Nghiên cứu bán tổng hợp chất trung gian trong quy trình tổng hợp thuốc chống ung thư vinblastin từ catharathin và vindolin chiết tách từ cây dừa cạn (catharanthur roseus)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG MAI VĂN ĐẠT NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CHẤT TRUNG GIAN TRONG QUY TRÌNH TỔNG HỢP THUỐC UNG THƯ VINBLASTIN TỪ CATHARATHIN VÀ VINDOLIN CHIẾT TÁCH TỪ CÂY DỪA CẠN CATHARANTHUR R

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

MAI VĂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CHẤT TRUNG GIAN TRONG QUY TRÌNH TỔNG HỢP THUỐC UNG THƯ VINBLASTIN TỪ CATHARATHIN VÀ VINDOLIN CHIẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đà Nẵng – Năm 2012

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

MAI VĂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CHẤT TRUNG GIAN TRONG QUY TRÌNH TỔNG HỢP THUỐC UNG THƯ VINBLASTIN TỪ CATHARATHIN VÀ VINDOLIN CHIẾT TÁCH TỪ CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUR ROSEUS )

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH TRẦN VĂN SUNG

Đà Nẵng – Năm 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất

kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả luận văn

MAI VĂN ĐẠT

MỤC LỤC

2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC

3.1.2 Thiết bị 31 3.2 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC CHẤT TRUNG GIAN TRONG

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CÁC KÝ HIỆU

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon-13

EI-MS Phổ khối ion hóa bằng va chạm electron

ESI-MS Phổ khối lượng ion hóa bụi điện tử

bảng Tên bảng Trang 4.1 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 57 43 4.2 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 59 52

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số hiệu

1.2 Một số alkaloid tiêu biểu trong cây dừa cạn 12

1.11 Sơ đồ tổng hợp vinblastin 1 từ catharanthin 3 và vindolin 4 23 1.12 Sơ đồ tổng hợp (±)-catharanthin của Raucher và cộng sự 24

1.14 Tổng hợp vinblastin 1 từ hai tác nhân chìa khóa 4 và 41 25

1.17 Sơ đồ tổng hợp toàn phần vinblastin 1 27

3.1 Sơ đồ tổng hợp các hợp chất trung gian trong quy trình

4.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 56 39 4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 56 40 4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất 56 41

4.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 57 45 4.7 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 57 46 4.8 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 57 47 4.9 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất 57 48 4.10 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất 57 49

4.13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 59 54 4.14 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 59 55 4.15 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 59 56 4.16 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất 59 57 4.17 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất 59 58

4.18 Phổ khối ESI-MS của chất 59 59

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi trường bị ô nhiễm đó là điều kiện sống thay đổi và thói quen sinh hoạt của con người có nhiều bất lợi cho sức khỏe, Những yếu tố này đã tác động đến sức khỏe con người, làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh, mà trong đó có nguy cơ các tế bào bị biến đổi Đây là một trong những nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày càng tăng Vì thế, một trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học là nghiên cứu, cải tiến các biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng sống cho người bệnh

Vinblastin là một loại thuốc được sử dụng để điều trị bệnh ung thư thông qua phương pháp hóa trị liệu Đây là hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, được tách ra từ lá dừa cạn Hoạt chất này có khả năng chống phân bào được sử dụng kết hợp với một số loại thuốc khác để điều trị nhiều loại ung thư như ung thư bạch cầu, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn, các u bạch huyết,… Tuy nhiên, vinblastin lại có hàm lượng rất thấp chỉ chiếm khoảng 0,01% trong

lá dừa cạn khô và quá trình phân lập hợp chất này rất tốn kém, đầy khó khăn

và hiệu suất thấp [15], [16] Chính vì những yếu tố này nên vinblastin luôn là đối tượng quan tâm của các nhà khoa học Nhiều phương pháp tổng hợp vinblastin đã được nghiên cứu bao gồm: nuôi cấy tế bào [15], công nghệ chuyển hóa [31], bán tổng hợp và tổng hợp toàn phần Trong các phương pháp trên, phương pháp bán tổng hợp tận dụng 2 alkaloid phụ trong quá trình phân lập vinblastin từ dừa cạn là catharanthin và vindolin được quan tâm nhiều nhất Đây là 2 alkaloid có hàm lượng cao hơn vinblastin (trong 1 tấn nguyên liệu thực vật khô tách được 400 g catharanthin và 800 g vindolin [15]

và có khả năng ghép đôi để tạo thành vinblastin Do đó việc nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin là rất cần thiết

Vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “nghiên cứu bán tổng hợp chất trung gian trong quy trình tổng hợp thuốc chống ung thư vinblastin từ catharathin và vindolin chiết tách từ cây dừa cạn”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Luận văn này là một phần của đề tài nghiên cứu thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020” Những nội dung sau đây dự định sẽ được nghiên cứu trong quá trình thực hiện luận văn:

2.1 Thu thập tài liệu, thông tin

Thu thập các tài liệu đã công bố trong nước và trên thế giới liên quan đến cây Dừa cạn, tổng hợp vinblastin

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu quy trình tổng hợp bốn chất trung gian 56, 57, 58 và chất

59 trong quá trình tổng hợp thuốc chống ung thư vinblastin từ catharathin và vindolin, chiết tách từ cây dừa cạn

- Các chất tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC), sắc ký lỏng gắn với khối phổ (LC/ MS)…

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 Phương pháp tổng hợp hữu cơ cơ bản

4.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng theo dõi quá trình phản ứng

4.3 Phương pháp phân lập và tinh chế: Sử dụng sắc kí cột trên silicagel với các hệ dung môi rửa giải phù hợp kết hợp với kết tinh

4.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ: Sử dụng kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FTIR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H, 13C-NMR

5 BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN

Ngoài phần mở đầu, kết luận, các danh mục tài liệu tham khảo và phụ lục, nội dung luận văn chia làm 4 chương

Chương 1 trình bày tổng quan của tài liệu

Chương 2 nêu nguyên liệu hoá chất và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày phần thực nghiệm của đề tài

Chương 4 trình bày kết quả nghiên cứu và thảo luận của đề tài

6 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

Cây dừa cạn còn có tên là bông dừa, hải đằng Tên khoa học là Catharanthus roseus (L.) G – Don [Apocynaceae] là loại cây cỏ cao khoảng

40 – 60 cm Thân mềm tẽ nhiều cành nên cây thường nghiêng về một phía Hoa có 5 cánh màu phớt hồng hoặc màu trắng Cây có nguồn gốc ở

Madagasca (châu Phi), được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam để làm cây cảnh Cây dễ trồng, phát triển nhanh nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta Dáng cây đẹp, mềm mại, lá xanh mướt, hoa rực sáng

Vinblastin là hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, được tách ra từ lá dừa cạn Hoạt chất này có khả năng chống phân bào được sử dụng kết hợp với một số loại thuốc khác để điều trị nhiều loại ung thư như ung thư bạch cầu, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn, các u bạch huyết ,…

Tuy nhiên, vinblastin lại có hàm lượng rất thấp chỉ chiếm khoảng 0,01% trong lá dừa cạn khô và quá trình phân lập hợp chất này rất tốn kém, đầy khó khăn và hiệu suất thấp làm cho giá thành của sản phẩm rất cao

Từ các kết quả khảo sát sơ bộ của Viện Hóa học công nghiệp, kết hợp so sánh và tham khảo các tài liệu nước ngoài, chúng tôi nhận thấy rằng với công nghệ chiết suất hiện đại hiệu suất thu hồi khoảng 40%, trên giống dừa cạn tốt nhất (có hàm lượng vinblastin 0,014% tính theo khối lượng lá khô – tương đương với Madagasca), chi phí tối thiểu để phân lập 1 gam vinblastin vẫn còn lớn hơn 200 USD, trong khi đó giá xuất xưởng của Eli Lilly, Geoden Richer

và của Cipla chỉ dao động trong khoảng 120 – 135 USD/1 gam vinblastin sunfat Như vậy nếu thuần túy chỉ dựa vào chiết – tách, các thuốc chống ung thư từ lá và hoa dừa cạn của Việt Nam sẽ không cạnh tranh được ngay ở thị trường trong nước

Đề tài nghiên cứu bán tổng hợp chất trung gian trong quy trình tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharathin chiết tách từ cây dừa cạn làm thuốc chống ung thư của chương trình hóa dược thực hiện thành công sẽ tạo ra công nghệ bán tổng hợp vinblastin phù hợp với Việt Nam, tận dụng có hiệu quả các hoạt chất chiết suất từ lá dừa cạn và làm giảm giá thành của thuốc, mang lại cuộc sống tốt đẹp hơn cho mọi người

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DỪA CẠN

Cây dừa cạn còn có tên là bông dừa, hải đằng Tên khoa học là Catharanthus roseus (L.) G – Don [Apocynaceae] là loại cây cỏ cao khoảng

40 – 60 cm Lá hình trứng mọc đối, mặt trên của lá màu xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt, gân lá màu trắng ngà chạy giữa chia phiến lá thành 2 phần bằng nhau Thân mềm tẽ nhiều cành nên cây thường nghiêng về một phía Hoa có 5 cánh màu phớt hồng hoặc màu trắng Quả có 2 đại hơi choãi ra, thường tập trung ở phần ngọn Cây có nguồn gốc ở Madagasca (châu Phi), được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam để làm cây cảnh Cây dễ trồng, phát triển nhanh nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta Dáng cây đẹp, mềm mại, lá xanh mướt, hoa rực sáng, đấy là những nét đặc trưng tạo được sự hấp dẫn của loài cây này

