protein

như: thủy phân bằng acid hydrocloric 6 M chứa 0,1% - 1% phenol, thủy phân bằng

acid mercaptoethansulfonic (MESA)…[1]

Để tách và phát hiện các acid amin, thường dùng kỹ thuật sắc ký lỏng với các đầu dòkhác nhau tùy theo yêu cầu độ nhạy của phương pháp Các đầu dò thường sử dụng làđầu dò hấp thu tử ngoại, đầu dò huỳnh quang, đầu dò khối phổ

Việc tách và phát hiện acid amin tự do có thể bằng sắc ký lỏng trao đổi ion rồi tạodẫn chất sau cột phân tách Hoặc có thể tạo các dẫn chất trước cột rồi tách bằng sắc

ký lỏng pha đảo Các thuốc thử tạo dẫn chất thường dùng như ninhydrin, phthalaldehyd (OPA), 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat (AQC),phenylisothiocyanat (PITC), dimethylamino-azobenzensulfonyl clorid (DABS-Cl),9-fluorenylmethyl cloroformat (FMOC-Cl)… [5], [6], [12], [34], [38]

ortho-Một kỹ thuật phân tích acid amin hiện đại không cần tạo dẫn chất đó là sử dụng sắc

ký lỏng ghép đầu dò khối phổ [19], [48] Việc phát hiện acid amin sẽ dựa trên khốilượng phân tử của chính acid amin cần phân tích, đạt độ nhạy và tính đặc hiệu cao

1.5 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN

Việc xác định hàm lượng collagen được thực hiện thông qua việc xác định hàm lượng4-hydroxyprolin do 4-hydroxyprolin là một acid amin chiếm tỷ lệ cao và đặc trưngcủa collagen [11], [30] Nguyên tắc chung là thủy phân collagen trong điều kiện thíchhợp, sau đó định lượng 4-hydroxyprolin giải phóng ra sau quá trình thủy phân Từlượng 4-hydroxyprolin suy ra hàm lượng collagen có trong mẫu

Định lượng 4-hydroxyprolin đã được nghiên cứu từ thập niên 50 thế kỷ XX [24] Banđầu, phương pháp được sử dụng để định lượng 4-hydroxylrolin là phương pháp tạomàu đo quang Sau đó, phương pháp phổ biến được sử dụng là HPLC với các đầu dò

khác nhau Năm 2005, Xiaohong Bi và cộng sự đã cho thấy FT-IR có thể được sử

dụng để dự đoán lượng collagen ở các vùng khác nhau của sụn [7] Tuy nhiên, phươngpháp FT-IR chỉ là phương pháp bán định lượng và thường được sử dụng trong chẩnđoán bệnh lý

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng collagen

công bố

Phương phápđịnh lượng

Tài liệutham khảoRobert E.Newman, Milan A

Edward J Miller, Annie J

Sắc ký lỏng (tạo dẫn chấtvới FMOC-Cl) – đầu dòhuỳnh quang

[22]

X Bi, G.Li, S B Doty and N

Guifeng Zhang, Aimei Sun,

Statis Pataridis, Adam

Eckhardt, Katerina

Mikulíková, Pavla Sedláková,

Ivan Miksík

Michelle L.Colgrave, Peter G

Anna S F Marques, Helio A

Martins-Júnior, and Takeo

Sakuma

Ariane Nimptsch, Stephanie

Schibur, Christian Ihling,

Andrea Sinz, Thomas Riemer,

Daniel Huster, Jürgen Schiller

S W Polly Chan, John Greaves,

Nancy A Da Silva and

Szu-Wen Wang

Tobias Langrock and Ralf

HPLC với đầu dò UV và

Bing Qiu, Fengxiang Wei,

Xiuzhi Sun, Xi Wang, Binhong

Duan, Chunlin Shi, Jianying

Zhang, Jiye Zhang, Wenliang

Qiu, Wenling Mu

Yuki Taga, Masashi Kusubata,

Kiyoko Ogawa-Goto, and

Shunji Hattori

Bilgin Vatansever, Burcu

Cassia Maria Lins da Silva,

Eliani Spinelli, Silvana Vianna

Rodrigues

HPLC (tạo dẫn chất vớiAQC) - đầu dò huỳnhquang

4-Với sắc ký lỏng pha đảo, việc định lượng hydroxyprolin có thể sử dụng đầu dò hấpthu tử ngoại hoặc huỳnh quang Tuy nhiên phương pháp định lượng collagen này đòihỏi việc xử lý mẫu phải có thêm bước tạo dẫn chất, hoặc gắn marker tương đối phứctạp Vì vậy nhược điểm là tốn thời gian dài hơn, cần thuốc thử hóa chất riêng và cóthể làm tăng độ không đảm bảo đo của phương pháp

