Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát các tổ hợp gien thường gặp trong bệnh lý bạch cầu cấp

Luận văn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh bạch cầu cấp (BCC) là bệnh lý ác tính của hệ tạo máu được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương BCC được chia thành 2 nhóm chính là BCC dòng tủy (BCCDT) và BCC dòng lympho (BCCDL) Trước đây, việc chẩn đoán và phân loại bệnh bạch cầu cấp hoàn toàn dựa trên hình thái học và nhuộm hóa tế bào theo tiêu chuẩn phân loại của FAB (French – American - British) [9], [30] Gần đây, trên thế giới, việc xác định dấu ấn miễn dịch bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy (Flow Cytometry) đã được dùng nhằm phân loại các phụ nhóm của BCC như: BCC dòng lympho B (BCCDL-B), BCC dòng lympho (BCCDL-T) và BCCDT, đặc biệt là những trường hợp không biệt hóa [23]

Ngày nay, những bất thường về di truyền tế bào và về gien được tìm thấy trong hầu hết các bệnh ung thư máu Tế bào bệnh bạch cầu có thể mang những bất thường nhiễm sắc thể (NST) khác nhau bao gồm những thay đổi về số lượng NST như tăng

số lượng bộ NST hay giảm số lượng bộ NST, 3 NST và những thay đổi về cấu trúc NST như mất đoạn, đảo đoạn và chuyển đoạn NST

Trong BCCDT, 4 chuyển vị NST thường gặp là t(8;21), t(15;17), t(9;11) và

inv(16)/t(16 ;16) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gien AML1/ETO [35], [88], PML/RARA [27],, MLL/AF9 [19] và CBFB/MYH11 [89] tương ứng gặp trong 25-30% bệnh nhân Bên

cạnh đó, trong BCCDL, 4 chuyển vị NST thường gặp là t(1;19), t(4;11), t(12;21) và

t(9;22) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gien E2A/PBX1 [62], [96], MLL/AF4 [29], [149], TEL/AML1 [72] và BCR/ABL [80] tương ứng gặp trong 30-35% bệnh nhân

Sự nhận dạng gien BCR và ABL trong chuyển đoạn t(9;22) tiêu biểu cho

bước ngoặc quan trọng khác trong việc thiết lập cơ sở di truyền trong bệnh bạch cầu [124] Nhiều nghiên cứu sau đó đã xác lập cơ sở phân tử cho những bất thường NST đặc trưng trong bệnh bạch cầu Ngoài việc cung cấp những đầu mối về nguyên nhân bệnh bạch cầu, những tiến bộ như thế có ý nghĩa quan trọng trong

việc xử trí bệnh [14]

Có nhiều phương pháp để phát hiện các bất thường về di truyền tế bào như

phân tích NST đồ, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence In Situ

Hybridization), lai so sánh bộ gien (CGH: Comparative Genomic Hybridization),

SKY (Spectral Karyotyping), M-FISH (Multiplex- Fluorescence In Situ

Hybridization) hoặc CGH microarray, gọi là kỹ thuật di truyền tế bào phân tử Ngoài

ra, còn có kỹ thuật khuếch đại gien phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymarase Chain Reaction) Với những ưu điểm như độ nhạy cao (có khả năng phát hiện 1 tế bào ác tính trong 10.000 – 1.000.000 tế bào) [17], [115], [144], phát hiện được những chuyển đoạn NST khó được phát hiện bằng kỹ thuật NST đồ do kích thước NST không thay đổi rõ như t(12;21)(p13;q22) [121] đồng thời cho kết quả nhanh nên kỹ thuật RT-PCR ngày càng trở thành công cụ quan trọng trong chẩn đoán các bất thường về NST và gien cho bệnh nhân ung thư máu

Tại Việt Nam, nhiều nhà khoa học đã thực hiện khá nhiều nghiên cứu về ung thư, từ dịch tễ cho đến điều trị Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền trong phân tích các bất thường NST trong chẩn đoán và điều trị bệnh lý bạch cầu cấp còn rất hạn chế Trước đây, chỉ có vài báo cáo ứng dụng kỹ thuật phân tích

di truyền tế bào kinh điển để phát hiện bất thường NST Philadelphia (Ph) trong bệnh BCMDT, nhưng chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu trên số lượng nhỏ bệnh nhân, chưa được áp dụng thường qui trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh

Từ tháng 3 năm 2006, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học thành phố Hồ Chí Minh (BV TMHH TP HCM) đã áp dụng thường qui các kỹ thuật sinh học phân tử FISH và RT-PCR trong chẩn đoán, tiên lượng và đặc biệt là theo dõi đáp ứng điều trị, đánh giá bệnh tồn lưu ở mức độ phân tử ở bệnh lý bệnh BCMDT, BCCDT và BCCDL Trong năm 2006, 123 bệnh nhân bệnh bạch cầu được phân tích bằng kỹ thuật FISH để phát hiện các chuyển đoạn t(9;22), t(15;17) và t(8;21) và bằng kỹ

thuật RT-PCR để phát hiện các tổ hợp gien BCR/ABL, PML/RARA và AML1/ETO

tại Bệnh viện Trong 2 năm, từ 2008 đến 2010, Bệnh viện phối hợp với Đại học Y

dược TP HCM triển khai đề tài cấp Nhà nước chuẩn hóa các kỹ thuật di truyền phân tử trong bệnh lý huyết học

Việc ứng dụng sinh học phân tử (kỹ thuật RT-PCR, Multiplex PCR, PCR định lượng gien) cho kết quả nhanh chóng hơn so với các kỹ thuật di truyền như nhiễm sắc thể đồ hay FISH, nên đáp ứng kịp thời với nhu cầu chẩn đoán bệnh và chọn lựa phác đồ thích hợp Kỹ thuật có độ nhạy cao, nên rất thích hợp để theo dõi điều trị bệnh và đánh giá nguy cơ tái phát bệnh Bên cạnh đó, chúng ta có thể phát hiện nhiều bất thường cùng một lúc, thay vì tốn nhiều thời gian và chi phí cho việc khảo sát từng bất thường như trong kỹ thuật FISH, nên phân nhóm tiên lượng bệnh sớm

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu tổng quát như sau: "Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát các tổ hợp gien thường gặp trong bệnh lý bạch cầu cấp, góp phần phân loại nhóm tiên lượng bệnh và theo dõi điều trị, tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh, từ ngày 01 tháng 10 năm 2009 đến 31 tháng 7 năm 2011" Để đạt được kết quả trên, chúng tôi cần phải thực hiện các mục tiêu chuyên biệt sau:

1 Xác định tỷ lệ của các tổ hợp gien thường gặp lúc mới chẩn đoán trong nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

2 Xác định tỷ lệ của các tổ hợp gien thường gặp lúc mới chẩn đoán trong nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

3 Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Di truyền phân tử và ý nghĩa trong bạch cầu cấp dòng tủy

Đối với BCCDT, có rất nhiều yếu tố tiên lượng bệnh như: triệu chứng lâm sàng, độ tuổi, huyết học, miễn dịch và di truyền học Nhờ sự phát triển của sinh học phân tử, những bất thường về NST và các đột biến gien ngày càng được xác định một cách dễ dàng và trở thành một công cụ quan trọng giúp chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh Tương ứng với tính đa dạng về mặt biểu hiện lâm sàng, những thay đổi NST và đột biến gien trong BCCDT rất phức tạp [117] Khảo sát những bất thường về NST và đột biến gien lúc chẩn đoán có ý nghĩa quyết định đối với tiên lượng bệnh Bên cạnh đó, việc phát hiện các đột biến gien đóng vai trò rất quan trọng đối với chẩn đoán, điều trị, cũng như xác định các yếu tố tiên lượng bệnh Việc phân nhóm nguy cơ theo di truyền tế bào khác nhau giữa nhóm bệnh nhân (BN) trẻ tuổi và nhóm ≥ 60 tuổi và những bất thường NST mắc phải hiện diện trong tế bào ung thư máu của hầu hết bệnh nhân BCCDT

1.1.1 Các bất thường NST và gien phổ biến

Vào thập niên 1970, gần 50% BCCDT được tìm thấy có bất thường NST bằng phân tích NST đồ kinh điển Ngày nay, với sự phối hợp của các kỹ thuật di

truyền phân tử như kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence in situ

Hybridization), lai so sánh bộ gien (CGH: Comparative Genomic Hybridization), khuếch đại gien (PCR: Polymerase Chain Reaction), khoảng 55 đến 78% BCCDT người lớn có bất thường NST, trong đó 55% là 1 bất thường; 15-20% là tam bội (trisomy) hoặc đơn bội (monosomy) và phần còn lại có từ 2 bất thường trở lên

Những bất thường NST thường gặp trong BCCDT bao gồm t(15;17), t(8;21), inv(16), +8, +21, del(5q), -7, bất thường 11q23 và bất thường 12p11-13 Sự phối hợp giữa dữ liệu lâm sàng và di truyền phân tử đã đưa đến việc nhận ra những phân nhóm BCCDT và giúp phân nhóm tiên lượng Những bất thường di truyền xuất

hiện rơi vào hai nhóm bổ sung được định nghĩa rộng gồm nhóm I và nhóm II Nhóm I bao gồm những đột biến hoạt hóa những con đường truyền tín hiệu, làm tăng cường sự tăng sinh và khả năng sống sót của những tế bào bạch cầu đầu nguồn Những đột biến dẫn đến hoạt hóa thụ thể tyrosine kinase FLT3 hoặc hoạt hóa đường truyền tín hiệu RAS được xếp vào những đột biến thuộc nhóm I Nhóm II bao gồm những đột biến ảnh hưởng đến những yếu tố phiên mã hoặc là thành phần của phức hợp đồng hoạt hóa phiên mã, làm suy giảm khả năng biệt hóa tế bào Những tổ hợp gien được tạo thành từ những chuyển đoạn t(8;21), inv(16)/t(16;16),

t(15;17), hoặc những đột biến của gien CEBPA, MLL, và NPM1 được xếp vào

nhóm II [28] (Phụ lục 1 Danh mục các gien)

