Xây dựng quy trình định lượng (s) amlodipin bằng phương pháp hplc pha đảo sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang

Trong nghiên cứu này, chúng tôi giới thiệu kết quả phân tích đồng phân quang học S-amlodipin bằng phương pháp HPLC pha đảo sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang.. Đối tượng và phươ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-TRẦN MỸ THIÊN THANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG PHA

ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-TRẦN MỸ THIÊN THANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ THU CÚC

TS PHAN VĂN HỒ NAM

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan dây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trongluận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

Trần Mỹ Thiên Thanh

Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2016 – 2018Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN BẰNG PHƯƠNG

PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG PHA ĐỘNG

CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG

Trần Mỹ Thiên ThanhHướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Thu Cúc, TS Phan Văn Hồ Nam

Từ khóa: HPLC, amlodipin, phân tách đồng phên, đồng phân quang học

Phần lớn các chế phẩm trên thị trường ở dạng racemic amlodipin Tuy nhiên, để cải thiện

tính an toàn và hiệu quả, amlodipin được sản xuất dưới dạng đồng phân (S)-amlodipin

và được đưa ra thị trường vài năm trước Trong nghiên cứu này, chúng tôi giới thiệu kết

quả phân tích đồng phân quang học (S)-amlodipin bằng phương pháp HPLC pha đảo sử

dụng pha động có chứa tác nhân đối quang

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: hoạt chất amlodipin và (S)-amlodipin

Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện quan trọng ảnh hưởng trong quátrình tách (thành phần và tỉ lệ pha động) nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứngcác thông số: hai pic đồng phân phải tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs >1,5; hệ sốbất đối As nằm trong khoảng 0,8-1,5 Sau khi tìm được điều kiện thích hợp, tiến hànhthẩm định quy trình phân tích bao gồm: khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặchiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng Quy trình phân tích

sau khi được thẩm định đã được áp dụng để định lượng hoạt chất (S)-amlodipin và xác định tạp (R)-amlodipin trong một số chế phẩm chứa (S)-amlodipin trên thị trường.

Kết quả

Để xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để phân tích đồng phân quang học củaamlodipine như sau: sử dụng cột C18 của Germini NX Pha động là hỗn hợp methanol –dung dịch đệm NaH2PO4 5 mM có chứa 17,5 mM SBE-β-CD và 0,3 mM PEG, pH 2,5(25: 75, tt/tt) Tốc độ dòng 1 ml/ phút, nhiệt độ 30 oC, thể tích tiêm mẫu 10 µl, bước sóngphát hiện 237 nm Độ phân giải của các đồng phân lớn hơn 1,5 Giới hạn định lượng là

250 - 750 µg.mL-1 Độ lệch chuẩn tương đối dưới 2% (n = 6), độ phục hồi là 98 -102%,phương pháp này phù hợp trong kiểm tra chất lượng

Kết luận

Đã xây dựng được quy trình phân tách đồng phân quang học amlodipin bằng phươngHPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang Quy trình này có tính chọn lọc,giới hạn phát hiện thấp, cho kết quả chính xác và độ lặp cao Quy trình này đã được áp

dụng để định lượng (S)-amlodipin, xác định tạp đồng phân (S)-amlodipin trong một số chế phẩm chứa (S)-amlodipin.

Master’s Thesis – Academic course: 2016 – 2018Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210

CHIRAL SEPARATION OF (S)-AMLODIPINE ENANTIONMER BY RP-HPLC

USING CHIRAL MOBILE PHASE ADDITIVE

Tran My Thien ThanhSupervisor: Assoc Dr Le Thi Thu Cuc; Dr Phan Van Ho Nam

Keywords: HPLC, amlodipine, chiral separation, enantiomers.

Introduction

Amlodipine, a third generation dihydropyridine calcium antagonist that is in a group ofdrugs called calcium channel blockers It is used to lower blood pressure - to treat highblood pressure (hypertension) - or to prevent chest pain (angina) Amlodipine has two

enantiomers called (S)-amlodipine and (R)-amlodipine Only (S)-amlodipine is biologically active, while the R) -amlodipine has many side effects Most of the products

on the market are racemic amlodipine However, to improve safety and effectiveness,

amlodipine is produced in the form of isomer (S)-amlodipine and was marketed several years ago In this study, we present the results of optical (S)-amlodipine analysis by

reverse-phase HPLC using a mobile phase containing the chiral separation agent

Material and methods

This subject of this study was amlodipine and (S)-amlodipine The aim of the study was

to investigate some important conditions affecting the separation process in order toselect analytical conditions that suitable in some chromatographic the parameters Twoisomers must be completely separated With the resolution of the enantiomers were morethan 1.5; the asymmetry factor is between 0.8 and 1.5 After finding out the appropriatechromatographic conditions for separatation of amlodipine enantiomers, the method wasvalidated is system suitability, selectivity, linearity and range, limit of detection,precision and accuracy Then, the validated method was applied for quantification of (S)-

amlodipin and determination of (S)-amlodipin’s enantionmeric impurity in some available (S)-amlodipin finhised products.

Results

The appropriate chromatographic conditions for a HPLC method was developped for thechiral separation of amlodipine The two enantiomers were separated on a Germini NXC18 column The mobile phase was methanol - phosphate buffer (5 mmol.mL-1NaH2PO4, pH 2.5; containing 17.5 mM sulfobutylether-β-cyclodextrin (SBE-β-CD) and

0.3 mM polyethylene glycol-20000 (PEG) (25: 75, v/v) and UV detection at 237 nm Theresolution of the enantiomers were more than 1,5 The effective range of quantificationfor both enantiomers was 250 – 750 µg.mL-1 Relative standard deviation was below 2%(n=6), the recovery range was 98 -102% The method is suitable in quality control

Conclusion

The HPLC approach for quality control of (S)-amlodipine and its enantiomeric impurity

was successfully developed using Germini NX C18 column The validated method was

applied for quantification of (S)-amlodipine and determination of (S)-amlodipine’s enantiomeric impurity in some available S)-amlodipine drugs

