Nghiên cứu sự đột biến gene k RAS và mối liên quan đột biến gene k RAS với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng

Luận văn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư (UT) là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầutrên thế giới, bệnh có xu hướng ngày càng gia tăng Dựa trên ước tính tìnhhình UT toàn cầu năm 2008 (GLOBOCAN 2008), trên thế giới có khoảng12.700.000 trường hợp UT và 7.600.000 trường hợp tử vong do UT trongnăm 2008 [75]

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là nguyên nhân gây tử vong cao hàngthứ 3 trong các tử vong do UT nói chung Theo Hiệp hội phòng chống UTquốc tế (Union for International Cancer Control - UICC), ước tính trên thếgiới mỗi năm có khoảng 1.000.000 trường hợp UTĐTT mới được phát hiện

và khoảng hơn 500.000 người chết vì căn bệnh này [36] Tỉ lệ mắc bệnh giữacác vùng miền, các châu lục có sự khác nhau Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ

5 sau các UT của dạ dày, phổi, vú và vòm họng Trong UT đường tiêu hóa thìUTĐTT đứng thứ 2, sau UT dạ dày Theo thống kê của Bệnh viện K Hà Nội,

tỉ lệ mắc UTĐTT là 9% tổng số bệnh nhân (BN) UT nói chung Tuy nhiên, sovới các UT của đường tiêu hóa thì UTĐTT là loại có tiên lượng tốt nhất [1],[8], [18], [19]

Cơ chế hình thành và phát triển của UTĐTT là do biến đổi và tích lũycác gen trong tế bào của niêm mạc đại trực tràng (ĐTT) Sự tích lũy dần cácbiến dị di truyền thường phải trải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), và điều nàyphù hợp với các nghiên cứu dịch tễ học di truyền về diễn biến của UTĐTTtrải qua nhiều bước [32], [76]

Sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ y sinh, hiện nay đã chophép xác định tương đối chính xác, đầy đủ và nhanh hầu như tất cả các dạngđột biến quan trọng trong những dòng tế bào UT phổ biến như UT phổi, ulympho ác tính, UTĐTT… Điều đáng ngạc nhiên là mặc dù mang nhiều đột

biến nhưng khả năng phát triển của tế bào UT dường như lại lệ thuộc chủ yếuvào nguồn tín hiệu sinh trưởng của một hoặc một nhóm gen sinh UT(oncogene) nhất định Những oncogene này mã hóa các protein đóng vai tròmắt xích trong các con đường tín hiệu nội bào Những đột biến này làm chocác tế bào UT có khả năng tăng sinh vô hạn, liên tục phân chia và thực hiệnquá trình xâm lấn, di căn… Tuy nhiên, chính đặc điểm này cũng làm phơi bày

“gót chân Achilles” của tế bào UT Bằng việc “đánh sập” các oncogene chủ

chốt như HER2, K-RAS, β-catenin, cyclin E, B-Raf… bằng công nghệ iRNA,

các nhà khoa học đã thành công trong việc ức chế sự phát triển của nhiều loại

tế bào UT in vitro [49] Những nghiên cứu trên mô hình chuột biến đổi gen

tiếp tục khẳng định tầm quan trọng của các gen đích trong nhiều bệnh UT,

trong đó có oncogene K-ras trong UTĐTT [74] Từ những bằng chứng trên,

một thế hệ mới các thuốc điều trị UT có khả năng tác động chính xác tới cácđích tiềm năng trong tế bào UT đã ra đời - đó là liệu pháp điều trị đích

Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu về UTĐTT, nhưng chủ yếu

là về đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi và mô bệnh học (MBH), còn ít thấy

có những nghiên cứu về đột biến gen trong UT nói chung và trong UTĐTT

nói riêng Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đột biến gen K-RAS và mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư đại trực tràng” được tiến hành nhằm 2 mục tiêu chính sau:

1 Nghiên cứu tình trạng đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng.

2 Tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh và nồng độ CEA ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Gen và ung thư đại trực tràng

Từ những nghiên cứu về cơ chế phát sinh và phát triển UTĐTT có sựliên quan đến sự biến đổi các gen tham gia vào sự chuyển dạng từ tế bào lànhsang tế bào UT Các gen này được chia thành 3 nhóm: gen UT, gen ức chế

UT và các gen sửa chữa DNA [49] Để hình thành UT phải có sự đột biến ở

cả 2 nhóm gen UT và gen ức chế UT Khi gen tiền UT bị đột biến thành gen

UT và gen ức chế UT bị bất hoạt hoặc bị tổn thương, lúc đó các tín hiệu cho

tế bào phát triển vượt quá các tín hiệu điều hòa thì sự phát triển của tếbào sẽ nhanh chóng vượt khỏi tầm kiểm soát và UT hình thành [2],[29], [93]

1.1.1 Các gen ung thư

Gen UT (oncogene) được định nghĩa là các gen đột biến mà các biến đổi

của chúng gây ra nguy cơ UT hoặc thúc đẩy quá trình UT Bình thường cácgen UT ở trạng thái gen tiền UT có vai trò trong sự điều hòa chu trình tế bào,phát triển và biệt hóa tế bào [49] Khi bị đột biến các gen tiền UT sẽ biểu hiệnquá mức các tín hiệu phân chia tế bào làm các tế bào tăng sinh thừa thãi, trởthành những gen UT (oncogene) [140] Một số gen UT được cho là có vai tròquan trọng trong quá trình phát triển UTĐTT đó là:

1.1.1.1 Gen RAS

Các gen UT được khẳng định có liên quan đến UTĐTT là họ gen RAS bao gồm H-RAS, K-RAS, N-RAS, mã hóa cho một protein 21-kDa Protein

RAS có vai trò trong việc truyền tín hiệu từ bề mặt tế bào vào trong nhân,

điều hòa khung xương tế bào và phân chia tế bào Dạng đột biến gen RAS,

gây hoạt hóa một loạt các protein kinase thành làn sóng, gây ra phosphoryl

các phân tử protein truyền tín hiệu nhân Chức năng gen RAS bị hoạt hóa cũng

liên quan đến yếu tố sinh mạch và chết tế bào theo chương trình (apoptosis)[38], [144]

Đột biến K-RAS2 được phát hiện từ 37 - 41% tất cả các UTĐTT Đột biến gen K-RAS và N-RAS cũng được tìm thấy trong 50% các khối u ĐTT

[50] Tần số đột biến tăng theo kích thước và độ loạn sản của polype, tuynhiên tần số này không tăng khi chuyển từ polype sang UT Các u tuyến với

đường kính > 1cm có tần số đột biến gen K-RAS là 50% [48], tương tự như

đột biến gặp trong UT Ngược lại, u tuyến có đường kính nhỏ (< 1cm) chỉ có

< 10% gen RAS bị đột biến, chứng tỏ đột biến gen RAS là đột biến mắc phải trong quá trình u tuyến phát sinh, đột biến gen RAS dường như có vai trò tiên

phong trong u tuyến [50]

1.1.1.2 Giảm methyl hóa DNA

Methyl hóa DNA có vai trò phức tạp trong phát triển UT Giảm methylhóa do Bodmer, Bishop và Karran đưa ra năm 1994, liên quan đến tăng biểu

hiện gen và có thể đóng vai trò hoạt hóa các gen UT như K-RAS Tương tự

như sự tăng hoạt hóa DNA có thể xảy ra đồng thời với giảm methyl hóa tạivùng khác của bộ gen trong nhiều loại UT [49], [50]

1.1.1.3 Gen C-MYC

Gen MYC (Myelocytomatosis) mã hóa cho các yếu tố phiên mã trực tiếp liên quan đến sự phát triển khối u Sản phẩm protein mã hóa bởi gen MYC có

cấu trúc bình thường, nhưng gia tăng về số lượng, hậu quả sự hoạt hóa gen

MYC là tăng biểu hiện gen Các gen MYC đôi khi cũng được coi là gen tiền UT, các tế bào mang gen tiền ung thư MYC được gọi là C-MYC

[49], [50], [132]

1.1.2 Các gen áp chế ung thư

Gen áp chế UT (tumor suppressor gene) là một loại gen UT được tạo ra

do sự đột biến làm mất chức năng Bình thường các gen này liên quan đếnkiểm soát hoặc ức chế phân chia tế bào, biệt hóa tế bào hoặc mã hóa tế bàochết theo chương trình Sự mất hoạt tính của các gen này gây ra mất khả năngkiểm soát sự phát triển bình thường của tế bào, làm biến đổi tế bào lành thành

và được coi là gen giữ cổng (gatekeeper) [50], giúp kiểm soát sự phát triểncủa tế bào theo một số cơ chế khác nhau, bao gồm điều hòa kết dính tế bào,

xử lý con đường truyền tín hiệu, duy trì khung xương tế bào, phân chia tế bào

và chết tế bào theo chương trình Mất hoặc bất hoạt gen APC dẫn đến mất cân

bằng phân chia tế bào, sự chết của tế bào và rối loạn phát triển của tế bào Đột

biến gen APC gặp trong 70% tất cả các UTĐTT, các nghiên cứu đều thống nhất là sự bất hoạt chức năng gen APC tạo ra một làn sóng ban đầu cho sự lan tràn dòng tế bào tiền UT Gen APC dường như có liên quan đến khởi phát của

polype tuyến [71]