Hình 1.1 Lá và hoa cây dừa cạn

- Tác dụng dược lý - Công dụng:

Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai alkaloid vinblastin và vincristin, là những chất ức chế mạnh sự phân bào Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong

bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia

tế bào Ngoài ra, cao dừa cạn còn có tác dụng hạ huyết áp, ngăn cản sự phát triển của thai trên động vật mang thai và kháng một số chủng nấm gây bệnh

Vinblastin sulfat: Là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, được lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn và được lựa chọn hàng thứ hai trong liệu pháp trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận Lựa chọn hàng thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da Nó cũng được dùng chữa bệnh sarcom lympho, sarcom chảy máu Kaposi và sarcom tế bào lưới Các tác dụng không mong muốn như buồn nôn, nôn, nhức đầu và dị cảm xảy ra sau khoảng 4 - 6 giờ và kéo dài 2 - 3 giờ Hiện tượng tiêu chảy, táo bón, tắc ruột, liệt, chán ăn và viêm miệng cũng có thể xảy ra và thường

báo trước những tác dụng độc hại thần kinh Tổn thương hệ thần kinh đôi khi

có tính lâu dài khi dùng liều quá cao; đã xảy ra mù và tử vong Chứng rụng tóc có tính hồi phục đã xảy ra ở khoảng 30 - 60% người dùng thuốc Sự ức chế nhẹ tủy xương với giảm bạch cầu xảy ra ở tỷ lệ cao bệnh nhân, buộc phải ngưng dùng thuốc.Thuốc có tác dụng độc hại tại chỗ Cần tránh sự tràn thuốc

ra ngoài khi tiêm tĩnh mạch, vì có thể gây viêm tĩnh mạch ở nơi tiêm Vinblastin có thể gây độc cho thai, nên chỉ dùng ở thời kỳ mang thai nếu tình trạng bệnh đe dọa tính mạng hoặc bệnh nặng mà các thuốc an toàn hơn không

có hiệu lực

Vincristin sulfat: Là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp Nó được dùng trong liệu pháp phối hợp thuốc, là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không - Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân Phối hợp thuốc chứa vincristin là lựa chọn hàng thứ hai cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính Một số chuyên gia ưa dùng vincristin chỉ để làm thuyên giảm và không dùng trong điều trị duy trì vì việc sử dụng kéo dài sẽ gây độc hại thần kinh Sự kháng vincristin có thể phát triển trong quá trình điều trị Vincristin gây giảm bạch cầu nên phải đếm số lượng bạch cầu trước mỗi liều Những tác dụng phụ thường bắt đầu với buồn nôn, nôn, táo bón, co cứng cơ bụng, sút cân và phục hồi nhanh Thuốc cũng có thể gây những phản ứng chậm phục hồi như rụng tóc và bệnh thần kinh ngoại biên Những tai biến nặng về thần kinh có thể xảy

ra như mất những phản xạ gân sâu, viêm đau thần kinh, tê các chi, nhức đầu, mất điều hòa Những khuyết tật thị giác, liệt nhẹ hoặc bại liệt và teo một số cơ duỗi có thể xảy ra chậm Liệt những dây thần kinh sọ 2, 3, 6 và 7 cũng có thể

xảy ra Các tai biến thần kinh có thể kéo dài trong nhiều tháng Thuốc gây độc tại chỗ, cần tránh sự tràn thuốc ra ngoài, tốt nhất nên cho dùng thuốc bằng cách tiêm truyền tĩnh mạch Phần lớn thuốc được thải trừ trong mật và một phần ít hơn trong nước tiểu Trong bệnh vàng da tắc mật, độc tính của vincristin lớn hơn và cần phải giảm liều Vincristin thải trừ chậm nên có nguy

cơ tích lũy, do đó ít nhất một tuần mới được dùng một lần

Theo Đông y, dừa cạn có tác dụng làm săn, chống viêm, hạ áp, được sử dụng để điều trị một số bệnh: viêm đại tràng, bệnh trĩ, khí hư bạch đới, tăng huyết áp, viêm nhiễm phần phụ, kinh bế, zona, phong ngứa, đái tháo đường, vàng da Lá và phần ngọn của cây được dùng làm thuốc Có thể để tươi giã đắp, phơi khô sắc uống hoặc chế biến thành dạng trà