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ……… iv

DANH MỤC CÁC BẢNG……… vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ……… ix

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU………. 3

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ AMLODIPIN……… 3

1.1.1 Tính chất vật lý 3

1.1.2 Tính chất hóa học……… 4

1.1.3 Tác dụng dược lý 4

1.1.4 Chỉ định 4

1.1.5 Tương tác thuốc 4

1.1.6 Định tính và định lượng……… 5

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG……… 6

1.2.1 Khái niệm về đồng phân đối quang……… 6

1.2.2 Các phương pháp phân tích đồng phân đối quang……… 7

1.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang………… 9

1.2.4 Điện di mao quản phân tích đồng phân đối quang……… 10

1.2.5 Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang khác………… 10

1.3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)……… 11

1.3.1 Khái niệm về phương pháp HPLC……… 11

1.3.2 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ……… 11

1.3.3 Pha động trong sắc ký pha đảo……… …… 12

1.4 PHA ĐỘNG ĐỐI QUANG (CHIRAL MOBILE PHASE) …… 14

1.4.1 Khái niệm……… 14

1.4.2 Các tác nhân quang hoạt ……… 15

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG (S)-AML……… 16

1.5.1 Một số đề tài nghiên cứu trong nước……… 17

1.5.2 Một số đề tài nghiên cứu ngoài nước……… 16

CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 19

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU……… 19

2.1.1 Đối tượng……… 19

2.1.2 Hóa chất……… 18

2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ……… 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 21

2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng (S)-amlodipin ……… 21

2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích ……… 23

2.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG MỘT VÀI CHẾ PHẨM (S)-AML TRÊN THỊ TRƯỜNG……… 25

2.3.1 Định lượng (S)- amlodipin……… 25

2.3.2 Xác định tạp đồng phân (R)-amlodipin 26

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC (S)-AMLODIPN BẰNG HPLC SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG 27

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 27

3.1.2 Thẩm định quy trình phân tích (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang

40 3.1.3 Dự thảo quy trình phân tích đồng phần quang học (S)-amlodipin bằng phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 50

3.1.4 Úng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin trên trên thị trường………

52 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC AMLODIPN BẰNG HPLC SỬ DỤNG CỘT CELLULOSE- 4 53

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 53

3.1.2 Thẩm định quy trình phân tích (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng cột cellulose-4 57

3.2.3 Dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học (S) amlodipin

bằng phương pháp HPLC sử dụng cột cellulose-4.……… 68

3.2.4 Úng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin trên trên thị trường………

70 CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN……… 72

CHƯƠNG 5 –KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 76

5.1 Kết luận 76

5.2 Kiên nghị 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

PHỤ LỤC 82

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

FDA Food and Drug Administration

cao

MIP-colum

Molecularly Imprinted Polymer- column

NSAID Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs

RP-HPLC Revesed phase -high performance liquid

chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năngcao pha đảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục các chất đối chiếu……… 19

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất thuốc thử……… 19

Bảng 2.3 Danh mục trang thiết bị, dụng cụ……… 20

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các cột sắc ký khác nhau……… 27

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát các tác nhân đối quang khác nhau……… 29

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát các nồng độ tác nhân đối quang khác nhau…… 29

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát các nồng độ pH dung dịch khác nhau ………… 32

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát các nồng độ PEG khác nhau……… 34

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát các nồng độ NaH2PO4 khác nhau 34

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát các tỷ lệ pha động khác nhau……… 38

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn Amlodipin (n=6)……… 40

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (S)-amlodipin (n=6)……… 41

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn amlodipin…… 44

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn (S)- amlodipine 45 Bảng 3.12 Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện đồng phân amlodipin trong mẫu chuẩn amlodipin và mẫu chuẩn (S)-amlodipin… 46 Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipine (đồng phân (S)-amlodipin)………. 47

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipin (đồng phân (R)-amlodipin)……….

47 Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ lặp lại của viên nén (S)-amlodipin………… 48

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (n=9) (đồng phân (S)-amlodipin)……… 48

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (đồng phân

Bảng 3.21 Kết quả khảo sát tạp đồng phân (R)-amlodipin trong các chế

phẩm ……… 52

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn

phân amlodipin trong mẫu chuẩn amlodipin và mẫu chuẩn (S)-amlodipin….

Bảng 3.31 Kết quả khảo sát độ lặp lại của viên nén (S)-amlodipin……… 65

Bảng 3.32 Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (n=9) (đồng

Bảng 3.33 Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (đồng phân

Bảng 3.34 Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén (S)-amlodipin ………… 67 Bảng 3.35 Kết quả khảo sát LOD (µg/ml) và LOQ (µg/ml) của viên nén (S)

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của amlodipin……… 3

Hình 3.1 SKĐ của dung dịch chuẩn amlodipin tại các cột sắc ký khảo sát 27 Hình 3.2 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của cột sắc ký PHLC lên độ phân giải

Hình 3.4 SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (thay đổi nồng độ tác nhân đối

quang)……… 31

Hình 3.5 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ tác nhân đối quang

Sulfobutyl ether- β-cyclodextrin (SBE-β-CD) khác nhau lên độ phân giải và

Hình 3.6 SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (thay đổi pH của pha động) …… 33 Hình 3.7 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ pH dung dich khác

nhau lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine………

34

Hình 3.8 SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (khác PEG)……… 35 Hình 3.9 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ PEG khác nhau lên

lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipin ………

37

Hình 3.13 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các tỷ lệ pha động khác nhau

lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipin ………

39

Hình 3.19 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn……… 42

Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu thử (S)-amlodipin……… 42

Hình 3.21 Độ tinh khiết của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử……… 42

Hình 3.22 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu chuẩn……… 43

Hình 3.23.Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu chuẩn 43 Hình 3.24 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử 43

Hình 3.25 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu thử… 43 Hình 3.26 Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin…… 44

Hình 3.27 Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (R)-amlodipin…… 44

Hình 3.28 Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin 45 Hình 3.29 Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,3 µg/ml……… 46

