Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1

Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của cácloài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhómvirus cúm A gây nên Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chimmang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh Đây là mối nguyhiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác Ngoài ra, chúng còn là nơicung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên các subtype mới Cácsubtype virus cúm A gây bệnh trên người đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể

và biến chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh, trướcđây đã tạo nên những vụ dịch thảm khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại táihiện và gây nên đại dịch mới Năm 2004 các đại dịch cúm gia cầm tại cácnước châu Á (bao gồm dịch do H5N1 gây ra tại Trung Quốc, Nhật, NamTriều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia và Lào; do H7N3(Pakistan); do H5N2 ( Đài Loan) đã gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làmchết hàng chục người ở Việt Nam và tại Thái Lan Chủng H5N1 điển hình ởchâu Á có tính kháng nguyên và di truyền giống với chủngA/Vietnam/1203/04

Để phòng chống sự lây lan mạnh mẽ của đại dịch cúm gia cầm, hàngnăm Việt Nam cần một lượng vaccine rất lớn để tiêm chủng cho hàng trămtriệu con gà vịt Ngoài những công nghệ sẵn có Việt Nam đang tìm kiếmnhững công nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao.Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng đượccác tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem làhướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sứckhoẻ cộng đồng như Việt Nam

Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào cáccây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trongnhững hướng đi chính hiện nay Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũngđược bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấysinh khối tế bào để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp Do tế bào thựcvật có ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàngsản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọnghơn cả tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang các mầm bệnh cho người.

Với mục đích tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúmA/H5N1, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương

pháp khả thi, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá”.

2 Mục tiêu của đề tài

- Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein

vỏ của virus H5N1

- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây

thuốc lá tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens

3 Nội dung nghiên cứu

- Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vàovector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp

- Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ củavirus H5N1

- Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein

vỏ của virus H5N1 và biến nạp vào vi khuẩn A rhizogens.

- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây

thuốc lá tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cúm A/H5N1

1.1.1 Cấu tạo

Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tínhcủa gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra.Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phântype khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt vỏ của hạtvirus Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện,đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tửkhoảng 250 triệu Dal Phân tích thành phần hóa học một virion có chứakhoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là

carbonhydrate Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand (Hình

1)

Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A Ghi chú: A: Các dạng

hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình

cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị

phức hợp enzyme polymerase của virus) C: Cấu trúc của phức hợp

ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA củavirus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bàonhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus Trên bề mặt cókhoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng

10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ

virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các

dấu ấn khác của virus , Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử

NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên

có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảmnhiễm , Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp (reassortment) giữa cácphân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau

về độc tính và khả năng gây bệnh Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quantrọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA),hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm

và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ Các subtype này gây nhiễm chohầu như phần lớn mọi loài sinh vật bao gồm các loài lông vũ (gà, chim vàthuỷ cầm), lợn, ngựa, chồn đất, hải cẩu, cá voi và loài người Trên cơ sởtrình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân đoạn (HA,

NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên

trong vỏ virus, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide, mã hóa cho

11 protein tương ứng của virus (hình 2)

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen (hình trái) gồm 8 gen là 8 đoạn RNA sợi

đơn âm (-ssRNA) và mô hình (hình phải) thể virus cúm H5N1 gồm các protein và các đoạn –ssRNA (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).

1.1.2 Độc lực và tính thích ứng vật chủ

Độc lực gây bệnh của virus cúm A

Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại:Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độclực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồntại trong tự nhiên

- HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơquan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48h sau nhiễm Loại này rất nguyhiểm gây lo ngại cho cộng đồng Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bàophôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin ,

- LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gâybệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết

vật chủ Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tựnhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus cóđộc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAInguy hiểm ,

Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chimhoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tựnhiên rất khó kiểm soát Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủcủa chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên

Hình 1.3 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của

virus cúm A (Nguồn: qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194)

http://www.impe-qn.org.vn/impe-Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm

A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau nhưgia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở

người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm

khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm , , Đặcđiểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi,tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên

(gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có

khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi

chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh

từ gia cầm sang người và giữa người với người , ,

1.1.3 Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1

Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hôhấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổnthương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đócòn được gọi là virus hướng đa phủ tạng Khả năng gây bệnh của viruscúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủngvirus Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn

ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủngcường độc (H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơquan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người, có lẽ do tínhthích ứng thụ thể sialic của chúng , Hầu hết các chủng virus cúm A nhânlên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủngcường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàmlượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúmthực nghiệm trên chuột lang, chuột Hamster, chồn đất ,

Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễndịch chống lại virus bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thểkhông có tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do viruscúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ở

tự nhiên, và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm

A Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính khángnguyên khác với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít

có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới Đây lànguyên nhân làm cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiềulần trong năm, và các đợt dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và cóthể gây nên đại dịch cúm mới Khả năng gây bệnh của biến chủng viruscúm mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể có được đáp ứng miễn dịch đặchiệu với biến chủng đó và chúng trở nên thích nghi lây nhiễm ở loài vậtchủ mới , ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân của cácđại dịch cúm trên người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người Tuynhiên, các chủng này vẫn thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng năm