Trong dân gian, cao sắc nước của lá và hoa dừa cạn được sử dụng để chữa mắt, tiêu viêm, cầm máu và làm dịu vết đốt của côn trùng Dùng lá giã nát đắp lên những vết bỏng (chú ý chỉ đắp trong trường hợp không trợt da, bỏng nhẹ) làm mát da thịt, giảm đau, chống bội nhiễm Đặc biệt, theo y học

cổ truyền ở Ấn Độ, Madagasca và Việt Nam, các thầy lang còn dùng lá dừa cạn để trị bệnh tiểu đường [2], [5] Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học, dừa cạn có thể hỗ trợ trị ung thư, chống sự phân chia tế bào, tỏ ra có hiệu quả đối với ung thư bạch huyết, ung thư ruột già

- Một số bài thuốc của cây dừa cạn:

+ Điều trị zona:

Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16 gam, thổ linh 16 gam, bạch linh 10 gam, kinh giới 12 gam, chi tử 10 gam, nam tục đoạn 16 gam, cam thảo đất 16 gam, hạ khô thảo 16 gam Sắc uống ngày 1 thang, sắc ba lần, uống ba lần

+ Thuốc đắp: Lá dừa cạn, lá cây hòe Hai thứ lượng bằng nhau, giã nhỏ đắp lên các tổn thương, băng lại

Tác dụng: làm giảm đau nhức

+ Điều trị khí hư bạch đới:

Dừa cạn 12 gam, rễ cây bạch đồng nữ 16 gam, biển đậu 16 gam, đan sâm 16 gam, cây chó đẻ 16 gam, lá bạc sau 16 gam Sắc uống ngày 1 thang + Trà dược cho bệnh nhân tăng huyết áp:

Dừa cạn 160 gam, lá đinh lăng 180 gam, hoa hòe 150 gam, cỏ xước

160 gam, đỗ trọng 120 gam, chi tử 100 gam, cam thảo đất 140 gam Các vị sao giòn tán vụn trộn đều, bảo quản trong hộp kín tránh ẩm Ngày dùng 40 gam Hãm nước sôi vào ấm chuyên, sau 10 phút có thể dùng được Uống thay trà trong ngày

Công dụng: an thần hạ áp, làm bền vững thành mạch, êm dịu thần kinh, phòng chống và ngăn ngừa những tai biến có thể xảy ra

+ Lỵ trực trùng:

Đi ngoài nhiều lần, bụng đau từng cơn, phân có chất nhầy, có máu mũi, sút cân nhanh

Bài thuốc: dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 20 gam, cỏ sữa 20 gam, cỏ mực

20 gam, chi tử 10 gam, lá khổ sâm 20 gam, hoàng liên 10 gam, rau má 20 gam, đinh lăng 20 gam Đổ 3 bát nước sắc lấy 1,5 bát, chia ba lần uống trong ngày

+ Bệnh trĩ:

Bệnh trĩ, Búi trĩ sưng đau, tiết dịch, chảy máu tươi

Bài thuốc: dùng hoa và lá dừa cạn, lá thầu dầu tía Hai thứ giã nhỏ đắp

tại chỗ băng lại Đồng thời cho uống bài sau: dừa cạn (sao vàng) 20 gam, cỏ mực 20 gam, phòng sâm 16 gam, hoàng kỳ 12 gam, đương quy 12 gam, bạch truật 16 gam, thăng ma 10 gam, sài hồ 10 gam, trần bì 10 gam, cam thảo 12 gam Sắc ba lần uống ba lần, ngày 1 thang Dùng thuốc 10 ngày liền Nghỉ 3 –

4 ngày, sau đó tiếp đợt 2

+ Khát nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, Đông y gọi là chứng tiêu khát Bài thuốc: dừa cạn 16 gam, cát căn 20 gam, thạch hộc 12 gam, hoài sơn

16 gam, sơn thù 12 gam, đan bì 10 gam, khiếm thực 12 gam, khởi tử 12 gam, ngũ vị 10 gam Sắc ba lần uống ba lần, ngày 1 thang

+ U xơ tuyến tiền liệt : Dừa cạn 12 gam, huyền sâm 12 gam, xuyên sơn

10 gam, chè khô 12 gam, hoàng cung trinh nữ 5 gam, cát căn 16 gam, bối mẫu 10 gam, đinh lăng 16 gam Sắc uống ngày 1 thang, chia ba lần

- Thành phần hóa học của cây dừa cạn:

Hoạt chất của dừa cạn là alkaloid có nhân indol trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong lá và rễ Dừa cạn Việt Nam có tỷ lệ alkaloid toàn phần là 0,1 - 0,2% Rễ chứa hoạt chất (0,7 - 2,4%) nhiều hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37 - 1,15%) Các chất chủ yếu là: vinblastin, vincristin tetrahydroalstonin, prinin, vindolin, catharanthin, ajmalicin, alstonine, leurocin, vincaleucoblastin, vincosid (1 glucoalkaloid tiền thân để sinh tổng hợp các alkaloid) Từ dừa cạn, người ta còn chiết được các chất sau: acid pyrocatechic, sắc tố flavonoid (glucosid của quercetin và kampferol) và anthocyanin từ thân và lá dừa cạn hoa đỏ Ngoài ra từ lá chiết được acid ursolic, từ rễ chiết được cholin