1.1.1.1 Chuyển đoạn t(8;21)(q22;q22)

Chuyển đoạn t(8;21)(q22;q22) được mô tả lần đầu tiên vào năm 1973 Đây

là chuyển đoạn rất thường gặp trong bệnh BCCDT thể M2 (theo FAB) tạo ra tổ hợp

gien AML1/ETO [35], [88] Gien AML1 (acute myeloid leukemia 1 gene) còn được biết đến với tên PEBP2a (polyoma enhancer binding protein 2 subunit a), hoặc CBFA2 (core binding factor subunit A2) gồm có 9 exon, tạo thành một vùng có kích thước 150 kb Gien ETO (Eight Twenty One) còn có tên là gien CDR (cyclin D-related) hoặc MTG8 (myeloid translocation gene on chromosome 8) gồm có 13 exon kéo dài một đoạn 87 kb Hậu quả chuyển đoạn này là chuyển gien AML1 trên nhiễm sắc thể số 21 đến gắn với gien ETO trên nhiễm sắc thể số 8 Gien AML1 bình

thường mã hóa protein có vai trò trong hoạt hóa phiên mã làm tế bào phân chia và

biệt hóa Khi xuất hiện chuyển đoạn, protein hình thành từ tổ hợp gien AML1/ETO

không những không có chức năng của protein AML1 mà còn ức chế protein AML1 bình thường, dẫn đến tế bào bị ung thư

Chuyển đoạn t(8;21) có tiên lượng tốt ở người lớn bệnh BCCDT, tỷ lệ đạt lui bệnh cao với thời gian lui bệnh kéo dài nếu trong điều trị củng cố sử dụng liều cao Cytarabine Khác với người lớn, trẻ em có chuyển đoạn t(8;21) đáp ứng trung bình với hóa trị liệu và có thời gian sống ngắn hơn [150]

1.1.1.2 Chuyển đoạn t(15;17)(q22;q11)

Chuyển đoạn t(15;17)(q22;q11) và tổ hợp gien PML/RARα là chuyển đoạn

đặc hiệu trong BCCDT, thể M3 (APL) [123], được gợi ý bằng sự hiện diện của nhiều hạt lớn tiền tủy bào kết hợp với đông máu nội mạch lan tỏa, nhưng cũng có

phân nhóm với ít hạt li ti Tổ hợp gien PML/RARA được sử dụng như một chỉ điểm

cho việc phát hiện những tế bào APL tại thời điểm chẩn đoán cũng như theo dõi trong suốt quá trình điều trị Tuy nhiên, tổ hợp gien này hiện diện trong hầu hết nhưng không phải trong tất cả những trường hợp APL [27], [143] Chuyển đoạn

này mang gien RARα (Retinoic Acid Receptor α) trên nhiễm sắc thể số 17 đến gắn với gien PML (Promyelocytic Leukemia) trên nhiễm sắc thể số 15 Những điểm gãy trên gien RARA luôn xuất hiện ở intron 2 dài 17 kb Trái lại, 3 vùng điểm gãy trên gien PML liên quan đến chuyển vị t(15;17) nằm trên intron 6 (bcr1; 55%

trường hợp), exon 6 (bcr2; 5%), và intron 3 (bcr3, 40%) Kết quả là có 3 đồng dạng

của tổ hợp gien PML/RARA có khả năng xảy ra là dạng dài (L hoặc bcr1), dạng

biến thể (V hoặc bcr2), và dạng ngắn (S hoặc bcr3) Điều đáng lưu ý là trong

trường hợp dương tính với bcr2, những sản phẩm PCR của bản mã PML/RARA sẽ

có kích thước khác nhau tùy thuộc vào vị trí của điểm đứt gãy nằm trên exon 6 của

gien PML

Bình thường, protein sản phẩm của gien RARα có chức năng hoạt hóa quá

trình phiên mã của các gien có vai trò giúp tế bào trưởng thành Cấu trúc của protein này có phần gắn vào deoxyribonucleic acid (DNA) và một phần tương tác với dẫn chất của acid retinoic Trong trường hợp chuyển đoạn t(15;17), tổ hợp gien

PML/RARα mã hóa protein mới, protein mới này không những không hoạt hóa phiên mã mà còn ức chế chức năng của RARα bình thường do đó tế bào không tổng

hợp được protein, quá trình trưởng thành tế bào dừng lại ở giai đoạn tiền tủy bào Theo y văn, để hoạt động ức chế phiên mã, protein PML/RARα phải gắn với một phức chất khác gồm chất đồng ức chế nhân (NcoR: Nuclear CoRepressor) và enzym histone de-acetylase Hiện tượng gắn hai phức này sẽ bị ly giải với sự có

mặt của dẫn chất acid retinoic và khi ly giải thì protein PML/RARα không còn tác dụng

Lợi dụng đặc tính này, người ta dùng ATRA (All Trans Retinoic Acid) để điều trị bệnh Những chiến lược điều trị APL mới tập trung vào giảm thiểu liệu

pháp hóa trị, dùng kết hợp ATRA và Arsenic trioxide (nhắm vào đích là gien PML)

như là liệu pháp ban đầu cho những bệnh nhân không thể đáp ứng với anthracycline hoặc những người lớn tuổi [81] Kết quả dương tính với tổ hợp gien

PML/RARA ở những bệnh nhân sau giai đoạn điều trị củng cố như là một dấu hiệu

báo trước mạnh mẽ cho sự tái phát về mặt huyết học sẽ diễn ra sau đó [4] Trái lại, những kết quả âm tính lặp lại sẽ đi liền với việc thời gian sống sót kéo dài trên phần

lớn bệnh nhân Do đó, phát hiện t(15;17) và tổ hợp gien PML/RARA đóng góp rất

lớn trong việc quyết định điều trị bằng ATRA; cũng như là cơ sở cho chẩn đoán, theo dõi điều trị và tiên lượng [65]

1.1.1.3 Đảo đoạn nhiễm sắc thể 16

Đảo đoạn nhiễm sắc thể 16, inv(16)(p13;q22) đã được Le Beau mô tả trong bệnh BCCDT vào năm 1983; ngoài ra, một bất thường liên hệ khác cũng được mô

tả là chuyển đoạn t(16;16)(p13;q32) Bất thường này xảy ra chủ yếu (khoảng 50%) trên bệnh nhân BCC dòng tủy-monô bào có kèm tăng bạch cầu ái toan (BCCDT-

M4Eo) Tuy nhiên, tổ hợp gien CBFB/MYH11 vẫn được tìm thấy ở nhiều dạng

khác của BCCDT như thể M4 không kèm bạch cầu ái toan, thể M2, M5; và ít gặp hơn trong thể M1, M6, và M7 [70] Bất thường inv(16)/t(16;16) được phát hiện trên 8-9% bệnh nhân mới được chẩn đoán BCCDT [122], và 4 - 16% bệnh nhân BCCDT có bất thường NST

Đối với gien CBFB, phần lớn những điểm đứt gãy nằm trên intron 5 dài 15

kb Hướng từ đầu 5’ đến đầu 3’ là hướng từ tâm động đến đầu mút của NST Gien

MYH11 gồm có 21 exon trải dài một đoạn 37 kb Vùng 5’ của gien MYH11 thường

bị mất trong suốt quá trình đảo đoạn Kết quả là chỉ có tổ hợp gien CBFB/MYH11

được biểu hiện trong trường hợp inv(16)(p13q22) Trong cả hai trường hợp đảo

đoạn và chuyển đoạn, gien CBFB ở 16q22 và gien MYH11 ở 16p13 bị gãy, kết quả tạo thành tổ hợp gien 5’CBFB và 3’MYH11 Do kết quả của hiện tượng ghép nối khác nhau (alternative splicing), 10 bản mã của tổ hợp gien CBFB/MYH11 (từ A

đến J) đã được báo cáo (Hình 1.1) Trong đó, hơn 85% những bệnh nhân dương tính có bản mã dạng A; bản mã dạng D và E, mỗi dạng chiếm gần 5%; trái lại, tất

cả những dạng còn lại chỉ xuất hiện rời rạc RNA thông tin của tổ hợp gien này là một dấu ấn phân tử điển hình thích hợp cho cả trong chẩn đoán lẫn theo dõi điều trị [22], [109] Những bệnh nhân BCCDT có inv(16)/t(16;16) có tiên lượng tốt với tỷ

lệ đạt lui bệnh cao và thời gian sống kéo dài (hơn 50% bệnh nhân) Sự chuyển đoạn

xảy ra ít hơn 10% ở bệnh nhân lớn hơn 60 tuổi bệnh BCCDT mới

Hình 1.1 Những dạng bản mã của tổ hợp gien CBFB/MYH11 [22], [109]

1.1.1.4 Chuyển đoạn t(9;11)(p22;q23)

Gien MLL tổ hợp với một trong 60 gien đồng hành khác nhau tạo thành

những chuyển đoạn NST trong những bệnh bạch cầu cấp khác nhau, hình thành nên những protein tổ hợp MLL phức tạp [57] Trong số những chuyển đoạn liên quan đến bất thường NST 11 thì chuyển đoạn t(9;11)(p21-22;q23) chiếm tỉ lệ cao nhất trong bệnh BCCDT, đặc biệt là trong bệnh BCCDT thứ phát đã được điều trị với những chất ức chế men topoisomerase II; hiếm gặp trong bệnh BCCDL [6], [61], [105]

Gien MLL nằm trên NST 11 gắn kết với gien tiền ung thư (proto-oncogene) AF9 nằm trên NST 9 tạo thành tổ hợp gien MLL/AF9 mã hóa cho một protein tổ hợp mới (novel chimeric protein) [6] Mặc dù gien MLL có kích thước khoảng 120

kb, nhưng vùng đứt gãy chính của gien MLL chỉ nằm trên một đoạn dài 8,3 kb có chứa vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn BamHI, và những điểm đứt gãy tập trung trong vùng 6,5 kb nằm giữa exon 8 và 12 [130] Gien MLL tham gia vào

những chuyển đoạn NST tạo thành những protein tổ hợp MLL gây ung thư Gần

đây, Austin T Thiel và cộng sự đã chứng minh rằng alen MLL hoang dại

(wild-type) cần cho sự hình thành ung thư gây ra bởi MLL/AF9 và duy trì những tế bào

