Nghiên cứu kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser trong một số chỉ định trên bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm

Luận văn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) hiện nay đang rất phát triển ở Việt Nam Với kỹ thuật này, mặc dù phôi đã được nuôi cấy thành công ngoài cơ thể, nhưng khi cấy vào tử cung, khả năng bám vào niêm mạc tử cung làm tổ của phôi chỉ đạt trung bình khoảng 20%, tỷ lệ thai lâm sàng khoảng 35% và tỷ lệ em bé sinh ra còn thấp hơn nữa [66] Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng làm tổ của phôi Trong đó, một yếu tố quyết định là phôi phải thoát ra khỏi được màng trong suốt Năm 1989, Cohen và cộng sự đã chứng minh rằng việc tạo một lỗ thủng trên màng trong suốt sẽ giúp phôi TTTON thoát màng dễ hơn và tỉ lệ làm tổ của phôi sẽ cao hơn Kỹ thuật này được các tác giả đặt tên là kỹ thuật “hỗ trợ thoát màng” (assisted hatching-AH) [trích dẫn 39]

Có ba cơ chế có thể giải thích hiệu quả của hỗ trợ phôi thoát màng: (1) Trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo kéo dài hoặc đông lạnh, màng trong suốt bị cứng chắc bất thường hoặc không mỏng đi trong quá trình phôi phát triển, làm cho phôi không thể thoát ra ngoài và bám vào nội mạc tử cung để làm tổ [33], [41] (2) Hỗ trợ phôi thoát màng giúp phôi thoát màng sớm hơn, phù hợp với

“cửa sổ làm tổ” của niêm mạc tử cung sớm hơn 1-2 ngày của chu kỳ kích thích buồng trứng so với chu kỳ tự nhiên [114] (3) Mở màng trong suốt nhân tạo có thể tạo một kênh trao đổi các chất chuyển hóa, các yếu tố tăng trưởng

và các “tín hiệu dẫn truyền” giữa phôi và niêm mạc tử cung [34]

Có nhiều phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng, có thể làm mỏng hay làm thủng màng trong suốt của phôi bằng cơ học, hóa chất hoặc bằng tia laser Tuy nhiên, kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser hiện được nhiều trung tâm ưa chuộng vì tính tiện dụng và an toàn của nó Mặc dù hỗ trợ phôi thoát màng có thể sử dụng rộng rãi cho nhiều trường hợp, nhưng nói chung,

kỹ thuật này thường được dùng cho một số chỉ định của bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm [38], [156]

Tại Việt Nam, kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser mới được

áp dụng Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương bắt đầu thực hiện hỗ trợ phôi thoát màng vào năm 2009 Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu trên thế giới và một

số rất ít nghiên cứu trong nước đánh giá hiệu quả của kỹ thuật hỗ trợ thoát màng trong TTTON Các nghiên cứu đã chứng minh rằng hỗ trợ thoát màng nói chung giúp làm tăng tỉ lệ phôi làm tổ và tỉ lệ có thai của TTTON [38], [156] Bên cạnh đó cũng có không ít nghiên cứu cho thấy kỹ thuật này không đem lại hiệu quả [38], [141], [163]

Nhìn chung, vẫn tồn tại một số vấn đề mà các nghiên cứu trước đây còn chưa đề cập đến hoặc còn chưa thống nhất Đó là hỗ trợ phôi thoát màng trên

nhóm đối tượng TTTON nào sẽ có hiệu quả? Nếu có hiệu quả thì cách thức đục lỗ hay làm mỏng sẽ tốt hơn? Nếu đục lỗ hay làm mỏng thì kích thước bao nhiêu là tối ưu? Để góp phần trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu với Đề tài “ Nghiên cứu kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser trong một số chỉ định trên bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm”.

Mục tiêu nghiên cứu

1 Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser diode 1.48µm với hai phương pháp đục lỗ và làm mỏng màng trong suốt của phôi ở bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm trên 38 tuổi chuyển phôi tươi.

2 Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser diode 1.48µm với hai phương pháp đục lỗ và làm mỏng màng trong suốt của phôi trên các bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) [39], [57]

TTTON có nghĩa là cho tinh trùng thụ tinh với noãn và nuôi cấy thành phôi trong ống nghiệm Sau đó, một số phôi sẽ được chuyển trở lại vào buồng

tử cung Quá trình phát triển của phôi và thai sẽ diễn ra hoàn toàn bình thường trong tử cung người mẹ

Kỹ thuật này được thực hiện thành công trên thế giới lần đầu tiên vào năm 1978 và lần đầu tiên ở Việt Nam năm 1998

Một chu kỳ TTTON bao gồm: kích thích nang noãn, chọc hút lấy noãn

ra ngoài cho kết hợp với tinh trùng trong phòng thí nghiệm, nuôi cấy thành phôi để chuyển trở lại vào buồng tử cung

Có 3 phác đồ KTBT thường được sử dụng: Phác đồ dài (thường dùng trong IVF cổ điển): dùng GnRH đồng vận (GnRH a) bắt đầu từ ngày thứ nhất

của chu kỳ kinh hoặc từ ngày thứ 21 của chu kỳ và liên tục trong 14 ngày Sau

đó, dùng FSH phối hợp với GnRH cho đến khi tiêm hCG Phác đồ ngắn:

GnRHa được tiêm cùng với FSH từ đầu chu kỳ Phác đồ ngắn thường được

chỉ định cho những phụ nữ có dự trữ buồng trứng kém Có thể sử dụng GnRH

đối vận (GnRH-antagonis) từ ngày 5-6 của chu kỳ để đề phòng đỉnh LH nội

sinh hoặc để giảm nguy cơ quá kích buồng trứng Từ ngày thứ 8-13 của FSH,

chỉ định cho thuốc rụng noãn (thường dùng hCG) khi siêu âm có > 1 nang 18mm hoặc > 3 nang noãn kích thước > 16 mm.

Chọc hút noãn sau tiêm hCG 34-36 giờ Noãn thu được sẽ ủ ấm trong

tủ cấy CO2, 370C khoảng 3-6h trước khi được cấy với tinh trùng hoặc cho thụ tinh bằng kỹ thuật ICSI

Đánh giá thụ tinh được tiến hành 18-20h sau cấy với tinh trùng trong

kỹ thuật IVF cổ điển, 14-16h sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn Đánh giá thụ tinh bình thường khi thấy hai tiền nhân

Hiện nay, các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới đánh giá chất lượng phôi chủ yếu dựa vào hình thái và tốc độ phân chia của phôi Hình thái của phôi được theo dõi và đánh giá từ hình thái noãn, hợp tử rồi đến phôi phân chia Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia sớm (ngày 2, 3) dựa vào các chỉ tiêu chính là số lượng phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào, tỷ

lệ các mảnh vỡ (fragment) Các chỉ tiêu phụ gồm có sự phân chia phôi bào đồng thời (synchronise - phân chia 2-4-8), mật độ hạt trong bào tương, số lượng hạt nhân, không bào trong phôi bào Đánh giá hình thái phôi nang dựa vào độ nở rộng của phôi, hình thái của khối tế bào nội phôi (ICM) và nguyên bào lá nuôi (TE)

Hình 1.1 Quy trình thụ tinh ống nghiệm.

Chọc hút noãn qua âm đạo

Nuôi cấy phôi

Chuyển phôi Kích thích nang noãn

Tỉ lệ thành công của mỗi chu kỳ điều trị TTTON trung bình trên thế giới hiện nay khoảng 25%-70% Tỉ lệ này phụ thuộc vào tuổi bệnh nhân, chỉ định điều trị và phác đồ điều trị của từng trung tâm.

1.2 Một số kỹ thuật hỗ trợ sinh sản thông dụng kèm theo TTTON

1.2.1 Đông lạnh phôi

Đây là kỹ thuật phổ biến ở hầu hết các trung tâm làm thụ tinh trong ống nghiệm Nguồn phôi đông lạnh chủ yếu từ các phôi thừa sau chu kỳ chuyển phôi tươi, hoặc từ phôi của các bệnh nhân vì một số lý do không chuyển được phôi tươi hay từ phôi của người hiến tặng Phôi có thể được đông lạnh ở các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi và bằng các phương pháp đông lạnh khác nhau như đông lạnh chậm, đông phôi thuỷ tinh hoá Trong đó, phương pháp đông phôi thủy tinh hóa là phổ biến nhất hiện nay

1.2.2 Đông tinh trùng

Kỹ thuật này được chỉ định cho các trường hợp chồng khó lấy tinh trùng hoặc trước khi đi xa hay điều trị tia xạ, hoá chất Tuy nhiên, cần phân tích chất lượng tinh trùng trước đông để khi rã đông sẽ có những chỉ định thích hợp cho mẫu tinh trùng đó

1.2.3 Đông noãn

Đông noãn thường được chỉ định cho các trường hợp: Chồng không lấy được tinh trùng trong ngày vợ chọc hút noãn mà không muốn xin tinh trùng của người khác; Các trường hợp xin noãn mà chưa chuẩn bị niêm mạc tử cung phù hợp; trước khi điều trị tia xạ, hoá chất; Bảo tồn khả năng sinh sản