ở người, do khả năng biến đổi kháng nguyên của chúng Đây cũng chính lànguồn virus trao đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia cầm,

để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trênngười , , ,

1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ

Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm vànhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp,đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [49],

Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợpcủa HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuốicùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm

Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của

tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy

ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi

tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase Thời gian một chutrình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng

vài giờ Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưngcác tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quátrình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vậtchủ ,

Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gencủa virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein củavirus và các RNA vận chuyển Phức hợp protein – RNA của virus được vậnchuyển vào trong nhân tế bào

Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợidương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúngtổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase Các sợi

này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu

5’-và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợpribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào.Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thốngenzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10

- 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’, sau đó được vận chuyển ra bào tương vàdịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus

Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyểngắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện

tượng “nảy chồi” của virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại

nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng các RNP

của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus

gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialicacid Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởngthành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác ,

Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A/H5N1

Nó có tác dụng gắn virus vào tế bào bị nhiễm Tên gọi của HA bắt nguồn

từ việc protein HA có khả năng ngưng kết hồng cầu (hem: bao vây)

16 loại kháng nguyên HA khác nhau được đánh dấu từ 1 đến 16 H16mới được phát hiện ở virus phân lập từ mòng biển đầu đen tại Thuỵ Điển

và Na Uy năm 2005 [15] Ba loại protein HA đầu tiên (H1, H2 và H3) đượctìm thấy phổ biến ở virus cúm người

Cấu trúc:

HA là một glycoprotein

màng tạo thành từ 3 tiểu phần

giống hệt nhau Nó có hình trụ,

dài khoảng 135 Ǻ 3 monomer tạo

thành lõi xoắn alpha ở giữa; 3 đầu

hình cầu chứa vị trí gắn sialic

acid Những monomer HA được

tổng hợp, glycosyl hoá, rồi cắt

thành hai chuỗi polypeptide nhỏ

hơn: HA1 và HA2 Mỗi monomer

bao gồm một chuỗi xoắn dài

HA2 neo bám vào màng virus

-là vùng quyết định độc lực của virus , Protein HA có khối lượng phân tửkhoảng 63.103 Dal (nếu không được glycosyl hóa) và 77.103 Dal (nếu đượcglycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.103 Dal và HA2 là 29.103 Dal) ,

Chức năng: Cho phép nhận biết tế bào đích của động vật có xương

sống và hoàn thành quá trình nhận biết bằng cách gắn kết với thụ thể chứasialic acid của những tế bào này; và cho phép đưa bộ gen của virus vào tế

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc protein 3 chiều của HA (Nguồn:http://vi.wikipedia.org/wiki/Hemagglutinin)

bào đích bằng cách hợp nhất màng endopisome của tế bào chủ với vỏ ngoàivirus

Cơ chế hoạt động: HA gắn kết với phân tử glycoprotein trên bề mặt

của tế bào đích, dẫn đến các phân tử virus kết dính với tế bào vật chủ.Màng tế bào sẽ bao bọc lấy virus và phần màng này sẽ tách ra hình thànhmột màng mới nằm trong tế bào gọi là endosome, endosome chứa virusđược bao gói Tế bào sau đó bắt đầu cố gắng phân giải những thành phầnbên trong endosome bằng cách acid hoá phần bên trong nó và biến nóthành một lysosome (thể sinh tan) Tuy nhiên, ngay khi pH trong endosomexuống 6.0, cấu trúc vốn được gấp lại của phân tử HA trở nên không bền,

mở ra một phần và giải phóng một chuỗi peptide rất kị nước nằm trongphân tử protein Chuỗi fusion protein này hoạt động như một mỏ neo, gắnvào màng của endosome và khoá lại Sau đó, ở pH thấp hơn, phần còn lạicủa HA sẽ gấp lại hình thành một cấu trúc mới, rút mỏ neo lại và kéo màngendosome vào sát màng virus rồi hợp nhất hai màng này Ngay lúc này, cácthành phần của virus, bao gồm RNA genome, tự do hoà vào tế bào chất

1.3 Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/ H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới

1.3.1 Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới

Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên ngườitrong các vụ dịch cúm gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là dovirus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avianinfluenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay và phát sinh nhiều dưới dòng(sublineage) và nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực rất cao , Chủng viruscúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tạiScotland vào năm 1959 Có thể gọi cúm A/H5N1 phân lập năm 1959 tạiScotland là virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-Ck-Scotland-(59)

(H5N1) (số đăng ký: X07869) Từ đó cho đến nay, H5 và N1 đã có thay đổilớn xét về cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch Sau gần 40năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông (1996), vàHồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm màcòn thích ứng và gây chết người bệnh Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003 đếnnay, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gâybệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độtruyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1trước đây , ,

Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thếgiới đã có hàng trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề chongành chăn nuôi và kinh tế Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do viruscúm A/H5N1, mỗi năm một cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúmgia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đếntháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11% Việt Nam và Indonesia là các 2quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 trênthế giới Tính gây bệnh của A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ởchức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứngcủa sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gâybệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến Hàng ngàn công trìnhnghiên cứu về cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt trong 5năm gần đây, trong đó có phát triển công nghệ và các loại vaccine gâymiễn dịch cho gia cầm và chuẩn bị đối phó với đại dịch có thể xảy ra ởngười

Virus cúm A/H5N1 có 3 trong 4 tính chất cần có để tạo một đại dịch:

có khả năng lây nhiễm trên người, gần như tất cả mọi người đều chưa có

đáp ứng miễn dịch bảo vệ và virus có khả năng gây chết cao Trong số 16nước có người chết do cúm gia cầm, Inonesia và Việt Nam được WHO xác

định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúm A/H5N1 có được các điều kiện

thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người.Không giống như dịch cúm A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2002, có thể khốngchế bằng cách tiệu diệt và loại trừ loài gia cầm trong vùng dịch để cắt đứtnguồn lây Cúm A/H5N1 thể độc lực cao giai đoạn 2003 đến nay, với sựxuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan truyền từNam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới, đây vẫn là thách thức đốivới cộng đồng và cần nghiên cứu ứng dụng các phương pháp khác nhau đểkhống chế sự lây truyền một cách có hiệu quả

Theo số liệu thống kê năm 2006, virut cúm gia cầm đã làm số ngườichết ở Indonesia 45 người, Trung Quốc là 8 người, Thái Lan là 3 người, vàcho đến nay, chủng A/Vietnam/1203/2004 (Viet04) là một trong nhữngchủng có độc tính cao nhất ở động vật có vú, như chồn và chuột

Trước tình hình lây lan của dịch cúm A/H5N1 Trên thế giới cũngnhư ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu như:

Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus

cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từnhững tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003 Những chuỗigen giúp xác định phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã đượcViện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch

tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen , [44] Trên

cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng địnhnguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Namcùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc Các biến chủng H5N1của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc,

Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng(A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biếnchủng thuộc dòng Quảng Đông Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở giacầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biếnđổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từvùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông Các chủng phân lập những năm2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệphân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhómvùng Trung Quốc và Hồng Kông , Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủngH5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn

đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồngkháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng QuảngĐông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch

Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phânbiệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệtcác phân type HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kếthợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới Phát hiện nhanh H5N1 và các phântype khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh họcphân tử đã được xây dựng thành phương pháp Nghiên cứu vaccine và miễndịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạochế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợptrên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam

Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ sinh học được giao

đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm” và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm

A/H5N1 cho gia cầm tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” trong giai đoạn

2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương

(VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung ương II (NAVETCO), Trung tâmKiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccinesản xuất từ chủng NIBRG-14

1.3.2 Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới

Trong tự nhiên, “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” là các hiện tượng xảy ra liên tục theo thời gian, còn “trộn kháng nguyên” tái tổ hợp

subtype Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) thường định kỳ xảy

ra giữa các loài mắc nhằm tạo nên các biến thể virus cúm mới mà hệ miễndịch của cơ thể vật chủ không có khả năng nhận dạng đáp ứng và kịp hìnhthành miễn dịch H5N1 sử dụng thụ thể sialic xâm nhập tế bào .Hemagglutinin cùng với protein enzyme neuraminidase, được xác định làprotein có vai trò kháng nguyên và độc lực và các protein kháng nguyên

có nguồn gen từ các chủng H5N1 của Việt Nam, cũng được nghiên cứu sảnxuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp và sử dụng với các mục đích khác nhau, trong

đó có thử nghiệm làm kháng nguyên kích thích miễn dịch và chẩn đoán

Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tínhchiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch Đối với dịchcúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu pháttriển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, màcòn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của khángnguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiềuloại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúmđúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào Có nhiều loại kháng thể, nhưngtrước hết chỉ kháng thể kháng HA(H5) có vai trò tiên quyết quan trọng

trong quá trình trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch Các vaccine phòngbệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống vàvaccine thế hệ mới

Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại

vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như

chủng gây bệnh trên thực địa Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous

vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giốngchủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng

Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang

được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:

Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus

đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virustype H5N1 và H7N1 Ví dụ, hãng Merial của Pháp sản xuất vaccineTrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2),

sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi

Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và

tách chiết làm vaccine

Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc

Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép genkháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làmvaccine phòng chống virus cúm A/H5N1

Vaccine DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA,

NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen

Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật

di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ

gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi

bằng kỹ thuật gen Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới(WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sảnxuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC),VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC) Hai chủng cúmA/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1)hoặc A/Vietnam/1203/2004(H5N1) Trung Quốc cũng là nước sản xuấtnhiều giống virus vaccine chống cúm, ví dụ, Viện Nghiên cứu Thú yHarbin (Cáp - Nhĩ - Tân) đã thành công trong việc tạo giống vaccine vôhoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủngA/Turkey/England/N-28/73(H5N2), loại subtype H5N2 có độc lực yếu; haygiống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1 từchủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu Các loạivaccine này đã được nhập và sử dụng tại Việt Nam từ năm 2006 cho đếnnay

Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14: Chủng NIBRG-14 là giống

virus vaccine nhược độc (attenuated vaccine) thế hệ mới, thuộc loại hìnhvaccine được xóa gen bằng công nghệ gen (gene-deletion vaccines), đượclắp ráp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics –basedtechnology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà Phương pháp

di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus nhân tạo nhược độclàm vaccine, cụ thể hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG-14 này được tái tổhợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/MountSinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làmnền, còn các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúmcường độc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam(A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 đã bị

đột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số đột biến điểm ở

các bộ mã ở hai đầu của vùng “độc”, làm thay đổi 3 amino acid tại vùng

gây độc Như vậy về mặt miễn dịch học, mặc dù virus được xử lý làm mấtđộc tính gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên

bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã lấy mẫu ban đầu, do vậy, cókhả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1gây bệnh trong tự nhiên

1.4 Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens và ứng dụng

1.4.1 Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens

Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc nhóm Gram (-), yếm

khí, khi xâm nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn này gây ra các triệu

chứng bệnh trên thực vật như tạo khối u hay lông rễ Agrobacterium thuộc

họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogens, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi Trong đó A tunefaciens và A rhizogenes là hai loài

được nghiên cứu nhiều nhất là vi khuẩn gây ra bệnh khối u (crown gall) vàbệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm

Tác nhân gây bệnh của hai loài vi khuẩn trên đã được xác định là do

sự có mặt của Ti (tumour inducing) ở A tumefaciens và Ri (root-inducing)

ở A rhizogenes Khi tế bào thực vật bị thương, sẽ tiết ra các polyphenol

hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển đoạn DNA (transfer DNA) từ plasmid hay R-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ Nhìn chung, cơ chếcủa quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của hai loài vi khuẩn này được chính minh là

T-tương tự nhau Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn A tumefaciens

do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định Trong khi đó các gen mã hóa

sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá

trình hình thành rễ tơ ở thực vật ,

Giống như Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợikép, có trọng lượng phân tử lớn, từ 200 - 800 kb, gồm hai vùng chính là T-DNA và vir (virulence) Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ

- nguồn cacbon và nito cho vi khuẩn Ri-plasmid được chia làm hai nhómchính: agropine và mannopine và một số nhóm phụ được tìm thấy và phân

loại sau này như: cucumopine và mikimopine Trong đó các chủng thuộc

nhóm agropine (A4, 15834, LBA9402, 1855) được chứng minh là độc hơn

so với các chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủngnày được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật ,

T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính làvùng biên trái TL-DNA và biên phải TR-DNA Hai vùng này đều có kíchthước khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNAnày sẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ Vùng TR-DNAmang các gen mã hóa tổng hợp DNA (tms1 và tms2), vùng TL-DNA baogồm 18 khung đọc (ORFs) trong đó có bốn loci 10, 11, 12 và 15 mã hóacho rol A, B, C và D (root locus) Các Ri-plasmid của các chủng

A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa

vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống như vùng TL-DNA của các chủngthuộc nhóm agropine nhưng khuyết gen rolD ,

Các gen rolA, rolB and rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trìnhcảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật Sự biểu hiện đồng thời của ba gennày gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Các rễ tơđặc điểm sinh trưởng, phân nhánh mạnh và phát triển nhanh hơn rất nhiều

so với rễ bình thường Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quantrọng hơn cả, khi gen rolB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứngtạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo được kiểuhình rễ tơ

1.4.2 Hệ vector nhị thể

Kích thước lớn của Ri-plasmid và Ti-plasmid gây nhiều khó khăntrong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium và trong các thao tác

sử dụng để thiết kế gen vào các vector này Mặt khác các enzyme giới hạn

có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi công nghệgen lại cần những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzyme giới

hạn Thêm vào đó, ở A.tumefaciens, một số gen mã hóa sinh tổng hợp

auxin được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội nhưng lại cản trở quá

Hình 1.6 Cấu trúc Ri plasmid

trình tái sinh bình thường ở thực vật Với các lí do trên đây, các nhà khoahọc đã cải tiến Ti-plasmid thành một hệ vector nhị thể gồm có vectorchuyển gen (mang cấu trúc T-DNA) và vector bổ trợ (mang các gen vir)đảm nhiệm chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật

Vector chuyển gen trong hệ vector nhị thể ở A.tumefaciens có thể sử dụng để chuyển gen thông qua A.rhizogenes Khi nhiễm A.rhizogenes với

thực vật sẽ làm chuyển T-DNA từ vector chuyển gen cùng với T-DNA của

A.rhizogenes vào genome thực vật

Sự tái sinh thành cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogenes có

thể xảy ra thông qua sự phát triển phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan từ

rễ Tuy nhiên, thực vật tái sinh từ lông rễ thường bị biến đổi hình thái: lá bịgấp nếp, hệ thống rễ ăn nghiêng, sinh trưởng cằn cỗi và khả năng sinh sảnkém

Hình 1.7 Hình ảnh tạo khối u gây ra do A tumefaciens (trái) và

rễ tơ do A rhizogenes (phải).