Sắc ký lỏng ghép khối phổ đã được nhiều tác giả sử dụng để định lượng collagen Ưuđiểm của phương pháp này là không cần phải tạo dẫn chất nên rút ngắn được giaiđoạn xử lý mẫu, có độ chính xác và độ đặc hiệu cao Đặc biệt với đầu dò khối phổ,

có thể định lượng được từng type collagen cụ thể [30], [47]

Tại Việt Nam, nghiên cứu định lượng collagen chưa được quan tâm nhiều Chúng tôichỉ tìm được một tài liệu tiếng Việt của tác giả Vũ Thị Trà (năm 2015) về định lượngcollagen Nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Trà đã xây dựng được quy trình xác địnhcollagen bằng phương pháp HPLC kết hợp đầu dò huỳnh quang Hàm lượng collagenđược xác định thông qua định lượng 4-hydroxyprolin tạo dẫn chất với AQC Quytrình định lượng gồm 3 giai đoạn: thủy phân mẫu, tạo dẫn chất và tiến hành sắc ký.Quy trình đã được thẩm định và áp dụng để xác định hàm lượng collagen trong một

số mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường Tuy nhiên theo tác giả, nghiên cứu mớidừng lại ở ứng dụng thực tế trên một số ít thực phẩm chức năng, thời gian xử lý mẫukhá dài (24 giờ) và phải có giai đoạn tạo dẫn chất với AQC Do đó cần được nghiêncứu tối ưu hóa sâu hơn nữa [3]

Kết luận: nghiên cứu định lượng collagen đã được thực hiện từ khoản thập niên 50

thế kỷ XX với phương pháp ban đầu là đo quang Hiện nay các công trình nghiên cứuđịnh lượng collagen chủ yếu là dùng phương pháp sắc ký lỏng với nhiều kỹ thuật nhưsắc ký trao đổi ion tạo dẫn chất sau cột, sắc ký lỏng pha đảo tạo dẫn chất trước cột,sắc ký rây phân tử Tuy nhiên vấn đề xử lý mẫu còn phức tạp HILIC rất phù hợp đểphân tích chất 4-hydroxyprolin trong collagen Sự kết hợp HILIC và sắc ký lỏng sửdụng đầu dò khối phổ sẽ giúp giai đoạn xử lý mẫu đơn giản hơn, tiết kiệm được thờigian và chi phí, đổng thời đảm bảo tính đặc hiệu, độ nhạy, độ chính xác cao của quytrình phân tích DĐVN V, BP năm 2017, USP 40 năm 2017, không có chuyên luậncollagen [1], [42], [43] Tại Việt Nam hiện chưa có công trình nghiên cứu xây dựngquy trình định lượng collagen trong thực phẩm chức năng sử dụng phương pháp LC-

MS/MS Điều đó cho thấy đề tài “Xây dựng quy trình định lượng collagen trong

thực phẩm chức năng bằng phương pháp LC-MS/MS” là cấp thiết Vì vậy chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu này

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu chuẩn

Chất chuẩn trans-4-Hydroxy-L-prolin đạt tiêu chuẩn phân tích (hàm lượng ≥ 99%),

số lô BCBR6572V của nhà cung cấp Sigma-Aldrich

Chất chuẩn Collagen, Bovine, type I đạt tiêu chuẩn phân tích (hàm lượng ≥ 96%), số

lô 7584 của nhà cung cấp Advanced BioMatrix

Hình 2.7 (A) Lọ chất chuẩn trans-4-Hydroxy-L-proline; (B) Lọ chất chuẩn collagen

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quy trình định lượng collagen được xây dựng dựa trên nguyên tắc định lượng trựctiếp 4-hydroxyprolin không qua giai đoạn tạo dẫn chất, từ hàm lượng 4-hydroxyprolinsuy ra hàm lượng collagen nhờ hệ số chuyển đổi 4-hydroxyprolin được định lượngbằng kỹ thuật sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) trên hệ thống sắc ký lỏng siêuhiệu năng Acquity UPLC® H class với đầu dò khối phổ hai lần tứ cực TQ Dectector

được trang bị nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) Hệ thống phân tích sử dụng kỹ thuậtghi phổ MRM, giúp xác định và định lượng chất phân tích 4-hydroxyprolin

Điều kiện sắc ký để định lượng collagen bằng phương pháp LC-MS/MS được xácđịnh sau khi khảo sát điều kiện khối phổ và khảo sát điều kiện sắc ký