10 Vindesin 9.Vincaleukoblastin

11.Vinorelbin 12 Vincristine sulfate

13 Vinblastine sulfate Hình 1.2 Một số alkaloid tiêu biểu trong cây dừa cạn

- Hoạt tính sinh học

Năm 1952, khi nghiên cứu tác dụng của các alkaloid từ lá dừa cạn lên

chuột , R Noble và C Noble đã phát hiện ra các hợp chất này có khả năng làm giảm số lượng bạch cầu trong máu chuột Từ đó, theo định hướng nghiên cứu các chất gây độc tế bào hoặc gây ức chế phân bào bạch cầu ác tính, các vinca alkaloid có hoạt tính như vinblastin, vincristin, vindesin và vinorelbin

đã được phân lập hoặc bán tổng hợp để ứng dụng trong điều trị ung thư, đặc biệt là các bệnh Hodgkin và các bệnh ung thư máu

Năm 1958, lần đầu tiên Noble và Beer đã phân lập được vinblastin 1 còn gọi là vincaleukoblastin từ lá cây dừa cạn

1 Vinblastin 9 Vincaleukoblastin

Trong các năm 1959 đến 1962, Johnson và Svoboda đã tìm ra vincristin

- một alkaloid có hàm lượng thấp trong cây dừa cạn Hợp chất muối sunfat của vinblastin và vincristin đã được áp dụng rộng rãi trong các trị liệu hóa học chữa ung thư máu, ung thư mô bào bạch huyết, ung thư tinh hoàn và ung thư

vú [32]

Với các kết quả nghiên cứu về cơ chế gây bệnh ung thư và điều trị trong y học lâm sàng hiện đại và trong lĩnh vực sinh học phân tử, vinblastin, vincristin và các dẫn xuất lại đã được khẳng định một lần nữa là các hoạt chất

có tác dụng chống ung thư thực thụ, không chỉ với vai trò là các tác nhân gây độc tế bào (cytotoxicity) như đã biết, mà còn đóng vai trò là các chất ức chế hoạt tính của NF-κB (nuclear factor κB) - tác nhân chủ yếu trong quá trình

gây ra các bệnh viêm và phát sinh tế bào ung thư

Vinblastin 1 được FDA phê chuẩn vào năm 1965 là thuốc điều trị nhiều loại ung thư như: bạch cầu, bàng quang, tinh hoàn, các u bạch huyết, … và được bán trên thị trường hơn 40 năm Vinblastin 1 trở thành một dược phẩm quan trọng, tuy nhiên lại có hàm lượng rất nhỏ trong thực vật (chiếm 0,01% trong lá dừa cạn khô và việc tách hợp chất này từ thực vật rất mất thời gian, tốn kém, hiệu suất thấp và đầy khó khăn [15], [16] Do đó vinblastin là đối tượng luôn được các nhà khoa học quan tâm Nhiều phương pháp tổng hợp vinblastin đã được nghiên cứu bao gồm: nuôi cấy tế bào [15], công nghệ chuyển hóa [31] , bán tổng hợp và tổng hợp toàn phần Trong đó phương pháp bán tổng hợp để tận dụng 2 alkaloid phụ trong quá trình tách vinblastin 1 từ dừa cạn là vindolin 4 và catharanthin 3 có hàm lượng lớn hơn nhiều (trong 1 tấn nguyên liệu thực vật khô tách được 400 g catharanthin và 800 g vindolin , đồng thời cũng là các monome có thể ghép đôi tạo thành vinblastin 1 cũng được quan tâm rất lớn

Cho đến nay, vinblastin và các dẫn xuất sử dụng làm thuốc chống ung thư trên thế giới đã được sản xuất chủ yếu theo hai con đường [23]:

1 - Chiết xuất từ lá dừa cạn;

2 - Bán tổng hợp từ vindolin và catharanthin

Vinblastin và các dẫn xuất là các alkaloid dimeric có hàm lượng thấp (~ 0,01 % trong lá dừa cạn khô), trong khi alkaloid chủ yếu của dừa cạn là vindolin - một trong hai phần monomer cấu thành vinblastin - có hàm lượng

trong lá dừa cạn lớn hơn 4 đến 5 lần so với vinblastin Trong quá trình phân tách “alkaloid tổng số” của dừa cạn bằng sắc ký hấp phụ, thông thường vindolin và catharanthin được rửa giải ra trước so với vinblastin Để hạ giá thành thuốc, tận dụng phụ phẩm vindolin, catharanthin cũng như các vinca alkaloid khác, các nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin và các dẫn xuất từ vindolin và catharanthin đã được phát triển mạnh mẽ và đưa vào áp dụng trên thế giới từ cuối những năm 1970 [13], [23]