1.4.3 Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp

Tế bào thực vật nói chung và rễ tơ nói riêng với ưu thế nuôi cấy dễdàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượngsinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thựcvật không mang các mầm bệnh cho người , được xem là một trong những

xu hướng hiện nay được sử dụng để biểu hiện các dược phẩm sinh học tái

tổ hợp Đặc biệt rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trườngkhông cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dưlượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra Hơn nữa các rễ tơ có thểđược nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyềnsản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp Thêm vào

đó, so sánh với thực vật chuyển gen, nuôi cấy mô tế bào thực vật có ưuđiểm lớn trong công tác sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp làkhông đòi hỏi diện tích canh tác, không chịu ảnh hưởng vào khí hậu, mùa

vụ, sản phẩm thu được không mang các yếu tố độc hại từ thuốc trừ sâu,thuốc diệt cỏ và rút ngắn được rất nhiều thời gian trong trồng trọt Đặc biệthơn cả ở hệ thống nuôi cấy lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dượcphẩm sinh học tái tổ hợp ra ngoài môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giảnhơn rất nhiều trong quá trình tinh sạch các dược phẩm sinh học này

Cho tới nay, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất thành công các proteintái tổ hợp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơnhư SEAP (human secreted alkaline phosphatase) , protein huỳnh quangkết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B) , fungal phytase , và đặc biệt hơn

cả là các kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể , (hình1.8)

Hình 1.8 Nuôi cấy rễ tơ G.glabra

a: bằng hệ thống bioreactor

b, c: thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy

(Nguồn:http://www.ejbiotechnology.info/content/vol11/issue2/full/6/ f4.jpg&imgrefurl)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

- Chủng vi khuẩn E coli One Shot TOP 10 (Invitrogen)

- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 (Viện Sinh học phân tử

và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức)

c Các vector:

- HA của virus H5N1 đã được tối ưu hóa mã để biểu hiện ở thực vật doViện Công nghệ sinh học cung cấp

- Vector chuyển gen pK7WG2D(1) (phụ lục 2)

- Vector pENTRTM221/calnhận từ Viện Sinh học phân tử và Dược học,Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức Vector này được thiết kế mang đoạnsignal peptide calreticulin nằm giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai

điểm cắt của enzyme giới hạn là SacI và HindIII nằm ở đầu 3’ của đoạn tín

hiệu dẫn (phụ lục 2)

- Vector chuyển gen pPTN289 mang gen gus được sử dụng để kiểm tra

qui trình chuyển gen sử dụng trong nghiên cứu (phụ lục 2)

2.1.2 Hóa chất

a) Các môi trường nuôi cấy:

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB, YMP

- Môi trường nuôi cấy thực vật: WPM, MS

Thành phần của các loại môi trường được trình bày trong phụ lục 1

b) Các loại kháng sinh: Kanamycin, Cefotaxim, Carbecillin, Spectinomycine c) Một số hóa chất khác: Kit tinh sạch DNA -AccuPrep® Gel Purification Kit,Gateway® LR ClonaseTM II, thang DNA 1kb và các loại enzyme giới hạnSacI, HindIII Các hóa chất được cung cấp bởi các hãng: New EnglandBiolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals(Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Invitrogen (Mỹ).

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng,bình nuôi cây, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH, máyquang phổ…

Một số thiết bị dùng trong sinh học phân tử: máy PCR System 9700(Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máychụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy xung điện Gel Pluser, máy hút chânkhông , cùng với các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào thựcvật và Phòng thí nghiệm trọng điểm gen, Viện Công nghệ sinh học

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR

a Thiết kế mồi cho gen HA1

Cơ sở lý thuyết

Mồi là các đoạn trình tự dài 15 - 30 nucleotide có khả năng bắt cặp vớitrình tự bổ sung tương ứng, có vai trò làm điểm khởi đầu cho quá trình tổnghợp chuỗi nucleotide trong phản ứng PCR theo chiều 5’ - 3’ Mỗi đoạn genđược nhân lên nhờ một cặp mồi đặc hiệu nằm ở hai đầu đoạn gen đó

Phương pháp

Cặp mồi HA1_SacI_F (5’-GGGGAGCTCGATCAGATCTGCATTGGAT-3’)

và HA1_HindIII_R (5’-GGGAAGCTTTTACCTTCTTTCTCTCTGTGG-3’)

được thiết kế với mục đích khuyếch đại vùng gen HA1 dựa vào trình tự genHAop (pUC18/HA1) (phụ lục 3).

b Kỹ thuật PCR

Cơ sở lý thuyết

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗipolymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình

tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq DNA

polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA quan tâm lên hàngtriệu lần

Phương pháp

Cấu trúc gen HA1 được nhân lên bằng kỹ thuật PCR_với cặp mồi đặchiệu HA1_Sacl_F/HA1_HindIII_R/HA1 Để đảm bảo độ chính xác cao chothí nghiệm, chúng tôi sử dụng Pfu DNA polymerase để thay thế Taq-polymerase trong phản ứng PCR Sản phẩm PCR được chạy điện di kiểm trabằng gel agarose 0,8%, sử dụng đệm TAE 1X trước khi tiến hành các bước thínghiệm tiếp theo

Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen HA1 quan tâm từ HAop đượctiến hành với thành phần được trình bày trong bảng 2 1 và chu kỳ nhiệt trongbảng 2.2 Trong đó, nhiệt độ gắn mồi được xác định dựa trên nhiệt độ bắt mồicủa cặp mồi đã được thiết kế

8 Primer R 4

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

của enzyme giới hạn là SacI và HindIII nằm ở đầu 3’ của đoạn tín hiệu dẫn.

Hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 sẽ phục vụ cho bước thiết kế vector chuyểngen bằng công nghệ Gateway cloning (mục 2.2.4) Trên vector còn có genkháng kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi M13, phục vụ cho việc chọnlọc các dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn

- Sản phẩm PCR – đoạn gen HA1 (mục 2.2.1) được tinh sạch theo bộkit AccuPrep® PCR Purification Kit (Bionner)

1 AATGCCAACT TTGTACAAAA AAGCAGGCTC ATTTAACTTT

121 CGTCGCTGTC GTCTCCGCTG AGCTCTCTAG AAAGCTTGACCCAGCTTTCT TGTACAAAGT

TGGC CCC

Hình 2.1 Cấu trúc attL1_Cal/SacI&HindIII/attL2 nằm trong vector pENTR/Cal

- Phản ứng cắt enzyme giới hạn: Đoạn gen HA1 và pENTR/cal được cắt bằng

enzyme giới hạn SacI và Hind III theo bảng 2.3

b Phản ứng lai ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal

Sản phẩm PCR – đoạn gen HA1 được ghép nối vào vector pENTR/caltạo plasmid tái tổ hợp mang gen HA1 (ký hiệu pENTR/cal/HA1)

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 220C trong 1 giờ 30 phút

Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tếbào khả biến E.Coli DH5α

2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt

a Chuẩn bị tế bào khả biến

- Cơ sở lý thuyết

Tế bào nuôi cấy trên môi trường mới đến đầu pha log và được làm sạchnhờ việc rửa nhiều lần bằng CaCl2 0,1M Dưới tác dụng của muối CaCl2,thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA

có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột Tế bàochứa DNA tái tổ hợp có khả năng biểu hiện các gen kháng kháng sinh nênđược chọn lọc trên môi trường chứa chất kháng sinh đó

- Phương pháp tạo tế bào khả biến

Tế bào khả biến E coli One ShotTOP 10 được tạo theo phương pháp

của Sambrook và cộng sự (1998) có cải tiến ở bước rửa cặn khuẩn trong CaCl20,1M sau khi ly tâm Bước này được lặp lại ba lần, để trong đá lần đầu và thứhai 30 phút, lần thứ ba 45 phút

b Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli DH-5α

Sản phẩm phản ứng ligation được biến nạp vào tế bào khả biến E.ColiDH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt Quá trình biến nạp được thực hiện nhưsau:

• Bổ sung 5 µl sản phẩm phản ứng lai vào tế bào khả biến và đảo nhẹ

• Ủ trong đá 15 – 30 phút

• Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây

• Để trong đá 15 - 30 phút

• Bổ sung 200 µl LB lỏng

• Nuôi lắc 200v/phút ở 370C trong 1giờ

• Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọnlọc (Kanamycin 50 mg/L)

• Nuôi qua đêm ở 370C

c Kiểm tra khuẩn lạc dương tính bằng kỹ thuật colony PCR

Kỹ thuật colony-PCR cũng giống như PCR, nhưng chỉ khác là mẫuDNA được thay bằng khuẩn lạc Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vikhuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm

khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu

d Đọc trình tự

Để chắc chắn rằng plasmid pENTR/cal/HA1 có mặt trong các dòngkhuẩn lạc và đoạn gen HA1 ghép nối chính xác, chúng tôi tiến hành đọc trình

tự các pENTR/cal/HA1 sử dụng cặp mồi đặc hiệu M13F/R

e Tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang pENTR/cal/HA1 đã đượckiểm tra đọc trình tự trong môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin 50mg/L ở 370C qua đêm Các tế bào E.coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến

pha cân bằng thì được ly tâm thu cặn Thành và màng tế bào được phá vỡbằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt Sau đó, DNA hệ gen và protein đượctủa lại bằng muối potassium acetate và SDS, phần tủa bị loại bỏ khỏi dungdịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm Dịch DNA được cố định trên màng củacột tinh sạch, sau khi rửa và hòa tan trong nước, DNA được thu lại bằng lytâm tốc độ cao

Phương pháp tách chiết plasmid được thực hiện theo protocol của kitPlasmid Extraction Kit (Bionner) hoặc theo Sambrook và cộng sự (1998)

2.2.4 Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway

a Cơ sở lý thuyết

Kỹ thuật Gateway là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó mang lại hiệu

quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện protein và dònghóa đoạn DNA Dựa vào điểm đặc hiệu trong hệ thống tái tổ hợp của phage I