1.1.2.2 Gen P53

Protein p53 được Lane D và Levine A phát hiện vào năm 1979 Gen

P53 mã hóa cho protein p53 chứa 393 axít amin, là một gen ức chế UT [50] Gen P53 có chức năng chủ yếu đáp ứng lại các tổn thương DNA, trong pha

(G1), kích thích sửa chữa DNA và thúc đẩy chết tế bào theo chương trình, gen

P53 đóng vai trò chủ đạo trong việc duy trì tính ổn định của DNA nên nó được coi là “người trông giữ bộ gen” [56], [118] Khi gen P53 bị đột biến, cơ

chế này bị mất đi và các dòng tế bào có thể có thêm các đột biến khác để tiến

triển UT Trong quá trình phát triển UTĐTT, đột biến gen P53 có thể xảy ra

do sự mất đi của nhiễm sắc thể hoặc do mất tính dị hợp tử Đột biến gen P53

gặp ở 50% trong các UT ở người và hơn 50% trong các ung thư biểu mô

tuyến (UTBMT) ĐTT Nhưng đột biến gen P53 rất hiếm gặp trong polyp tuyến [50], [73] Như vậy, bất hoạt gen P53 có liên quan đến quá trình chuyển

từ polyp tuyến lành tính sang UT

1.1.2.3 Gen MCC

Gen MCC (mutated in colon cancer), nằm trên 5q2, gần gen FAP Gen MCC mã hóa cho một protein gồm 829 axít amin, gần giống với cấu trúc protein APC Dường như có liên quan về vai trò của gen này với gen APC

nhưng chưa được rõ [49]

1.1.2.4 Gen DCC

Gen DCC (deleted in colon cancer) nằm trên vai dài nhiễm sắc thể 18 (18q21), là gen ức chế UT Vai trò của gen DCC trong ức chế UT là làm mất tương tác bình thường giữa các tế bào Đột biến gen DCC gặp 13% trong UTĐTT, tuy nhiên vai trò chính xác của gen DCC còn chưa được rõ Đột biến gen DCC ít gặp trong u tuyến nhỏ, nhưng khi u tuyến phát triển thành ung thư

biểu mô (UTBM) tại chỗ thì tần số đột biến lại tăng lên, tăng cùng với sự pháttriển xâm lấn của khối u [50]

1.1.2.5 Gen R11

Gen R11 mã hóa cho thụ thể truyền tín hiệu yếu tố phát triển n-2

(TGF-2) Gen R11 ức chế tế bào phát triển trong ĐTT và liên quan đến chết tế bào

theo chương trình Ung thư có thể phát triển khi đột biến ảnh hưởng đến cơchế kiểm soát chết tế bào theo chương trình Trong các khối u có tính không

ổn định về vi vệ tinh (Microsatellite instability - MSI), 80 - 90% có đột biến

gen R11 [49], [85], [103] Tuy nhiên, cần phải có đột biến gen khác cùng với

MSI thì khối u mới phát sinh

1.1.2.6 Gen SMAD4

Là thành viên của họ gen SMAD tạo nên mạng lưới liên kết nội bào, vai trò của gen SMAD4 là mã hóa cho protein vừa nhận tín hiệu từ bề mặt màng vào trong nhân tế bào, đột biến gen SMAD4 gặp từ 10 - 30% trong UTĐTT [50] Hệ thống SMAD có cơ chế bảo đảm cho tế bào có sự nhạy cảm khác nhau đối với môi trường ngoại bào, gen SMAD4 dường như là một đích bất

hoạt trong UTĐTT và đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn giữa của quátrình phát sinh UTĐTT [51], [102], [117]

1.1.3 Các gen sửa chữa lỗi ghép cặp sai (DNA-mismatch repair)

Gen hMSH2 ở vị trí nhiễm sắc thể số 2 (2p16) và gen hMLH1 ở nhiễm

sắc thể số 3 (3p21), các gen này đóng vai trò phát triển UTĐTT di truyềnkhông polype - Hội chứng Lynch (Hereditary non-polyposis colorectal cancer

- HNPCC) Chúng có nhiệm vụ sửa chữa DNA tổn thương trong quá trình saochép DNA Đột biến những gen này làm sao chép DNA sai lệch dẫn đến độtbiến tăng lên, ngoài gặp trong hội chứng Lynch còn gặp 15% trong UTĐTTtản phát [48], [116]

Như vậy, trong quá trình phát sinh UTĐTT có nhiều gen tham gia.Dưới đây là một số gen tham gia vào quá trình phát triển UTĐTT [49],[84], [125]

Bảng 1.1 Một số gen tham gia vào quá trình

phát triển ung thư đại trực tràng

hMLH1

[116] 3p21

UTĐTT di truyền không polyp Sửa chữa lỗi ghép cặp DNA

P53

[50] 17p13

Ức chế khối u, sửa chữa DNA tổn thương, chết tế bào theo chương trình

Kiểm soát chu kỳ tế bào

[103] Gen ức chế khối u Hoạt hóa TGF-

1.2 Gen K-RAS và ung thư đại trực tràng

1.2.1 Gen K-RAS

Kể từ khi được phát hiện ra từ những thập niên 70 của thế kỉ 20, cấu

trúc, chức năng và vai trò của gen K-RAS ngày càng được sáng tỏ.

1.2.1.1 Cấu trúc gen K-RAS

Gen K-RAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 12, ở vị trí 12.1: (12p12.1) Cụ thể là các gen K-RAS nằm từ nucleotid 25358179 đến nucleotid

25403853 trên nhiễm sắc thể 12 [45], [97]

K-RAS

Hình 1.1 Vị trí gen K-RAS trên nhiễm sắc thể 12

Nguồn: theo McGrath J.P (1983) [97]

1.2.1.2 Chức năng của gen K-RAS

Gen K-RAS là các gen sinh UT, mỗi gen K-RAS mã hóa cho một protein

tham gia chủ yếu trong việc điều hành phân chia tế bào Thông qua một quátrình truyền tín hiệu (transduction), protein truyền tín hiệu từ ngoài tế bào vàođến nhân tế bào Các tín hiệu này kích hoạt tế bào để phát triển và phân chia

hoặc trưởng thành với những chức năng chuyên biệt Các protein K-RAS là một

GTPase GTPase là một enzyme có chức năng chuyển đổi một phân tử gọi làGTP (Guanosine-5,-Triphosphate) đến một phân tử gọi là GDP (Guanosine-5,-

Diphosphate) Các protein K-RAS hoạt động như một chuyển đổi, nó có thể hoạt động (kích hoạt) hay yên nghỉ (bất hoạt) Để truyền tín hiệu, các protein K-RAS phải được kích hoạt bằng cách gắn vào một phân tử của GTP Các protein K-RAS

được bất hoạt khi nó chuyển đổi các GTP tới GDP, khi protein kết hợp với GDP,

nó không truyền tín hiệu tới nhân tế bào [91], [106], [110]

Những sản phẩm protein của gen K-RAS đóng vai trò quan trọng trong

phân bào, sự khác biệt tế bào và sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)[45], [58] [88], [89], [97]

1.2.1.3 Cơ chế sinh ung thư của gen K-RAS

Dưới tác dụng của các yếu tố môi trường (bức xạ, hóa chất ), sự đột

biến gen K-RAS có thể xảy ra Khi đột biến, các gen K-RAS có tiềm năng gây chuyển biến tế bào bình thường thành tế bào UT Đột biến gen K-RAS làm

thay đổi một protein (amino acid) trong một khu vực quan trọng của protein

K-RAS, gây ra các protein để được tiếp tục hoạt động Thay vì kích hoạt sự

tăng trưởng tế bào để phản ứng lại các tín hiệu đặc biệt từ bên ngoài tế bào,protein hoạt động quá mức (overactive protein) chỉ đạo các tế bào phát triển

và phân chia không ngừng Trong quá trình phát triển phôi, các protein RAS hoạt động quá mức phá vỡ sự phát triển bình thường và trở thành các

K-mô nhất định [74], [82], [90], [119]

Một số đột biến gen được hình thành trong thời gian của mỗi con người

và chỉ có mặt trong các tế bào nhất định Những thay đổi này gọi là đột biến

thân (hay đột biến soma) Sự đột biến soma trong gen K-RAS có liên quan đến

sự phát triển của nhiều loại UT Những đột biến này dẫn đến một protein RAS đó là luôn luôn chủ động và có thể tác động trực tiếp đến tế bào để phát

K-triển và phân chia không có kiểm soát [45], [70], [97]

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, đột biến gen K-RAS là phổ biến trong UTĐTT

1.2.2 Các phương pháp xác định đột biến gen K-RAS

Nhiều phương phương pháp khác nhau có thể được áp dụng để xác định

đột biến gen K-RAS trên cơ sở tỉ lệ tế bào UT trong mô phân tích.