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP VINBLASTIN

1.2.1 Giới thiệu về vinblastin

Tên thương mại: Alkaban-AQ, nincaluicolflastine, rozevin, velban, velbe, vinblastin, vinblastine sulfate, vincaleucoblastin, vincaleucoblastine, vincaleukoblastine, vincoblastine,…

Công thức phân tử: C46H58N4O9

Công thức cấu tạo:

9' 10' 15'

N

16' 17'

17 18

N1

2 12 3 4 5

19 6 7 8

N

9 10

COOCH 3 24

H

27

CH 2 CH 3 21

N6'

7' 8'

OH

21'

CH 2 CH 3 20'

COOCH 3 23'

7' 8' 13' N1' 2'

9' 10' 11' 12'

H 10 9 611

12 13

N1

2 7 16 17 20

21 1514 3

N

4 5

CH 3 O

H

16' 17' 14' 3' 15'20' 21'

N4'

5' 6'

OH

18'

CH 2 CH 3 19'

COOCH 3

Vinblastin hiện có 2 hệ thống đánh số các nguyên tử trong công thức cấu tạo đó là theo hệ thống IUPAC (1) và theo sinh học (1’) [10], [11], [14], [20] Trong nội dung luận văn này, chúng tôi sử dụng hệ thống đánh số theo IUPAC 1.2.2 Phương pháp bán tổng hợp

a Bán tổng hợp vinblastin từ catharanthin và vindolin

Phương pháp bán tổng hợp vinblastin 1 thành công nhất là dựa vào giả

thuyết sinh học coi vindolin 4 và catharanthin 3 là các tiền chất Các alkaloid này là hai trong số nhiều alkaloid có hàm lượng lớn thu được từ C roseus Theo phương pháp này, vinblastin 1 cũng như các đimeric alkaloid kiểu vinblastin là sản phẩm thu được do sự kết hợp của vindolin 4 với một dẫn xuất trung gian xuất phát từ catharanthin 3 [20]

Sau một số kết quả nghiên cứu tiên phong [10], các đimeric alkaloid kiểu vinblastin có cấu hình S ở C(18’) là yếu tố tạo nên hoạt tính sinh học đã được tổng hợp bằng phản ứng Polonovski có biến đổi

Năm 1976 tại Pháp, Potier, Langlois cùng các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các đimeric alkaloid kiểu vinblastin dựa trên cơ sở oxy hóa catharanthin 3 thành catharanthin N-oxit 14 sau đó ghép đôi với vindolin 4 theo phản ứng Polonovski có biến đổi còn được gọi là phản ứng Potier-Polonovski Phản ứng này phân cắt liên kết C(5)-C(18) của dẫn xuất catharanthin 3 tạo điều kiện cho sự ghép đôi với vindolin 4 cho hợp chất đimeric alkaloit kiểu vinblastin có cấu hình S “tự nhiên” ở nguyên tử cacbon bất đối C(18’) là anhiđrovinblastin 15 (Hình 1.3)

Hình 1.3 Sơ đồ bán tổng hợp anhiđrovinblastin 15 Phương pháp này mở ra con đường tổng hợp các hợp chất đimeric alkaloid kiểu vinblastin có cấu hình tự nhiên có khả năng chữa bệnh ung thư Năm 1976 lần đầu tiên Atta-ur-Rahman và các cộng sự đã bán tổng hợp thành công vinblastin 1 từ catharanthin 3 và vindolin 4 (Hình 1.4)

Hình 1.4 Sơ đồ bán tổng hợp vinblastin 1 của Atta-ur-Rahman và cộng sự Xuất phát từ catharanthin 3 phản ứng Prevost có cải tiến đã được thực hiện, bằng cách cho tác dụng với CH3COOAg, I2 trong acid axetic băng và sau đó khử với NaBH4 thu được 20-axetoxyđihiđrocatharanthin 16 16 chuyển hóa với acid m-cloroperbenzoic 17 cho hợp chất N-oxit tương ứng 18 Phản ứng của 18 với vindolin 4 trong anhiđrit tricloaxetic tạo immonium 19 Khử liên kết đôi của immonium 19 bằng NaBH4 cho 20-axetylvinblastin 20 Thủy phân 20 trong môi trường bazơ trung bình được đeaxetylvinblastin 21, 21 sau

đó được axetyl hóa tạo thành vinblastin 1 Hiệu suất cả quá trình bắt đầu từ 18

là 35% [12]

Phát triển kết quả đạt được sau khi tổng hợp thành công anhiđrovinblastin 15 bằng phương pháp mới của mình, năm 1978 nhóm của Potier cũng đã nghiên cứu và tổng hợp thành công vinblastin 1 theo sơ đồ ở Hình 1.5 Hiệu suất quá trình là 30% tính từ 22 [21], [26], [27]