đã được chuyển dạng bởi MLL/AF9 Điều này cho thấy có sự đồng biểu hiện giữa

một gien gây ung thư MLL và dạng hoang dại tương ứng của nó trong sự hình thành ung thư gây ra bởi MLL/AF9 [139] Gien AF9 có kích thước hơn 100 kb và

có hai vùng cụm đứt gãy (breakpoint cluster region) đã được xác định là BCR1 và BCR2 trước đây còn được gọi tương ứng là vị trí A và vị trí B Vùng BCR1 nằm bên trong intron 4, còn vùng BCR2 nằm bên trong intron 7 và 8 [105]

Tổ hợp gien MLL/AF9 đã được chứng minh là có vai trò rất quan trọng trong

sự phát triển của tế bào gốc và sự hình thành ung thư do ức chế sự biệt hóa của những tế bào đầu nguồn hệ tạo máu Nhìn chung, những bệnh nhân BCCDT có

mang tổ hợp gien MLL/AF9 được xếp vào nhóm có tiên lượng trung bình [61]

1.1.2 Đột biến gien

Phần lớn những bệnh nhân BCCDT có di truyền học tế bào bình thường thuộc nhóm có tiên lượng trung bình Những bệnh nhân này thường không đáp ứng với phác đồ hóa trị liệu thông thường, cũng như phác đồ điều trị tăng cường mà cần phải được ghép tủy Gần đây, có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng do sự xuất hiện những đột biến gien hoặc những thay đổi về biểu hiện của một gien nào đó đã ảnh hưởng trực tiếp đến tiên lượng của bệnh nhân Điều này được ghi nhận trên cả bệnh nhân BCCDT người lớn lẫn trẻ em [91], [131] Có mối tương quan giữa kiểu gien được quy định bởi các đột biến trên với dự hậu điều trị hay nguy cơ tái phát ở BN được chẩn đoán BCCDT có tế bào bình thường

Những đột biến gien có ý nghĩa tiên lượng như gien nucleophosmin (NPM1), gien fms-related tyrosine kinase 3 (FLT3), gien MLL, gien CEBPA hay một số đột biến gien khác chiếm tỷ lệ ít hơn Trong đó, đột biến nhân đoạn của gien FLT3

được xem là yếu tố tiên lượng quan trọng nhất trên những bệnh nhân BCCDT có di truyền học tế bào bình thường, và được xem là yếu tố tiên lượng xấu Ngoài ra, đột

biến gien MLL hoặc sự biểu hiện quá mức của gien BAALC và ERG cũng được xem

là những yếu tố tiên lượng xấu [131] Trái lại, đột biến gien NPM1 và CEBPA là

những yếu tố tiên lượng tốt

1.1.2.1 Đột biến NPM1

Đột biến NPM1 được tìm thấy ở khoảng 25-35% bệnh nhân BCCDT; và

chiếm tỉ lệ ưu thế (từ 45-62%) ở những bệnh nhân BCCDT không có bất thường NST [138], [145] Đột biến này có tần xuất thấp hơn ở bệnh nhân BCCDT trẻ em [13], [21]

Vào năm 2005, nhóm nghiên cứu của Falini đã có một khám phá quan trọng

là nhận thấy sự định vị một cách bất thường trong tế bào chất của protein nucleophosmin (NPM1) vốn nằm trong nhân là do những đột biến xảy ra tại exon

12 của gien NPM1 (gien này nằm ở vị trí 5q35) [41] Sự tích lũy trong tế bào chất

của protein NPM1 bị đột biến là do sự phối hợp của hai biến đổi chính: sự mất

những phần tryptophan vốn bình thường cần cho NPM1 gắn vào nhân, và sự phát sinh của một mô típ xuất tín hiệu nhân thêm vào ở đầu C bởi đột biến exon 12 [39]

NPM1 là một phosphoprotein có nhiều chức năng và mang tính bảo tồn cao, nằm trong nhân, và vận chuyển qua lại giữa nhân và tế bào chất NPM1 đóng một vai trò rất đa dạng trong những quá trình tế bào bao gồm hình thành ribosome; đáp ứng với những tác nhân gây stress như tia cực tím; định hình và duy trì tính ổn định của bộ gien; điều hòa hoạt động và ổn định những gien ức chế tế bào ung thư như

p53 và ARF; và điều hòa phiên mã [50] Những hoạt động này liên quan đến những

con đường ức chế sự tăng sinh và sinh trưởng, nhưng cũng liên quan đến sự biệt hóa tế bào

Gần đây, NPM1 được chỉ ra rằng có vai trò như là một chất đồng biểu hiện trong quá trình điều hòa phiên mã có liên kết với retinoic acid (RA) [39] Nghiên cứu này cho thấy rằng trong suốt quá trình biệt hóa tế bào gây ra bởi RA, protein hoạt hóa yếu tố phiên mã 2 α (AP2α: activating protein transcription factor 2 α) gắn kết NPM1 vào promoter của những gien đáp ứng đích xác RA NPM1 dường như đóng vai trò là chất ức chế bằng việc gây ra những thay đổi trong cấu trúc crômatin liên quan đến histon deacetylase

Có một giả thuyết thú vị là thông qua việc định vị trong bào tương, lượng protein NPM1 dự trữ được xả ra từ hệ thống phiên mã qua trung gian AP2α, dẫn đến việc giải ức chế cho những gien đích RA Do đó, sự điều chỉnh về mặt dược học con đường tín hiệu RA có thể là một lựa chọn cho phương pháp điều trị nhắm trúng đích [40]

Có khoảng 11% đến 15% những đột biến của gien NPM1 kết hợp với những

bất thường di truyền khác [136], [138], [145] Vì vậy, có một câu hỏi được đặt ra là

liệu BCCDT có mang đột biến gien NPM1 có định rõ một sự tồn tại riêng biệt về

mặt lâm sàng và sinh học hay không Tuy nhiên, một khi liệu pháp điều trị nhắm trúng đích trở nên sẵn có thì không chỉ bệnh nhân BCCDT không có bất thường

NST mang đột biến gien NPM1 mà cả bệnh nhân BCCDT mang đột biến gien

NPM1 cũng được hưởng lợi từ liệu pháp này [42] Ngoài ra, theo Cilloni và cộng

sự, chính sự hiện diện trong bào tương của nucleophosmin đã gây bất hoạt yếu tố nhân, làm cho tế bào trở nên nhạy hơn với hóa trị liệu như Etoposide, Daunorubicin hay Aracytin Những trường hợp có kết quả di truyền học tế bào bình thường

(thuộc nhóm tiên lượng trung bình) với sự hiện diện của đột biến gien NPM1 sẽ có

tiên lượng tốt

1.1.2.2 Đột biến FLT3

Thụ thể bề mặt tế bào FLT3 (do gien FLT3 mã hóa) và ligand của nó đóng

vai trò quan trọng trong sự tăng sinh và biệt hóa của những tế bào đầu nguồn hệ tạo máu Trên những bệnh nhân BCCDT, những đột biến sinh dưỡng dẫn đến sự hoạt hóa chính của FLT3 đã được xác định trên hai vùng chức năng của thụ thể: vùng juxtamembrane (JM), và vùng tyrosine kinase (TKD, tyrosine kinase domain) [93], [148] Đột biến nhân đoạn bên trong (internal tandem duplication-ITD) xảy ra tại vùng JM domain (có vai trò chính yếu trong sự tự ức chế kinase) được tìm thấy trên khoảng 28% đến 34% của những bệnh nhân BCCDT có kết quả di truyền học tế bào bình thường [68], trái lại những đột biến điểm trên vùng JM thì hiếm gặp Vòng hoạt hóa (activation loop-AL) ở đầu C của vùng TKD bị ảnh hưởng bởi những đột biến điểm, chèn đoạn nhỏ, hoặc mất đoạn chủ yếu liên quan đến codon

835 và 836 xảy ra trên 11% đến 14% bệnh nhân BCCDT không có bất thường NST [83], hiếm gặp trên những codon khác Tất cả các đột biến đều làm gia tăng quá mức hoạt tính của FLT3

Đột biến xảy ra tại vùng JM được xem là có tiên lượng xấu Có rất nhiều

nghiên cứu chỉ ra rằng những bệnh nhân mang đột biến gien FLT3-ITD có tiên

lượng kém hơn đáng kể so với bệnh nhân không mang đột biến này [43], [90],

[146] Việc phân nhóm tiên lượng của những đột biến gien FLT3 xảy ra tại vùng

TKD hiện vẫn còn nhiều tranh cãi Hiện tại, có một số chất ức chế FLT3 ở những giai đoạn khác nhau của sự tiến triển lâm sàng như PKC412 (midostaurin), CEP-

701 (lestaurtinib), hoặc MLN518 (tandutinib) đang được thử nghiệm lâm sàng Khi

được sử dụng như những tác nhân riêng lẻ thì những hợp chất này có khả năng giới

hạn hoạt động của FLT3 trong BCCDT có mang đột biến gien FLT3 Những dữ

liệu này cho ta cái nhìn đầy hứa hẹn khi kết hợp những chất ức chế này với liệu pháp hóa trị Kết quả từ những thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 sẽ cho chúng ta

biết liệu sự ức chế gien FLT3 đột biến có phải là một phương pháp điều trị nhắm

trúng đích thành công cho những bệnh nhân BCCDT có mang đột biến gien này hay không [28]

1.1.2.3 Đột biến CEBPA

Yếu tố phiên mã CEBPA là một chìa khóa phân tử trong sự điều hòa biệt hóa

và định hướng dòng của những tế bào đầu nguồn dòng tủy đa chức năng trở thành những tế bào bạch cầu trung tính trưởng thành [104]

Có hai loại đột biến gien CEBPA dị hợp tử chính đã được xác định trong

bệnh BCCDT Dạng thứ nhất là những đột biến vô nghĩa (nonesense) ảnh hưởng đến vùng đầu N của phân tử, ngăn chặn sự biểu hiện của protein CEBPA suốt chiều dài Dạng thứ hai là những đột biến đầu N và đầu C, thường xuất hiện đồng thời

[28], [38] Nhiều nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng những đột biến gien CEBPA gắn

liền với tiên lượng tốt [90]