1.2.2.1 Kỹ thuật giải trình tự gen

Đây là phương pháp thường được sử dụng khi mật độ tế bào UT trong

mô phân tích  30% Với tỉ lệ này, việc xác định đột biến gen bằngphương pháp giải trình tự gen trực tiếp có độ nhạy và độ đặc hiệu lên đến99% DNA của bệnh nhân tách chiết từ mẫu mô được sử dụng để khuếch

đại gen K-RAS bằng phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) sau khi tinh sạch được đưa vào giải trình tự trực tiếp sử

dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems,

Foster city, USA) Trình tự gen được đối chiếu với trình tự gen K-RAS

hoang dại trên GenBank (National center for biotechnology information NCBI) và phân tích theo phương pháp ABI Prism 310 genetic analyzer(Applied Biosystems) [47]

-1.2.2.2 Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)

Phương pháp phát hiện đột biến bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên

nguyên lý: trình tự kiểu dại codon 12 thuộc exon 2 của gen K-RAS có vị trí

nhận biết của enzyme giới hạn BstNI, đột biến tại codon 12 làm mất vị trícắt của enzyme BstNI Với kỹ thuật này thì sản phẩm PCR khuếch đại exon

2 gen K-RAS được phân cắt bởi enzym BstNI Sản phẩm cắt bằng enzym

được điện di phân tích trên gel agarose NuSieve GTG nồng độ 3% sẽ xác

định được đột biến điển hình trên gen K-RAS Đây là phương pháp truyền

thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao trong

trường hợp xác định đột biến điển hình Phương pháp này hứa hẹn khảnăng áp dụng rộng rãi và hiệu quả trong việc sàng lọc nhanh các đột biến

tại codon 12 của gen K-RAS [137], [145].

1.2.2.3 Kỹ thuật Scorpions-Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS)

Hiện nay, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm phát

hiện đột biến gen K-RAS Tuy nhiên, chỉ một vài kỹ thuật được các cơ quan

quản lý Y Dược của Châu Âu và Hoa Kỳ cấp giấy phép công nhận đạt tiêuchuẩn ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng Kỹ thuật Scorpions ARMS là một

trong số ít những kỹ thuật đó (European Union in vitro Diagnostic Medical Device Directive 98/79/EC) Scorpions ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật

khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trongphản ứng Real time PCR để phát hiện các đột biến Nguyên lý của kỹ thuậtkhuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNApolymerase chỉ khuếch đại hoàn chỉnh 1 phân tử DNA một khi đầu 3’ của mồi

và sợi khuôn bổ xung hoàn toàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sungvới sợi khuôn phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn Dựa trên nguyên lý này,

kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trongtrường hợp alen đột biến đó chiếm 1 tỉ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuônDNA Scorpions là phân tử có cấu tạo một đầu mang trình tự của đoạn mồiđặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với mộtđầu dò Fluorophore phát tín hiệu huỳnh quang của đầu dò được gắn vớiquencher có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh quang của fluorophore Trongphản ứng PCR khi đầu dò bám với đoạn trình tự khuếch đại,Fluorophore được giải phóng khỏi quencher, phát tín hiệu đến cảm biếncủa máy Realtime - PCR [55]

1.2.2.4 Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp)

Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp) là một công nghệmới nhất được phát triển bởi các nhà khoa học tại Viện công nghệ RIKEN-

Nhật Bản nhằm phát hiện các đột biến trên gen K-RAS Nguyên lý cơ bản của

kỹ thuật SmartAmp là: “Khuếch đại DNA = Phát hiện đột biến” Để thực

hiện được nguyên lý này, kỹ thuật SmartAmp sử dụng các cặp mồi phát hiện

đột biến (I) được thiết kế bất đối xứng nhằm giảm thiểu các khả năng mồi ghép cặp sai với sợi khuôn (II), một loại protein mới với khả năng nhận biết

và bám đặc hiệu tại vị trí có sự ghép cặp không tương đồng giữa mồi vàkhuôn (TaqMutS) ngăn không cho phức hợp mồi - khuôn được khuếch đạitrong phản ứng kéo dài chuỗi Chỉ những phức hợp mồi - khuôn DNA ghépcặp hoàn toàn mới được khuếch đại nhờ DNA polymerase, tín hiệu của sảnphẩm khuếch đại đặc hiệu đột biến được phát hiện trong hệ thống máyRealtime - PCR Thực tế cho thấy một trong những khó khăn của việc ápdụng các kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự, Scorpions ARMS trongthực tế lâm sàng thường đòi hỏi qua nhiều bước, đội ngũ kỹ thuật viên có kiếnthức chuyên sâu về sinh học phân tử, giá thành cao, thời gian phân tích kết quảlâu Các công trình nghiên cứu áp dụng kỹ thuật SmartAmp cho thấy kỹ thuật

vận hành qua 1 bước duy nhất “khuếch đại DNA = phát hiện đột biến”, có độ

chính xác cao, thời gian từ khâu tách mẫu đến cho kết quả phân tích đột biếngen rất ngắn, chỉ khoảng 30 phút Đây là một ưu thế nổi bật của kỹ thuậtSmartAmp so với các kỹ thuật khác như giải trình tự gen (1 - 2 ngày), PCR -RFLP (1 - 2 ngày), Scorpions ARMS (3 - 4 giờ) [55], [79], [87] Một khi kỹthuật SmartAmp được áp dụng thành công, kỹ thuật mới này sẽ là một công cụđắc lực giúp các nhà Y Sinh học và các bác sĩ lâm sàng Việt Nam hiện thựchóa mục tiêu y học: Điều trị bệnh theo thực trạng bộ gen của cá thể

Kể từ khi được khám phá từ những thập niên 70 của thế kỷ 20, gen

K-RAS tiếp tục được nghiên cứu nhằm sáng tỏ vai trò mới trong việc tiên

lượng hiệu quả đáp ứng thuốc trên các nhóm BN UT khác nhau Những tiến

bộ trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe được thừa hưởng những thành tựu khoahọc trong lĩnh vực y sinh Do vậy, trong tương lai, các nhà nghiên cứu cũngnhư các bác sĩ lâm sàng cần phải giải đáp những câu hỏi như: Đột biến gen

K-RAS có gây kháng thuốc điều trị đích trên nhóm bệnh nhân UTĐTT; Có hay không những dấu ấn sinh học tiềm năng khác ngoài K-RAS ? Định

hướng nghiên cứu để tìm ra thế hệ thuốc điều trị đích mới cho những nhóm

BN bị đột biến kháng thuốc ?

1.2.3 Đột biến gen K-RAS và hiệu quả điều trị đích trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới được thực hiện nhằm

phân tích tình trạng gen K-RAS (mã hóa cho protein RAS) ở các BN UTĐTT

được điều trị bằng cetuximab hoặc panitumumab Theo thống kê, oncogene

K-RAS bị đột biến trong hơn 30% các ca UTĐTT Cho đến nay, có hơn 3000 đột biến điểm trong gen K-RAS đã được báo cáo, trong đó đột biến hay gặp

nhất là đột biến thay thế nucleotit ở codon 12 (chiếm 82%) và codon 13

(chiếm 17%) ở exon 2 của gen K-RAS

Hình 1.2 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR

Nguồn: Theo Scartozzi M và CS (2011) [122]

Đột biến tại codon 12 và 13 đóng một vai trò quan trọng trong quá trìnhtiến triển bệnh UTĐTT và nguy cơ kháng thuốc ức chế EGFR của khối u Độtbiến tại những vị trí khác như codon 61 và 146 cũng đã được báo cáo nhưngchiếm tỉ lệ nhỏ và ảnh hưởng của những dạng đột biến này trên lâm sàng chưa

được làm sáng tỏ Gen K-RAS mã hóa cho một protein G đóng vai trò truyền

tín hiệu nội bào xuôi dòng từ EGFR Protein G này thuộc họ protein RAS cóchức năng truyền tín hiệu từ các thụ thể bề mặt tế bào tới những đích nội bàothông qua các dòng thác tín hiệu (bao gồm con đường RAS-MAPK) Trong tếbào, protein RAS được giữ cân bằng thông qua sự hình thành 2 phức hợptương ứng với các trạng thái của protein RAS: Phức hợp RAS-GTP (proteinRAS được hoạt hóa) và phức hợp RAS-GDP (protein RAS bị bất hoạt)

Protein RAS được hoạt hóa nhờ yếu tố chuyển nucleotide guanine (guanine nucleotide exchange factors (GEFs) Việc truyền tín hiệu của protein RAS bị

ức chế khi phức hợp RAS-GTP bị thủy phân thành phức hợp RAS-GDP nhờmột loại protein có chức năng hoạt hóa GTPase (GAPs) [122] Ở điều kiệnsinh lý bình thường, nồng độ RAS-GTP trong cơ thể được kiểm soát chặt chẽ

nhờ sự hoạt động nhịp nhàng của 2 yếu tố GEFs và GAPs Khi gen K-RAS bị

đột biến sẽ mã hóa cho những protein RAS mới có khả năng chống lại hoạttính GTPase của GAPs Do đó, những protein RAS đột biến này luôn luôn tồn

tại ở trạng thái hoạt hóa RAS-GTP (Hình 1.3) Không giống như các protein

RAS kiểu hoang dại luôn bị bất hoạt sau một khoảng thời gian rất ngắn, cácprotein RAS đột biến có khả năng kích hoạt vĩnh viễn các con đường truyềntín hiệu nằm xuôi dòng nó bất kể có sự hoạt hóa của thụ thể EGFR nàohay không Đây chính là cơ chế phân tử lý giải cho tình trạng kháng

thuốc điều trị đích ở những BN mang khối u bị đột biến gen K-RAS [39], [63], [64], [114], [134], [136].