Để khảo sát điều kiện sắc ký định lượng collagen bằng phương pháp LC-MS/MS,

tiến hành chuẩn bị dung dịch chuẩn trans-4-Hydroxy-L-prolin:

- Dung dịch chuẩn gốc (nồng độ 1.000 µg/mL hay 1.000 ppm): Cân 0,0100 g chuẩn

trans-4-Hydroxy-L-prolin đưa vào bình định mức 10 mL Thêm 8 mL nước cất, lắc

đều và thêm nước cất đến vạch

- Dung dịch chuẩn làm việc (nồng độ 10 µg/mL hay 10 ppm): hút 1 mL dung dịchchuẩn gốc đưa vào bình định mức 100 mL Thêm 90 mL nước cất, lắc đều và thêmnước cất đến vạch

- Dung dịch chuẩn khảo sát điều kiện khối phổ (nồng độ 1 µg/mL hay 1 ppm): hút 1

mL dung dịch chuẩn làm việc đưa vào bình định mức 10 mL Thêm vào 8 mL hỗn

hợp methanol - nước (9 : 1) pH 1,6 (điều chỉnh bằng acid formic) và lắc đều, siêu âm

15 phút, thêm hỗn hợp này đến vạch

- Dung dịch chuẩn khảo sát điều kiện sắc ký (nồng độ 135 ng/mL hay 135 ppb): hút0,135 mL dung dịch chuẩn làm việc đưa vào bình định mức 10 mL Thêm vào 8 mL

hỗn hợp acetonitril - nước (95 : 5) + 5 mM amoni acetat + 0,1% acid formic và lắc

đều, siêu âm 15 phút, thêm hỗn hợp này đến vạch

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất

2.2.1.1 Thiết bị

Danh mục thiết bị sử dụng được trình bày ở bảng 2.4 Các thiết bị phân tích này đãđược hiệu chuẩn đạt yêu cầu theo quy định GLP và ISO 17025 : 2005

Bảng 2.4 Danh mục các thiết bị sử dụng Tên thiết bị Mã hiệu Hãng sản xuất Thông số

điều khiển bởi phần mềmMassLynx®4.1

Tần số siêu âm: 37 kHzCông suất siêu âm: 300 WCông suất gia nhiệt: 1.200 WMáy lắc Ika®

2.2.1.3 Hóa chất

Bảng 2.5 Danh mục các hóa chất sử dụng Tên hóa chất Hãng sản xuất Tiêu chuẩn

Acid hydrocloric Merck hoặc tương đương Tinh khiết dùng cho phân tích HPLC

2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký định lượng collagen bằng phương pháp MS/MS

LC-2.2.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ (MS)

Khảo sát điều kiện khối phổ bằng cách tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn

trans-4-Hydroxy-L-prolin nồng độ 1 µg/mL vào hệ thống khối phổ hai lần tứ cực (MS/MS)

Sử dụng chế độ điều chỉnh tự động (auto-tune) và kiểm tra lại bằng cách điều chỉnhthủ công (manual-tune) xác định các thông số của đầu dò để lựa chọn năng lượng bắnphá ion tối ưu cho ion mẹ và từng ion con

Nguồn ion hóa ESI sử dụng chế độ ion dương (+)

Bảng 2.6 Các thông số khảo sát nguồn ion hóa điện tử

Xử lý dữ liệu: Chất phân tích mục tiêu được phát hiện bằng kỹ thuật ghi phổ MRM.

Từ dữ liệu MRM giúp chuyển tiếp cho việc xác định và định lượng chất phân tích

2.2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Mẫu khảo sát là dung dịch chuẩn trans-4-Hydroxy-L-prolin nồng độ 135 ng/mL Các

yếu tố khảo sát điều kiện sắc ký gồm: pha tĩnh, hệ pha động, so sánh chương trìnhgradient pha động và chế độ đẳng dòng, nồng độ đệm, lượng acid formic thêm vào,tốc độ dòng, thời gian tái cân bằng cột

Điều kiện sắc ký dự kiến:

- Hệ sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC® H class với đầu dò TQ Detector.