1.1.2.4 Đột biến c-KIT

Gien tiền ung thư KIT nằm trên NST băng 4q12, mã hóa cho một

glycoprotein xuyên màng, là một thành viên trong họ thụ thể bề mặt tế bào (receptor tyrosine kinase), và ligand của nó là yếu tố tế bào gốc (SCF: stem cell factor) [120] Việc gắn kết với SCF thúc đẩy quá trình dimer hóa và transphosphoryl hóa, dẫn đến hoạt hóa những đường truyền tín hiệu xuôi dòng liên quan đến sự tăng sinh, biệt hóa, di chuyển và sống sót của những tế bào gốc tạo

máu Những đột biến làm suy giảm chức năng của gien KIT có thể ảnh hưởng đến phần bên ngoài tế bào của thụ thể c-KIT có vai trò trong sự dimer hóa, hoặc ảnh

hưởng đến AL trên vùng TKD [67]

Đột biến gien KIT tại exon 8 nằm ở phần bên ngoài tế bào của thụ thể, hoặc

tại codon 816 của AL trên vùng TKD gặp trong khoảng 25% trường hợp BCCDT

có yếu tố gắn lõi (CBF: core binding factor) [106], [128] BCCDT có yếu tố gắn lõi được định nghĩa bằng sự hiện diện của chuyển đoạn t(8;21)(q22;q22) hoặc inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) về mặt di truyền [38] Có một số nghiên cứu

đánh giá ý nghĩa tiên lượng của những đột biến gien KIT trong bệnh BCCDT có

yếu tố gắn lõi [106], [128]

Đột biến gien KIT tại codon 816 trên exon 17 đi kèm với chuyển đoạn

t(8;21) gắn liền với thời gian sống không bệnh, thời gian sống không tái phát (RFS, Relapse-Free Survival), và thời gian sống chung (OS, Overall Survival) ngắn, tồn tại nguy cơ tái phát (CIR, Cumulative Incidence of Relapse) Trái lại, khi đi kèm với inv(16)(p13q22)/ t(16;16)(p13;q22) có nhóm nghiên cứu báo cáo rằng không ảnh hưởng đến tiên lượng; ngược lại, theo Care và cộng sự thì trong trường hợp này

những đột biến gien KIT đi kèm với tỉ lệ tái phát cao nhưng không làm giảm thời gian sống sót [18] Những đột biến gien KIT đi kèm với nguy cơ tái phát cao; những sự khác biệt này chủ yếu là do ảnh hưởng bởi những đột biến gien KIT trên

tố gắn lõi [28]

Ngoài ra, các đột biến thường gặp khác trong BCCDT như đột biến gien

WT-1 hay gien RAS cũng nên được khảo sát để phục vụ cho việc đánh giá tiên

lượng, lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp cũng như theo dõi điều trị

1.1.3 Phân nhóm tiên lượng BCCDT theo những bất thường NST và gien

Căn cứ vào những bất thường NST và gien, bệnh nhân BCCDT có thể được chia thành 3 nhóm tiên lượng (TL) tương đối khác nhau là tốt, trung bình và xấu (Bảng 1.1 và 1.2) theo nghiên cứu của the United Kingdom Medical Research Council (MRC) và the Cancer and Leukemia Group B (CALGB)

Bảng 1.1 Phân nhóm tiên lượng BCCDT theo kết quả NST và gien

Theo ASH 2006

Tốt

t(15;17)(q22;q12-21) – PML/RARA t(8;21)(q22;q22) - AML1/ETO inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) – CBFB/MYH11 Đột biến gien NPM1 không kèm đột biến FLT3-ITD Đột biến gien CEBPA không kèm đột biến FLT3-ITD

Trung bình

Không phát hiện NST bất thường

t(9;11)(p22;q23) – MLL/AF9, del(7q), del(9q), del(11q), del(20q),

bất thường 17p kết hợp với những biến đổi khác

Bảng 1.2 Tần suất và ý nghĩa dự hậu của các dấu ấn di truyền học phân tử trên

bệnh nhân BCCDT - MRC BCCDT [150]

Bất thường NST Tổng số BN CR %

Nguy cơ tái phát tại 5 năm (%)

OS 5 năm (%) Tiên lượng tốt

Bảng 1.3 Tiên lượng cho BN BCCDT dựa trên sự kết hợp đột biến gien và di

- Đột biến NPM1 đơn độc

- Đột biến CEBPA

Trung bình

Bình thường Chỉ bất thường +8 t(9;11)

Bất thường khác không được liệt vào

TL tốt, TL xấu và không có đột biến

Del(7)/ 7q- Bất thường của 11q23, loại trừ t(9;11) inv(3)

t(3;3) t(6;9)t(9;22)

Di truyền học tế bào bình

thường với đột biến ITD đơn độc hay MLL-PTD

FLT3-1.2 Di truyền phân tử và ý nghĩa trong bạch cầu cấp dòng lympho

BCCDL là một rối loạn ác tính của tế bào đầu dòng lympho B và T, đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào blast trong tủy xương gây ra suy giảm các dòng tế bào máu bình thường Tế bào lympho non cũng tích tụ ở các vị trí ngoài tủy, đặc biệt ở màng não, thượng thận, tuyến ức, gan, lách và hạch Cũng giống như các bệnh máu ác tính khác, khảo sát những bất thường NST và gien tại thời điểm chẩn đoán rất quan trọng cho phân nhóm tiên lượng, giúp lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp và là dấu ấn để theo dõi tồn lưu tế bào ác tính trong quá trình điều trị BCCDL [117]

Bất thường NST gồm có bất thường về số lượng và cấu trúc, chiếm từ 50 đến 65% Tần suất của các bất thường NST thay đổi tùy theo nhóm BCCDL B hay

T, và khác nhau giữa nhóm bệnh nhân trẻ em và người lớn (Bảng 1.4)

Bảng 1.4 Tần suất các bất thường NST trong BCCDL [117]

1.2.1 Các bất thường NST và gien phổ biến

Chuyển đoạn NST là những yếu tố tiên lượng quan trọng trong BCCDL [102], [110] Trước khi có imatinib, NST Ph hay chuyển đoạn t(9;22)(q32;q11) vốn hiện diện trong khoảng 5% bệnh nhân BCCDL trẻ em là một yếu tố tiên lượng xấu [47], mặc dù cũng có một số trẻ mang NST Ph có thể được chữa khỏi chỉ bằng hóa trị liệu tích cực [103] Không như bệnh nhân BCCDL trẻ em vốn đáp ứng tốt với hóa trị liệu và có tiên lượng tốt, bệnh nhân BCCDL người lớn thường có tiên lượng xấu và cần được ghép tủy sớm

1.2.1.1 Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22)

Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) được Romana nhận dạng đầu tiên bằng kỹ thuật FISH vào năm 1994 Đến năm 1995, Golub đã chứng minh tổ hợp gien trong

chuyển đoạn này là TEL/AML1 [121] Chuyển đoạn này không dễ được phát hiện

bằng kỹ thuật phân tích NST vì kích thước NST thay đổi không đáng kể Những nghiên cứu khác nhau sau đó đã chứng minh rằng đây là chuyển đoạn thường gặp nhất ở bệnh BCCDL trẻ em, và chiếm khoảng 25% trường hợp BCCDL trẻ em [134] Phần lớn những bệnh nhân dương tính nằm trong độ tuổi từ 1 đến 12 tuổi ở thời điểm chẩn đoán, và thường gặp nhất là độ tuổi từ 2 đến 5 tuổi; tất cả đều thể hiện dấu ấn miễn dịch thuộc dòng tế bào precursor-B, đặc biệt là BCCDL thể common và BCCDL thể pre-B, hiếm gặp hơn ở dòng tế bào BCCDL thể pro-B Ngoài ra, những bệnh nhân này được đặc trưng bởi lượng tế bào bạch cầu thấp ở thời điểm chẩn đoán (< 50.000/L) Điều thú vị là đa phần những bệnh nhân có chứa DNA non-hyperdiploid (chỉ số DNA = 1) hầu hết có sự đồng biểu hiện của những

dấu ấn dòng tủy, và phần lớn (70-80%) cho thấy có sự mất đoạn của alen TEL

không tái sắp xếp [20], [118], [119] Hơn nữa, chuyển đoạn t(12;21) không được tìm thấy trong bệnh BCCDL T hoặc BCCDT Nó chưa bao giờ được mô tả ở bệnh nhân bệnh bạch cầu tuổi nhũ nhi (dưới 1 tuổi), và tần xuất gặp ở bệnh bạch cầu người lớn thấp (< 2%) [78], [119]

Chuyển vị t(12;21) liên quan đến gien TEL hay còn gọi là gien ETV6 nằm trên NST 12 và gien AML1 hay còn gọi là gien CBFA2 nằm trên NST 21 [73] Gien TEL có kích thước rất lớn và gồm có 8 exon, nhưng vùng có mang những điểm đứt

gãy (intron 5) có kích thước chỉ 15 kb, nằm giữa exon 5 và 6 Hiện tại, chỉ có rất ít trường hợp được mô tả là có điểm đứt gãy nằm trên intron 4 nên đây vẫn được xem

là trường hợp ngoại lệ [134] Đối với gien AML1, những điểm đứt gãy có thể xuất

hiện hoặc trên intron 1 có kích thước rất lớn (thường gặp hơn) hoặc trên intron 2

Từ đó, có hai dạng bản mã của tổ hợp gien TEL/AML1 được tạo thành Dạng thứ nhất là tổ hợp gien TEL exon 5 (nucleotide 1033)– AML1 exon 2 (nucleotide 503)

có tần suất cao Trong một số ít trường hợp, do hiện tượng ghép nối khác nhau (alternative splicing), có thể gây ra hiện tượng bỏ qua (skipping) exon 2 (dài 39 bp)

trên gien AML1 dẫn đến việc tạo thành 2 sản phẩm PCR trên cùng bệnh nhân có kích thước lệch nhau 39 bp [49] Dạng thứ hai là tổ hợp gien TEL exon 5 – AML1

exon 3, ít gặp hơn, được tìm thấy trong khoảng 10% bệnh nhân BCCDL dương tính

với tổ hợp gien TEL/AML1, và ngắn hơn dạng thứ nhất 39 bp Tuy nhiên, protein

được tạo thành từ hai dạng bản mã này vẫn có cùng bộ khung và cấu trúc [45] Cả

gien TEL và gien AML1 đều mã hóa cho những yếu tố điều hòa phiên mã nhân Tổ hợp gien này phá vỡ chức năng bình thường của gien TEL và/ hoặc tạo ra một yếu

tố ức chế phiên mã, làm suy giảm biểu hiện của gien AML1

Tiên lượng nhóm bệnh nhân này tốt và độc lập với các yếu tố nguy cơ chuẩn lâm sàng như tuổi và số lượng bạch cầu Kết quả điều trị tốt với tỷ lệ sống khỏi

bệnh đến 90% Tổ hợp gien TEL/AML1 có tần xuất xuất hiện cao trong bệnh

BCCDL precursor-B đã thúc đẩy nhiều nhóm nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR định lượng nhằm vào tổ hợp gien này để theo dõi tồn lưu tế bào ác tính Những dữ liệu ban đầu cho thấy tồn lưu tế bào ác tính vẫn có thể được phát hiện sau giai đoạn tấn công trong 40-50% bệnh nhân, và mức độ tồn lưu tế bào ác tính cao được tìm thấy ở vài bệnh nhân Tuy nhiên, mặc dù tổ hợp gien có tần xuất xuất hiện tương đối cao nhưng chỉ một loạt nhỏ bệnh nhân được theo dõi lâu dài (luôn ít hơn 30 bệnh nhân), hiếm tái phát và xuất hiện muộn, chúng ta khó xác định bất kỳ mối tương quan lâm sàng nào xa hơn [45]