Đột biến gen K-RAS gây kích

hoạt vĩnh viễn RAS

Bình thường

Hình 1.3 Đột biến gen K-RAS

hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu nội bào

Nguồn: theo Van Krieken J.H và CS, (2008) [136]

1.3 Yếu tố nguy cơ và quá trình phát sinh ung thư đại trực tràng

1.3.1 Các yếu tố nguy cơ

1.3.1.1 Tuổi và giới

Kết quả thu được từ nhiều nghiên cứu cho thấy tỉ lệ mắc UTĐTT tăngtheo tuổi, tỉ lệ gặp thấp ở tuổi dưới 40, trừ trường hợp có bệnh do gen hoặcviêm mạn tính vùng chậu trước đó [65], [66]

UTĐTT là bệnh chung cho cả hai giới nhưng nam thường bị nhiều hơn

nữ, tỉ lệ nam/nữ thay đổi từ 1,1 - 2,1 lần Phụ nữ ở các vùng khác nhau có tỉ lệmắc tương tự như nhau, vào khoảng 60 - 80% so với nam giới[36], [59], [109]

1.3.1.2 Địa dư

Sự phân bố của UTĐTT rất khác nhau giữa các châu lục và các quốc giatrên thế giới [105] Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc UTĐTT tăng lên hàng năm Năm

1991 tại Hà Nội, tỉ lệ mắc UTĐTT là 4,3/100.000 dân nhưng đến năm 1999

đã tăng lên 13,3/100.000 dân [6], [11], [109]

1.3.1.3 Polype

Khoảng từ 70 - 90% các trường hợp UTĐTT hình thành từ polype utuyến (adenomatous polype) Quá trình từ một polype u tuyến tiến triển thànhmột UT phải có biến đổi về gen và thời gian phải mất 5 - 10 năm Bệnh nhân

có polype u tuyến thì 50% phát triển thành UT sau 15 năm [92], [104]

1.3.1.4 Yếu tố di truyền

Yếu tố di truyền trong UTĐTT bao gồm các hội chứng di truyền nhưbệnh đa polype tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis - FAP) vàUTĐTT di truyền không polype [33],

- UTĐTT di truyền không polype (Hội chứng Lynch), được mô tảnăm 1895 bởi Aldred Warthin Năm 1962, Henry Lynch bổ sung cácđặc điểm của hội chứng là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể

Nguyên nhân của hội chứng là do đột biến các gen hMLH1 (50%), hMSH2 (40%) và hMSH6 (10%) UTĐTT di truyền không polype bao

- Bệnh đa polype tuyến gia đình (FAP): là bệnh di truyền theo tính trội, tỉ

lệ gặp từ 1 - 2% các UTĐTT Nguyên nhân do đột biến gen APC (Adenomatous polyposis coli), trong đó có 80% do đột biến gen APC, 15% có giảm biểu hiện gen APC và 5% có biểu hiện gen APC bình thường Người

bệnh đa polyp tuyến gia đình thường phát triển từ hàng trăm tới hàng ngànpolyp trước tuổi 30, trong đó 90% xuất hiện ở tuổi 20, 10% ở lứa tuổi lên 10

và chắc chắn (100%) phát triển thành UTĐTT ở tuổi 40 [36], [132]

1.3.1.5 Bệnh viêm ruột

- Bệnh viêm loét ĐTT chảy máu:

Viêm loét ĐTT chảy máu là một yếu tố làm tăng nguy cơ UTĐTT.Nguy cơ UT ở người viêm loét ĐTT chảy máu tương đối thấp trong 10 nămđầu nhưng sau đó lại tăng lên 0,5 - 1% mỗi năm và nằm trong khoảng từ 8 -30% sau 25 năm Những người trẻ bị viêm loét chảy máu toàn bộ ĐTT có

nguy cơ mắc UT là 12% năm 15 tuổi, 23% năm 20 tuổi và 42% năm 24 tuổi.

Để phòng ngừa phải theo dõi và phát hiện sớm những tổn thương sinh UT,đặc biệt là loạn sản độ cao là biểu hiện sớm của quá trình hình thành UT [78]

- Bệnh Crohn's:

Bệnh viêm hạt mạn tính của ống tiêu hóa chủ yếu là ở đoạn cuối củahồi tràng, 20% phối hợp với tổn thương ở đại tràng (ĐT), tổn thương ĐT đơnđộc là 20% Bệnh thường gặp ở nam giới từ 20 - 40 tuổi Bệnh Crohn's làm

tăng nguy cơ phát sinh UTĐTT [24]

1.3.1.6 Những yếu tố nguy cơ khác

Chế độ ăn nhiều mỡ động vật làm tăng các vi khuẩn kị khí ở ruột, làmchuyển đổi axít mật bình thường thành các chất gây UT Các amin dị vòngđược sinh ra trong quá trình nướng các loại thịt có màu đỏ ở nhiệt độ cao làcác chất có khả năng gây UT [31] Ăn nhiều rau và hoa quả, hoạt động thể lựclàm giảm nguy cơ UTĐTT [24]

Thừa cân béo phì làm tăng nguy cơ phát triển UTĐTT từ 15 - 33%.Nguy cơ polype u tuyến cũng tăng ở những người có chỉ số khối cơ thể cao(BMI 45 - 46%) [36], [109]

Khói thuốc lá làm khởi động quá trình sinh UTĐTT do tham gia vào cácphức hợp hoạt hóa pha I và pha II của quá trình hoạt hóa và giải độc tế bào,

do tác động tới một số gen liên quan đến quá trình sinh UTĐTT như:Glutationine-S-transferase (GSTM1 và GSTT1), Cytochrome P450A1(CYP1A1) và N-acetyl transferase (NAT1 và NAT2) [36], [41], [105]

Đái tháo đường type II làm tăng nguy cơ ở mức trung bình đối với utuyến và UTĐTT Mức selenium thấp làm tăng nguy cơ UTĐTT Folate làmethion cần thiết cho quá trình methyl hóa Có mối liên quan giữa mức tăngcholesterol và UTĐTT với RR = 1,65 khi làm lượng cholesterol > 276 mg/dl[59], [109], [126]

1.3.2 Cơ chế hình thành và phát triển của ung thư đại trực tràng

1.3.2.1 Quá trình phát sinh ung thư đại trực tràng qua nhiều bước

UTĐTT hình thành và phát triển do tích lũy các biến đổi gen trong tế bàobiểu mô của niêm mạc của ĐTT Các biến đổi gen kết hợp với những tác nhângây UT sẽ gây đột biến hoặc khiếm khuyết gen, tạo nên UT và làm mất chứcnăng của gen ức chế UT Sự tích lũy dần các biến dị di truyền thường cầnphải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), và điều này phù hợp với các nghiên cứudịch tễ học di truyền về diễn biến của phát sinh UTĐTT trải qua nhiều bước[76], [81], [124]

UTĐTT phát sinh từ một tế bào đơn lẻ phát triển bằng cách tạo dòng tếbào Các biển đổi đó được coi là do đột biến hoặc được di truyền, tích lũy dầntrong dòng tế bào này Có những biến đổi bị loại trừ, có biến đổi chiếm ưuthế Những tế bào có ưu thế phát triển dần dần tạo ra một dòng tế bào tiếp tụcphát triển và những đột biến kế tiếp được tích lũy lại trong tế bào gây rapolype (biểu hiện sớm nhất có thể quan sát được trong u ĐTT), dần dầnnhững biến đổi di truyền đủ gây ra phát sinh UT và UT sẽ phát triển Thực tế,các BN có polype thì sau một thời gian dài (nếu có) thì mới tiến triểnthành UT Những phân tích MBH khối u thường phát hiện thấy các tếbào u tuyến nằm cạnh ngay khối u Khối u phát sinh như là từ một tếbào nguồn gốc từ polype [111]

Về mặt MBH, có hai loại polype chính là polype tăng sản (polype khôngloạn sản) và polype u tuyến (polype loạn sản) Polype không loạn sản có cấutrúc biểu mô vẫn giữ trật tự bình thường, những khối này là lành tính và pháttriển chậm [132] Polype u tuyến thể hiện loạn sản rõ, các tuyến càng loạn sảnmạnh khi u phát triển to hơn và xâm lấn ra các mô lân cận (tính chất ác tính).Khối u có thể phát triển không liên tục Một polype nhỏ có thể khôngtiến triển trong nhiều năm, thậm chí vài chục năm, nhưng khi có một đột biếntiếp theo xuất hiện trên một tế bào nào đó, một làn sòng phát triển mới có thể

xảy ra Một tỉ lệ cao các u tuyến phát triển và trở thành ác tính, kích thướctăng nhanh U tuyến có đường kính < 10 mm rất ít phát triển thành ác tính, utuyến có đường kính > 10 mm thì khoảng 15% có nguy cơ UT hóa trong 10năm tiếp theo Những khối u tiến triển có thể di căn vào các hạch vùng hoặc

di căn xa tới phúc mạc, tới gan… [123], [132]

Nghiên cứu của Fearon., Vogelstein B và CS (1990) cho thấy sự biến đổi

di truyền trong quá trình tiến triển của khối u ĐTT và mối liên quan giữa từnggiai đoạn phát triển của khối u khi chuyển từ dạng tế bào tiết nhày bìnhthường thành polyp, rồi tiếp theo thành UT với các biến đổi gen, có một sốgen được xác định là đóng vai trò quan trọng trong tiến trình gây UTĐTTtheo trình tự nhiều bước Các gen này trực tiếp thúc đẩy sự phát triển củanhiều tế bào u hoặc phá vỡ hàng rào để khối u phát triển Sự biến đổi ditruyền liên tiếp có được do sự tích tụ tính không ổn định di truyền Nhữngnghiên cứu này tạo nên mô hình kiểu mẫu để hiểu biết rõ cơ chế nhiều gentham gia vào quá trình sinh u gồm những đột biến và thứ tự xuất hiện của cácđột biến đó Những nguyên lý di truyền cơ bản từ việc phân tích trongUTĐTT cũng có thể được áp dụng cho tất cả các loại UT khác [61]

Biểu mô

bình thường Biểu mô

Hình 1.4 Quá trình phát sinh ung thư đại trực tràng qua nhiều bước

Nguồn: Theo Smith G và CS (2002) [127].