Kỹ thuật Gateway cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng

khác nhau trong khi vẫn duy trì định hướng chính và cấu trúc đọc, thay thếviệc sử dụng enzym cắt giới hạn và enzym nối hiệu quả Kỹ thuật này là mộtphương pháp có hiệu quả cao cho việc tách dòng có định hướng của các sảnphẩm PCR

Kỹ thuật này gồm có hai loại phản ứng LR và BP (Invitrogen) Trongnghiên cứu này phản ứng LR được thực hiện giữa vector tiếp nhận và vectorđích pK7WG2D (1) dưới sự xúc tác bởi hỗn hợp enzym LR ClonaseTM II Đoạn gen cần quan tâm sau khi đưa vào vector tiếp nhận (ví dụ,pENTR/HA1), ở bên sườn có hai điểm tái tổ hợp (attL1 và attL2) Chuyểnđoạn gen quan tâm vào vector đích (ví dụ, pK7WG2D (1)), vector này chứatất cả trình tự cần biểu hiện và cũng chứa hai điểm tái tổ hợp (attR1 và attR2)

ở giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính ccdB Trộn hai plasmid, att1 vàatt2 là hai điểm định hướng và đặc hiệu để tái tổ hợp, mỗi một điểm trênvector này chỉ tái tổ hợp với một điểm tương ứng trên vector kia mà khôngkết hợp với vị trí khác, nhưng nó sẽ kết hợp với những điểm xác định theo thứ

tự phân tử., vì vậy, attL1 phản ứng với attR1, còn attL2 phản ứng với attR2.Hai sự tái tổ hợp này tạo ra dòng biểu hiện, một là giữa attL1 và attR1 thứ hai

là attL2 và attR2 Sản phẩm của hai sự tái tổ hợp sẽ tạo ra một plasmid nhưmong muốn và các sản phẩm phụ Plasmid mới có hai sự lựa chọn: Khángkháng sinh và chọn lọc âm tính Vì vậy, tế bào sau khi được biến nạp sảnphẩm LR đều là những dòng khuẩn lạc dương tính trên môi trường có khángsinh chọn lọc

Tuy nhiên, để xác định chính xác các plasmid tái tổ hợp mới được tạothành đúng như mong đợi, các phản ứng cắt bằng enzym giới hạn và PCRcũng sẽ được thực hiện

b Phương pháp

Vector pK7WG2D là vector đích nằm trong hệ thống Gateway Với 2

vị trí tái tổ hợp attR1, attR2 và gen ccdB - gen mã hóa plasmid F gây ức chế

sự sinh trưởng của tế bào E.Coli Khi thực hiện phản ứng LR, hai vị trí này sẽđược trao đổi với 2 điểm tái tổ hợp khác trên vector pENTR/HA1 là attL1 vàattL2 Kết thúc phản ứng sẽ tạo được dòng biểu hiện mà gen cần chèn nằmgiữa hai vị trí attB1 và attB2 Cấu trúc vector pK7WG2D được trình bày tạiphụ lục 2

- Bổ sung 300 µl YMP lỏng, nuôi lắc 200 v/p trong 1 giờ ở 280C.

- Cấy trải 50 - 100 µl khuẩn lên môi trường YMP đặc có bổ sung khángsinh chọn lọc cefotaxim 500 mg/L Ủ đĩa 2 ngày ở tủ 280C

* Chọn dòng bằng colony-PCR

Lựa chọn 10 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa chứa kháng sinh chọn lọc đểthực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu HA1_Sac I_F vàHA1_Hind III_R Phản ứng này được thực hiện tương tự như phản ứng PCRthông thường, chỉ khác là DNA được thay bằng dịch khuẩn Sản phẩmcolony-PCR được điện di kiẻm tra trên gel agarose 0,8%

Chọn các khuẩn lạc dương tính với phản ứng colony-PCR để tiến hànhnuôi lỏng trong môi trường YMP qua đêm ở 280C (50 ml YMP lỏng có bổsung 100 µl cefotaxim 500 ml/L) Dịch khuẩn sử dụng cho việc tách chiếtplasmid Sau đó, thực hiện phản ửng cắt plasmid tách được bằng hai enzyme

- Vector chuyển gen mang gen mong muốn sẽ được sử dụng để chuyển

vào vi khuẩn A rhizogenes bằng xung điện tạo vector tái tổ hợp

2.2.5 Biến nạp vector chuyển gen vào A rhizogenes ATCC15834

a Chuẩn bị tế bào khả biến A rhizogenes ATCC15834

50 ml tế bào vi khuẩn A rhizogenes nuôi cấy trên môi trường mới đến

đầu pha log được thu lại bằng ly tâm lạnh Cặn của tế bào vi khuẩn được làmsạch bằng cách rửa nhiều lần bằng nước khử ion và glyxerol 10% đã đượclàm lạnh trước Các thao tác được thực hiện trong box vô trùng Bước cuốicùng bổ sung 0,5 ml glycerol 10% chia đều 50 µl vào 10 ống eppendorf vàgiữ ở tủ -850C

b Phương pháp biến nạp bằng xung điện

Cơ sở lý thuyết

Dưới tác động của điện trường cực lớn, lỗ màng tế bào mở ra, nhờ đóDNA di chuyển theo điện trường dễ dàng xâm nhập vào tế bào Khi ngừngxung điện, cấu trúc màng tế bào hồi phục trong môi trường LB và giữ DNAlại trong tế bào Tế bào chứa DNA tái tổ hợp có khả năng biểu hiện các genkháng kháng sinh nên được chọn lọc trên môi trường chứa chất kháng sinhđó