Noãn sau khi rã đông muốn thụ tinh được phải làm ICSI để khắc phục khả năng thụ tinh thấp do thay đổi cấu trúc màng trong suốt khi đông lạnh Tỷ

lệ thai lâm sàng từ các chu kỳ đông noãn còn thấp

1.2.4 Xin, cho phôi, noãn, tinh trùng

Có nhiều trường hợp không có tinh trùng hoặc không có noãn, do vậy cần phải dùng noãn hoặc tinh trùng của người cho Một số trường hợp không

có phôi của chính mình mà muốn có con có thể xin phôi hiến

1.2.5 Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)

ICSI (intra-cytoplasmic sperm injection) là kỹ thuật dùng hệ thống vi thao tác xử lý tiêm tinh trùng vào bào tương noãn Kỹ thuật này giúp kiểm soát được tỷ lệ thụ tinh, đảm bảo khả năng có phôi Do vậy, ICSI góp phần trong sự ổn định và gia tăng hiệu quả của một chu kỳ TTTON

1.2.6 Kỹ thuật lấy tinh trùng từ tinh hoàn và mào tinh

Các kỹ thuật này thực hiện cho các bệnh nhân vô sinh nam xuất tinh không có tinh trùng (azoospermia) do tắc hoặc không tắc ống dẫn tinh Tinh

trùng thu được chưa trưởng thành hoàn toàn, do vậy phải tiến hành ICSI để thụ tinh với noãn

1.2.7 Hỗ trợ phôi thoát màng (AH)

Kỹ thuật này giúp phôi dễ thoát màng nhằm tăng tỷ lệ có thai và làm tổ của phôi Đến nay, trên thế giới đã có 4 phương pháp được áp dụng để hỗ trợ phôi thoát màng: Làm mỏng hoặc làm thủng màng trong suốt bằng cơ học, bằng men pronase, bằng axit Tyrode và bằng tia laser Có nhiều tranh cãi xung quanh chỉ định của kỹ thuật cho đối tượng TTTON nào thì hiệu quả

1.2.8 Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD)

Chẩn đoán di truyền trước làm tổ được tiến hành nhằm sàng lọc phôi không có bất thường về di truyền trước khi chuyển phôi, đôi khi có thể thực hiện trên noãn trước khi cho thụ tinh Kỹ thuật này cho phép các cặp vợ chồng có nguy cơ truyền bệnh di truyền cho con có cơ hội sinh con không mắc bệnh, không phải bỏ thai khi thai đã lớn, tránh được những hậu quả xấu ảnh hưởng lên tâm lý của người mẹ và gia đình

1.2.9 Nuôi cấy noãn non (IVM)

Trưởng thành noãn non là kỹ thuật nuôi noãn non đến giai đoạn trưởng thành ở môi trường nuôi cấy chuyên biệt ngoài cơ thể Noãn sau khi đã trưởng thành sẽ được thụ tinh bằng phương pháp IVF/ICSI và nuôi cấy tiếp như các trường hợp TTTON thông thường

1.3 Quá trình phát triển của phôi tiền làm tổ

1.3.1 Quá trình phát triển của phôi tiền làm tổ tự nhiên

Thụ thai là kết quả của quá trình làm tổ của noãn đã thụ tinh Noãn thụ tinh hay còn gọi là phôi tiền nhân (phôi ngày 1) sẽ trải qua ba giai đoạn trong suốt quá trình làm tổ:

* Giai đoạn 1: Di chuyển đến buồng tử cung

- Các yếu tố tác động đến quá trình di chuyển là dịch ổ bụng, hoạt động

cơ trơn của vòi tử cung và hoạt động của nhung mao vòi tử cung

- Ngoài ra, noãn cũng sẽ thực hiện tuần tự quá trình phân bào và biệt hoá

tế bào trong suốt quá trình di chuyển này:

+ Ngày 0: Noãn thụ tinh với tinh trùng, hiện tượng này thường xảy ra ở một phần ba ngoài của vòi tử cung

+ Ngày 1: Phôi ngày 1 (hợp tử có hai tiền nhân) trong suốt quá trình di chuyển được bảo vệ bởi màng trong suốt (zona pellucida) và được dinh dưỡng nhờ cơ chế thẩm thấu

+ Ngày 2: Phôi phân chia có từ 2-4 tế bào

+ Ngày 3: Phôi phân chia có từ 6-8 tế bào, lúc này phôi nằm ở khoảng eo của vòi tử cung.

+ Ngày 4: Phôi tiếp tục phân bào và trở thành phôi dâu, có từ 15-50 tế bào Phôi nằm ở đoạn kẽ vòi tử cung

+ Ngày 5: Hình thành phôi nang (blastocyst), biệt hoá thành hai nhóm tế bào phôi (nguyên bào lá nuôi và khối tế bào nội phôi) Phôi đã đến buồng tử cung

+ Ngày 6 (hatching): Phôi thoát khỏi màng trong suốt

* Giai đoạn 2: Tương tác giữa các nguyên bào lá nuôi của phôi nang và niêm mạc tử cung và thương lượng miễn nhiễm để niêm mạc tử cung chấp nhận phôi làm tổ

* Giai đoạn 3: Làm tổ tại niêm mạc tử cung

+ Ngày 8: Phôi thoát màng chìm vào niêm mạc tử cung, hình thành phôi hai lá, chưa tiếp xúc với mạch máu của mẹ

+ Ngày 9: Phôi chìm hoàn toàn vào niêm mạc tử cung, tạo các hốc giữa các hợp bào nuôi, chưa tiếp xúc với mạch máu mẹ

+ Ngày 10: Tiếp xúc với mạch máu mẹ nên hiện diện hCG trong máu mẹ

1.3.2 Quá trình phát triển của phôi tiền làm tổ trong TTTON

+ Ngày 0: Noãn sau chọc hút được các chuyên viên phôi học thu nhặt

và đánh giá chất lượng noãn dựa vào hình thái trưởng thành của các tế bào hạt bao quanh noãn, bào tương noãn, cực cầu và nhân của noãn Cho noãn thụ tinh với tinh trùng sau chọc hút 3- 6h

+ Ngày 1: Kiểm tra thụ tinh Hình thái hai tiền nhân có thể tiên lượng được khả năng phát triển của phôi [140], [154], [155] Đánh giá hình thái dựa vào kích cỡ, vị trí hai tiền nhân và các hạt nhân

+ Ngày 2, 3: Giai đoạn phôi phân chia sớm: Đánh giá chất lượng phôi dựa vào hình thái: số lượng (ngày 2: 4 tế bào; ngày 3: 8 tế bào) và độ đồng đều của phôi bào, sự phân chia đồng bộ (2-4-8) của phôi bào, độ chiết quang, mật độ hạt của bào tương phôi bào, Đánh giá chất lượng phôi ngày 2 rất quan trọng để quyết định ngày chuyển phôi Có thể chuyển phôi ngày 2, ngày

3 hoặc ngày 5 (tùy trung tâm) Thông thường, nếu có ít nhất 2-3 phôi ngày 3 chất lượng tốt thì sẽ nuôi cấy tiếp để chuyển phôi ngày 5

+ Ngày 4: Phôi dâu, bắt đầu xuất hiện các hốc dịch nhỏ

+ Ngày 5: Phôi nang nở rộng, dịch nang lấp đầy thể tích phôi, khối tế bào nội phôi có nhiều tế bào nhỏ, liên kết chặt, các nguyên bào lá nuôi có nhiều tế bào, liên tục

+ Ngày 6: Phôi thoát màng

Kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng được thực hiện trên phôi ngày 2, ngày

3 hoặc ngày 5 (tùy trung tâm) Khi tiến hành AH trên phôi ngày 2, ngày 3, thường đến ngày 5 phôi sẽ thoát màng (sớm hơn tự nhiên một ngày), giúp cho phôi làm tổ sớm hơn, dễ đồng bộ với niêm mạc tử cung hơn [100]

vú Một số nghiên cứu gần đây cho thấy màng trong suốt là màng kép có ba lớp đồng tâm [36], [174] Các sợi của lớp trong cùng (lớp 1) tỏa tròn hình vành tia Các sợi của lớp ngoài cùng (lớp 3) xếp theo hướng tiếp tuyến Các sợi lớp giữa xếp ngẫu nhiên Dưới kính hiển vi (KHV) phân cực, các lớp này lưỡng chiết, phân biệt rõ 3 lớp với lớp giữa chiết quang ít nhất (hình 1.2) [36]

Hình 1.2 Cấu trúc nhiều lớp của màng trong suốt chụp dưới KHV phân cực (PolScope) A: noãn người chụp KHV đảo ngược bình thường B: noãn người chụp KHV phân cực C: Phôi ngày 3 chụp phân cực D: Các lớp của màng trong suốt phân biệt dưới KHV phân cực E: Các lớp của màng trong suốt noãn và phôi

(Nguồn: Pelletier PolScope views laminar zona Fertil Steril 2004 [36]).