1.3.2.2 Tính không ổn định vi vệ tinh và các gen sửa chữa DNA

Cơ chế phân tử sinh UTĐTT gần đây được đưa ra là sự nhân lên của cácsai sót, hay còn gọi là tính không ổn định của các vi vệ tinh MSI Quá trìnhnày có thể xảy ra qua hai giai đoạn kéo dài tách biệt hoặc giao thoa nhau Sựkhông ổn định này có thể xảy ra đối với toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc chỉ xảy rađối với một vùng gen lặp lại gọi là vùng vi vệ tinh (microsatellite) Cácmicrosatellite là các đoạn lặp lại đặc biệt của DNA Các trình tự này chứaCytosine (C) và Adenine (A) hoặc các Dinucleotide (lặp lại CA) Những trình

tự này được tìm thấy rải rác trong toàn bộ gen (genome), tuy nhiên chức năngchính xác của chúng còn chưa được biết rõ [111]

Ở khối u, các trình tự lặp lại này thường bị biến đổi, điển hình là xuấthiện các alen mới, gây ra sự khiếm khuyết trong việc tái tổng hợp DNA Sựkhiếm khuyết này được gọi là sự không ổn định “microsatellite” hoặc MSI

Sự suy giảm khả năng nhân lên bình thường của DNA là do mất chức năngcủa DNA polymerase trong quá trình nhân lên Sau đó, các tế bào nhận ra saisót bắt cặp sai Sự phát hiện ra MSI trong UTĐTT không có đa polype ditruyền (HNPCC) đã dẫn đến sự phát minh ra các gen sửa chữa bắt cặp sai

DNA (gây ra do đột biến các gen hMSH2, hMLH1, hPMS1 hoặc hPMS2)

đóng vai trò làm phát triển HNPCC [67], [69]

Hầu hết các u ở những BN này đều biểu hiện MSI Các gen sửa chữaDNA được cho là có vai trò quan trọng trong phát triển UT do mất chức năngprotein Sau khi mất chức năng của gen ức chế UT, cùng với quá trình biến

đổi các gen UT dần dần tiến triển, khoảng 15% UTĐTT có MSI [111], chứng

tỏ có một cơ chế phát sinh UT liên quan đến MSI

1.4 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng

1.4.1 Đặc điểm lâm sàng ung thư đại trực tràng

Đau bụng là một trong những triệu chứng sớm và thường gặp trong 60 80% các trường hợp UTĐTT, mức độ đau từ nhẹ, âm ỉ, đến đau thành cơn dữdội, xuất hiện không theo một qui luật về cường độ, thời gian và không liênquan đến bữa ăn, vị trí đau thường tương ứng với vùng UT Ung thư ĐT phảithường đau âm ỉ, khu trú ở bên phải Ung thư ĐT trái thường theo kiểu thâmnhiễm, xơ vòng khi phát triển làm cho ĐT chít hẹp nên đau bụng thường quặntừng cơn, có khi đau giữ dội UT trực tràng (TT) thường hay có đau âm ỉ lanxuống hạ vị [21], [94], [131]

-Rối loạn tiêu hóa thường gặp là táo bón hoặc ỉa lỏng hoặc xen kẽ giữatáo bón và ỉa lỏng Táo bón thường gặp ở UT ĐT trái nhiều hơn do UTthường nhanh chóng làm hẹp lòng ruột, cản trở sự lưu thông của phân, gây ứđọng làm tăng quá trình thối rữa, lên men và sinh nhiều hơi làm bụng chướng.Tăng bài tiết chất nhày ở ruột làm ỉa lỏng, đôi khi có máu, ỉa lỏng thường gặpkhi có u ở ĐT phải do tính chất giải phẫu của ĐT phải tiếp nối với ruột non,phân ở đây còn lỏng Ung thư trực tràng (UTTT) thường gây thay đổi thóiquen đại tiện, gây hội chứng giả lỵ với mót rặn và đau hậu môn sau khi đạitiện, phân có thể khuôn nhỏ, kiểu bút chì hay phân dẹt Nhiều kết quả nghiêncứu cho thấy triệu chứng rối loạn tiêu hóa thường gặp trong UTĐTT gồmnhững triệu chứng rất đa dạng và phong phú và không đặc trưng cho riêngUTĐTT Thực tế, những triệu chứng của UTĐTT cũng có thể gặp trongnhiều bệnh lý khác của đường tiêu hóa, đặc biệt là trong hội chứng ruộtkích thích, vì vậy khi có các rối loạn như trên kéo dài cần thiết phải nộisoi ĐTT toàn bộ bằng ống soi mềm để loại trừ UTĐTT

Đi ngoài ra máu là do chảy máu từ khối UT, chảy máu ở khối u ĐT phảiphân thường có máu màu đỏ sẫm, chảy máu ở khối u ĐT trái phân có máumàu đỏ hơn, máu thường lẫn một chút nhày của niêm mạc ruột Đối với UT

TT, đi ngoài ra máu là triệu chứng hay gặp nhất, rất đa dạng với phân toànmáu hoặc phân nhày máu lẫn lộn, có thể xuất hiện từng đợt hoặc kéo dài làm

BN thiếu máu Máu trong phân là do chảy máu từ khối u, chảy máu vi thể sẽchỉ phát hiện được bằng xét nghiệm tìm máu tiềm ẩn trong phân (test FaecalOccult Blood - test FOB) Khi số lượng máu lớn sẽ nhìn thấy bằng mắtthường, triệu chứng đi ngoài ra máu thường hay gặp ở ĐT trái và TT hơn ởnửa ĐT phải, màu sắc của máu trong phân có thể cho biết vị trí của khối u,khi chảy máu từ khối u ở ĐT trái và TT máu thường sáng hơn là máu chảy từ

ĐT phải hay manh tràng Hiện nay, một số nước đã sử dụng xét nghiệm tìmmáu ẩn trong phân như một test sàng lọc UTĐTT có hiệu quả Tuy nhiên, khixét nghiệm âm tính cũng chưa thể loại trừ được UTĐTT vì 40% test âm tínhgiả do khối u có thể không chảy máu hoặc chảy máu từng giai đoạn mà khilàm test FOB vào giai đoạn không chảy máu và test FOB thường âm tính nếunồng độ hemoglobin < 2 ml/gram [35]

Bán tắc ruột: hậu quả của khối u là làm hẹp lòng ĐT, ngày càng hẹp hơn,

do đó sớm hoặc muộn cũng sẽ xuất hiện những triệu chứng của bán tắc ruột

Ở mức độ nhẹ, triệu chứng Bouveret: đau âm ỉ hoặc có cảm giác nặng bụng,chướng bụng; ở mức độ nặng hơn, hội chứng Koenig: đột ngột lên cơn đaubụng, nôn hoặc buồn nôn, bụng óc ách nhiều hơi, sau vài giờ khỏi hẳn Kếtthúc bằng việc đi ngoài phân lỏng hoặc đánh trung tiện thì dễ chịu hẳn

Tắc ruột điển hình: do hậu quả của khối u làm hẹp lòng ĐT hoặc do khối

u gây lồng ruột rồi đi đến tắc ruột đột ngột Đau bụng, nôn hoặc buồn nôn,bụng trướng hơi, các quai ruột nổi lên như rắn bò, bí trung đại tiện là nhữngtriệu chứng thường gặp

Khám bụng thấy khối u gặp ở 60% số BN UTĐTT, vị trí u thường gặp ởvùng hố chậu phải hoặc nửa bụng bên phải [12] Đối với UT ĐT trái, chỉ sờthấy khối u ở một phần tư các trường hợp, u ở hai góc phải và trái của ĐT khó

sờ hơn vì vướng bờ sườn che lấp, khi sờ thấy u thường là dấu hiệu muộn,ngoài ra còn có thể khám thấy những khối u do di căn ở gan, ở phúc mạc vànhững triệu chứng tắc ruột do khối u Khám TT có thể phát hiện và xác địnhđược vị trí, kích thước và mức độ di động của khối u đối với những khối u ởphần thấp của TT Cũng như triệu chứng rối loạn phân, tỷ lệ các trường hợp

sờ thấy u ở bụng qua nghiên cứu của các tác giả cũng khác nhau

Các biểu hiện toàn thân thường gặp ở UT ĐT phải nhiều hơn

là UT ĐT trái với biểu hiện như sụt cân, chán ăn, mệt mỏi, thiếumáu, sốt cũng thường gặp

Nhìn chung, không có một bệnh cảnh chung cho UTĐTT Ở giai đoạnsớm, UTĐTT hầu như không có biểu hiện gì đặc biệt, các triệu chứng lâmsàng chỉ có tính chất gợi ý Theo Keddie và Hargreaves, chỉ có 40% số BN là

có bảng lâm sàng điển hình [131] Vì vậy, đứng trước một biểu hiện thay đổithói quen đại tiện, táo bón hoặc tiêu chảy, đau quặn bụng, đi ngoài ra máu,nhày, thể trạng gầy sút, mệt mỏi hoặc thiếu máu không rõ lý do… thì cần phảinghĩ đến UTĐTT và phải thực hiện các biện pháp chẩn đoán