- Cột BEH HILIC kích thước 2,1 x 100 mm, cỡ hạt 1,7 µm với tiền cột tương ứng.Cột BEH Amide kích thước 2,1 x 100 mm, cỡ hạt 1,7 µm với tiền cột tương ứng

- Tốc độ dòng: 0,3 – 0,5 mL / phút

- Thể tích tiêm: 10 µL

- Pha động là acetonitril, nước với muối amoni acetat và/hoặc acid formic

- Chương trình pha động: đẳng dòng (isocratic) hoặc chương trình gradient pha động

Khảo sát pha tĩnh

Bảng 2.7 Thông số cột BEH HILIC và cột BEH Amide

- Hạt silica gắn nhóm amide vớicầu nối Ethylene Bridged Hybrid

Tiêm dung dịch chất chuẩn trans-4-Hydroxy-L-prolin nồng độ 135 ng/mL vào hệ

thống sắc ký để đánh giá khả năng lưu giữ chất phân tích trên cột BEH HILIC và cộtBEH Amide

Đánh giá tính lặp lại của kết quả bằng cách tiêm liên tục 6 lần trên cùng 1 ống đựng

mẫu Từ đó chọn loại pha tĩnh phù hợp với chất phân tích trans-4-Hydroxy-L-prolin.

Tiêu chí đánh giá: hình dạng pic, tính lặp lại của diện tích đỉnh và thời gian lưu Yêu cầu: Pic nhọn, hẹp; RSD diện tích đỉnh và thời gian lưu của pic trans-4-Hydroxy-

L-prolin của 6 lần tiêm liên tiếp ≤ 5% [4]

Hệ 2: Kênh A: acetonitril + 10 mM amoni acetat

Kênh B: nước + 10 mM amoni acetat

Hệ 3: Kênh A: acetonitril + 0,1 % acid formic

Kênh B: nước + 0,1 % acid formic

Hệ 4: Kênh A: acetonitril - nước (95 : 5) + 10 mM amoni acetat + 0,1 % acid formic

Kênh B: acetonitril - nước (5 : 95) + 10 mM amoni acetat + 0,1 % acid formic

Ở mỗi hệ, khảo sát trên 5 chương trình gradient pha động như trình bày ở bảng 2.8

Bảng 2.8 Chương trình gradient khảo sát pha động

Tiêu chí đánh giá: hình dạng pic, tính lặp lại của diện tích đỉnh và thời gian lưu Yêu cầu: pic nhọn, hẹp; RSD diện tích đỉnh và thời gian lưu của pic trans-4-Hydroxy-

L-prolin của 6 lần tiêm liên tiếp ≤ 5% [4]

So sánh chương trình gradient pha động và chế độ đẳng dòng (isocratic)

Tiêm 6 lần mẫu chuẩn trans-4-Hydroxy-L-prolin nồng độ 135 ng/mL với chế độ đẳng

dòng ở tỷ lệ A : B phút 0,5 của chương trình gradient pha động đã chọn Đánh giá kếtquả này so với chương trình gradiant tương ứng

Tiêu chí đánh giá: hình dạng pic, tính lặp lại của diện tích đỉnh và thời gian lưu Yêu cầu: pic nhọn, hẹp; RSD diện tích đỉnh và thời gian lưu của pic trans-4-Hydroxy-

L-prolin của 6 lần tiêm liên tiếp ≤ 5 % [4]

Khảo sát nồng độ đệm

Khảo sát trên hệ pha động đã chọn các nồng độ muối amoni acetat lần lượt là 10 mM

và 5 mM Tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp với mỗi nồng độ muối amoni acetat khảo sát đểđánh giá tính lặp lại của kết quả Lựa chọn kết quả tốt nhất

Tiêu chí đánh giá: hình dạng pic, tính lặp lại của diện tích đỉnh và thời gian lưu Yêu cầu: pic nhọn, hẹp; RSD diện tích đỉnh và thời gian lưu của pic trans-4-Hydroxy-

L-prolin của 6 lần tiêm liên tiếp ≤ 5% [4]

Khảo sát lượng acid formic thêm vào

Khảo sát trên hệ pha động đã chọn với lượng acid formic là 0,1% và 0,2% Tiêm lặplại 6 lần với mỗi nồng độ để đánh giá tính lặp lại của kết quả Lựa chọn kết quả tốtnhất

Tiêu chí đánh giá: hình dạng pic, tính lặp lại của diện tích đỉnh và thời gian lưu Yêu cầu: pic nhọn, hẹp; RSD diện tích đỉnh và thời gian lưu của pic trans-4-Hydroxy-

L-prolin của 6 lần tiêm liên tiếp ≤ 5 % [4]

Khảo sát tốt độ dòng

Khảo sát dòng pha động ở tốc độ 0,3 ml/phút, 0,4 ml/phút và 0,5 ml/phút

Tiêu chí đánh giá: hình dạng pic, diện tích đỉnh và thời gian lưu.

Yêu cầu: pic nhọn, hẹp; thời gian lưu ngắn.