RT-1.2.1.2 Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11)

Khoảng 20-30% bệnh nhân BCCDL người lớn có mang NST Ph với sự tạo

thành tổ hợp gien BCR/ABL mã hóa cho protein BCR/ABL có trọng lượng phân tử

190 kDa gọi là P190 BCR/ABL Tỷ lệ này thậm chí lên đến 50% ở nhóm bệnh

nhân trên 50 tuổi [47] ABL (Albeson) gien nằm trên nhiễm sắc thể 9q34 được mang đến gắn vào BCR (breakpoint cluster region) gien, nằm trên nhiễm sắc thể

22q11 Trong đa số bệnh nhân BCMDT, điểm gãy nhiễm sắc thể nằm ở vùng

Major-breakpoint cluster region (BCR), bao gồm 5 exon – được gọi là b1 đến b5, tương ứng với exon 12 đến exon 16 của BCR gien Trong vùng Major-BCR, điểm

gãy thường xảy ra ở khoảng giữa b2 và b3 hay b3 và b4 Bên cạnh đó, khoảng 2/3 bệnh nhân BCCDL, điểm gãy thường xảy ra ở khoảng giữa intron thứ nhất của

BCR gien, được gọi là Minor-BCR Ngoài ra, còn có một điểm gãy khác nữa gọi là Micro-BCR và được tìm thấy ở những bệnh nhân bạch cầu cấp dòng neutro (chronic neutrophilic leukemia), nhưng khá hiếm gặp Ở ABL gien, cho dù là

BCMDT hay BCCDL, điểm gãy thường xảy ra ở intron đầu tiên, đôi khi có thể intron thứ hai [125] Khi nhiễm sắc thể gãy, một tổ hợp gien mới hình thành, trong

trường hợp đó, exon thứ nhất của ABL gien thường bị mất đi Vì vậy, những tổ hợp gien mới được tạo thành như sau: khi điểm gãy là Minor-BCR, tổ hợp gien e1a2 BCR/ABL; Major-BCR, tổ hợp gien b2/a2 hay b3/a2 BCR/ABL Từ đó, những sản

phẩm protein tương ứng là P190 kDa protein, P210 kDa protein Trong điểm gãy

Micro-BCR, sản phẩm là P230 protein [84], [98]

BCR/ABL fusion protein dẫn đến sự kích hoạt tyrosine kinase mà đóng vai trò trung tâm trong sự tiến triển bệnh BCCDL và BCMDT mang Ph+ Phát hiện này giúp cải thiện đáng kể tiên lượng cho bệnh nhân nếu được điều trị thêm bằng thuốc ức chế đặc hiệu hoạt tính ABL như imatinib [31], [92], [111] Cũng như trong BCMDT, kháng imatinib do sự xuất hiện thêm đột biến tại vùng gắn imatinib của BCR/ABL cũng thường gặp trên lâm sàng sau một thời gian điều trị Các thuốc

ức chế ABL thế hệ mới như dasatinib, nilotinib hay bosutinib có thể là giải pháp thay thế hiệu quả khi có kháng imatinib [103]

1.2.1.3 Chuyển đoạn t(4;11)(q21;q23)

Những nghiên cứu phân tử chỉ ra rằng t(4;11)(q21;q23) liên quan đến gien

MLL nằm trên NST 11 và gien AF4 nằm trên NST 4 [29] Những ca bệnh nhân dương tính với tổ hợp gien MLL/AF4 chiếm khoảng 50-70% những ca BCCDL nhũ

nhi, và khoảng 5% những ca trẻ em và người lớn [112] Sự hiện diện của t(4;11) gắn liền với kiểu hình BCCDL pro-B (CyCD79a+, CD19+, CD10-, CD24-) và với

sự đồng biểu hiện của những kháng nguyên chuyên biệt dòng tủy (CD15 và CD65) [51]

Chuyển đoạn t(4;11)(q21 ;q23) nối phần 5’ của gien MLL vào phần 3’ của gien AF4 Gien MLL gồm có 37 exon trải dài một vùng trên 1 MB Protein MLL có

chứa một vùng gồm 3 hốc AT (AT-hook) có khả năng gắn với rãnh nhỏ của DNA Một vùng có khả năng gắn với DNA đã được methyl hóa nằm ở phần 5’ của protein

được mã hóa bởi exon 8 Gien MLL được nhận thấy có liên quan đến khoảng 30

chuyển đoạn khác nhau, trong đó có khoảng 20 chuyển đoạn với gien gắn kết đồng

hành đã được xác định [53] Những bất thường về cấu trúc của gien MLL được tìm

thấy trên bệnh BCCDL precursor-B, BCCDT, hội chứng loạn sinh tủy, vài trường hợp BCCDL-T, và trong bệnh bạch cầu thứ phát [130] Ngoài ra, đối với những bất

thường về cấu trúc trên gien MLL như chuyển đoạn, mất đoạn xảy ra ở exon 11 có

liên quan đến bệnh BCCDL-T [74]; và sự nhân đôi đoạn được nhận thấy trên cả

bệnh BCCDT mới (de novo) lẫn thứ phát cũng như trong tế bào máu ngoại vi và

những tế bào bạch cầu đơn nhân tủy xương bình thường [127]

Gien AF4 gồm có 20 exon và mã hóa cho protein giàu serine-proline Chức

năng của protein này vẫn chưa được xác định, và những vùng chức năng hiện vẫn

chưa được mô tả Tổ hợp gien MLL/AF4 được tìm thấy trong gần như toàn bộ

những ca có mang t(4;11) và trong một số đáng kể những ca mà t(4;11) không được phát hiện bằng những kỹ thuật di truyền Khác với t(8;21) hoặc t(12;21) chỉ có 1 hoặc 2 dạng bản mã khác nhau, t(4;11) có ít nhất 10 dạng bản mã khác nhau của tổ

hợp gien MLL/AF4 đã được phát hiện do những điểm đứt gãy nằm trên những

intron khác nhau và còn do hiện tượng ghép nối khác nhau Vùng đứt gãy chính của

gien MLL đã được mô tả kỹ, và nằm trên một mảnh dài 8,3 kb có chứa vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn BamHI Những điểm đứt gãy tập trung trong vùng 6,5

kb nằm giữa exon 8 và 12; chỗ gãy xuất hiện thường xuyên nhất là trên intron 9 và

10 ở bệnh nhân BCCDL trẻ em và người lớn, và trên intron 11 ở bệnh nhân

BCCDL nhũ nhi [130] Vùng có mang cụm đứt gãy của gien AF4 thì rộng hơn, trải

dài một vùng 40 kb Điểm gắn kết có tần suất cao nhất là exon 4; trong một vài

trường hợp hiếm exon 5, 6, và 7 của gien AF4 được nối vào gien MLL

Bình thường gien MLL mã hóa cho protein có khả năng gắn kết DNA và có

vai trò quan trọng cho hoạt động phiên mã các gien liên quan đến quá trình biệt hóa

Trong chuyển đoạn t(4;11), gien này bị chuyển tới gắn với gien AF4 ở nhiễm sắc thể số 4, làm mất tính bình thường của gien MLL và sản phẩm protein của nó mất

khả năng gắn kết DNA làm cho tế bào không biệt hóa được

Tổ hợp gien MLL/AF4 được xác định như là một yếu tố bất lợi ở bệnh bạch

cầu nhũ nhi bởi nhiều nhóm nghiên cứu [112] Chuyển đoạn này gắn liền với tiên lượng xấu ở người lớn, nhưng dường như tiên lượng được cải thiện khi dùng Ara-C liều cao trong giai đoạn tấn công ở bệnh BCCDL người lớn Ở những ca trẻ em, có một vài ý kiến cho rằng nhóm tuổi khác nhau sẽ có tiên lượng khác nhau [114] Bên cạnh đó, theo Young và Godley, bệnh nhân BCCDL có chuyển đoạn t(4;11) được tiên lượng xấu với tỷ lệ đáp ứng điều trị ban đầu cao nhưng thời gian lui bệnh ngắn dưới 1 năm [150]

1.2.1.4 Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13)

Năm 1984, Williams đã mô tả chuyển đoạn liên quan nhiễm sắc thể 1 và 19

là t(1;19)(q23;p13) ở 5% bệnh BCCDL tế bào pre-B, là một chỉ điểm cho những trường hợp có nguy cơ cao tái phát tại hệ thần kinh trung ương [147] Chuyển vị t(1;19) được tìm thấy trong khoảng 5-6% bệnh nhân BCCDL trẻ em và khoảng 3% bệnh nhân BCCDL người lớn [117] Trong cả bệnh nhân người lớn và trẻ em, chuyển đoạn này xuất hiện gần như đặc hiệu trên bệnh nhân BCCDL pre-B [82], [117] Hầu hết những ca có mang chuyển vị t(1;19) biểu hiện một dấu ấn miễn dịch đặc trưng với sự đồng biểu hiện của CD19, CD10, CD9, hoàn toàn không có CD34,

và hiện diện ít nhất một phần CD20 [60] Hơn nữa, chuyển vị t(1;19) có tương quan với sự hiện diện của những yếu tố có nguy cơ cao về mặt lâm sàng như lượng bạch cầu tăng cao, mức độ lactate dehydrogenase huyết thanh cao, và ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương

Chuyển đoạn này có liên quan đến gien E2A trên NST 19 (băng

p13.2-p13.3) mã hóa cho những yếu tố tăng cường gắn kết Ig helix-loop-helix E12 và

E47; và gien PBX1 (còn được gọi là gien PRL) trên NST 1q23 mã hóa cho protein homeobox gắn kết DNA Tổ hợp gien E2A/PBX1 mã hóa cho yếu tố hoạt hóa phiên

mã liên tục (chimeric), còn được gọi là oncoprotein (protein gây ung thư) với vùng

hoạt hóa phiên mã ở đầu N của gien E2A gắn với vùng homeobox gắn kết DNA đầu C của gien PBX1 Từ đó làm tế bào tăng sinh quá mức không kiểm soát được

Hoạt động biến dạng của những protein này đã được chứng minh cả trong ống nghiệm (in vitro), lẫn trong tế bào sống (in vivo) [46]

Đối với gien E2A, những điểm đứt gãy xuất hiện một cách chuyên biệt ở một vùng intron dài 3,5 kb nằm giữa exon 13 và 14 Còn đối với gien PBX1, những

điểm đứt gãy nằm rải rác khắp một vùng intron dài khoảng 50 kb giữa exon 1 và 2

[96] Trong phần lớn các trường hợp, tổ hợp gien E2A/PBX1 được tạo thành do sự kết hợp hằng định giữa exon 13 (nucleotide 1518) của gien E2A với exon 2 (nucleotide 388) của gien PBX1 [63] Một bản mã dạng biến thể khác được mô tả

trong khoảng 5-10% những bệnh nhân dương tính với t(1;19) Nó được đặc trưng bởi việc kéo dài thêm 27 nucleotide chèn vào điểm gắn kết bình thường giữa

nucleotide 1518 và 388 của gien E2A và PBX1 tương ứng Những nucleotide thêm

vào này bắt nguồn từ một exon được cắt ghép một cách khác biệt hoặc là của gien

E2A, hoặc là của gien PBX1, nhưng nguồn gốc chính xác thì vẫn chưa được biết rõ

Bệnh nhân BCCDL có tổ hợp gien này tiên lượng xấu và đáp ứng kém với hóa trị liệu

1.2.2 Các bất thường NST và gien khác

1.2.2.1 Chuyển đoạn t(8;14)(q24;q32)

Những chuyển đoạn liên quan tới gien C-MYC của 8q24 rất giống với

trường hợp lymphoma Burkitt, trước đây được coi là dấu hiệu tiên lượng xấu trong BCCDL dòng tế bào B Đối với nhóm bệnh nhân này, phác đồ hóa trị liệu mạnh như trường hợp của lymphoma Burkitt có thể giúp cải thiện tiên lượng [54], [75]

Ở người, gien này nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có thể chuyển đến nhiễm

sắc thể số 14 do chuyển đoạn t(8;14) Ở vị trí mới, gien MYC hoạt động ở giai đoạn

trong chu kỳ phân bào mà bình thường nó không hoạt động và hậu quả là tế bào phân chia không bình thường

Chuyển đoạn này được phát hiện với tỷ lệ cao ở những bệnh nhân có bướu Burkitt, độc lập với xét nghiệm Epstein-Barr virus Chuyển đoạn giống như trên được phát hiện ở những bệnh nhân BCCDL tế bào B (FAB, BCCDL3) Chuyển đoạn này chiếm 7% trong những trường hợp bất thường nhiễm sắc thể Nhóm bệnh nhân này có tỷ lệ cao bị xâm lấn thần kinh trung ương lúc chẩn đoán và có tiên lượng xấu cần phải áp dụng hóa trị liệu liều cao mới cho kết quả điều trị tốt

1.2.2.2 Thay đổi số lượng NST

Bất thường tăng số lượng NST > 50 NST được phát hiện ở 20-30% bệnh BCCDL ở trẻ em Các NST tăng thêm thường gặp là NST 2, 6, 14, 17, 18 và 21 Những bệnh nhân nhóm này thuộc nhóm tiên lượng tốt và được ghi nhận là đáp ứng bền vững với điều trị [150] Bất thường tăng số lượng NST từ 47-50 NST chiếm tỷ lệ 10-15% trẻ em bệnh BCCDL Các NST tăng thêm thường gặp là NST 8,

13 và 21 Mặc dù những nghiên cứu trước đây báo cáo những bệnh nhân trong nhóm này có tiên lượng trung bình, hóa trị liệu phối hợp nhiều thuốc cải thiện đáng

kể kết quả điều trị Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Raimondi cho rằng tiên lượng cho nhóm này tương tự như nhóm tăng số lượng NST > 50 Trong nhóm này, bất thường 3 NST 21 đơn độc liên quan đến tiên lượng tốt

Bệnh nhân bị thiếu hụt số lượng NST (hypodiploidy) có tiên lượng xấu, bất

kể các phương pháp điều trị tích cực hiện có

1.2.3 Phân nhóm tiên lượng BCCDL theo những bất thường NST và gien

Tiên lượng bệnh BCCDL được cải thiện rất nhiều trong hai thập kỷ qua, cho đến nay hơn 90% bệnh nhân có đáp ứng lui bệnh hoàn toàn và gần 80% được điều trị khỏi bệnh Chiến lược điều trị được lựa chọn theo đặc điểm lâm sàng như tuổi,

số lượng bạch cầu và sự đáp ứng sớm với điều trị Việc nhận dạng các bất thường NST và sự thay đổi phân tử đặc hiệu trong bệnh BCCDL đã cải thiện sự hiểu biết

về sinh bệnh học của bệnh và quan trọng hơn là có được những dữ liệu đáng tin cậy

để đánh giá, phân loại nhóm nguy cơ của bệnh (Bảng 1.5)

Bảng 1.5 Các bất thường NST, tần xuất và nhóm nguy cơ của BCCDL Dưới nhóm Các bất thường di truyền

đi kèm Tần xuất ở trẻ em

Nhóm nguy cơ

Đa bội; tam NST 4, 10, 17 25% B precursor

t(12;21)(p13;q22) - TEL/AML1 28% B precursor Thấp

4% B precursor Bất thường 11q23;

Không xác định

Theo ASH 2009

Các nghiên cứu lớn có phân tích NST thành công ở 60 - 90% trẻ em bệnh BCCDL, cho thấy sự bất thường NST chiếm 80% trường hợp [33], [112] Dựa trên các bất thường về số lượng và cấu trúc, BCCDL được chia thành 2 nhóm: tiên lượng tốt và xấu theo bảng 1.6 Trong hơn 10 năm qua, chúng ta đã có những tiến

bộ trong hồi sức huyết học, trong chẩn đoán và điều trị các bệnh lý ác tính của hệ thống tạo máu, cũng như phát hiện mới trong cơ chế bệnh sinh ở mức độ tế bào (dấu ấn miễn dịch tế bào) và sinh học phân tử Nhờ đó, việc điều chỉnh các phác đồ điều trị theo phân nhóm tiên lượng trước khi điều trị tấn công và sau khi đạt lui bệnh hoàn toàn đã đem lại kết quả điều trị rất ngoạn mục cho bệnh BCCDL, và có thể đạt đến hy vọng chữa khỏi

Bảng 1.6 Phân nhóm tiên lượng BCCDL theo kết quả NST và gien

E2A/PBX1 Thường gặp ở bệnh nhân BCCDL pre-B

Chuyển đoạn liên quan đến

gien MYC nằm trên 8q24 với

Bất thường 9p

Gặp ở khoảng 10% BCCDL trẻ em Bạch cầu tăng cao, có dấu ấn miễn dịch của tế bào dòng T, nguy cơ tái phát cao 47-50 NST (Near

hyperdiploidy) Cải thiện TL với phát đồ điều trị cao 82-94 NST (Near tetraploidy) Tỉ lệ thất bại với điều trị cao

Xấu

Số lượng NST bình thường Tương tự với nhóm Near hyperdiploidy

Theo ASH 2009

1.3 Nguyên tắc và ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử

Do sự có mặt các gien bất thường trong ung thư nói chung và bệnh máu ác tính nói riêng nên việc sử dụng kỹ thuật di truyền học tế bào và sinh học phân tử rất

có ý nghĩa [97] Ngày nay, các kỹ thuật FISH, PCR được dùng nhiều để xác định các gien ung thư Đôi khi phân tích nhiễm sắc thể không thể phát hiện được một số bất thường gien, trong khi kỹ thuật FISH và PCR có một số thuận lợi hơn vì có thể

phát hiện bất thường gien cả khi tế bào ở giai đoạn gian kỳ, hoặc khi bất thường chiếm tỷ lệ thấp, rất thường gặp trong trường hợp theo dõi bệnh nhân đang điều trị Một số thuận lợi khác là thời gian thực hiện PCR cực nhanh, chỉ cần mất 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA được quan tâm, so với các phương pháp kỹ thuật di truyền phải mất cả tuần hoặc lâu hơn [100]

1.3.1 Phản ứng khuếch đại gien (PCR)

Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR), được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền, lần đầu tiên được mô tả bởi Kary Banks Mullis vào giữa thập niên 1980 Từ khi ra đời kỹ thuật này đã trở thành một công cụ cực kỳ đắc lực cho các nhà nghiên cứu và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và di truyền [97]

1.3.1.1 Nguyên tắc

PCR là quá trình khuếch đại của một đoạn trình tự DNA đặc hiệu trong

phòng thí nghiệm do sự xúc tác của enzym Taq polymerase, tạm gọi là phản ứng khuếch đại gien Tất cả các Taq polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch

DNA khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn mạch đơn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn,

và Taq polymerase sẽ nối dài mồi hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã hình thành dựa vào đặc tính đó của các Taq polymerase Thật vậy, nếu ta cung cấp hai

mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi [37] Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình

tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer); từ “xuôi” và “ngược” so với chiều phiên mã của gien

1.3.1.2 Quy trình của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba bước:

♦ Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết

cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (melting temperature - Tm) của phân tử, thường là ở 940C - 950C trong vòng

30 giây - 1 phút Đây là giai đoạn biến tính (denaturation)

♦ Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các

mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng

400C - 700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút Đây

là giai đoạn lai (hybridization)