1.4.2 Cận lâm sàng ung thư đại trực tràng

1.4.2.1 Xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân (test FOB:Faecal occult blood)

Nguyên lý chung là tìm hemoglobin trong phân và không phải làphương pháp chẩn đoán đặc hiệu UTĐTT vì tất cả các nguyên nhân gây chảymáu đều làm FOB dương tính Hiện nay, có ba phương pháp thử test FOB,trong đó phương pháp thử giấy thấm bão hòa Gaiac (Test Hemocult II) phát

hiện gián tiếp Hemoglobin qua phản ứng oxy hóa khử của hemoglobin được

sử dụng phổ biến [86], [98], [141],

1.4.2.2 Xét nghiệm CEA (Carcinoma embrionic antigen)

CEA là kháng nguyên UT biểu mô phôi, là một trong những chất chỉđiểm chính của UTĐTT Những nghiên cứu cho thấy nồng độ CEA tronghuyết thanh người bình thường có giới hạn cao nhất là 5ng/ml Trong UTĐTT

có sự tương quan giữa tỉ lệ CEA và giai đoạn bệnh CEA có giá trị đánh giáhiệu quả điều trị bệnh, điều trị có kết quả CEA trở về bình thường sau 6 tuần.Ứng dụng lớn nhất của CEA là để theo dõi tái phát, di căn sau điều trị, nồng

độ CEA tăng cao biểu hiện bệnh tái phát hoặc di căn [15], [23], [24]

1.4.2.3 Nội soi đại trực tràng

Nội soi TT ống cứng chỉ cho phép khám xét được đến 20 cm bao gồmcác tổn thương ở hậu môn, TT và một phần ĐT xích ma Soi ĐT xích mabằng ống soi mềm có thể lên đến 60 cm, cho phép khám đến ĐT xuống, cóthể phát hiện đến 60% các UTĐTT Soi ĐT ống mềm được bắt đầu từ năm

1957 bởi Mutsunaga (Nhật Bản) Hiện nay, soi ĐT ống mềm kết hợp sinhthiết được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán UTĐTT Với ưu điểm là cókhả năng phát hiện được những tổn thương nhỏ, nội soi có thể thấy được bềmặt khối u sần sùi, loét, hoại tử, tổn thương xuất huyết, khối u trên nền niêmmạc cứng, tình trạng niêm mạc xung quanh khối u, kích thước khối u so vớichu vi lòng ĐT Qua nội soi có thể quan sát trực tiếp toàn bộ khung ĐT, tiếnhành sinh thiết và làm xét nghiệm MBH

Để có thể phát hiện được các týp phẳng và lõm cần phải sử dụng cácchất màu để nhuộm (như indigocarmin, xanh methylene) để làm nổi rõ cáctổn thương qua sự bắt màu khác nhau giữa các vùng lành và vùng tổn thương

Từ phương pháp này mà các UT sớm týp phẳng và týp lõm được phát hiệnsớm Trong 10 năm trở lại đây, nội soi nhuộm màu phóng đại đã được áp

dụng trong chẩn đoán và điều trị các tổn thương ĐTT, nhờ vậy mà ngay trongnội soi đã xác định được những tổn thương không cần điều trị, tổn thương cầncắt bỏ hoặc phải phẫu thuật Gần đây, đã phát triển hệ thống nội soi có dải ánhsáng hẹp (Narrow band immaging) cho phép xác định rõ bề mặt tổnthương mà không cần nhuộm màu trong việc phân biệt các tổn thương

ác tính và không ác tính ở ĐTT Nội soi nhuộm màu phóng đại và hệthống nội soi có dải ánh sáng hẹp là các phương tiện tiềm năng trongchẩn đoán UTBM ở giai đoạn sớm

Tổn thương trên nội soi của UTĐTT là sự kết hợp giữa các hình tháinhư loét, sùi, thâm nhiễm… Tùy thuộc chúng được phát hiện vào thời điểmnào trong quá trình tiến triển, các thể thường gặp bao gồm:

- Thể sùi: Khối u lồi vào trong lòng ĐT, mặt u sần sùi, có thể chia thànhthùy, múi, màu loang lổ trắng lẫn đỏ tím Có thể hoại tử trung tâm tạo giảmạc, có trường hợp loét sâu xuống tạo ổ loét [14], [29]

- Thể loét: Tổn thương UT là một loét tròn hoặc bầu dục, mặt u lõm sâuvào trong thành ĐT, màu đỏ sẫm hoặc có giả mạc hoại tử, bờ ổ loét phát triển

gồ lên, có thể sần sùi, đáy mủn bở, ranh giới u rõ ràng

- Thể “loét + sùi”: Tổn thương có dạng hỗn hợp loét và sùi rộng trên bềmặt, đáy có nhiều giả mạc, bờ nhiễm cứng có nhiều nốt to nhỏ không đều,niêm mạc xung quanh nhạt màu dễ chảy máu, thể “loét + sùi” chiếm 45% cáctrường hợp u [17]

- Thể thâm nhiễm (thể trai): tổn thương lan tỏa không rõ ranh giới, u códạng cứng, phẳng hoặc hơi nhô khỏi bề mặt, đôi khi có loét nông hoặc chỉ hơilõm xuống, niêm mạc bề mặt bạc màu mất bóng

- Thể chít hẹp: Mặt khối u giống thể loét, phát triển toàn chu vi làmnghẹt khẩu kính ĐT gây tắc ruột [29]

- Thể dưới niêm: U đội niêm mạc ĐT phồng lên, niêm mạc phía trênbình thường hoặc hơi đỏ.

1.4.2.4 Siêu âm nội soi (Endoscopic ultrasonography)

Siêu âm nội soi được áp dụng ở Nhật Bản vào năm 1980 Về nguyêntắc, kỹ thuật này đưa một ống soi vào trong lòng ruột, đầu ống soi này có mộtdụng cụ chuyên biệt có khả năng phát ra các sóng siêu âm Trong siêu âm nộisoi, hình ảnh có độ nét cao hơn các phương pháp chẩn đoán khác kể cả chụpcắt lớp vi tính hoặc chụp cộng hưởng từ, đặc biệt với những thăm dò thànhống tiêu hóa, nội soi siêu âm có thể đánh giá được u dưới niêm mạc và mức

độ xâm lấn của khối u vào thành ruột [57], [120]

1.4.2.5 Nội soi ảo (Virtual colonoscopy)

Đây là kỹ thuật mới với độ nhạy cao, dựa trên kỹ thuật mô phỏng bachiều kết hợp với sự phát triển của phần mềm vi tính chuyên biệt giúp táidựng hình ảnh ba chiều trên những lát cắt của máy chụp cắt lớp vi tính đa lớpcắt Nội soi ảo nhìn tốt hơn X-quang có thụt baryte nhưng kém nội soi chuẩntrong việc tìm những polype nhỏ Kỹ thuật này làm nhanh hơn và không đaunhư soi ĐT ống mềm, có thể phát hiện ra những tổn thương (polype và UT)kích thước lớn hơn 1cm Nội soi ảo có giá trị đặc biệt trong đánh giá trướcphẫu thuật tình trạng tắc ruột của UTĐTT đầu gần [80]

Tuy nhiên, phương pháp này còn một số hạn chế như độ nhạy thấp vớinhững tổn thương phẳng, polype nhỏ và sự chuẩn bị ĐT kém, còn nhiều dịch,không thể sinh thiết được

1.4.2.6 Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác

Siêu âm, chụp X-quang thụt baryte, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộnghưởng từ cũng có thể xác định được vị trí, mức độ xâm lấn, tính chất di căncủa khối u Tuy nhiên, để chẩn đoán xác định UTĐTT trước phẫu thuật thì nộisoi kết hợp sinh thiết làm xét nghiệm MBH vẫn là tiêu chuẩn vàng

1.4.2.7 Mô bệnh học ung thư đại trực tràng

MBH là phương pháp chẩn đoán quyết định UTĐTT, cho phép phân cáctýp vi thể, độ ác tính và giai đoạn UT Trong UTĐTT thì UTBM chiếmkhoảng 90 - 95% Theo phân loại của Tổ chức Y tế thế giới năm 2000(WHO) Hình thái MBH các loại UTBM của ĐTT bao gồm [68]

- Ung thư biểu mô tuyến (Adenocarcinoma): chiếm 95% tổng cácUTBM của ĐTT Tùy theo mức độ biệt hóa của các tế bào và tuyến màphân ra:

+ UTBMT biệt hóa cao (Well differentiated)

+ UTBMT biệt hóa vừa (Moderately differentiated)

+ UTBMT biệt hóa thấp (Poorly differentiated)

- UTBM tuyến nhầy (Mucinous adenocarcinoma)

- UTBM tế bào nhẫn (Signet-ring cell carcinoma)

- UTBM tế bào vảy/dạng biểu bì (Squamous cell/epidermoid carcinoma)

- UTBM tuyến vảy (Adenosquamous carcinoma)

- UTBM tủy (Medulary carcinoma)

- UTBM không biệt hóa (Undifferentiated carcinoma): Hiếm gặp, chỉ chiếmkhoảng 1% các trường hợp UTBM của ĐTT

Ngoài ra, còn một số thể UTĐTT hiếm gặp như các UT biểu mô và môliên kết kết hợp (carcinosarcoma), đặc biệt các UTBM sớm dạng phẳng, chủyếu được nêu ra trong y văn của Nhật Bản

1.4.2.8 Phân độ ác tính ung thư biểu mô đại trực tràng

- Độ ác tính thấp (Low-grade): gồm UTBMT biệt hóa cao và vừa

- Độ ác tính cao (High-grade): Gồm UTBMT biệt hóa thấp vàUTBM không biệt hóa, UTBM tuyến nhầy, UTBM tế bào nhẫn vàUTBM tế bào nhỏ cũng được coi như UT kém biệt hóa (biệt hóa thấp)

Hầu hết, UTBMT của ĐTT là u biệt hóa cao và vừa, khoảng 20 - 25%biệt hóa thấp hoặc không biệt hóa [138].