Trong nang noãn, màng trong suốt đóng vai trò như một hàng rào sinh

lý ngăn giữa noãn và các tế bào nang Khi thụ tinh, tinh trùng gắn với các thụ thể trên bề mặt màng trong suốt Những thay đổi về sinh hoá của màng trong suốt xảy ra sau khi thụ tinh làm màng này cứng lại và ngăn chặn hiện tượng

đa thụ tinh [44] Trong quá trình phát triển của phôi giai đoạn tiền làm tổ, màng trong suốt bảo vệ sự toàn vẹn của phôi [17] Khi di chuyển từ vòi trứng

về tử cung, màng trong suốt rất cần thiết để đảm bảo cấu trúc của phôi vì liên kết giữa các tế bào của phôi rất yếu Ngoài ra, nếu tách bỏ toàn bộ hoặc một phần màng trong suốt của phôi cừu thì phôi có thể bị thoái hoá khi gặp một số kháng thể trong tử cung [158] Khi làm thụ tinh trong ống nghiệm, màng trong suốt của phôi có thể bị cứng lại do ảnh hưởng của quá trình nuôi cấy kéo dài hoặc phải trải qua đông lạnh và rã đông [33], [41]

Bên cạnh đó, màng trong suốt còn có thể chịu ảnh hưởng của một số yếu tố khác Môi trường nội tiết do dùng thuốc kích thích rụng trứng cũng là một yếu tố liên quan đến độ dày màng trong suốt [23]

Đã có những nghiên cứu cho thấy độ dày và hình dạng của màng trong suốt có liên quan đến chất lượng phôi, sự phát triển của phôi và tỷ lệ có thai [58], [78] Đặc biệt là quá trình mỏng đi của màng trong khi phôi phát triển Trong tự nhiên, khi phôi ngày 5 (phôi nang-blastocyst), di chuyển đến tử cung, phôi sẽ tự thoát màng và hiện tượng làm tổ sẽ xảy ra Trước khi thoát màng, phôi nang nở to, màng trong suốt giãn ra và mỏng đi Trong quá trình

PhôiNoãn

Lớp3 Lớp 2 Lớp 1

Mặt trong màng trong suốt Mặt ngoài màng trong suốt

Thoi vô sắ c

Màng trong suốt Thước đo 20µm

thoát màng, màng trong suốt mỏng đi do hai yếu tố: (1) Xuất hiện các chu kỳ

co thắt và dãn ra của phôi; (2) Vai trò của chất lysins do các nguyên bào lá nuôi và niêm mạc tử cung tiết ra làm ly giải màng trong suốt Khi không có chất này sẽ dẫn tới việc làm tổ thất bại [62] Chu kỳ co giãn của màng trong suốt được theo dõi trên thực nghiệm ở phôi nang của chuột, cừu, bò và người Kết quả là sau vài chu kỳ như vậy, màng trong suốt sẽ mỏng đi Tương tự như vậy, chu kỳ co giãn xảy ra trên các nguyên bào lá nuôi của phôi nang người, hiện tượng này cũng giúp cho phôi thoát màng xảy ra trong điều kiện nuôi cấy Tuy vậy, ở điều kiện tự nhiên, chưa rõ sự co giãn này có làm phôi thoát màng tốt hơn hay không, nhưng dường như nó cũng giúp cho phôi tiếp xúc và làm tổ trên niêm mạc tử cung [63]

Người ta nhận thấy rằng quá trình mỏng đi này không chỉ thường thấy rõ

ở giai đoạn phôi nang nở ra, mà còn thấy được từ giai đoạn hợp tử cũng như giai đoạn phân chia của phôi Những phôi tốt nhất thường có sự thay đổi độ dày mỏng của màng trong suốt Theo Gabrielsen và cộng sự (2000), khi màng trong suốt mỏng đi hơn 25%, tỷ lệ có thai là 40% (24/60) Ngược lại, với những phôi có màng mỏng đi ít hơn 10% thì không ghi nhận được trường hợp nào có thai (0/21) Ngoài ra, sự mỏng đi của màng trong suốt không những liên quan đến tỷ lệ có thai cao mà còn liên quan đến hình thái phôi tốt [55], [56]

- Sự phát triển của phôi

Các số liệu nghiên cứu trên phôi nang chuột gần đây cho thấy phôi thoát màng khi nuôi cấy nhân tạo phụ thuộc vào số lượng tế bào đầy đủ để cấu thành phôi đó Đối với các phôi ngừng phát triển (có thể do nhiều yếu tố: Chất lượng noãn, chất lượng tinh trùng, chất lượng phôi không tốt do các nguyên nhân di truyền, do phác đồ KTBT hoặc do các yếu tố khách quan: môi trường nuôi cấy, chất lượng lab thụ tinh ống nghiệm không đảm bảo ), hiện tượng thoát màng không thể xảy ra Phôi không có đủ số lượng tế bào, áp lực nội phôi không đủ làm cho phôi không nở ra được để thoát màng [trích dẫn 39, 76]

- Một số yếu tố khác

Phôi thoát màng trong tự nhiên không giống như phôi nuôi cấy Phôi nuôi cấy (in vitro) thường tự thoát màng chậm hơn so với phôi tự nhiên (in vivo) khoảng 1-2 ngày [62] Sự khác biệt này liên quan đến tử cung và các yếu tố gây ly giải lá nuôi phôi (TE) của niêm mạc tử cung [88]

1.4.2 Hỗ trợ phôi thoát màng: khái niệm, chỉ định, các phương pháp

1.4.2.1 Khái niệm

Dựa trên giả thuyết về sự bất thường có thể có của màng trong suốt và

sự thoát màng của phôi trong khi thực hiện nuôi cấy phôi trong TTTON, các nhà khoa học phát triển các kỹ thuật làm mỏng hoặc làm thủng màng trong suốt bên ngoài phôi, giúp phôi dễ thoát ra ngoài và làm tổ vào tử cung hơn

Kỹ thuật này được các tác giả đặt tên là kỹ thuật “hỗ trợ phôi thoát màng” (assisted hatching) [33]

Hỗ trợ thoát màng có thể được thực hiện từ các phôi ở giai đoạn phân chia sớm đến giai đoạn phôi nang, bằng các phương pháp khác nhau và trên nhiều chỉ định khác nhau của bệnh nhân TTTON

1.4.2.2 Các chỉ định thường gặp của AH trên bệnh nhân TTTON.

Chỉ định AH đến nay nhìn chung chưa thống nhất giữa các trung tâm

TTTON, có trung tâm chỉ định AH 100% bệnh nhân TTTON Ngược lại, có trung tâm không chỉ định AH vì cho rằng AH không hiệu quả

Một số chỉ định thường gặp của AH:

1 Bệnh nhân tiên lượng kém (ít phôi, lớn tuổi, tăng FSH, màng trong suốt dày bất thường)

2 Bệnh nhân thất bại nhiều lần mặc dù chất lượng phôi tốt

3 Bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh

Ngoài ra, AH có thể chỉ định trong các trường hợp nuôi noãn non (IVM),

hỗ trợ sinh thiết phôi chẩn đoán di truyền trước làm tổ (PGD), màng trong suốt của phôi không đàn hồi

1.4.2.3 Các phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng [39]

Các phương pháp đều có mục đích chung là làm thủng (hình 1.3) hoặc làm mỏng (hình 1.4) màng trong suốt bao quanh phôi trước khi chuyển phôi vào

tử cung Cách thức hỗ trợ phôi thoát màng có thể chỉ là đục một lỗ nhỏ hay làm mỏng 5-10µm hoặc đục lỗ to hay làm mỏng đến nửa chu vi màng trong suốt, hoặc thậm chí lột bỏ màng trong suốt hay làm mỏng hoàn toàn màng này

Hình 1.3 Đục lỗ thủng trên phôi ngày 3.

Màng trong suốt

Lỗ thủng sau AH

Hình 1.4 Làm mỏng màng trong suốt của phôi ngày 3.

a Hỗ trợ phôi thoát màng bằng phương pháp cơ học

Phương pháp cổ điển nhất là phương pháp cơ học Người ta sử dụng một kim giữ phôi và một loại kim chuyên dụng xuyên thủng màng trong suốt, sau đó mài màng trong suốt vào kim giữ để xé rách một đoạn nhỏ trên màng trong suốt của phôi (hình 1.5) Cohen và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật xẻ màng trong suốt bán phần (1989) Niset và cộng sự dùng kỹ thuật mài màng trong suốt (1992) [trích dẫn 39] Phương pháp này hiện ít được sử dụng vì khó thao tác, dễ gây tổn thương phôi

Hình 1.5 Làm mỏng bằng phương pháp cơ học: mài màng trong suốt

b Hỗ trợ phôi thoát màng bằng men pronase

Trong phương pháp này, phôi sẽ được cho vào môi trường có chứa men pronase là một loại men tiêu protein ở nồng độ thích hợp trong một thời gian ngắn (khoảng 10 giây) Dưới tác động của men này, toàn bộ màng trong suốt của phôi sẽ mỏng đi hay hoàn toàn biến mất Fong và cộng sự (1998) là những người đầu tiên báo cáo thành công phương pháp này [51] Phương pháp này hiện ít được sử dụng vì độ an toàn không cao

c Hỗ trợ phôi thoát màng bằng axit Tyrode

Phương pháp hỗ trợ thoát màng sau phương pháp cơ học thường được dùng là phương pháp sử dụng axit Tyrode Điểm yếu của phương pháp này là axit Tyrode có tính độc trên phôi, làm tiêu các phôi bào, ngoài ra còn đòi hỏi

kỹ năng thao tác chuẩn xác, hạn chế tối đa thời gian phôi tiếp xúc với axit Lợi thế khi dùng axit Tyrode so với phương pháp cơ học là có thể tăng kích

Phôi bào

Vị trí làm mỏng

thước lỗ thủng trên màng trong suốt dễ dàng hơn Ngoài ra, không cần phải đầu tư ban đầu tốn kém cho phương pháp này Tuy nhiên, mỗi lần thao tác lại tốn khá nhiều dụng cụ tiêu hao.

axit Tyrode.