Hình 3.30 Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,2 µg/ml……… 46

Hình 3.31 Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,1 µg/ml……… 46

Hình 3.32 Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-amlodipin 2,5mg) 53 Hình 3.33 Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 5 ((S)-amlodipin 5mg) 53

Hình 3.34 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (S)-amlodipin……… 53

Hình 3.35 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (R)-amlodipin……… 53

Hình 3.36 SKĐ kết quả khảo sát các cột cellulose khác nhau 54

Hình 3.37 SKĐ khảo sát trên các tỷ lệ pha động……… 56

Hình 3.38 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các tỷ lệ pha động khác nhau lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine……… 56

Hình 3.39 Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine……… 58

Hình 3.40 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (S)-amlodipin……… 58

Hình 3.41 Sắc ký đồ của chuẩn amlodipin +chuẩn (S)-amlodipin………… 59

Hình 3.42 Sắc ký đồ mẫu thử amlodipin……… 59

Hình 3.43 Sắc ký đồ của mẫu trắng ……… 59

Hình 3.44 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn……… 59

Hình 3.45 Sắc ký đồ mẫu thử (S)-amlodipin……… 59

Hình 3.46 Độ tinh khiết của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử……… 60

Hình 3.47 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu

chuẩn………

60

Hình 3.48 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu

Hình 3.50 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu thử…. 60

Hình 3.51 Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (R)-amlodipin…… 61 Hình 3.52 Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin…… 62 Hình 3.53 Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin…… 60

Hình 3.57 Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-Amlodipin 2,5mg) 70

Hình 3.58 Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-Amlodipin 5

mg)

70

Hình 3.59 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (S)-amlodipin……… 70

MỞ ĐẦU

Các đồng phân quang học có thể khác nhau về tính chất dược động học, dược lý họchay độc tính Không hiếm các trường hợp chỉ một đối quang có hoạt tính trong khiđối quang kia lại gây độc cho cơ thể Trong hướng dẫn của FDA (Mỹ) hay EMEA(Châu Âu) đều nhấn mạnh việc tách riêng các đối quang và đánh giá sự đóng góp củamỗi đối quang với tác dụng của thuốc [18] Hiện nay, các chế phẩm thuốc đang lưuhành ở dạng đồng phân riêng lẻ ngày càng phổ biến dẫn đến yêu cầu phát triển cácphương pháp phân tích đồng phân quang học nhằm phục vụ cho kiểm nghiệm tạpđồng phân của nguyên liệu và các chế phẩm thuốc trên thị trường

Amlodipin (AML) là thế hệ thứ ba của thuốc ức chế kênh calci thuộc nhómdihydropyridin (DHP) có khả năng chặn kênh calci được sử dụng trong điều trị bệnhcao huyết áp và chứng đau thắt ngực AML được sử dụng trong điều trị chứng đauthắt ngực ổn định mạn tính và trong điều trị tăng huyết áp từ nhẹ đến trung bình [36].Giống như hầu hết các chất ức chế kênh calci khác của nhóm dihydropyridin, AML

thường được sử dụng trong điều trị dưới dạng racemic Tuy nhiên, đồng phân (R) và (S) không có cùng hoạt tính sinh học Chỉ có (S)-AML có thuộc tính giãn mạch [10],

tác dụng của nó tương đương với dạng racemic nhưng ít tác dụng phụ hơn [35] trong

khi đó phù, đau đầu, chóng mặt, rát mặt và các phản ứng phụ khác đến từ (R)-AML [17] (S)-AML lại có tác dụng ức chế kênh calci mạnh, do tác động trên chuột mạnh hơn hơn so với (R)-AML khoảng 1000 lần Ngoài thời gian hoạt động dài hơn, (S)-

AML làm giảm nguy cơ tái nhịp nhanh, và độ thanh thải của bệnh nhân phụ thuộc

vào sự biến đổi nhiều hơn so với (R)-AML [33] Do sự khác biệt đáng kể về dược

động học giữa hai dạng đồng phân quang học này và để cải thiện tính an toàn và hiệu

quả, AML được sản xuất dưới dạng đồng phân (S) và được đưa ra thị trường vài năm trước Vì vậy, đồng phân (R) coi như là tạp chất nên hạn chế sử dụng và cần được

thực hiện bởi các phương pháp phân tích nhanh và hiệu quả

Có nhiều nghiên cứu phân tích các đồng phân quang học đã được báo cáo như sắc kýlỏng ghép đầu dò khối phổ [41], điện di mao quản [4], [16], Phương pháp CE rẻtiền do tiết kiệm dung môi hóa chất nhưng độ ổn định và độ lặp lại của CE không

bằng HPLC Vì vậy đề tài sử dụng HPLC để phân tách, đây là phương pháp vẫn được

áp dụng trong hầu hết các quy trình

Các đồng phân quang học của AML đã được tách trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năngcao khi sử dụng pha tĩnh cột chiral (chiral stationary phases- CSPs) [27, 30] hoặc phađộng chứa chiral (chiral mobile phase additives- CMPAs) [12, 37, 40] Do các cột bấtđối thường đắt tiền và không thông dụng Nên trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu

và ứng dụng phương pháp để định lượng (S)-AML trên HPLC với pha động có chứa

tác nhân đối quang Đề tài giúp giảm chi phí và góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất

lượng cho viên nén chứa (S)-amlodipin để có thể áp dụng trong kiểm tra chất lượng

và tiêu chuẩn hóa Đề tài “Xây dựng quy trình định lượng (S)-amlodipin bằng phương

pháp HPLC pha đảo sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang” được thực hiệnvới các mục tiêu sau:

- Khảo sát các pha động có chứa tác nhân đối quang có thể tách (S)-amlodipin bằng

phương pháp HPLC

- Thẩm định phương pháp định lượng (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng pha động

có chứa tác nhân đối quang

- Ứng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin trên thị trường

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ AMLODIPIN

Công thức cấu tạo:

(4RS)-2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2-clorophenyl)-Khối lượng phân tử : 408,879 g/mol