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp vinblastin của Potier và các cộng sự

Năm 1988, Kutney và cộng sự đã tổng hợp vinblastin 1 (hiệu suất 14%) thông qua enamin trung gian 25 là sản phẩm của phản ứng khử chọn lọc 1,4 của ion trung gian iminium 21 khi sử dụng tác nhân khử là các dẫn xuất của 1,4-đihiđronicotinamit 27 [16], [18], [25] (Hình 1.6)

Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp vinblastin của Kutney và cộng sự

Cũng trong thời gian này, Kutney và cộng sự đã tổng hợp anhiđrovinblastin 15 với hiệu suất cao bằng phương pháp mới rất đơn giản, cho catharanthin 3 và vindolin 4 tương tác trực tiếp với sự có mặt của ion sắt (III) làm nhân tố kích thích quá trình đime hóa trong môi trường acid trung bình cho ion trung gian iminium 21 và sau đó là phản ứng khử 21 với tác nhân NaBH4 thu được sản phẩm 15 [17] (Hình 1.7)

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp anhiđrovinblastin của Kutney và cộng sự Nhóm Tan, Sakamoto và cộng sự đã nghiên cứu phản ứng chuyển hóa từ chất chìa khóa trung gian anhiđrovinblastin 15 thành vinblastin 1 khi thực

hiện phản ứng oxi hóa bằng oxi không khí có mặt FeCl3 trong HCl và sau đó thực hiện phản ứng khử với NaBH4 Đồng thời nghiên cứu tăng hiệu suất tạo thành vinblastin 1 bằng cách thêm vào hệ phản ứng oxi hóa một số hợp chất như: (NH4)2C2O4 hoặc acid maleic và NH3, kết quả chuyển hóa có thể tăng lên từ 10-52% (Hình 1.8) [30]

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp vinblastin 1 từ anhiđrovinblastin 15

Năm 2007, Boger và cộng sự đã tổng hợp vinblastin theo phương pháp

“one-pot’’ trực tiếp từ catharanthin và vindolin theo hướng tổng hợp của các nhóm Kutney và Tan có sử dụng thêm CF3CH2OH trong giai đoạn tạo anhiđrovinblastin 15 theo sơ đồ ở Hình 1.9 [16]

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp vinblastin 1 của Boger và cộng sự

Sakamoto và các cộng sự (1990) đã phát triển phương pháp oxy hóa anhidro vinblastin (AVLB) bằng FeCl3/amoni oxalat và phương pháp này đã

được áp dụng tại Công ty Công nghệ Hóa dầu Mitsui để sản xuất vinblastin Hiệu suất chuyển hóa AVLB ~ 90 %, hiệu suất tạo thành vinblastin đạt tới hơn 40 % [24]

Theo hướng sử dụng xúc tác nguồn gốc sinh học làm tác nhân chiral, năm 2006, Tatsuya và các cộng sự đã công bố kết quả sử dụng kháng thể monoclon anti-vinblastin MAb-10-A9 làm xúc tác, oxy không khí và NaBH3CN được sử dụng làm các tác nhân oxy hóa - khử hóa; sau 24 giờ, hiệu suất chuyển hóa 3’,4’-anhydrovinblastin tạo thành vinblastin đạt tới 82,2 %, trong sản phẩm hoàn toàn không có mặt 20’-epi-vinblastin (leurosidin) Tuy nhiên, việc tổ hợp MAb-10-A9 trên động vật hiện vẫn còn đang ở trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển cho tương lai

Kuehne và cộng sự (1990) phát triển nghiên cứu theo hướng tổng hợp chọn lọc mảnh cấu trúc cacbometoxivelbanamin trong phân tử vinblastin Hợp chất tetracyclic amin acrylat (tổng hợp toàn phần từ 2-etyl-2-propenol và tryptamin) được ghép đôi với vindolin khi có mặt xúc tác AgBF4 rồi khử với KBH4 để tạo ra sản phẩm trung gian kiểu indoloazonin với hiệu suất tới 80 -

85 % Các giai đoạn tiếp theo được thực hiện chọn lọc về mặt lập thể để hoàn tất quá trình tổng hợp phần cấu trúc cacbometoxivelbanamin Hiệu suất tạo thành vinblastin hoặc các chất tương tự đạt tới 60 % Như vậy, có thể chủ động điều chế vinblastin và các dẫn xuất chỉ đi từ vindolin (chất này có hàm lượng chiếm tới 0,05 - 0,07 % lá dừa cạn khô) mà không phụ thuộc vào lượng catharanthin (chỉ có hàm lượng trong lá dừa cạn ~ 0,03 %; bằng khoảng hơn hai lần so với vinblastin) (Hình 1.10)