Phương pháp

- Rửa cuvette bằng cồn 700, rửa lại bằng nước khử ion vô trùng rồithấm khô

- Tế bào khả biến đặt trong đá 15 phút

- Bổ sung 1 µl plasmid vào 50 µl tế bào khả biến và trộn nhẹ

- Chuyển tất cả hỗn hợp dịch tế bào khả biến và plasmid vào cuvette

- Xung điện: 2,5 kV, 25 µF, 200 Ω

- Bổ sung 500 µl YMP và mix nhẹ

- Chuyển sang ống eppendoft 2ml

- Nuôi lắc ở 280C trong 1 giờ.

- Chuyển dịch ra đĩa môi trường YMP bổ sung 100 mg/LSpectinomycine

Sự có mặt của vector chuyển gen được kiểm tra bằng phản ứng PCR (mục 2.2.3 c) với cặp mồi đặc hiệu hoặc bằng phản ứng cắt bởi enzymegiới hạn SacI và HindIII (mục 2.2.2 a)

colony-2.2.6 Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa protein vỏ virus vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834

a Cơ sở lý thuyết

A rhizogenes là vi khuẩn mang thành phần Ri plasmid có thể chuyển

một gen mong muốn vào genome tế bào thực vật

Chủng A rhizogenes ATCC15834 mang vector chuyển gen nhị thể, vùng

vir được thiết kế sẵn trong tế bào vi khuẩn, trong khi T-DNA là vector chuyểngen pK7WG2D (1) mang cấu trúc HA1 vừa thiết kế được chuyển vào tế bàobằng xung điện

b Quy trình

Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá N tabacum K326 thông qua vi khuẩn A Rhizogenes ATCC15834 được tiến hành theo phương pháp của

Topping có cải tiến (Topping, 1998) Các bước chính như sau:

- Chuẩn bị chủng A rhizogenes ATCC15834 mang cấu trúc HA1: một

ngày trước khi biến nạp, nuôi một khuẩn lạc vào 5 ml YMP lỏng có bổ sungcefotaxim 500 mg/L, nuôi lắc 200 v/p ở 28oC

- Chuẩn bị mảnh lá thuốc lá có kích thước 1 cm2 được làm tổn thươngbằng lưỡi dao cắt bốn cạnh xung quanh, đặt trên môi trường WPM trong 2ngày

- Hút 1 ml dịch khuẩn nuôi lỏng ở trên cho vào 50 ml YMP lỏng, đoOD600 = 0,7 - 1 là có thể được sử dụng cho biến nạp

- Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên môi trường WPM, đượcnhặt ra một bình tam giác mới có bổ sung 5 ml MS.

- Đổ dịch khuẩn vào bình tam giác có chứa các mảnh cấy lá thuốc lá ởtrên

- Sau 30 phút chuyển các mảnh cấy lên giấy thấm đã khử trùng, thấmkhô và cấy lên môi trường WPM Sau 2 ngày chuyển sang môi trường WPM

có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/L và kanamycin 100 mg/L

- Sau 2 - 4 tuần các mảnh cấy bắt đầu cảm ứng tạo rễ được cắt và chuyểnsang môi trường WPM có bổ sung cefotaxim 400 mg/l và kanamycin 100 mg/l

2.2.7 Phương pháp đánh giá cây trồng chuyển gen

a Sàng lọc cây chuyển gen bằng chất chọn lọc

Do không phải toàn bộ các tế bào và các mẫu chuyển gen đều manggen chuyển nên nhất thiết phải tiến hành sàng lọc các tế bào chuyển gen Dựavào các gen chọn lọc được thiết kế trong vector chuyển gen mà người ta sửdụng các kháng sinh phù hợp để thu được các tế bào, mẫu mang gen chuyển.Gen chọn lọc điển hình là các gen mã hóa cho các loại enzyme có khả năng

khử độc đối với kháng sinh như kanamycin (nptII), hygromycine (hyg), gentamycine (gent),… hoặc chất diệt cỏ glyphosate hay basta (bar),… Chỉ

những tế bào mang gen biến nạp có thể sống sót trên môi trường chứa chấtkháng sinh hoặc chất diệt cỏ Các loại vector này đã được ứng dụng và manglại thành công trong việc chọn lọc nhiều đối tượng cây trồng chuyển gen nhưcây đu đủ, cây hồng, cây lúa, cây bông vải, cây thuốc lá, … , , , ,

b Phương pháp nhuộm mô tế bào

Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự của mặt của sản phẩm thôngqua một loại gen chỉ thị được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật là

gen gus hay gen uidA Gen gus nằm ở locus uid của vi khuẩn E coli và mã