♦ Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho Taq polymerase sử dụng

vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Đây là giai đoạn tổng hợp, hay kéo dài (elongation)

Một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kì sự khuếch đại sẽ là 230 so với số lượng bản mẫu ban đầu

1.3.1.3 Các hạn chế của phương pháp PCR

Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác rất đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả Có thể kể ba vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR:

♦ Kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên Trừ vài

trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm

♦ Sự ngoại nhiễm (contamination) là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn

liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vì hậu quả có thể rất nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ,… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó Chúng ta có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện pháp sau:

- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại, thí dụ như điện di, phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau

- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette, găng, áo choàng,…) cho các khu vực riêng biệt, không sử dụng vào các thao tác khác Đặc biệt, các dụng cụ trong khu vực sau PCR không bao giờ được đưa vào khu vực trước PCR

- Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khếch đại khi hút dung dịch phản ứng

- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước

- Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho đủ với 1 hay 2 lần thao tác

- Sử dụng găng tay, không thao tác trực tiếp bằng tay, tránh lây nhiễm thành phần phân hủy RNA

♦ Các sai sót gây ra do Taq polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (10-4, nghĩa

là cứ 10.000 nucleotide thì enzym gắn sai 1 nucleotide) Tuy nhiên, đặc tính này

không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh

trước khi đi đến trình tự chính thức, đặc biệt là chọn lựa loại Taq Polymerase thích

hợp theo mục đích thực nghiệm

1.3.1.4 Các biến thể PCR thường được sử dụng

Dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR, nhiều biến thể của phản ứng PCR được sử dụng như Nested PCR, Multiplex PCR [36]

♦ Nested PCR (PCR tổ): Sau khi khuếch đại PCR đích, sản phẩm PCR của

phản ứng lần 1 được sử dụng để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR lần 2 [48] Một cặp mồi khác được sử dụng để khuếch đại một đoạn nằm bên trong đoạn DNA đích Phương pháp này giúp làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng một cách đáng kể nhưng có nhược điểm là rất dễ lây nhiễm

♦ Multiplex PCR (PCR đa mồi): là phản ứng PCR khuếch đại cùng một lúc

nhiều đoạn DNA đích trong cùng một phản ứng nhờ việc sử dụng cùng lúc nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau [5], [26] Các đoạn DNA đích cần có kích thước khác nhau để dễ dàng phân biệt trên thạch [58]

1.3.1.5 Ứng dụng

PCR được dùng phổ biến không chỉ trong các nghiên cứu y sinh học mà ngày càng được áp dụng để chẩn đoán bệnh PCR có thể được dùng để chẩn đoán các trường hợp nhiễm virus, vi khuẩn, vi nấm cũng như chẩn đoán các bệnh di truyền do đột biến gien và nhiễm sắc thể [11]

1.3.2 Phản ứng PCR phiên mã ngược (RT-PCR)

1.3.2.1 Nguyên tắc

Kỹ thuật RT-PCR là kỹ thuật phối hợp quá trình phiên mã ngược (reverse

transcription) và phản ứng PCR Kỹ thuật này làm việc với đối tượng là RNA Do

Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên trước tiên, RNA được tổng hợp thành phân tử DNA bổ sung (complementary DNA – cDNA) nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Enzyme này có thể sử dụng các nucleotide tự do làm nguyên liệu để kéo dài chuỗi nucleotide dựa trên khuôn mẫu là RNA Tiếp đó, sản

phẩm từ quá trình sao chép ngược (cDNA) được khuếch đại nhờ Taq polymerase

Tất cả quá trình này được gọi chung là RT-PCR

1.3.2.2 Đặc điểm của RT-PCR

Đoạn mồi sử dụng trong quá trình phiên mã ngược có thể là mồi “ngược” của PCR giai đoạn sau, có thể là ologonucleotide oligodT (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), mà cũng có thể là các hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA (random primer) [59] Trong kỹ thuật RT-PCR, chất lượng của RNA là rất quan trọng Do đó, người

ta thường cho vào phản ứng RT-PCR một chất ức chế enzyme RNase là RNasin (RNase inhibitor) Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phương pháp cổ điển như Northern blot,…[7]

1.3.3.1 Nguyên tắc

Real-time PCR thực chất là một phản ứng PCR mà trong đó sản phẩm của phản ứng PCR được đánh giá sau mỗi chu kỳ nhờ vào sự phát huỳnh quang của sản

phẩm PCR Quá trình này diễn ra tự động nhờ vào sự hỗ trợ của máy real-time PCR [55], [140] Ở một ngưỡng huỳnh quang nhất định (tương ứng với một lượng sản phẩm PCR nhất định, các mẫu thử có số lượng DNA khác nhau sẽ cần một số chu

kỳ nhân đôi khác nhau để đạt được ngưỡng đó Số chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng (threshold cycle – Ct) và được dùng làm cơ sở để so sánh và tính toán nồng

độ DNA khuôn mẫu trong các mẫu thử [55], [69] Việc định lượng nồng độ DNA hay RNA khuôn mẫu có thể được thực hiện tuyệt đối hoặc tương đối

1.3.3.2 Sự phát huỳnh quang của sản phẩm PCR

Việc định lượng trong Q-PCR dựa trên sự phát huỳnh quang của sản phẩm PCR Có nhiều phương pháp gắn huỳnh quang vào sản phẩm như sử dụng SYBR Green, sử dụng các đoạn dò đặc hiệu (đoạn dò Taqman, đoạn dò Beacon, đoạn dò lai …) [66]

♦ SYBR Green là một chất phát huỳnh quang khi gắn vào DNA sợi đôi

Trong phản ứng PCR, DNA polymerase khuếch đại DNA đích tạo nên sản phẩm là các DNA sợi đôi Sản phẩm PCR càng nhiều thì cường độ huỳnh quang phát ra càng cao Vì vậy, cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với sản phẩm PCR tạo ra, đồng thời tỉ lệ thuận với lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu thử nghiệm Ưu điểm của SYBR Green là có thể sử dụng chung cho tất cả các loại thử nghiệm mà sản phẩm là DNA sợi đôi nên có giá thành thấp Tuy nhiên vì là không đặc hiệu nên SYBR Green có thể gắn vào những sản phẩm không mong muốn

♦ Đoạn dò Taqman là những oligonucleotide kích thước khoảng 24-30 đôi

base, có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích Đoạn dò Taqman có đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) và đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher) Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm thì đoạn dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn nên huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ, do đó không có tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng Khi phản ứng PCR diễn ra, đoạn dò Taqman sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm và

sẽ bị Taq polymerase có mặt trong phản ứng PCR cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp

nên sợi bổ sung Lúc này đầu reporter bị cắt ra, rời xa đầu quencher nên reporter không còn bị ảnh hưởng của quencher và do đó reporter sẽ phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Như vậy cường độ phát quang ứng với nồng độ sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ Ưu điểm của đoạn dò Taqman là đặc hiệu với DNA đích và dễ thiết kế Vì vậy, đoạn dò Taqman được sử dụng rất rộng rãi trong các phòng thí nghiệm có triển khai Real-time PCR

♦ Đoạn dò Beacon là một oligonucleotide có kích thước từ 25-40 đôi base,

đầu 5’ gắn với chất phát huỳnh quang (đầu R – reporter hay còn gọi là đầu F – Fluorophore) và đầu 3’ có gắn chất hấp phụ (đầu Q – Quencher) Đoạn dò Beacon được thiết kế có cấu trúc hình kẹp tóc (2 đầu đoạn dò có trình tự bổ sung với nhau) Khi không có mặt sản phẩm khuếch đại, đoạn dò Beacon tự bắt cặp thành cấu trúc kẹp tóc nên quencher sẽ hấp phụ hết ánh sáng của reporter Khi có mặt sản phẩm khuếch đại ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, đoạn dò Beacon bắt cặp vào sợi DNA đích nên quencher và reporter xa nhau, dẫn đến reporter phát ra huỳnh quang khi có nguồn sáng kích thích Ưu điểm của đoạn dò Beacon là tính đặc hiệu cao nhưng nhược điểm là khó thiết kế

1.3.3.3 Ứng dụng

Q-PCR thường được sử dụng để nghiên cứu các trình tự (DNA hay RNA) có

số lượng bản sao rất thấp, không thể định lượng bằng các phương pháp lai phân tử

cổ điển [8] Q-PCR có thể ứng dụng trong các lĩnh vực:

♦ Bệnh nhiễm: định lượng virus (HIV, HBV, HCV …), định lượng vi khuẩn

(Mycobacterium, Samonella, …), định lượng vi nấm (Candida, Cryptococcus, …)

♦ Ung thư học lâm sàng: đánh giá sự tồn lưu ác tính, sự trao đổi đoạn của

nhiễm sắc thể, các đột biến 1 nucleotide, …

♦ Sự biểu hiện gien: cytokines, receptors, …

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả loạt ca triển khai kỹ thuật mới

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Dân số

2.2.1.1 Dân số nghiên cứu: Bệnh nhân được chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp tại

bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh

2.2.1.2 Dân số mục tiêu: Bệnh nhân được chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp tại bệnh

viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh hội đủ tiêu chuẩn chọn mẫu, thuộc mẫu được chọn trong thời gian nghiên cứu từ ngày 01 tháng 10 năm 2009 đến 31 tháng 07 năm 2011

2.2.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

2.2.2.1 Tiêu chuẩn nhận vào nghiên cứu: Đối tượng trong dân số mục tiêu sẽ

được nhận vào nghiên cứu khi hội đủ các điều kiện sau:

♦ Vào thời điểm chẩn đoán:

- Bệnh nhân mới được chẩn đoán xác định BCC dòng tủy hay lympho

(Phụ lục 2 Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định bệnh bạch cầu cấp)

- Tiến hành khảo sát các tổ hợp gien lần 1

♦ Theo dõi điều trị: Tiến hành khảo sát các tổ hợp gien trên các bệnh nhân có biểu hiện dương tính lúc chẩn đoán

2.2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ: Đối tượng hội đủ tiêu chuẩn nhận vào nghiên cứu

nếu có một trong các yếu tố sau sẽ bị loại ra khỏi nghiên cứu:

♦ Bệnh nhân hoặc thân nhân không đồng ý tham gia chương trình

♦ Bệnh nhân cũ, đã hoặc đang điều trị khi chưa tiến hành xác định gien

♦ Mẫu không đạt chất lượng

Dương tính Định lượng

gien Dương tính

Sơ đồ 2.1 Các bước tiến hành xác định gien

2.3.2 Trang thiết bị, hóa chất, y dụng cụ cần thiết

2.3.2.1 Trang thiết bị (Phụ lục 3 Một số hình ảnh minh họa trang thiết bị)

♦ Bể ổn nhiệt, buồng xử lý vô trùng dùng cho PCR, dùng cho vi sinh

♦ Đĩa petri nhựa vô trùng đường kính 100 mm

♦ Hộp giữ lạnh 00C; -200C dùng cho ống nghiệm 0,2 mL; 1,5 mL

♦ Kính hiển vi soi ngược, lò vi ba (làm thạch)

♦ Máy chụp hình thạch Gel Doc EQ (Công ty Biorad, Mỹ), máy điện di thạch

♦ Máy đo nồng độ DNA, RNA (Ultrospec 5300 pro, Công ty GE, Mỹ)

♦ Máy hấp khử trùng, máy lắc ủ, máy trộn mẫu

♦ Máy luân nhiệt dùng cho PCR và PCR định lượng (Công ty Biorad, Mỹ)

♦ Máy ly tâm cho ống nghiệm 15 mL và 50 mL

♦ Máy ly tâm lạnh tốc độ cao cho ống nghiệm 1,5 mL

♦ Micropipet 0,1-2 µL; 2-20 µL; 20-200 µL; 200-1000 µL

♦ Tủ lạnh 40C, tủ đông -200C và -800C

2.3.2.2 Hóa chất

♦ 0,5 x TBE (Tris/Borate/EDTA), ACD (Acid Citrate Dextrose)

♦ Các cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược), Chloroform

♦ Dung dịch PBS (-) (Phosphate Buffered Saline, không có potassium), DEPC (DiEthyl PyroCarbonate), dung dịch ly giải hồng cầu (Red Blood Cell lysis buffer)

♦ Ethanol 75% (70% - 80%), Ethidium bromide

♦ Gotaq Flexi Polymerase (Công ty Promega, Mỹ)

♦ Hemavision Full kit (Công ty DNA Technology A/S, Đan Mạch)

♦ IPTG/ X-Gal (Công ty Sigma, Mỹ)

♦ Iscript cDNA synthesis kit, iTaq Polymerase (Công ty Biorad, Mỹ)

♦ Isopropanol (Propanol)

♦ Môi trường LB Agar, LB Broth (Công ty Miller, Mỹ)

♦ pGEM-T-Easy vector system II (Công ty Promega, Mỹ)

♦ QIAGEN Plasmid mini kit (Công ty QIAGEN, Mỹ)

♦ Sepazol-I (Công ty Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản)

♦ TaqMan Gene Expression Assay, TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2x) (Công ty Applied Biosystems, Mỹ)

♦ Thang chuẩn 100 bp (Công ty Biorad, Mỹ), thạch (Agarose)

2.3.2.3 Y dụng cụ

♦ Đầu côn 0,1-2 µL; 2-20 µL; 20-200 µL; 200-1000 µL

♦ Găng tay, khẩu trang, kim tiêm 21, ống tiêm 1 mL và 10 mL

♦ Que thủy tinh, tăm vô trùng, thùng đá

♦ Ống nghiệm 0,2 mL; 0,5 mL; 1,5 mL; 50 mL

♦ Ống nghiệm loại dãy 8 tuýp nắp phẳng dùng cho PCR định lượng

2.3.3 Lấy mẫu, vận chuyển mẫu và chuẩn bị mẫu

Bệnh nhân sau khi được chọn vào nhóm nghiên cứu, phiếu thu thập thông tin sẽ được ghi nhận (Phụ lục 4 Phiếu thu thập thông tin bệnh nhân) Sau đó, tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm

Tủy xương được ưu tiên chọn lựa Dùng mẫu máu để thay thế nếu tế bào non hiện diện trong máu ngoại biên từ 10% trở lên đủ để phát hiện dòng tế bào bất thường 1 – 2 mL tủy xương hoặc 10 mL máu được hút trong ống tiêm vô trùng, cho vào ống nghiệm có chứa ACD theo tỉ lệ 1:20 đến 1:10 Mẫu lập tức được trộn đều để tránh tạo cục máu đông Mẫu nên được ly trích càng sớm càng tốt Tốt nhất

là trong vòng 2 đến 3 giờ sau khi lấy mẫu Khi mẫu được chuyển đến vào thời điểm không thuận lợi hoặc việc chuyển mẫu bị chậm, mẫu máu và mẫu tủy có thể giữ ở nhiệt độ mát 20C – 80C trong vòng 24 giờ

2.3.4 Ly trích RNA

Toàn bộ RNA được ly trích bằng cách sử dụng hóa chất Sepazol-I (Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản) theo qui trình kỹ thuật do công ty cung cấp Mẫu máu hay tủy bệnh nhân được cho vào ống nghiệm 50 mL, kế tiếp cho dung dịch ly giải hồng cầu (Red Blood Cell lysis buffer) đủ 50 mL, giữ trong thùng đá trong 1 phút, ly tâm

1.500 vòng/ phút ở 40C trong 5 phút Sau khi ly tâm, hút bỏ lớp dịch trong ở trên, giữ cặn tế bào, thêm 25 mL dung dịch phân hủy hồng cầu, trộn đều, giữ trong thùng

đá trong 1 phút, ly tâm 1.500 vòng/ phút ở 40C trong 5 phút Sau đó, cặn tế bào được rửa sạch bằng dung dịch PBS(-) Cuối cùng, chuyển cặn tế bào vào ống nghiệm 1,5 mL, 107 tế bào cho mỗi ống nghiệm, thêm 980 µL Sepazol, trộn và giữ

5 phút ở nhiệt độ phòng; sau đó, trộn đều bằng ống tiêm 1 mL và kim 21 (hơn 10 lần), lưu trữ ở -800C

Để ly trích RNA từ dung dịch Sepazol trên, cho thêm 200 µL Chloroform vào ống nghiệm, trộn kỹ và ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng, kế tiếp ly tâm 15.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C Sau đó, chúng tôi chuyển phần dịch trong ở lớp trên vào ống nghiệm 1,5 mL mới, thêm 650 µL Isopropanol (2-Propanol) (Tỉ lệ 1:1), trộn kỹ,

ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng, rồi ly tâm 15.000 vòng/ phút trong 15 – 20 phút ở 40C Phần tủa RNA được rửa sạch bằng 800 µL Ethanol 75% (70% - 80%), ly tâm 15.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C Cẩn thận hút bỏ dịch nổi, tránh để nước bám trên thành ống nghiệm, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Tất cả các bước đều được thực hiện trong buồng xử lý vô trùng RNA được hòa tan với 20 µL dung dịch DEPC cất giữ ở -800C cho đến khi sử dụng

Riêng đối với kỹ thuật RQ-PCR, cần tiến hành đo nồng độ RNA bằng máy Ultrospec 5300 pro Mẫu đạt chất lượng khi có OD260:OD280 = 1,8 – 2,0 Lấy lượng thể tích mẫu chứa đúng 1µg RNA để tổng hợp cDNA nhằm đảm bảo sự đồng nhất đầu vào của các mẫu cần định lượng Lượng RNA còn lại được lưu trữ ở nhiệt

độ -800C

2.3.5 Tổng hợp cDNA (complementary DNA – Đoạn DNA bổ sung)

Vì nucleic acid cần phát hiện là RNA nên đầu tiên RNA cần được phiên mã ngược thành cDNA cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng kít iScript cDNA synthesis (Công ty Biorad, Mỹ), tuân thủ qui trình kỹ thuật của công ty Chuẩn bị

20 µL hỗn hợp dung dịch gồm: 5x iScript Reaction Mix, iScript Reverse Transcriptase, Nuclease – free water, mẫu RNA (1µg)

Dung dịch trên được ủ bằng máy luân nhiệt iCycler (Biorad) theo chu trình luân nhiệt sau: 250C trong 5 phút, 420C trong 30 phút, 850C trong 5 phút, và giữ trong 40C cho đến khi lấy ra khỏi máy cDNA được lưu trữ ở -200C đến khi sử dụng

2.3.6 Phản ứng khuếch đại gien

Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại các cDNA Mỗi phản ứng PCR gồm có các bước sau: duỗi mạch cDNA, gắn kết cặp mồi vào mạch khuôn cDNA, tổng hợp đoạn cDNA mới Nhiệt độ bắt cặp và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo từng loại tổ hợp gien, cặp mồi, tùy theo từng trường hợp cụ thể Phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng máy luân nhiệt iCycler (Công ty Biorad) Chứng âm được sử dụng là nước cất Sản phẩm sau PCR được điện di trên thạch 2% chứa 0,5 µg/mL ethidium bromide trong 0,5 x TBE, quan sát bằng hệ thống Gel Doc EQ (Công ty Biorad)

Các bước thực hiện được tuân thủ nghiêm ngặt nhằm chống lây nhiễm Các giai đoạn thao tác khác nhau như ly trích RNA, tổng hợp cDNA, PCR, sau PCR được tiến hành ở khu vực riêng biệt Đặc biệt, các dụng cụ trong khu vực sau PCR không bao giờ được đưa vào khu vực trước PCR Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khếch đại khi hút dung dịch phản ứng Sau mỗi lần thao tác, dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước Ngoài ra, luôn luôn sử dụng găng tay, không thao tác trực tiếp bằng tay, tránh lây nhiễm thành phần phân hủy RNA

2.3.6.1 Kiểm tra chất lượng cDNA

Để kiểm tra chất lượng cDNA, chúng tôi sử dụng gien chứng nội tại

(internal control gene) là gien GAPDH, với mồi xuôi (forward) là GAPDH-F

GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3’) và mồi ngược (reverse) là GAPDH-R CAACGTAGGTCCACCACTGACACG-3’) Phản ứng PCR sử dụng 1 µL cDNA; được trộn với 0,1 µL (0,5 U) iTaq Polymerase (Biorad), 1 µL (10 pmol) cặp mồi xuôi và ngược trong 20 µL hỗn hợp phản ứng Chu trình luân nhiệt như sau: 940C