Tên thường: Amlodipin besylat (Amlodipin tồn tại dưới dạng muối amlodipin besilat,trong chế phẩm có chứa từ 95,0 đến 102,0 % : C20H25ClN2O5.C6H5SO3H

Khối lượng phân tử: 567,06 g/mol

pKa = 8,6

1.1.1 Tính chất vật lý [1]: Bột kết tinh màu trắng Dễ tan trong methanol, hơi tan

trong ethanol, khó tan trong nước và 2-propanol

1.1.2 Tính chất hóa học [8]

xạ AML có tác dụng chống đau thắt ngực, thời gian chống đau kéo dài 24 giờ Ngườibệnh có thể dùng phối hợp với thuốc chẹn beta và nitrat trong điều trị đau thắt ngực.Amlodipin là dẫn chất của dihydropyridin có tác dụng chẹn calci qua màng tế bào.Trong phân tử amlodipin có một nguyên tử carbon bất đối nên amlodipin tồn tại dướidạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang Nhiều nghiên cứu đã chứng minh

trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả truyền (levamlodipin

S(-)-amlodipin) đóng vai trò chính để tạo ra tác dụng điều trị tăng huyết áp và đau thắt

ngực (S)-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn (R)-amlodipin 1000 lần [29].

1.1.4 Chỉ định [11]

- Tăng huyết áp (có thể dùng cho bệnh nhân đái tháo đường)

- Dự phòng ở người bệnh đau thắt ngực ổn định

1.1.5 Tương tác thuốc [1]

- Thuốc gây mê: làm giảm huyết áp mạnh

- Lithi: Khi dùng cùng với amlodipin, có thể gây độc thần kinh, buồn nôn, ỉa chảy

- NSAID đặc biệt là indomethacin do ức chế prostaglandin hoặc giữ natri và dịch nênlàm giảm tác dụng chống tăng huyết áp của amlodipin

- Amlodipin liên kết cao với protein huyết tương do đó cần thận trọng với nhữngthuốc liên kết với protein huyết tương (thay đổi nồng độ thuốc)

1.1.6 Định tính và định lượng

1.1.6.1 Các phương pháp định tính

Phổ hồng ngoại [1, 16]

Nguyên tắc: So sánh phổ hồng ngoại của chất thử và chất chuẩn AML

Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của amlodipin besilatchuẩn đối chiếu

Dung dịch thử: Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong pha động, pha loãng thành 50,0 mlvới cùng dung môi Hút chính xác 5,0 ml dung dịch thu được pha loãng thành 100,0

ml bằng pha động

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 50,0 mg amlodipin besylat chuẩn (ĐC) trong pha động,pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi pha động Hút chính xác 5,0 ml dungdịch thu được pha loãng thành 100,0 ml bằng pha động

Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu

Tính hàm lượng của C20H25ClN2O5.C6H6O3S dựa vào diện tích pic đáp ứng của dungdịch thử và dung dịch chuẩn và hàm lượng được công bố của C20H25ClN2O5.C6H6O3Strong amlodipin besylat chuẩn

1.1.6.3 Các chế phẩm hiện có trên thị trường:

Các chế phẩm hiện có trên thị trường chủ yếu tồn tại ở dạng racemic, một số ít tồn tại

ở dạng (S)-amlodipin:

- Dạng racemic: Amlodipin 5mg, Amlor 5 mg (Thái Lan), Norvasc,

- Dạng (S)-amlodipin: Asomex 2,5mg và Asomex 5mg, S-amcad 2,5mg (Cipla - ẤnĐộ)

Các chế phẩm thường ở hai dạng bào chế là viên nén và viên nang

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG [6]

1.2.1 Khái niệm về đồng phân đối quang

Đồng phân đối quang (enantiomers) là hai đồng phân không gian dạng ảnh và vật quagương Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống nhau, chỉ khác về cách bố tríkhông gian của các nhóm thế quanh cacbon bất đối Đồng phân quang học là hiệntượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về góc quay của mặt phẳng ánh sángphân cực Điều kiện cho tính quang hoạt chính là: cấu trúc hình học của phân tử phảinhư thế nào đó để phân tử không chồng khít với hình ảnh trong gương của nó tương

tự như quan hệ giữa bàn tay phải và bàn tay tráí (chirality) Ngoài ra sự khác biệttrong cấu trúc phân tử theo kiểu như sự khác biệt của bàn tay phải và bàn tay trái, khảnăng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo những góc bằng nhau nhưng ngượcchiều nhau, còn lại tất cả các tính chất lí hóa thông thường của các đồng phần đó là

giống nhau Chất mà có khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực mộtgóc α nào đó gọi là chất quang hoạt.

Cấu hình R và S (cấu hình tuyệt đối): khi nguyên tử cacbon liên kết với 4 nguyên tửhoặc nhóm nguyên tử khác nhau C*abcd Thiết lập trình tự ưu tiên của cacbon bất đối:a>b>c>d Người ta quan sát phân tử theo trục C-d từ phía ngược chiều với d nếu từa->b ->c theo chiều kim đồng hồ thì cấu hình là R (rectus = phải), theo chiều ngượckim đồng hồ thì là cấu hình S (sinister = trái) trong đấy thứ tự ưu tiên a-b-c theo Cahn-Ingold- Prelog như sau

–I> Br> Cl> S> F> O> N> C> H

-COOH> -C=O> -CHO> -CH2OH> -CH=R> -CH3 ( R ở đây chỉ các CH3)

Chính sự khác nhau về cấu trúc không gian này đã làm cho chúng có tương tác khácnhau với các thụ thể sinh học, cũng như chất mang, receptor, enzym Vì thế, đặc tínhdược động học, cũng như đặc tính dược lý của hai đồng phân đối quang của một sốthuốc rất khác nhau Có tới một nửa các dược chất đang sử dụng hiện nay có đồngphân đối quang, mà 1/3 trong số đó có các đồng phân đối quang mang đặc tính dược

lý hoặc dược động học khác nhau

1.2.2 Các phương pháp phân tích đồng phân đối quang

Phân tích đồng phân đối quang là một trong những chủ đề khó trong hóa phân tích dobản chất lí hóa quá gần nhau của hai đồng phân đối quang trong mỗi cặp đồng phânđối quang Các đồng phân đối quang có thể được tách bằng hai cách: trực tiếp hoặcgián tiếp