Kỹ thuật này cần dùng một kim giữ (holding pipette) để giữ phôi và một kim chuyên dụng (hatching pipette hay micropipette) để bơm dung dịch axit (hình 1.6) Sau khi làm mỏng hoặc tạo lỗ đạt yêu cầu cần dừng ngay bơm axit ra tiếp để tránh cho khoang quanh phôi khỏi bị axit xâm nhập và rửa sạch phôi khỏi môi trường có axit Người ta có thể hút bớt một số mảnh vỡ ngoài các phôi bào, hoặc các phôi bào thoái hoá của phôi rã đông trong quá trình này [127]

d Hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser (LAH)

Đây là phương pháp ra đời sau cùng và được xem là tiên tiến nhất hiện nay Tadir và cộng sự (1991) là những người đầu tiên mô tả phương pháp này [151]

* Khái niệm laser [7]

Laser là chữ viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, nghĩa là: khuếch đại ánh sáng bằng bức xạ cưỡng bức Laser là chùm ánh sáng có những tính chất đặc biệt: Có độ đơn sắc, độ định hướng và độ chói phổ rất cao Những tính chất trên tạo ra một ưu thế đặc biệt của laser và được ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau

* Các loại tia laser và ứng dụng

Nguồn laser sử dụng trong y học gồm hai nhóm chính [5]:

- Các laser công suất thấp, còn gọi là laser mềm hay laser không nhiệt, được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực Vật lý trị liệu để điều trị bệnh Các chùm tia laser này có công suất chỉ cỡ vài milliwatt tới vài chục milliwatt và chỉ gây tǎng nhiệt độ của tổ chức được chiếu không quá 0,10C-0,50C Hiệu quả điều trị của laser loại này dựa trên sự kích thích sinh học của tia laser dẫn tới điều chỉnh lại các rối loạn hoạt động của tổ chức bị tổn thương, tǎng cường sức đề kháng và tái tạo mô Điển hình cho nhóm laser này là: Laser He-Ne, laser IR (laser bán dẫn hồng ngoại: Ga-As), laser He-Cd và laser Nitơ

- Các laser công suất cao, còn gọi là laser cứng Chùm tia laser loại này thường phải có công suất lớn cỡ vài watt cho tới vài trǎm watt Các laser này tạo ra hiệu ứng nhiệt để làm quang đông hoặc bốc bay tổ chức Điển hình cho nhóm này là: Laser CO2, laser Nd-YAG, laser Rubi, laser Argon, Laser diode bán dẫn cũng nằm trong nhóm này

* Các loại tia laser dùng trong hỗ trợ phôi thoát màng(LAH)

Có hai loại LAH:

(1) Laser tiếp xúc: Xung laser được truyền qua sợi quang siêu vi tiếp xúc trực tiếp với màng trong suốt bằng một kim chuyên dụng Sau đó, nhiều tác giả khác sử dụng tia laser trực tiếp nhưng có cải tiến hơn Nhược điểm của dùng tia laser trực tiếp là năng lượng laser theo dõi khó chính xác, có thể tạo các xung laser không an toàn Ngoài ra, hệ thống này mở nên dễ bị bụi bẩn, tắc nghẽn đầu dây, khó tinh chỉnh, dễ bị ảnh hưởng của môi trường ngoài (2) Laser không tiếp xúc: Hệ thống laser không tiếp xúc cho phép vật kính truyền ánh sáng của tia laser đến được đích Tia laser được truyền qua nước,

do vậy tránh cho tia làm đột biến phôi Blanchet và cộng sự là những người đầu tiên sử dụng hệ thống này [26] Hiện nay, hệ thống này được tinh chỉnh

về độ an toàn rất tốt và hiệu quả cao để sử dụng cho phôi người Khi có hệ thống này, những người làm kỹ thuật có thể thực hiện sinh thiết phôi để lấy tế bào làm chẩn đoán trước sinh dễ dàng hơn, ít gây tổn thương phôi hơn

Hình 1.7 AH bằng tia laser tiếp xúc

Hình 1.8 AH bằng tia laser không tiếp xúc.

* Laser cứng, bán dẫn điện, diode bước sóng 1,48 µm

Loại laser không tiếp xúc này được đánh giá cao về độ an toàn và tiện lợi trong sử dụng được Rink và cộng sự giới thiệu năm 1994 [trích dẫn từ 39] Đây là loại laser indium-galiium-arsenic-phosphorus (InGaAsP) - laser cứng, bán dẫn điện, hoạt động với độ dài bước sóng 1,48µm

Cơ cấu của loại laser này khá phức tạp gồm ba gương và ba thấu kính Chùm sóng laser không nhìn thấy phát xạ từ laser diode 1,48µm (vùng phát

xạ 2×0,2 µm2) được chuẩn trực bằng một vật kính của kính hiển vi đảo ngược (KHVĐN) đã hiệu chỉnh ở độ dài bước sóng 1,5µm (độ dài tiêu cự 4,4mm; số khẩu độ 0,65) Sau đó, chùm tia này tiếp hợp với chùm tia mục tiêu nhìn thấy (670nm) bằng chiếc gương đầu tiên phản xạ chùm tia 1,48µm và bán dẫn bức

xạ 670nm kèm theo Cả hai chùm tia cộng tuyến này ghép thành đôi đi qua hai gương còn lại và thấu kính thứ hai hướng dọc theo trục quang học của KHVĐN Tiêu điểm của bức xạ laser cuối cùng được dẫn qua vật kính độ phóng đại 45 lần) của KHVĐN

Hình 1.9 Sơ đồ laser 1,48 µm

Khoảng một nửa công suất (55mW) của laser nguồn (120mW) được dùng trên mặt phẳng tiêu điểm tương đương với mật độ công suất 109kW/cm2 Tuy nhiên, công suất hấp thu có lúc chỉ hạn chế ở mức 47mW (Rink và cộng sự

thấu kính

gươngvật kính chuyên dụng

1996) do loại laser này sinh nhiệt [130] Nhiệt lượng ở vòng tròn đích của chùm laser thường từ 60-800C Tăng độ rộng vòng tròn nhiệt sẽ kèm theo tăng thời gian chiếu (Rink và cộng sự 1994) [trích dẫn từ 39] Tuy nhiên, cần ghi nhận rằng có một vài yếu tố khác làm ảnh hưởng đến năng lượng cần thiết để tia laser tạo được lỗ thủng mong muốn như nhiệt độ môi trường nuôi cấy (Rastegar và cộng sự 1996) [124], hệ thống vật kính lắp đặt không chuẩn, loại đĩa sử dụng trong thao tác (Schmoll và cộng sự 2003) [136]…

Nhìn chung, dù với phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng nào thì phác

đồ thực hiện hỗ trợ thoát màng và tay nghề của chuyên viên về phôi học vẫn đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến tỉ lệ thành công

1.4.3 Tình hình nghiên cứu liên quan đến hỗ trợ phôi thoát màng

1.4.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới về hỗ trợ phôi thoát màng

Trên thế giới, hỗ trợ phôi thoát màng được thực hiện từ năm 1989 Từ

đó đến nay, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá các phương pháp

hỗ trợ phôi thoát màng: bằng cơ học, bằng hoá chất hay bằng tia laser và đánh giá hiệu quả của hỗ trợ phôi thoát màng trên từng nhóm chỉ định bệnh nhân

Có nhiều nghiên cứu đưa ra những ý kiến đồng nhất Ngược lại, còn có nhiều nghiên cứu đưa ra các kết quả trái ngược nhau

a Nghiên cứu các phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng.

* Nghiên cứu trên thế giới về hỗ trợ phôi thoát màng bằng cơ học

Bảng 1.1 Dữ liệu Cochrane 2009 tổng kết AH bằng cơ học [38]

Nhóm nghiên cứu Nhóm AH(n thai/N) Nhóm chứng(n thai/N) Tỷ suất chênh

[95% độ tin cậy]

Xu hướngIsiklar 1999

226

10/22 10/28 28/103 12/82

235

3.20 [0.91, 11.27]

0.85 [0.28, 2.58 ] 0.72 [0.38, 1.36 ] 1.54 [0.67, 3.54 ]

1.09 [0.71, 1.66 ]

Trong bốn nghiên cứu trên, hai nghiên cứu có xu hướng tăng tỷ lệ có thai (PR-pregnancy rate), hai nghiên cứu còn lại PR giảm (không có ý nghĩa thống kê) Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cho rằng AH bằng cơ học có hiệu quả Stein A và cộng sự (1995) xẻ một phần màng trong suốt bằng cơ học đã kết luận như vậy và cho biết AH không làm phôi thoái hóa [146] Tương tự, Nakayama và cộng sự (1999) sử dụng hệ thống vi thao tác piezo để

mở màng trong suốt cũng thấy có hiệu quả trên nhóm bệnh nhân có phôi tốt [107] Nhóm bệnh nhân trong nghiên cứu này là những bệnh nhân IVF thất bại nhiều lần

* Nghiên cứu trên thế giới về hỗ trợ phôi thoát màng bằng hoá chất

Theo Cochrane 2009 tổng kết trên 12 nghiên cứu về AH bằng hóa chất, chỉ có một nghiên cứu cho thấy tỷ lệ có thai (PR) tăng có ý nghĩa thống kê Trong khi đó, có 9 nghiên cứu PR tăng không có ý nghĩa thống kê (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Dữ liệu Cochrane 2009 tổng kết AH trên bằng hóa chất [38]:

Nhóm nghiên cứu Nhóm AH(n thai/N) Nhóm chứng(n thai/N) Tỷ suất chênh

[95% độ tin cậy] Xu hướng

32/68 30/83 2/15 21/60 3/7 10/2240/127 20/4818/10040/108 18/50 4/28

1.86 [1.12, 3.10 ]

0.90 [0.38, 2.10 ] 0.74 [0.35, 1.59 ] 1.37 [0.79, 2.35 ] 1.29 [0.58, 2.88 ] 1.36 [0.32, 5.73 ]

1.38 [1.11, 1.73 ]

* Nghiên cứu trên thế giới về hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser

- Nghiên cứu ứng dụng laser tiếp xúc

Laser được ứng dụng trong hỗ trợ sinh sản ở mức độ tế bào từ đầu thập

kỷ 80 (Berns và cộng sự 1981) [22] Tadir và cộng sự (1989) là những người đầu tiên dùng loại laser cứng trong IVF có tên là neodymium: laser yttrium-aluminium-garnet (Nd: YAG, độ dài bước sóng 1064nm) để kiểm soát tinh trùng [150] Sau đó, Tadir dùng thiết bị Nd: YAG kết hợp với potassium-titanyl-photsphat thủy tinh hóa nhằm tăng tần số bức xạ lên (532 và 266nm) để đục thủng màng trong suốt Sự kết hợp này làm cho chùm tia laser chiếu trực tiếp lên kính hiển vi đảo ngược và tập trung vào vi trường qua vật kính Tác giả đã làm thủng màng trong suốt thành công [151] Tuy nhiên, theo Neev và cộng sự (1992) kết quả đạt được bằng phương pháp này không ổn định [110] Trong cùng thời điểm đó, Palanker và cộng sự đã dùng loại laser khí Argon fluorid (ArF) với độ dài bước sóng 193 nm tạo được các lỗ tròn, bờ sắc nét và ổn định trên màng trong suốt của trứng chuột Đường kính của các lỗ này phụ thuộc vào kích cỡ của đầu pipette thủy tinh dẫn tia laser [116] Tuy vậy, độ an toàn của loại laser không dùng nhiệt này cần phải được xem xét (Laufer và cộng sự 1993) [91] Hai loại tia laser excimer là Xeno chloride (XeCl)-phát xạ ở bước sóng 308nm và krypton fluoride (KrF)-phát xạ ở bước sóng 248nm đã được El-Danasouri và cộng sự (1993), Neev và cộng sự (1993) ứng dụng cho hỗ trợ phôi thoát màng trên chuột thành công [trích dẫn từ 39], [108] Blanchet và cộng sự (1992) cũng đã dùng laser KrF bước sóng 260nm trên phôi chuột rã đông [26] Tuy nhiên, loại laser này được cho là có nhiều điểm hạn chế nếu dùng trên người

vì nó có thể gây độc hoặc gây đột biến gen (Kochevar và cộng sự 1989) [86]

Loại laser nitơ mà Schütze và cộng sự (1994) (bước sóng 337nm) đã dùng cũng

bị đánh giá tương tự [trích dẫn từ 45] Feichtinger và cộng sự (1992); Strohmer

và Feichtinger (1992) là những người đầu tiên ứng dụng loại tia laser Er:YAG trong IVF [trích dẫn từ 39], [147] Đứa trẻ đầu tiên ra đời đã chứng minh độ an toàn của phương pháp này (Antinori và cộng sự 1994) [14] Tuy nhiên, loại laser tiếp xúc này cũng bộc lộc nhiều hạn chế Sau đó, Neev và cộng sự (1995); Schiewe và cộng sự (1995) đã dùng laser Ho:YSGG phát xạ trong nước, không cần bộ vi thao tác [109] Tuy vậy, loại laser này khó áp dụng thực tiễn

Nhìn chung, các loại laser được dùng nói trên đều có những nhược điểm khó ứng dụng trên phôi người vì một số nguyên nhân sau: Độ an toàn không cao, khả năng vô trùng kém, cần dùng ống thuỷ tinh (pipette) hoặc cáp quang dẫn đến tận nơi thao tác (dễ nhiễm khuẩn)…

- Nghiên cứu ứng dụng của laser không tiếp xúc

Hỗ trợ ICSI: Trong một số trường hợp độ đàn hồi của màng trong suốt

có vấn đề, người ta có thể đục một lỗ nhỏ (khoảng 10µm) trên màng trong suốt để đưa kim tiêm tinh trùng qua dễ dàng [127] Ngoài ra, người ta còn dùng tia laser để bất động tinh trùng trước khi tiêm vào noãn [105]

Hỗ trợ sinh thiết phôi chẩn đoán di truyền trước làm tổ (PGD): Laser được dùng để tạo lỗ thủng dẫn đường cho kim sinh thiết hút phôi bào [82], [87], [106]

Hỗ trợ hút các mảnh vỡ bào tương hoặc các phôi bào thoái hoá sau rã đông [98], [128]

Hỗ trợ phôi thoát màng: phổ biến nhất:

Bảng 1.3 Dữ liệu Cochrane 2009 tổng hợp các nghiên cứu về LAH [38]

Nhóm nghiên cứu Nhóm AH(n thai/N) Nhóm chứng(n thai/N) Tỷ suất chênh

[95% độ tin cậy] Xu hướng

933

30/103 11/69 50/183 21/52 43/82 12/38 5/37 2/18 12/80 10/35 3/40 44/82

819

1.27 [0.70, 2.32 ] 1.86 [0.81, 4.25 ]

1.85 [1.19, 2.86 ]

0.74 [0.33, 1.65 ] 0.95 [0.54, 1.67 ] 0.62 [0.26, 1.49 ] 1.77 [0.52, 6.01 ]

8.0 [1.44, 44.30]

0.81 [0.33, 2.00 ] 1.15 [0.41, 3.19 ]

*Nghiên cứu so sánh các phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng

Khi so sánh AH bằng các phương pháp hoá học hoặc cơ học với AH bằng laser, nhiều nghiên cứu cho thấy phương pháp AH bằng tia laser hiệu quả, an toàn, dễ hơn phương pháp hoá học hoặc cơ học, làm tăng rõ tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm tổ của các bệnh nhân TTTON [79], [82], [97] Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại cho rằng các phương pháp AH dùng tia laser, cơ học hay hoá chất đều làm tăng tỷ lệ làm tổ và tỷ lệ có thai [50], [16]

Có khá nhiều nghiên cứu so sánh LAH và AH bằng axit Tyrode Có tác giả đã kết luận rằng LAH đục lỗ trên màng trong suốt dễ và an toàn hơn nhiều

so với axit Tyrode [79] Có tác giả khác lại khuyến cáo đục lỗ bằng tia laser là biện pháp thay thế thích hợp cho đục lỗ bằng axit Tyrode [81]

b Các nghiên cứu trên một số chỉ định của bệnh nhân TTTON

* Nhóm bệnh nhân TTTON tiên lượng tốt và/hoặc không chọn bệnh nhân: nhiều nghiên cứu cho rằng hỗ trợ phôi thoát màng không làm tăng tỷ lệ

có thai và tỷ lệ làm tổ trên các bệnh nhân làm TTTON lần đầu tiên, bệnh nhân trẻ tuổi (<37 tuổi) [59], [80], [131]…

Bảng 1.4 AH trên nhóm bệnh nhân có tiên lượng tốt (Cochrane 2009) [38]

Nhóm nghiên cứu Nhóm AH(n thai/N) Nhóm chứng(n thai/N) Tỷ suất chênh

[95% độ tin cậy]

Xu hướng

30/103 43/82 12/38 21/60 3/7 10/28 44/82 40/108

508

1.27 [0.70, 2.32 ] 0.95 [0.54, 1.67 ] 0.62 [0.26, 1.49 ] 1.15 [0.55, 2.43 ] 0.40 [0.06, 2.89 ] 0.85 [0.28, 2.58 ] 0.94 [0.53, 1.65 ] 1.37 [0.79, 2.35 ]

1.04 [ 0.82, 1.33 ]

Trong 8 nghiên cứu, có 3 nghiên cứu cho thấy PR tăng, tuy nhiên không có ý nghĩa thống kê Tổng kết các nghiên cứu chỉ ra rằng AH không cải thiện được tỷ lệ có thai của nhóm tiên lượng tốt

Bảng 1.5 AH trên nhóm không chọn bệnh nhân (Cochrane 2009) [38]

Xu hướngBalaban 2006

50/183 21/52 32/68 30/83 10/22 10/22 2/18 12/8018/100 18/50 678

1.85 [1.19-2.86]

0.74 [0.33, 1.65 ]1.30 [0.66, 2.55 ]1.86 [0.99, 3.48 ]2.00 [0.62, 6.49 ]3.20 [0.91, 11.27]

8.00 [1.44, 44.30]

0.81 [ 0.33, 2.00 ] 0.74 [0.35, 1.59 ] 1.29 [0.58, 2.88 ]

1.45 [1.15, 1.83 ]

Trong 10 nghiên cứu, có 7 nghiên cứu báo cáo tỷ lệ có thai tăng (PR) ở nhóm AH, trong đó có 2 nghiên cứu PR tăng có ý nghĩa thống kê Nhìn chung

tỷ lệ có thai tăng có ý nghĩa thống kê khi tổng kết các nghiên cứu trên

Bảng 1.6 AH trên nhóm bệnh nhân không chọn lọc và có tiên lượng tốt

Xu hướng

18/3921/5232/68159/37321/603/710/2237/6610/3544/8240/10852/119

* Nhóm bệnh nhân tiên lượng kém

Bảng 1.7 AH trên nhóm bệnh nhân tiên lượng kém (Cochrane 2009) [38]

Nhóm nghiên cứu Nhóm AH(n thai/N) Nhóm chứng(n thai/N) Tỷ suất chênh

[95% độ tin cậy]

Xu hướngCohen 1992c

185

26/68 15/48 10/35 3/40

191

1.57 [0.80, 3.10 ] 0.91 [0.37, 2.26 ] 0.74 [0.25, 2.18 ]3.58 [0.89, 14.39]

1.32 [ 0.84, 2.07 ]

Theo dữ liệu Cochrane 2009, không có nghiên cứu nào chứng minh được AH có hiệu quả rõ trên nhóm bệnh nhân tiên lượng kém [38].