1.4.2.9 Phân giai đoạn ung thư đại trực tràng

+ Phân giai đoạn theo Dukes và Astler - Coller:

Năm 1930, Curthbert Dukes lần đầu tiên công bố phân loại giai đoạn A,

B, C theo mức độ xâm lấn của UTTT Hệ thống này được áp dụng rộng rãi vàđược cải tiến bởi nhiều tác giả Năm 1967, Turbul R.B.D cải tiến phân loạiDukes thành 4 giai đoạn áp dụng cho cả ĐT và TT Năm 1954, AstlerV.B., và sau này là Coller F.A., đã cải tiến sửa đổi phân loại giai đoạnDukes chi tiết hơn

Bảng 1.2 Phân giai đoạn ung thư đại trực tràng theo Dukes cải tiến và Astler - Coller Dukes cải tiến Tình trạng khối u Astler - Coller

B Khối u xâm lấn sát thanh mạc

Khối u xâm lấn vượt quá thanh mạc

B1B2

C Khối u xâm lấn lớp cơ, di căn hạch cạnh ĐT

Khối u xâm lấn thanh mạc, di căn hạch trung gian

Khối u xâm lấn vượt thanh mạc, di căn hạch cạnh ĐT

C1C2C3

Nguồn: theo Boland C.R (2003) [40]

Phân loại Dukes khá đơn giản, có giá trị đánh giá tiên lượng, điều trịphẫu thuật cho giai đoạn A, B, trong khi giai đoạn C cần phải xạ trị hoặc hóachất sau mổ Phân loại Astler - Coller giúp cho việc đánh giá tiên lượng, chitiết hơn, hoàn thiện hơn phân loại Dukes, hiện nay được nhiều nước áp dụng

+ Phân loại TNM:

Phân loại TNM do Denoix P đưa ra năm 1943, phân chia giai đoạn UTdựa trên ba yếu tố: Khối u (Tumor), hạch (Note) và di căn (Metastasis) Phânloại này đã thường xuyên được cải tiến bởi Hiệp hội quốc tế phòng chống UT(Union for International Cancer Control - UICC), và Ủy ban liên ngành củaHoa Kỳ về UT (American Joint Committee on cancer - AJCC).

Hệ thống phân loại TNM với UTBM cung cấp nhiều thông tin hơn các

hệ thống phân loại khác So với phân loại Dukes, phân loại TNM đưa ra cácyếu tố tiên lượng đối với từng nhóm nhỏ Phân loại này được đánh giá dựatrên sự xâm nhập của khối u vào thành ĐTT, xâm lấn vào các cơ quan kế cận

và tổ chức xung quanh (T), số hạch vùng liên quan (N), và việc có haykhông có di căn xa (M) (dựa vào cả chẩn đoán giai đoạn lâm sàng và giảiphẫu bệnh) [128]

- T: U nguyên phát

T: Không thể đánh giá được u nguyên phátTo: Không có bằng chứng của u nguyên phátTis: UTBM tại chỗ

T1: U xâm lấn lớp dưới niêm mạcT2: U xâm lấn lớp cơ

T3 : U xâm lấn hết lớp cơ dưới thanh mạc hoặc tới thanh mạchay tổ chức xung quanh ĐTT

T4 : U đã lan quá thanh mạc tạng hoặc xâm lấn trực tiếp vào cơquan hoặc cấu trúc lân cận

- N : hạch bạch huyết vùng

Nx : Không thể đánh giá được hạch vùng

No : Không có di căn vào hạch vùngN1 : Di căn vào 1 - 3 hạch quanh ĐTTN2 : Di căn vào từ 4 hạch quanh ĐTT trở lên

- M : Di căn xa

Mo : Chưa có di căn xa M1: Có di căn xa (di căn gan, phổi, não )

Bảng 1.3 Phân chia giai đoạn ung thư đại trực tràng của AJCC - 2006

T2, N0, M0

Giai đoạn IIIb T3-4, N1, M0

Giai đoạn IIIc Tx, N2, M0

Nguồn: theo AJCC (2006) [34].

Từ tháng 1/2010, UJCC đưa ra hệ thống phân loại mới của UTĐTT, nộidung cơ bản vẫn như phân loại lần thứ 6 (2002), nhưng chia thành các nhómnhỏ hơn ở T, N và M, trong đó giai đoạn T4 được chia thành T4a (UT xâmlấn vượt qua lớp thanh mạc) và T4b (khối u xâm lấn trực tiếp hoặc dính vàocác cơ quan hoặc các cấu trúc lân cận) N1a: di căn 1 hạch, N1b: di căn 2 - 3hạch, N1c: các tế bào UT di căn thành khối ở dưới thanh mạc, mạc treo, các

mô quanh ĐT, TT không liên quan đến phúc mạc và không có di căn hạchkèm theo N2a: di căn từ 4 - 6 hạch, N2b: di căn từ 7 hạch trở lên [72]

Các phương pháp phân chia giai đoạn từ Dukes cổ điển đến TNM đềuđược đánh giá bằng giải phẫu bệnh dựa trên mức độ xâm lấn của UT có giá trị

để đánh giá, tiên lượng và xây dựng phác đồ điều trị UTĐTT

1.4.2.10 Di căn hạch trong ung thư đại trực tràng

Phân bố các hạch bạch huyết của đại trực tràng:

Song hành cùng các động mạch nuôi ĐTT là các hạch bạch huyết vớirất nhiều chặng hạch Trong phân loại của Nhật Bản (1998) về UTBM ĐTT,các hạch được đánh số, mã hóa và phân thành các nhóm rất chi tiết và phứctạp Các hạch bạch huyết của ĐTT được phân nhóm dựa theo các hạch bạchhuyết độc lập Ở ĐT có 2 kiểu dẫn lưu bạch huyết: dẫn lưu dọc theo ruột (dẫnlưu cạnh ruột) và dẫn lưu hướng về hạch chính của mạc treo ruột (dẫn lưutrong mạc treo) Ở TT có 3 kiểu dẫn lưu bạch huyết: dẫn lưu dọc theo ruột,dẫn lưu hướng về hạch chính của mạc treo và dẫn lưu hướng về thành chậu(dẫn lưu bên)

Cách phân chia vị trí và phân nhóm hạch nói trên của UTĐTT NhậtBản (1998) mặc dù chi tiết nhưng cũng phức tạp nên khó áp dụng trong lâmsàng và nghiên cứu Nhiều tác giả thường áp dụng một cách phân loại khác,cũng của các tác giả Nhật Bản nhưng đơn giản hơn:

- Nhóm N1: Những hạch nằm trong vùng < 5 cm tính từ rìa khối u

- Nhóm N2: Những hạch nằm trong khoảng từ 5 – 10 cm tính từrìa khối u và hoặc nằm dọc theo các động mạch trung giannuôi dưỡng khối u

- Nhóm N3: Những hạch nằm quanh gốc động mạch chính nuôidưỡng khối u như động mạch mạc treo tràng dưới hoặc độngmạch ĐT giữa [9]

Di căn hạch trong ung thư đại trực tràng:

UTĐTT di căn theo ba con đường chính: lan tràn tại chỗ, theo đườngmáu và theo đường bạch huyết Trong các con đường di căn hạch trongUTĐTT, di căn theo đường bạch huyết là quan trọng nhất Di căn hạch là hiệntượng có mặt tế bào UT trong xoang của các hạch bạch huyết Theo Gilchrist(1940), tế bào UT xâm lấn lớp bạch mạch dưới niêm rồi đến lớp cơ, hạchbạch huyết cạnh ĐT, rồi đến các hạch trung gian, các hạch dọc thân mạch(hạch trung ương) Quá trình di căn của tế bào UT thường theo thứ tự cácchặng hạch, nhưng đôi khi có trường hợp nhảy cóc [44], [100], [108]

Hạch bị di căn trong UTĐTT thường có kích thước nhỏ hơn 5 mm, vìthế thường khó có thể phát hiện bằng mắt thường Chính vì thế, giải phẫubệnh có vai trò quan trọng và phải được làm cẩn thận để kiểm tra hạch mộtcách đầy đủ nhất Vét hạch không đầy đủ và còn lại mạc treo sẽ dẫn đến giaiđoạn bệnh hạ thấp [54], [101], [105]

Wong và CS phân tích giải phẫu bệnh của 196 trường hợpUTĐTT đã khuyên lấy ít nhất 14 hạch để đánh giá giai đoạn bệnh mộtcách đầy đủ nhất [143]