Theo cách gián tiếp: hai đồng phân này được tạo dẫn chất với một hợp chất đối quangkhác để tạo ra hai sản phẩm là đồng phân quang học, nhưng không phải là đối quang(diastereodisomers), như vậy chúng sẽ có tính chất vật lý và hóa lý khác nhau nhiềuhơn, do đó sẽ dễ tách ra khỏi nhau hơn [14,42,43]

Theo cách trực tiếp: các đồng phân đối quang được tách bằng một công cụ phân tích

có hiệu năng tách cao, và phải có sự góp mặt của một hay nhiều chất chọn lọc đốiquang Các chất chọn lọc đối quang này có đặc điểm là tương tác khác nhau đối vớicác đồng phân đối quang, do có cấu trúc không gian của chúng Có nhiều nhóm chất

chọn lọc đối quang, được phân loại tùy theo cấu trúc của chúng; các cyclodextrin vàdẫn chất; các oligo và polysaccarid, crown ether, các kháng sinh vòng lớn, các chấttrao đổi ion, các chất diện hoạt và các calixaren [31]

Đặc điểm duy nhất có thể lợi dụng để tách riêng hai đồng phân đối quang là khả năngtương tác khác nhau của chúng với những chất có ái lực đặc biệt với mỗi đồng phânđối quang của một hỗn hợp racemic Những chất này được gọi là chất chọn lọc đốiquang (chiral selector) Các chất này được đưa vào hệ thống tách để tương tác trựctiếp với hỗn hợp đồng phân đối quang Khi mức độ khác biệt giữa quá trình tương tácvới chất chọn lọc đối quang giữa hai đồng phân đối quang đủ lớn, chúng sẽ được táchriêng Các chất chọn lọc đối quang có bản chất hóa học khá đa dạng, có thể chia thànhcác nhóm chính sau:

Nhóm 1: có bản chất protein (albumin huyết thanh (HAS, HBA), α1- glycoprotein (AGP),…),cyclopeptid, có một số kháng sinh macrocyclic glycopeptid(vancomycin, teicoplanin, avoparcin, turbocuracin ) đã được dùng để tách nhiềuđồng phân đối quang

acid-Nhóm 2: các oligosaccarid không vòng và dẫn chất polysaccarid, phần lớn là các phân

tử monosaccarid Một số phân tử disaccarid, trisaccarid cũng có thể ảnh hưởng giốngnhư mono saccarid tự nhiên đó là vị trí liên kết và loại liên kết tạo nên khả năng nhậnbiết chất đối quang Các chất hay dùng là dẫn chất maltoz , lactoz, sucroz, amyloz,cellulose

Nhóm 3: chất chọn lọc đối quang dựa trên cấu trúc tạo thành một “hốc” chọn lọc đốiquang (chiral cavity) Đây là các cyclodextrin (CD) và dẫn chất (β-cyclodextrin, dẫnchất sulfat hóa, alkylhydroxyl hóa của β-CD), ether vòng, polymer

Nhóm 4: chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện tử π và nhómnhận điện tử π (chất chọn lọc kiểu Pirkle)

Nhóm 5: trao đổi lignand (ion đồng tạo phức với nhóm hoạt quang)

Sử dụng các chất chọn lọc đối quang kể trên, nhiều phương pháp đã được sử dụng đểphân tích các đồng phân đối quang, chủ yếu dựa trên các quá tình sắc kí (lỏng, khí,

pha siêu tới hạn) và điện di Trong đó hai kỹ thuật phổ biến nhất hiện nay để táchđồng phân đối quang là sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản hiệu năng cao.

1.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang

Có 3 lựa chọn để phân tách các đồng phân đối quang:

- Sử dụng pha tĩnh không gắn chất chọn lọc đồng phân đối quang và sử dụng phađộng chứa chất chọn lọc đối quang

- Tạo dẫn chất để biến hai đồng phân đối quang thành hai diastereoisomers có thểtách được bằng cách sử dụng pha tĩnh- pha động thông thường

- Sử dụng pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối quang và pha động không chứa chất chọnlọc đối quang

Lựa chọn thứ hai khó áp dụng do khó khăn trong việc tìm ra dẫn xuất phù hợp và độtin cậy của phương pháp bị ảnh hưởng bởi độ lặp lại của phản ứng tạo dẫn xuất.Lựa chọn thứ ba là phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay do số lượngpha tĩnh thương mại hóa sẵn có lớn, rất nhiều loại cột khác nhau, giúp người phântích có nhiều lựa chọn phù hợp với nhu cầu nhưng có một trở ngại là chi phí lớn chocột quang hoạt

HPLC là phương pháp ứng dụng rộng nhất, cho phép tách các đồng phân đối quangcủa hầu hết các hợp chất hoạt quang có tác dụng dược lý Kỹ thuật này được áp dụngcho cả trong phân tích và sản xuất đồng phân đối quang tinh khiết cho quy mô côngnghiệp

Lựa chọn thứ nhất có nhiều hạn chế do tiêu thụ nhiều chất chọn lọc đối quang và hiệuquả tách kém không lớn bằng điện di mao quản, nhưng ưu điểm là không sử dụng cộtquang hoạt đắt tiền vì thế cần phát triển nghiên cứu sâu hơn để áp dụng rộng rãi trongphân tích dược chất

1.2.4 Điện di mao quản phân tích đồng phân đối quang

Tương tự, các chất chọn lọc đối quang được sử dụng trong các pha tĩnh HPLC cũngđược sử dụng trong điện di mao quản Nhưng ở đây các chất chọn lọc đối quang đượchòa tan vào dung dịch điện ly nền (background electrolyte-BGE)