Tuy nhiên, nghiên cứu của Schoolcraft và cộng sự (1994) lại chứng minh được AH cải thiện tỷ lệ có thai và làm tổ ở nhóm bệnh nhân này [137]

* Nhóm bệnh nhân IVF thất bại nhiều lần: Nhiều nghiên cứu cho thấy

hiệu quả của AH trên nhóm bệnh nhân này [28], [29], [146]

Trong 5 nghiên cứu (bảng 1.8), tỷ lệ có thai đều cao hơn ở nhóm AH, tuy nhiên có 2 nghiên cứu PR tăng không có ý nghĩa thống kê, 3 nghiên cứu còn lại PR tăng có ý nghĩa thống kê Xu hướng chung đều nghiêng về AH có hiệu quả cho nhóm bệnh nhân này

Bảng 1.8 AH trên nhóm bệnh nhân IVF thất bại nhiều lần [163]

361

19/9810/5140/1293/4012/82

* Nhóm bệnh nhân TTON có màng trong suốt dày:

Có nghiên cứu cho rằng AH trên màng trong suốt dày cải thiện được tỷ

lệ có thai [34], tuy nhiên có nghiên cứu khác lại không cho kết quả như vậy [68]

* Nhóm bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh:

Bảng 1.9 Nhóm bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh không chọn lọc, không có

tiên lượng kém [163]

Nhóm nghiên cứu Nhóm AH(n thai/N) Nhóm chứng(n thai/N) Tỷ suất chênh

[95% độ tin cậy] Xu hướngBalaban et al 2006

595

50/18313/6414/10012/8020/11012/64

Trong 6 nghiên cứu, chỉ có 2 nghiên cứu cho rằng tỷ lệ thai lâm sàng tăng có ý nghĩa thống kê ở nhóm AH, số còn lại tỷ lệ có thai khác biệt không

có ý nghĩa thống kê Xu hướng chung ủng hộ cho thực hiện AH trên chuyển phôi đông lạnh

Nhìn chung, các nghiên cứu về AH trên nhóm chuyển phôi đông lạnh cũng chưa thống nhất kết quả, dù AH có xu hướng cải thiện ở nhóm này [17], [27], [35], [59], [74], [121], [142], [148]

* Nhóm bệnh nhân lớn tuổi

Nhiều nghiên cứu cho rằng AH cải thiện tỷ lệ có thai và làm tổ ở các bệnh nhân TTTON lớn tuổi, tuy nhiên vẫn có nhiều nghiên cứu khác không cho kết quả như vậy [24], [27], [53], [90], [104], [159]

Bảng 1.10 AH trên nhóm bệnh nhân chuyển phôi tươi lớn tuổi [163]

Nhóm nghiên cứu Nhóm AH(n thai/N) Nhóm chứng(n thai/N) Tỷ suất chênh

[95% độ tin cậy] Xu hướngFrydman et al 2006

198

21/5421/5520/4811/50

Trong 4 nghiên cứu được đề xuất, chỉ có một nghiên cứu cho thấy AH

có xu hướng cải thiện tỷ lệ có thai, 3 nghiên cứu còn lại đều chỉ ra rằng AH không hiệu quả trên nhóm đối tượng này

* Đánh giá dựa trên tỷ lệ sinh sống (LBR) [38], [163]:

Xu hướng chung cho thấy AH không hiệu quả đối với LBR: trên nhóm bệnh nhân không chọn lọc và có tiên lượng tốt và nhóm bệnh nhân chuyển phôi tươi lớn tuổi

Xu hướng chung LBR tăng: AH trên nhóm bệnh nhân chuyển phôi tươi IVF thất bại nhiều lần và nhóm chuyển phôi đông lạnh

c Các nghiên cứu hỗ trợ phôi thoát màng bằng cách làm mỏng, làm thủng hoặc lột bỏ màng trong suốt

*Làm mỏng

Mục đích của việc làm mỏng màng trong suốt là chỉ làm mỏng mà không làm thủng màng hoàn toàn Do vậy, nguy cơ mất các phôi bào và nhiễm trùng phôi sẽ được giảm thiểu tối đa Nhiều tác giả cho rằng làm mỏng màng trong suốt của phôi ở giai đoạn phân chia dường như làm cho phôi làm

tổ tốt hơn [13], [25], [73], [88], [120] Làm mỏng một phần màng trong suốt

bằng laser cũng làm tăng tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm tổ của nhóm bệnh nhân thất bại làm tổ nhiều lần [60].

Tuy vậy, một số nghiên cứu cho thấy làm mỏng màng trong suốt ở phôi

rã đông bằng phương pháp dùng men pronase hoặc dùng laser lại không cải thiện được tỷ lệ làm tổ [120], [121]

* Đục lỗ

Báo cáo phân tích đa trung tâm của dữ liệu Cochrane 2009 tổng hợp các nghiên cứu AH có thể thấy dù làm mỏng hay đục lỗ và trên nhóm bệnh nhân ngẫu nhiên thì AH vẫn có hiệu quả Tuy nhiên, phân tích các thử nghiệm đối chứng ngẫu nhiên của Dữ liệu Cochrane 2007 trước đó lại có đưa ra ý kiến rằng AH bằng cách làm mỏng không làm tăng đáng kể tỉ lệ có thai lâm sàng trong khi chỉ cần đục một lỗ thủng trên màng ZP là đã có tác động tích cực đến tỉ lệ có thai [38], [141]

Yano và cộng sự (2007) cho rằng làm mỏng màng trong suốt một phần hoặc toàn phần đều làm tăng PR và IR của các bệnh nhân thất bại làm tổ nhiều lần Tác giả cũng khuyến cáo nên làm mỏng một phần màng ZP tốt hơn

là làm mỏng toàn phần [168] Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác cho rằng với kích thước làm mỏng hoặc làm thủng càng lớn thì hiệu quả AH càng cao [48], [74], [75], [96]

* Tách bỏ màng trong suốt

Ngoài làm mỏng và đục lỗ, có các nghiên cứu AH còn tách bỏ màng trong suốt Nghiên cứu của Mansour và cộng sự (2000) đã dùng axit Tyrode

để loại bỏ màng trong suốt trước khi chuyển phôi ngày 3 Tỷ lệ có thai tăng

có ý nghĩa thống kê ở nhóm phụ nữ lớn tuổi [99] Một số nghiên cứu khác cũng báo cáo tỷ lệ có thai tăng khi tách bỏ màng trong suốt mà không làm phôi thoái hóa [38]

* Hiệu quả của vị trí AH

Nghiên cứu của Hirotoshi và cộng sự (2010) trên phôi nang rã đông cho thấy vị trí AH cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ phôi thoát màng Tác giả nhận thấy sự thoát màng xảy ra hoàn toàn và nhanh hơn khi AH gần vị trí của khối

tế bào nội phôi (ICM) so với khi AH ở vị trí đối diện với ICM [76] Tuy nhiên, có nghiên cứu lại cho rằng vị trí AH không ảnh hưởng đến kết quả có thai (Ren X và cộng sự 2013) [125] Một số nghiên cứu khác cho rằng quá trình thoát màng của phôi có thể có sự phân cực Nếu ICM thoát ra trước, khoang phôi nang còn lại có thể sinh ra một áp lực đủ lớn để tự đẩy nó ra nốt khỏi màng trong suốt Ngược lại, nếu khoang phôi nang ra trước, ICM còn lại

có thể tích nhỏ và không đủ áp lực để tự thoát ra được Sự phân cực này có phải là lý do thất bại của AH khi không xem xét đến yếu tố vị trí hay không vẫn còn là điều chưa chắc chắn [38], [156]

d Các nghiên cứu về thai đôi cùng túi ối sau AH

Đã có nhiều báo cáo cho thấy ICSI hoặc AH hay chuyển phôi nang có thể là nguyên nhân dẫn đến tăng tỷ lệ thai đôi cùng trứng (MZ) [8], [10], [61], [144], [166] Theo phân tích Cochrane [38], tỉ lệ thai đôi cùng trứng chiếm khoảng 0,8% sau khi làm hỗ trợ phôi thoát màng Một số nghiên cứu thấy rằng khi đục lỗ hoặc làm mỏng màng trong suốt với kích thước nhỏ sẽ dễ làm phôi bào bị kẹt dẫn đến tăng tỷ lệ MZ [152] Khi nghiên cứu so sánh nhóm lột bỏ hẳn màng trong suốt so với nhóm màng trong suốt còn nguyên, tỷ lệ MZ giảm