Vai trò của hạch được đánh giá như một yếu tố nguy cơ cao trong vấn

đề tiên lượng và trở thành yếu tố quyết định khi điều trị hóa chất bổ trợ Tỉ lệ

di căn hạch tỉ lệ thuận với mức độ triệt căn thực hiện trong phẫu thuật và việckiểm tra MBH sau mổ, đặc biệt là việc xác định và kiểm tra hạch bạch huyết

ở tất cả các khu vực Kỹ thuật mổ có thể ảnh hưởng tới số lượng hạch trongmẫu bệnh phẩm được cắt bỏ Hiệp hội UT Hoa Kỳ (AJCC) và Hội giải phẫubệnh Hoa Kỳ (College of American Pathologists-CAP) khuyến cáo tối thiểu

từ 8 - 12 hạch bạch huyết cần được kiểm tra để dự đoán chính xác tình trạng

di căn hạch trong UTĐTT [54]

Trên thực tế, số lượng hạch bạch huyết được kiểm tra trong mẫu bệnhphẩm thường phụ thuộc nhiều yếu tố như trình độ phẫu thuật viên, khối lượngphẫu thuật, tuổi BN, sự biến đổi giải phẫu Vì vậy, mức độ tỉ mỉ và kỹ năngphẫu tích hạch trong mẫu bệnh phẩm là yếu tố chính Trong UTĐTT, nhiềuhạch di căn có kích thước rất nhỏ (< 5 mm), vì thế cần thiết phải tỉ mỉ, kiênnhẫn trong việc tìm kiếm hạch.

1.5 Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài luận án

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu đột biến gen K-RAS

ở bệnh ung thư đại tràng trên thế giới (1)

Tác giả

Nghiên

cứu

vị trí codon

% đột biến

Đột biến theo giới

Đột biến theo tuổi

Đột biến theo

vị trí u

Đột biến theo giai đoạn Dukes;

týp MBH

Đột biến theo kích thước u

(16%) (p>0,05)

< 60:

(13%)

>60:

(23%) (p>0,05)

ĐT phải:

(37%)

ĐT trái:

(14%) (p<0,05)

Dukes A:

((20%);

Dukes B:

(19%) (p>0,05)

<15: (10%) 15-34: (17%)

>35(60%) (p<0,05)

(2011)

[137]

12,13 42,4Trong các nghiên cứu trên (bảng 1.4), các tác giả đã nghiên cứu xác

định tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN UTĐTT, tỉ lệ đột biến gen theo tuổi, giới,

vị trí UT ở TT và ĐT, giai đoạn Dukes và tỉ lệ kiểu đột biến theo giai đoạn

Dukes, tuy nhiên các tác giả chưa đi sâu nghiên cứu đột biến gen K-RAS

theo týp MBH, mức độ xâm lấn, mức độ ác tính và tính chất di căn củakhối u.

Theo Bongaerts B.W (Hà Lan - 2006), nghiên cứu đánh giá mối liênquan giữa sử dụng rượu, đồ uống có cồn và sự tăng nguy cơ đột biến gen

K-RAS kiểu chuyển đổi G  A trong UTĐTT, kết quả như sau: Năm 1986,

120.852 người đàn ông và phụ nữ, tuổi từ 55 - 69 đã hoàn thành một bảng câuhỏi về các yếu tố nguy cơ cho bệnh UT Các phương pháp tiếp cận nghiêncứu đã được sử dụng cho xử lý và phân tích dữ liệu Sau 7,3 năm theo dõi,không bao gồm 2,3 năm đầu tiên, dữ liệu hoàn chỉnh từ 4.076 trường hợp, 428

BN UTĐT và 150 BN UTTT, đã có hoàn chỉnh dữ liệu để phân tích Các chỉ

số để đánh giá yếu tố nguy cơ: Tỷ lệ (RR) và khoảng tin cậy 95% (95% CI).Kết quả cho thấy: tổng mức tiêu thụ rượu ≥ 30,0 g/ngày có liên quan với nguy

cơ UTĐTT và không thấy có đột biến gen K-RAS ở cả BN nam và BN nữ.

Đánh giá mối liên quan riêng đối với số BN nam có sử dụng rượu, bia với

nguy cơ đột biến gen K-RAS ở BN UTĐTT cho kết quả là: sử dụng rượu, bia

không có liên quan rõ ràng với nguy cơ bị các khối UTĐTT có chứa đột

biến gen K-RAS kiểu chuyển G → A ở BN nam Nghiên cứu này không thể

đánh giá được ở BN nữ vì số lượng BN nữ có sử dụng rượu bia rất ít vàkhông liên tục Trong kết luận, các tác giả đã khẳng định: rượu dường như

không tham gia vào quá trình phát sinh UTĐTT thông qua đột biến gen RAS, và đặc biệt sử dụng rượu bia không liên quan với các khối u ĐTT có đột biến gen K-RAS kiểu chuyển đổi G → A [41].

K-Bảng 1.5 Một số nghiên cứu đột biến gen K-RAS

ở bệnh ung thư đại tràng trên thế giới (2)

Tác giả cứu vị trí Nghiên

codon

% đột biến

Đột biến theo giới

Đột biến theo

vị trí u

Đột biến theo giai đoạn Dukes

Kiểu đột biến

Breivik J 12,13 39,4 Nam: TT: A: (34,4%) GA:

(37%) ĐT:

(41,3%)

B: (41,1%) C: (41,9%) D: (32,2%)

(57%) GT: (34%)

(43%)

TT:

(42%) ĐT:

(55%) (p>0,05)

A: (36%) B: (35%) C: (34%) D: (45%) (p>0,05)

Codon 12: GA: (33%) GT: (31%)

1.5.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Theo Tạ Thành Văn và CS (2011), trong xây dựng qui trình xác định

đột biến gen K-RAS, tiến hành nghiên cứu trên 10 mẫu mô UTĐTT thấy có 4/10 mẫu có đột biến gen K-RAS [28] Kết quả nghiên cứu 10 mẫu mô UT

đường tiêu hóa của Hồ Hữu Thọ và CS (2011), trong đó có 4 mẫu mô

UTĐTT thấy có 4/10 mẫu có đột biến gen K-RAS [25]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân UTBMĐTT được khám lâm sàng, xét nghiệm, nội soiĐTT và sinh thiết, xét nghiệm MBH cả trước và sau phẫu thuật điều trịtại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng, được làm xét nghiệm xác định đột

biến gen K-RAS tại Trung tâm Nghiên cứu gen và protein của Trường

Đại học Y Hà Nội

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân được khám, xét nghiệm, chẩn đoán xác định UTBMĐTT

và được phẫu thuật cắt bỏ khối u triệt căn

- Kết quả xét nghiệm MBH sau mổ khẳng định là UTBMĐTT

- Chưa được điều trị hóa chất hoặc xạ trị trước mổ

- Có kết quả xét nghiệm đột biến gen K-RAS.

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân UTBMĐTT không còn giai đoạn phẫu thuật triệt căn

- Những trường hợp MBH sau mổ không phải là UTBMĐTT

- Những trường hợp UTBMĐTT tái phát hoặc đã được điều trị bằnghóa chất, xạ trị trước phẫu thuật

- Những trường hợp UTBMĐTT có thêm UT khác kèm theo

- Không có kết quả xét nghiệm đột biến gen K-RAS.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tiến cứu, mô tả, cắt ngang

2.2 Cỡ mẫu

Áp dụng theo công thức:

n =

) (

2

2 2 / 1





p

q p

z 

Trong đó: n: số bệnh nhân cần nghiên cứu

Z2 1-/2 = 1,96

p: tỉ lệ mắc bệnh dựa theo nghiên cứu trước

q = 1 – p

 = 0,3 (giá trị sai số tương đối)

Theo kết quả nghiên cứu của Stefanius (Phần Lan - 2011), nghiên cứu

xác định đột biến gen K-RAS tại codon 12 và 13 ở BN UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS là 45% Vì vậy, chúng tôi ước lượng tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN mắc UTĐTT là 40% (p = 0,4).

Thay các giá trị vào công thức ta có :

n =

) (0 , 4 0 , 3

6 , 0 4 , 0 96 , 1

2 2

X

X X

n = 64 Như vậy, để có độ chính xác 95%, cỡ mẫu nghiên cứu phải có ít nhất là

64 bệnh nhân Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn được 79 BN đủ tiêuchuẩn đưa vào nghiên cứu

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 01/2010 đến tháng 7/2012

2.2.4 Địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu lâm sàng, nội soi, MBH tại Bệnh viện Việt Tiệp HảiPhòng; kết quả MBH được đọc xác định lại tại Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnhviện Trung Ương Quân đội 108

- Nghiên cứu xác định đột biến gen K-RAS tại Trung tâm Nghiên cứu

gen và protein, Trường Đại học Y Hà Nội

2.2.5 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu về nội soi

- Máy nội soi đại tràng ống mềm Olympus CF – Q150I do NhậtBản sản xuất

- Kìm sinh thiết: loại có kim cố định

- Lọ đựng bệnh phẩm có chứa dung dịch formon 10% để ngâm cốđịnh bệnh phẩm.

2.2.6 Dụng cụ, trang thiết bị và vật liệu nghiên cứu về gen

2.2.6.1 Dụng cụ, trang thiết bị

- Máy Gen Amp PCR System 9700 (USA)

- Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO)

- Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)

- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)

* Hóa chất dùng để tách chiết DNA (hãng Qiagen – Đức):

- Dung dịch Lysis buffer.

- Dung dịch K