Ưu điểm của phương pháp này là sự linh hoạt trong việc điều chỉnh điều kiện phântích để tối ưu hóa kết quả, các chất chọn lọc đối quang phổ biến đều có sẵn trên thịtrường và giá thành hạ hơn rất nhiều so với giá thành hạ hơn rất nhiều so với giá thànhcác cột sắc ký có gắn cùng chất chọn lọc đối quang đó, lượng tiêu thụ của dung dịchđiện ly nền trong điện di mao quản rất nhỏ, do đó lượng chất chọn lọc đối quang tiêuthụ cũng nhỏ hơn so với trường hợp đưa vào pha động để chạy sắc ký Trong số 5nhóm chất chon lọc đối quang đã liệt kê nhóm 1 và 3 [16] Tuy số chọn lọc đối quang

đã được dung trong CE hẹp hơn số chọn lọc đối quang được gắn lên pha tĩnh dungtrong HPLC nhưng khả năng tách đồng phân đối quang bằng CE lại tương đươngHPLC

Nguyên tắc: dựa trên cở sở tính chất điện di khác nhau của các phần tử chất tan Quátrình này xảy ra trong mao quản trên nền của dung dịch chất điện ly có pH thích hợp.Dưới tác dụng của lực điện trường E xác định đặt vào hai đầu mao quản

Cơ chế: sự di chuyển của các phần tử chất tan trong mao quản dưới tác dụng của lựcđiện trường nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất của dòng điện thẩm(Electro-Osmotic Flow, EOF), EOF là một dòng chảy khối của chất lỏng trong maoquản Nó có quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên mao quản EOF sẽ quyết địnhthời gian tồn tại của chất tan trong mao quản Nó tồn tại bao trùm lên dòng di chuyểncủa chất tan, nghĩa là chất tan trong dòng này

Thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu mao quản được dung trong kỹ thuật CE làrất lớn, thông thường từ 10-30kV Chính lực điện trường này làm động lực cho cácphần tử chất tan di chuyển theo một hướng nhất định và các chất có điện tích và độlớn khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau Do đó mà tạo nên sự tách của cácchất phân tích

1.2.5 Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang khác:

Phương pháp đo năng suất quay cực [10] cũng là một phương pháp dùng để phân tíchđối quang

- Định tính: với một chất trong điều kiện nhất định (về nhiệt độ và bước sóng) thì

[α] của nó là một hằng số Vì thế việc xác định [α] giúp nhận biết được chất đó cũng

như mức độ tinh khiết của nó

- Định lượng: dựa vào định luật Biot, khi đã biết chiều dài d của ống đo và năng suất

quay cực [α], đo góc quay cực φ của dung dịch, từ đó sẽ xác định được nồng độ Ccủa dung dịch đó:

∁ = [α].d φ

d: chiều dài của chất đo mà ánh sang phân cực truyền qua

1.3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.3.1 Khái niệm về phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- High performance liquid chromatography) là một

kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứatrong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao

Pha tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân, chất lỏng được baophủ trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc chất mang rắn đã được biến đổi bằng cáchliên kết hóa học với nhóm hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộngrãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợptách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Tùy thuộc vào bản chất các pha, kỹ thuật và phương tiện sắc ký mà người ta phânlàm nhiều loại sắc ký khác nhau :

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích đượcnhững hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion cókhối lượng phân tử không quá lớn (<3000).

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và phađộng: sắc ký pha thường (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo (reversedphase chromatography)

1.3.2 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chấtmang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

- Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng (liquid-liquid chromatography)

lỏng Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phasechromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơnsắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mátpha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thểứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phầnlớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

1.3.3 Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

 Hòa tan mẫu phân tích

 Phù hợp với đầu dò

 Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

 Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

 Tinh khiết dùng cho sắc ký

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng

ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol(MeOH), acetonitril (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất Nước làmột dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractiveindex), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index),

độ rửa giải (eluent strength)…

Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số

dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại

kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụngdung môi khác), tức thay đổi α Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.Trong quá trình tách của sắc ký pha đảo, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích vàpha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tínhbaz (nhận proton) của dung môi

Thông thường pha động trong sắc ký pha đảo bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dungdịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước Nước

là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl khôngphân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửagiải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của sắc ký pha đảo

Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng ápsuất cột

Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa chonhững hợp chất cần phân tích Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môiMeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước Với một hỗn hợp chất phân tíchphức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước Khi lựa chọn thìphải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng.Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic)hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradient).

1.4 PHA ĐỘNG ĐỐI QUANG (CHIRAL MOBILE PHASE) [13]

1.4.1 Khái niệm

Sự phân tách trực tiếp hai đồng phân đối quang có thể tối ưu hóa bằng cách thêm vàopha động chất chọn lọc đối quang, được gọi là pha động đối quang Cơ chế nhận biếtcác đồng phân đối quang đã được nói đến trong nhiều nghiên cứu khoa học trước đây.Nguyên tắc là chất chọn lọc đối quang sẽ tạo dẫn chất với hai đồng phân đối quang

để hình thành ra hai sản phẩm là đồng phân quang học, nhưng không phải là đốiquang (diastereodisomers), như vậy chúng sẽ có tính chất vật lý và hóa lý khác nhaunhiều hơn, do đó có thể tách chúng ra khỏi nhau trong điều kiện sắc ký lỏng bìnhthường

Sự phân tách các đồng phân đối quang được tối ưu hóa bởi các chất chọn lọc đốiquang sẽ dẫn tới sự tạo thành các phức chất đối quang trong pha động, các phức chất

là đồng phân quang học nhưng không đối quang hoặc các chất chọn lọc đối quang sẽbao bọc pha động tạo thành pha tĩnh quang hoạt có khả năng phân biệt và tách cácchất đối quang

Kỹ thuật sắc ký phân tích sẽ được chú trọng và mở rộng nghiên cứu dựa trên nguyêntắc sử dụng chất phụ gia là chất chọn lọc đối quang thêm vào pha động để tách vàđịnh lượng các đồng phân đối quang Bên cạnh đó cũng góp phần giới hạn việc lựachọn các hệ thống phát hiện và các phức chất không bền giữa chất chọn lọc đối quang

và các đồng phân đối quang sẽ dễ dàng được phát hiện bởi các đầu dò khác nhau, mở

rộng khả năng phân tách các chất và ít bị giới hạn hơn so với sử dụng cột sắc kýquang hoạt.