ở nhóm không có màng trong suốt [40] Qua đó, có thể nhận định rằng, nguy

cơ MZ có yếu tố do màng trong suốt nhưng đó không phải là yếu tố duy nhất

e Trẻ ra đời sau kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng

Các số liệu ghi nhận cho đến nay các trẻ ra đời từ các chu kỳ có hỗ trợ phôi thoát màng đều có các chỉ số phát triển trong giới hạn bình thường, không làm tăng nguy cơ thai dị dạng hoặc bất thường nhiễm sắc thể Các chỉ

số trên phản ánh độ an toàn của kỹ thuật này [38], [83], [132], [141]

1.4.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước về hỗ trợ phôi thoát màng

Kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng axit Tyrode được thực hiện đầu tiên ở Việt Nam tại Trung tâm TTTON Vạn Hạnh tháng 5/2008 Sau đó, kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser được triển khai vào tháng 7/2008 tại trung tâm này và tháng 4/2009 tại Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương

Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng mù đôi của Đặng Quang Vinh và cộng sự (2009) so sánh AH bằng axit Tyrode và tia laser trên 200 bệnh nhân tiên lượng kém (> 35 tuổi, IVF thất bại > 1 lần, FSH cơ bản > 10mIU/mL, độ dày màng ZP > 15µm, không xin noãn, có > 2 phôi chuyển, niêm mạc tử cung

> 7mm) chia 2 nhóm, mỗi nhóm 100 bệnh nhân Cách thức AH là làm mỏng 50% trên chiều dài 30-40µm của màng trong suốt Kết quả cho thấy không có

sự khác biệt giữa hai nhóm về tỷ lệ thai sinh hóa, tỷ lệ thai lâm sàng của nhóm LAH là 43% so với 41% ở nhóm dùng axit Tyrode (TAH), (p=0,47)

Tỷ lệ làm tổ của phôi cũng tương đương ở hai nhóm: LAH: 21,2%, TAH: 22,1% Tỷ lệ đa thai ở hai nhóm lần lượt là 53,4% và 58,5% (p=0,21) Nhóm tác giả kết luận hiệu quả AH bằng tia laser và axit Tyrode là như nhau và so sánh ưu nhược điểm của hai phương pháp (bảng 1.11) [1]

Bảng 1.11 So sánh hai phương pháp AH bằng axit Tyrode và bằng tia laser.

Laser Axit tyrode

Chi phí cho dụng cụ tiêu hao Ít hơn Nhiều hơn

Kỹ thuật thực hiện Dễ hơn Khó hơn

Yếu tố cần quan tâm Nhiệt lan tỏa Nồng độ axit

Triển khai các ứng dụng khác Thuận tiện hơn Không thuận tiệnNghiên cứu của Lê Thụy Hồng Khả và cộng sự (2009) so sánh phương pháp đục lỗ và làm mỏng bằng tia laser trên nhóm bệnh nhân không chọn lựa gồm có 485 bệnh nhân được phân bố ngẫu nhiên vào hai nhóm: Nhóm làm mỏng n = 257, nhóm đục lỗ n = 228 Cách thức làm mỏng: làm mỏng 50% độ dày màng trong suốt với chiều dài 40-50µm Cách thức đục lỗ: tạo lỗ 10-15µm LAH phôi ngày 2, chuyển phôi sau LAH 2 giờ Đặc điểm bệnh nhân giữa hai nhóm khác biệt không có ý nghĩa thống kê Tỷ lệ thai lâm sàng, tỷ lệ làm tổ giữa nhóm đục lỗ và làm mỏng lần lượt là: 36%; 17,3% so với 42%, 20,4% (p=0,52) Nghiên cứu kết luận hiệu quả của đục lỗ và làm mỏng là như nhau [3]

Nghiên cứu của Hán Mạnh Cường và cộng sự (2011) tại Bệnh viện Phụ sản Trung Ương đánh giá các yếu tố liên quan đến tỷ lệ có thai của nhóm chuyển phôi đông lạnh có LAH nói chung [4]

Nghiên cứu của Đoàn Thị Hằng và cộng sự (2011) tại Trung tâm Công nghệ phôi so sánh nhóm làm mỏng bằng axit Tyrode và nhóm chứng cho thấy

PR và IR nhóm AH (37% và 16,26%) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (15,9% và 7,14%) (p <0,05) [2]

Tổng kết các nghiên cứu về hỗ trợ phôi thoát màng, Uỷ ban thực hành của Hiệp hội kỹ thuật Hỗ trợ sinh sản và Hiệp hội Thuốc sinh sản của Mỹ và

Dữ liệu Cochrane đã có một số kết luận khi phân tích tổng hợp các nghiên cứu chuẩn như sau: Tỷ lệ trẻ sinh sống của nhóm làm AH tương đương với nhóm không làm AH Ưu thế của các phương pháp làm AH còn nhiều ý kiến trái ngược nhau Tỷ lệ sảy thai của nhóm AH không khác biệt Tỷ lệ đa thai ở nhóm AH nói chung cao hơn so với nhóm chứng [38], [141], [145] Sau khi tổng phân tích, các tác giả kết luận hiệu quả của AH với ví dụ cụ thể là một trung tâm có tỷ lệ có thai lâm sàng là 25%, khi triển khai AH có thể cải thiện

hỗ trợ phôi thoát màng khác nhau, áp dụng trên các đối tượng bệnh nhân khác nhau Hơn nữa, tay nghề của chuyên viên phôi học thực hiện kỹ thuật này và

tỷ lệ thành công của mỗi trung tâm cũng không đồng nhất Do vậy, việc so sánh và phân tích tổng hợp các nghiên cứu hoàn toàn không dễ dàng và khó đi đến được kết luận cuối cùng Có nhiều mục tiêu nghiên cứu khác nhau đã được thực hiện: (1) Đánh giá hiệu quả các phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng: AH bằng cơ học, bằng hóa chất hoặc bằng tia laser; (2) Đánh giá hiệu quả của cách thức hỗ trợ phôi thoát màng: Đục lỗ, làm mỏng hay tách bỏ màng trong suốt; (3) Chỉ định hiệu quả của AH trên các đối tượng bệnh nhân TTTON; (4) Đánh giá ảnh hưởng của kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng lên khả năng phát triển của phôi, tỷ lệ sinh sống, tỷ lệ đa thai, sảy thai

(1) Các nghiên cứu về đánh giá và so sánh các phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng có rất nhiều điểm chung và hầu như không có điểm bất đồng:

- Phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser đơn giản, dễ sử dụng, an toàn hơn so với phương pháp cơ học và hóa chất

- Đánh giá hiệu quả của từng phương pháp (có cải thiện PR, IR hay không) còn phụ thuộc vào cách thức hỗ trợ phôi thoát màng (đục lỗ, làm mỏng, tách bỏ màng trong suốt ) và chỉ định AH trên đối tượng TTTON nào

(2) Các nghiên cứu về cách thức đục lỗ, làm mỏng hoặc tách bỏ màng trong suốt

- Chưa thống nhất được đục lỗ hay làm mỏng với kích thước bao nhiêu

là tốt nhất

- Nghiên cứu tổng phân tích Cochrane 2009 cho rằng đục lỗ hay làm mỏng cũng có hiệu quả như nhau Tuy nhiên, cũng Cochrane 2007 trước đó lại cho rằng đục lỗ tốt hơn làm mỏng Nhìn chung, các nghiên cứu tổng phân tích

có thể đưa ra xu hướng chung về hiệu quả của một phương pháp Từng nghiên cứu có cách thiết kế về đối tượng nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu khác nhau Do vậy, phân tích các nghiên cứu có đối tượng và phương pháp không đồng nhất để tổng hợp kết quả có thể dẫn đến sai số là điều đương nhiên

- Nhiều nghiên cứu cho rằng kích thước lỗ nhỏ không những sẽ không

có hiệu quả mà còn làm phôi bào bị kẹt Hơn nữa, nếu lỗ càng càng lớn, hiệu quả càng cao, giảm tình trạng kẹt phôi bào, giúp phôi thoát màng hoàn toàn

và giảm nguy cơ sinh đôi cùng trứng

- Thực tế chưa có nghiên cứu nào chọn cùng một đối tượng nghiên cứu

để so sánh làm mỏng tốt hơn hay đục lỗ tốt hơn và so với nhóm chứng không AH.

(3) Các nghiên cứu về chỉ định của AH:

- Nhóm bệnh nhân tiên lượng tốt: Đa số các nghiên cứu cho rằng AH không hiệu quả trên nhóm bệnh nhân này

- Nhóm không chọn bệnh nhân: Đa số các nghiên cứu cho rằng AH không hiệu quả trên nhóm bệnh nhân này.