Khảo sát thời gian tái cân bằng cột

Khảo sát thời gian tái cân bằng cột lần lượt là: 10 phút, 8 phút, 5 phút

Tiêm 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn trans-4-Hydroxy-L-prolin nồng độ 135 ng/mL của

cùng 1 ống đựng mẫu với mỗi gradient pha động ở bảng 2.9

Bảng 2.9 Chương trình gradient khảo sát thời gian tái cân bằng cột

L-prolin của 6 lần tiêm liên tiếp ≤ 5 % [4]

2.2.3 Khảo sát điều kiện tối ưu của quy trình thủy phân collagen

Mẫu khảo sát là chất chuẩn collagen

2.2.3.1 Nguyên tắc chung

Collagen được thủy phân bằng dung dịch acid hydrocloric 6 N trong ống thủy phân

ở điều kiện nhiệt độ, thời gian, thể tích acid hydrocloric 6 N thích hợp Dịch thủyphân được trung hòa và pha loãng đến nồng độ mong muốn và được lọc qua mànglọc nylon 0,22 µm trước khi đưa vào hệ thống UPLC-MS/MS để phân tích

Dung dịch trung hòa là hỗn hợp acetonitril - nước (95 : 5) + 5 mM amoni acetat.

2.2.3.2 Khảo sát điều kiện thủy phân collagen

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy quy trình thủy phân collagen đều lựa chọn sửdụng acid hydrocloric với nồng độ 6 N là tối ưu [10], [11], [17], [21], [22], [32] Vìvậy thiết kế nghiên cứu này sẽ chọn nồng độ acid hydrocloric là 6 N và không khảosát các nồng độ acid hydrocloric khác

Tiến hành khảo sát ba yếu tố ảnh hưởng đến quy trình xử lý mẫu: thể tích dung dịchacid hydrocloric 6 N, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân mẫu

Từ kết quả định lượng mẫu collagen thủy phân, lựa chọn giá trị tối ưu của mỗi yếu tốkhảo sát

Bảng 2.10 Giá trị của các yếu tố khảo sát điều kiện thủy phân

Khảo sát thời gian thủy phân: cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn collagen, thêm 0,5

mL dung dịch acid hydroclorid 6 N, thủy phân ở nhiệt độ 110 °C trong các khoảnthời gian tương ứng

Khảo sát nhiệt độ thủy phân: cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn collagen, thêm 0,5

mL dung dịch acid hydroclorid 6 N, thủy phân ở các nhiệt độ tương ứng trong 6 giờ

Khảo sát thể tích acid hydrocloric 6 N: cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn collagen,

thêm vào từng thể tích acid hydroclorid 6 N tương ứng, thủy phân ở nhiệt độ 110 °Ctrong 6 giờ

Bảng 2.11 Bảng mô tả thí nghiệm khảo sát điều kiện thủy phân

Yếu tố

khảo sát

Lượng mẫucollagen (mg)

Thể tích acidhydrocloric 6 N (mL)

Nhiệt độ(°C)

Thời gian(giờ)Thể tích acid

Sau khi thủy phân, tiến hành pha loãng mẫu 2.000 lần bằng hỗn hợp dung dịch

acetonitril - nước (95 : 5) + 5 mM amoni acetat Hỗn hợp dung dịch này cũng đóng

vai trò trung hòa dịch thủy phân Sau khi pha loãng thu được dung dịch collagen đãthủy phân nồng độ 1 µg/mL, hút 1 mL lọc qua màng lọc nylon 0,22 µm và đưa vào

Với Ct : nồng độ trans-4-Hydroxy-L-prolin thu được (ng/mL)

mt : lượng cân mẫu (ng)

Hệ số pha loãng: 2.000

2.2.3.3 Đánh giá tính ổn định của quy trình thủy phân

Gọi x là thông số tối ưu của thể tích acid hydrocloric 6 N (mL)

y là thông số tối ưu của nhiệt độ thủy phân (°C)

z là thông số tối ưu của thời gian thủy phân (giờ)

Đánh giá tính lặp lại của quy trình thủy phân

- Thủy phân 3 mẫu với cùng nồng độ nhưng với lượng cân tăng gấp đôi để đánh giátính lặp lại của quá trình thủy phân

Yêu cầu: RSD diện tích đỉnh của pic trans-4-Hydroxy-L-prolin của 3 mẫu ≤ 5% [4].

Bảng 2.12 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính lặp lại của quy trình thủy phân

Khối lượng cânchuẩn collagen(mg)

Thể tích acidhydrocloric 6 N(mL)

Nhiệt độthủy phân(°C)

Thời gianthủy phân(giờ)