1.4.2 Các tác nhân quang hoạt [5]

Các tác nhân quang hoạt thích hợp với cấu trúc của chất phân tích Để đạt hiệu quảtách tốt, yêu cầu tác nhân phải là chất quang hoạt chọn lọc, cĩ tác động chọn lọc đếnthành phần quang hoạt của mẫu phân tích và tạo cho các thành phần này cĩ linh độđiện di khác, khơng hấp thụ UV ở vùng bước sĩng phát hiện của chất phân tích Trongcác tác nhân quang hoạt được sử dụng để tách đồng phân thì cyclodextrin và các dẫnchất của cyclodextrin là những tác nhân được sử dụng phổ biến nhất

1.4.2.1 Cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) là oligosaccharid vịng được tạo thành từ sự thủy phân tinh bộtbởi xúc tác của enzym cyclomaltodextrin glucopyranose Cấu tạo của các CD gồmcác đơn vị α-D-glucopyranose liên kết với nhau bằng cầu nối α-[1,4]-D-glucoside

Số lượng đơn vị α-D-glucopyranose thường gặp 6, 7, 8 tương ứng với các loại α-CD,β-CD và γ-CD

1.4.2.2 Beta-cyclodextrin

β-CD (hay cịn gọi là cyclomaltoheptaose) là loại CD chứa 7 đơn vị

D-glucopyranose, độ tan trong nước thấp hơn so với α-CD và γ-CD β-CD là dạng CD

được sử dụng thơng thường nhất, rẻ nhất cho dù độ tan là thấp nhất và cĩ giá trị vềthương mại

Dạng β-CD là dạng tự nhiên cĩ độ chọn lọc cao nhất đối với các đồng phân so với

các dạng CD khác, nên trong các cơng trình nghiên cứu về tách đồng phân quang học

bằng các phương pháp GC, HPLC, và CE, phần lớn ứng dụng β-CD và các dẫn chất của β-CD làm chất quang hoạt.

1.4.2.3 Các dẫn chất của β-CD

Sự thay thế nhóm hydroxyl ở vị trí của C2, C3 và nhóm chính C6 bằng các nhómkhác nhau như : alkyl-, hydroxyalkyl-, carboxyalkyl-, amino-, … sẽ tạo ra các dẫn

chất khác nhau β-CD Có nhiều loại dẫn chất của β-CD như: dẫn chất ester, ether,

sulfonat, Tùy theo điều kiện phản ứng có thể tạo ra các dẫn chất thế ở cả ba vị tríC2, C3 và C6; thế ở một vị trí của C2 hoặc C3; hoặc thế ở hai vị trí C2 và C3

Một số dẫn chất thương mại thông dụng của β-CD:

- Heptakis (2,6-di-O-methyl)-β-CD - Polymer carboxymethyl-β-CD

- Heptakis (2,3,6-tri-O-methyl)-β-CD - Sulfat-β-CD

- Heptakis (2,3-diacetyl-6-sulfo)-β-CD - Sulfobutyl-β-CD

- Heptakis (2,3-dimetyl-6-sulfo)-β-CD - Sulfobutyl-ether-β-CD

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG (S)-AML

1.5.1 Một số đề tài nghiên cứu trong nước

- Theo tác giả Lê Thị Thu Cúc, phân tích AML bằng phương pháp CE với các điềukiện [4]

+ Cột mao quản silica nung chảy (chiều dài hiệu quả 54cm, đường kính trong 50µm) duy trì ở nhiệt độ phòng 25 ºC trong suốt quá trình phân tích

+ Dung dịch điện ly nền: : dung dịch TRIS-phosphat 50 mM pH = 2,5 chứa 50 mMhydroxypropyl- β-cyclodextrin

+ Điện thế : 20 kV

+ Nhiệt độ cột : nhiệt độ phòng

+ Thể tích tiêm : 50 mbar x 10s

+ Detector UV : 214 nm

1.5.2 Một số đề tài nghiên cứu ngoài nước

- Theo tác giả Gabriel Hancu trong nghiên cứu phương pháp phân tích đồng phânđối quang của AML bằng phương pháp điện di mao quản (CE) [20]

Điều kiện điện di:

Cột mao quản silica nung chảy, dài 48cm chiều dài hiệu quả 40 cm, đường kính trong

50 µm duy trì ở nhiệt độ phòng 15ºC trong suốt quá trình phân tích

Dung dịch điện ly nền : dung dịch đệm phosphat 50Mm pH 3.0 chứa methyl- β-CD

Nhiệt độ cột : 15 °C

Áp suất tiêm mẫu : 50 mbar

Thời gian tiêm mẫu : 1 s

- Theo tác giả Xie, J., et al và trong nghiên cứu phương pháp phân tích đồng phân đốiquang của AML bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng tác nhân đốiquang [39]

Điều kiện sắc ký

Cột sắc ký : ODS C18 column (150x 4.6 mm i.d., 5 µm, Shimadzu)

Pha động : methanol - nước ( 45:55, v/v) có chứa 7,5 mM SBE-β-CD, 20M 0,3 mM và pH 2.5

Điều kiện sắc ký

Cột sắc ký quang hoạt : WondaSil C18 column (150 x 4.6 mm i.d., 5 µm, Shimadzu)

Pha động : acetonitril - ethanol - DEA (92:8:0.2% v/v/v)

Tốc độ dòng : 0,8 ml/ phút

Đầu dò : PDA -bước sóng phát hiện 240 nm

Thể tích tiêm : 10 µl

Nhiệt độ : nhiệt độ phòng

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Chất chuẩn đối chiếu

Bảng 2.1 Danh mục các chất đối chiếu

tính trên chế phẩm nguyên trạng

- Dung môi hóa chất thuốc thử

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất thuốc thử

STT Tên hóa chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc

2 Methyl- β-cyclodextrin (ME- β-CD) Phân tích Carbosynth (Mỹ)

4 β-cyclodextrin (β-CD) Phân tích

2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ

- Trang thiết bị dụng cụ

Bảng 2.3 Danh mục trang thiết bị, dụng cụ

STT Thiết bị kiểm nghiệm Mã hiệu Nguồn gốc

tris(3-cloro-4-Cột LuxTM Cellulose-3 được nhồi pha tĩnh bất đối cellulose tris(4-methylbenzoat)(250 x 4,6; 5µm).