Hình 1.10 Sơ đồ tóm tắt các phương pháp điều chế vinblastin từ vindolin và

cathrathin Năm 2011, Đào Hùng Cường và cộng sự Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã phân lập được bốn alkaloid (vincristine, vinblastine,

ajmalicine và alstonine) từ rễ cây dừa cạn hoa hồng của Bình Định [1]

Năm 2012, Trần Văn Sung và các cộng sự , Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tổng hợp vinblastin 1 từ catharanthin 3 và vindolin 4 qua chất trung gian chìa khóa 3’,4’-anhydrovinblastin 15 Chất trung gian 15 được hình thành do sự ghép đôi của catharanthin 3 và vindolin 4 bằng 2 phương pháp: phương pháp thứ nhất ứng dụng phản ứng Potier-Polonovski và phương pháp thứ hai sử dụng ion Fe(III) làm tác nhân kích thích [8] (Hình 1.11 )

Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp vinblastin 1 từ catharanthin 3 và vindolin 4

b Bán tổng hợp vinblastin từ vindolin

Khi tách ra từ lá dừa cạn (Catharanthus roseus), vindolin 4 là alkaloid chiếm lượng lớn hơn so với catharanthin 3 [29], nhằm tận dụng hết hai monome này để tổng hợp vinblastin 1, nhiều con đường đã được thực hiện như tổng hợp catharanthin (catharanthin tự nhiên là (+)-catharanthin) 3 sau đó cho tương tác với vindolin tự nhiên ((-)-vindonlin 4) hoặc cho vindolin tự nhiên 4 tương tác với một hợp chất khác để tạo nên vinblastin 1

(±)-Catharanthin 3 và (+)-anhiđrovinblastin 15, trung gian quan trọng để tổng hợp vinblastin 1 được Raucher và cộng sự tổng hợp toàn phần từ 1-cacbometoxi-5-etyl-1,2-đihiđropiriđin 28 và α-cloroacryloyl clorua 29 (Hình 1.13) Phản ứng Điels-Alder của 28 và 29 sau đó với CH3OH cho sản phẩm

30 30 phản ứng với Me3SiI hình thành 31 Cho 31 tác dụng với axetyl clorua 32 tạo ra 33, sau đó 33 phản ứng với tác nhân Lawesson thu được 34 Thực hiện phản ứng đóng vòng quang hóa 34 được sản phẩm 35 Khử 35 thu được (±)-catharanthin 3 (±)-Catharanthin 3 tương tác với vindolin tự nhiên 4 thông qua phản ứng Potier-Polonovski cho trung gian (±)-anhiđrovinblastin 15

indole-3-(+)-Anhiđrovinblastin 15 và (-)-anhiđrovinblastin 15 dễ dàng tách bằng sắc ký cột Từ trung gian 15 sẽ thu được vinblastin 1

Hình 1.12 Sơ đồ tổng hợp (±)-catharanthin của Raucher và cộng sự Magnus và các cộng sự đã tổng hợp vinblastin 1 bắt đầu từ vindolin tự nhiên 4 và amin 36 theo phương pháp phân cắt liên kết không oxi hóa thu được chất 38 Chất 38 được chuyển hóa thành chất 39 Sau khi hiđrogen hóa chất 39 rồi khử tiếp thu được vinblastin 1 (Hình1.13) [20]

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp vinblastin 1 từ vindolin 4 1.3 TỔNG HỢP TOÀN PHẦN VINBLASTIN

Yokoshima và cộng sự đã thực hiện tổng hợp toàn phần theo con đường ghép đôi hai chất chìa khóa trung gian (-)-vindolin 4 và nhân indol 41 được clo hóa tác dụng với nhau [33] (Hình 1.14)

Hình 1.14 Tổng hợp vinblastin (1) từ hai tác nhân chìa khóa 4 và 41 (-)-Vindolin 4 được tổng hợp toàn phần từ hai chất trung gian là indol

42 để tạo ra phần indol và phần amin được tạo ra từ đinitrobenzensulfonamit 43 Hợp chất 42 được tổng hợp từ 3-hiđroxianilin

2,4-45 thông qua 7-mesyloxyquinolin 44 Hợp chất 43 được tổng hợp từ penten-2-al 46 (Hình 1.15)

Hình 1.15 Sơ đồ tổng hợp toàn phần vindolin 4 Nhân indol 41 được tổng hợp từ 47 và 48 Hợp chất 47 được tổng hợp xuất phát từ axit 4-etylpent-4-enoic 49 (Hình 1.16)

Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp nhân indol 41 Giai đoạn cuối cùng, vinblastin 1 được tổng hợp theo sơ đồ trong hình 1.18 Đầu tiên là clo hóa nhân indol 41 cho 50, 50 phản ứng với vindolin 4 có mặt axit trifluoroaxetic (TFA) cho 52, chuyển hóa 52 thành 53, cuối cùng thủy phân 53 thu được (+)-vinblastin 1