Cột LuxTM Cellulose-4 được nhồi pha tĩnh bất đối cellulose methylphenyl carbamat) (250 x 4,6; 5µm)

tris(4-cloro-3 Bình định mức, pipet chính xác, pipet paster và các dụng cụ thủy tinh khácdung trong phân tích

- Lọc syringe 0,45 µm, màng lọc millipore 0,45 µm

- Cối chày và nhiều dụng cụ phân tích khác

Các thiết bị phân tích và dụng cụ phân tích đã được hiệu chuẩn đạt quy địnhtheo GLP và ISO/IEC 17025

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng (S)-amlodipin

Dựa vào cấu trúc hóa học của amlodipin là 1 base hữu cơ có khả năng ion hóa ở môitrường acid và qua tham khảo tài liệu [31], kỹ thuật sắc ký lỏng HPLC đã được lựa

chọn với tác nhân đối quang β-CD [19] vả các dẫn chất và qua tài liệu tham khảo [7,

27, 24], quy trình được tiến hành khảo sát như sau:

2.2.1.1.Khảo sát điều kiện sắc ký [21, 22, 23, 25, 26, 33, 34]

Để xây dựng các phương pháp xác định hai đồng phân đối quang của amlodipin trongcác chế phẩm thuốc, chúng tôi đã tiến hành khảo sát thực nghiệm khả năng tách haiđồng phân này trên phương pháp HPLC:

Khảo sát một số điều kiện quan trọng ảnh hưởng trong quá trình tách (thành phần và

tỉ lệ pha động) nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứng các thông số: hai pic

đồng phân phải tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs >1,5; hệ số bất đối As nằmtrong khoảng 0,8-1,5.

Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tíchbao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miềngiá trị, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng Quy trình sau khi được thẩm định

sẽ được áp dụng để định lượng và xác định tạp đồng phân trong một số chế phẩm

(S)-amlodipin trên thị trường

- Dung dịch mẫu chuẩn (S)-amlodipin (250 g/ml): Cân chính xác khoảng 12,5 mg

(S)-amlodipin chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml methanol,

siêu âm 5 phút, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc PTFE0,45µm

- Dung dịch mẫu thử amlodipin (500 g/ml): Cân 20 viên nén amlodipin, xác địnhkhối lượng trung bình viên Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng bột viên tươngứng với khoảng 25 mg amlodipin, cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 mlmethanol, siêu âm 5 phút, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua mànglọc PTFE 0,45µm

- Dung dịch mẫu thử (S)-amlodipin (250 g/ml): Cân 20 viên (S)- amlodipin, xác

định khối lượng trung bình viên Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng bột viên

tương ứng với khoảng 12,5 mg (S)-amlodipin, cho vào bình định mức 50 ml, thêm

khoảng 35 ml methanol, siêu âm 5 phút, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều.Lọc qua màng lọc PTFE 0,45µm

- Dung dịch mẫu placebo: chuẩn bị như dung dịch mẫu thử nhưng thay lượng bộtthuốc bằng lượng tá dược tương ứng trong mẫu thử

Tiến hành tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc kýđồ

Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity and range)

Độ đúng (Accuracy): Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn và tínhthông qua tỷ lệ thu hồi

Độ chính xác (Precision): (Độ lặp lại, độ chính xác trung gian)

Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ khi kiểm tra (R)-amlodipin

2.2.2.1 Tính tương thích hệ thống

Tiến hành: Tiêm 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn có cùng nồng độ, cùng điều kiện Ghi nhậncác thông số: thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), hệ số bất đối (AS), độ phân giải(RS), hệ số dung lượng (k’), số đĩa lý thuyết (N)

- Mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic của mẫu chuẩn

- Phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải giống nhau

- Đạt độ tinh khiết khi kiểm tra độ tinh khiết pic (Peak purity index)

2.2.2.3 Tính tuyến tính

Pha dãy dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ tăng dần chứa nồng độ mẫu thử trong đómẫu thử là 100% Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độchất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương phápbình phương tối thiểu

Sử dụng phân tích hồi quy trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trìnhhồi quy và trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của hệ số trong phương trình hồi quy.Yêu cầu: R2 ≥ 0,995

Giới hạn phát hiện: Dựa vào phương pháp pha loãng Đo tín hiệu thu được từ mẫutrắng (N) và mẫu chuẩn có nồng độ thấp biết trước (S) Giới hạn phát hiện là nồng độthấp nhất của chất cần thử còn phát hiện được bằng quy trình phân tích đang đượcthẩm định tương ứng với tín hiệu của mẫu chuẩn gấp 2- 3 lần tín hiệu mẫu trắng [S/N

= (2-3)/1]

2.2.2.4 Độ đúng

Thêm chính xác một lượng chất chuẩn cần phân tích vào mẫu placebo tương ứng với

3 mức nồng độ 80%, 100%, 120% so với mức nồng độ ghi trong quy trình và nằmtrong khoảng tuyến tính của phương pháp Tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng

độ thực hiện trên 3 mẫu

Độ đúng hay tỉ lệ phục hồi (%) = 𝐿ượ𝑛𝑔 ℎ𝑜ạ𝑡 𝑐ℎ𝑎𝑡 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖

2.2.2.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện: LOD = 3,3 x SDa

- Giới hạn định lượng: LOQ = 10 x SDa

Trong đó a là độ dốc đường chuẩn và SD là độ lệch chuẩn của đáp ứng