- Nhóm bệnh nhân tiên lượng kém (FSH cao, IVF thất bại nhiều lần, cao tuổi): Các nghiên cứu còn nhiều mâu thuẫn nhưng nhìn chung đều cho rằng AH không cải thiện PR ở nhóm này

+ Nhóm chuyển phôi tươi bệnh nhân lớn tuổi: Các nghiên cứu còn nhiều mâu thuẫn nhưng xu hướng chung cho rằng AH không cải thiện PR ở nhóm này

+ Nhóm IVF thất bại nhiều lần: Các nghiên cứu không thống nhất kết quả ở nhóm này

- Nhóm chuyển phôi đông lạnh: Số nghiên cứu cho rằng AH cải thiện

PR nhiều hơn số nghiên cứu cho AH không cải thiện được PR

- Nhóm có màng trong suốt dày: Nhiều nghiên cứu cho thấy PR không tăng sau AH

(4) Đánh giá ảnh hưởng của AH lên khả năng phát triển của phôi

- Khả năng phát triển của phôi: Các nghiên cứu về AH những năm đầu tiên đã báo cáo về các trường hợp có phôi bào thoái hóa sau AH Sau đó, khi

kỹ thuật AH có nhiều cải tiến, đa số các nghiên cứu đều cho rằng AH không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi so với nhóm chứng không AH

- Tỷ lệ sinh sống: Đa số các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sinh sống khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng Một số nghiên cứu cho rằng tỷ lệ này cao hơn có ý nghĩa thống kê

- Tỷ lệ đa thai: Số nghiên cứu cho rằng AH làm tăng tỷ lệ đa thai nhiều hơn số nghiên cứu báo cáo AH không làm tăng tỷ lệ đa thai

- Tỷ lệ sảy thai: Đa số các nghiên cứu nhận định AH không làm tăng tỷ

lệ sảy thai

Cho đến nay, tại Việt Nam và trên thế giới còn chưa có một nghiên cứu nào tiến hành so sánh cách thức đục lỗ và làm mỏng trên màng trong suốt của phôi với kích thước lớn hơn, đồng thời so sánh với nhóm chứng không làm

AH, thực hiện ngẫu nhiên trên nhóm đối tượng bệnh nhân có chọn lọc Các nghiên cứu đã tiến hành chỉ so sánh đục lỗ và làm mỏng với kích thước nhỏ (< 20µm), trong khi có nhiều nghiên cứu về cách đục lỗ hoặc làm mỏng đã cho thấy lỗ lớn hơn hoặc làm mỏng trên độ dài lớn hơn có hiệu quả hơn Tại Việt Nam còn chưa có nghiên cứu nào về LAH trên chỉ định bệnh nhân

TTTON lớn tuổi và chuyển phôi đông lạnh Do vậy, đề tài nghiên cứu “Đánh

giá hiệu quả hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser trên một số chỉ định của đối tượng thụ tinh trong ống nghiệm” được tiến hành với mục tiêu chính là đánh

giá và so sánh hiệu quả của cách thức làm mỏng 50% độ dày trên ¼ chu vi

màng trong suốt với đục lỗ 30µm bằng tia laser với nhóm chứng không làm LAH trên hai nhóm chỉ định chính của hỗ trợ phôi thoát màng là nhóm bệnh nhân lớn tuổi và nhóm chuyển phôi đông lạnh Hy vọng rằng kết quả của đề tài sẽ góp một phần nhỏ bé trong việc quyết định cách thức tiến hành và chỉ định của phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser.

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu:

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Đối tượng 1: Các bệnh nhân chuyển phôi tươi > 38 tuổi, chia làm ba nhóm:

Nhóm chứng: Không làm hỗ trợ phôi thoát màng trước khi chuyển phôi.Nhóm đục lỗ: Nhóm hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser (LAH-laser asisted hatching) tạo lỗ thủng 30 µm trên màng trong suốt của phôi trước chuyển phôi

Nhóm làm mỏng: Nhóm LAH bằng cách làm mỏng 50% độ dày trên ¼ chu vi màng trong suốt của phôi trước chuyển phôi

- Đối tượng 2: Các bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh được chia làm ba nhóm:

Nhóm chứng: chuyển phôi đông lạnh không làm LAH trước khi chuyển phôi.Nhóm đục lỗ: Nhóm LAH tạo lỗ thủng 30 µm trên màng trong suốt của phôi đông lạnh trước chuyển phôi

Nhóm làm mỏng: Nhóm LAH bằng cách làm mỏng 50% độ dày trên ¼ chu vi màng trong suốt của phôi đông lạnh trước chuyển phôi

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân vào mẫu nghiên cứu

* Tiêu chuẩn chọn chung:

Tất cả các bệnh nhân chuyển phôi tươi > 38 tuổi và bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh, có > 1 phôi rất tốt (phôi độ 4), niêm mạc tử cung > 8mm, < 14mm, chuyển phôi dễ, không có máu, đồng ý tham gia nghiên cứu Các bệnh nhân đạt tiêu chuẩn được chọn ngẫu nhiên vào các nhóm

* Tiêu chuẩn chọn riêng:

- Đối tượng 1: Chọn các trường hợp chuyển phôi tươi ngày 2 và ngày 3

- Đối tượng 2: Chọn các trường hợp chuyển phôi đông lạnh ngày 3

* Tiêu chuẩn loại trừ:

- Các trường hợp không đồng ý tham gia nghiên cứu

- Đối tượng 1 (bệnh nhân chuyển phôi tươi > 38 tuổi): Các trường hợp xin cho trứng.

- Đối tượng 2: Các trường hợp chuyển phôi đông lạnh có tiền sử đã làm IVF thất bại > 2 chu kỳ

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu:

Trung tâm Hỗ trợ sinh sản- Bệnh viện Phụ sản Trung Ương

2.1.4 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2009 đến tháng 9/2012

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu tiến cứu, thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có chứng

2.2.2 Cỡ mẫu: Tính theo công thức tính cỡ mẫu thử nghiệm lâm sàng ngẫu

nhiên có chứng của Tổ chức Y tế thế giới (WHO):

2 2 1

2 2 2 1 1 β 1 α/2

1

) p (p

) p (1 p ) p (1 p Z 2PQ (Z

n

−

− +

− +

Trong đó: n: số bệnh nhân tham gia mỗi nhóm nghiên cứu

P = (p1 + p2)/2; Q= 1-P; q1=1- p1 ; q2=1- p2

α = Mức ý nghĩa thống kê, là xác suất của việc mắc phải sai lầm loại I

β = Xác suất của việc mắc phải sai lầm loại II

* Đối tượng 1: Các bệnh nhân > 38 tuổi:

Chúng tôi không tìm được nghiên cứu nào trước đây so sánh LAH đục lỗ 30

µm và làm mỏng 50% độ dày trên ¼ chu vi màng trong suốt so với nhóm chứng không làm LAH trên bệnh nhân > 38 tuổi, do đó chúng tôi lấy tỷ lệ có thai ước tính của nghiên cứu thử nghiệm trên 20 bệnh nhân đầu tiên của mỗi nhóm

+ Tính cỡ mẫu nhóm chứng và nhóm làm mỏng:

p1= 45%= 0,45 = PR nhóm chứng; p2= 15%= 0,15 = PR nhóm LAH làm mỏng

α= 0,01= Độ tin cậy 99%; β= 0,1; z1- α /2 = 2,57; z1- β = 1,65

Thay số: n chứng = n làm mỏng = 53 bệnh nhân +10% dự trù = 58 bệnh nhân (đối tượng 1).

+ Tính cỡ mẫu nhóm chứng và nhóm đục lỗ:

p1= 45%= 0,45 = PR nhóm chứng; p2= 30%= 0,3 = PR nhóm LAH đục lỗ

α= 0,05 = Độ tin cậy 95%; β= 0,4; z1- α /2 = 1,96; z1- β = 0,84

Thay số: n chứng = n nhóm đục lỗ = 60 bệnh nhân +10% dự trù= 66 bệnh nhân (đối tượng 1).

+ Tính cỡ mẫu nhóm đục lỗ và nhóm làm mỏng:

p1 = 30% = 0,3 = PR nhóm LAH đục lỗ; p2 = 15% = 0,15 = PR nhóm LAH làm mỏng

α= 0,1 = Độ tin cậy 90% ; β= 0,4; z1- α /2 = 1,65; z1- β = 0,84.

Thay số: n nhóm đục lỗ = n nhóm làm mỏng = 62 bệnh nhân +10% dự trù

= 68 bệnh nhân (đối tượng 1).

Tóm lại, cỡ mẫu đối tượng 1 (các bệnh nhân > 38 tuổi): n nhóm chứng =

66, n nhóm đục lỗ = 68, n nhóm làm mỏng = 68.

Thực tế, nghiên cứu tiến hành trên 213 bệnh nhân chuyển phôi tươi > 38 tuổi

chia 3 nhóm: nhóm chứng: n=73; nhóm đục lỗ: n=72; nhóm làm mỏng: n=68.

* Đối tượng 2: Các bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh:

n: số bệnh nhân tham gia mỗi nhóm nghiên cứu + Tính cỡ mẫu nhóm chứng và nhóm làm mỏng: Lấy p của nhóm LAH làm mỏng và nhóm chứng trên FET trong nghiên cứu của Zhang XJ và cộng sự 2009 [172]:

p1= 40,3% = 0,403 = PR nhóm làm mỏng; p2= 16,1% = 0,16 = PR nhóm chứng

α= 0,05 = Độ tin cậy 95%; β= 0,4; z1- α /2 = 1,96; z1- β = 0,84

Thay số: n chứng = n nhóm làm mỏng = 53 bệnh nhân +10% dự trù= 58 bệnh nhân (đối tượng 2).

+ Tính cỡ mẫu nhóm đục lỗ và nhóm làm mỏng: Lấy p nhóm đục lỗ và nhóm làm mỏng trong nghiên cứu thử nghiệm của chúng tôi trên 20 bệnh nhân đầu tiên của mỗi nhóm

p1= 55% = 0,55 = PR nhóm LAH đục lỗ; p2= 25% = 0,25 = PR nhóm LAH làm mỏng

α= 0,01= Độ tin cậy 99%; β= 0,2 z1- α /2 = 2,57; z1- β = 1,28

Thay số: n nhóm đục lỗ = n nhóm làm mỏng = 49 bệnh nhân +10% dự trù = 54 bệnh nhân (đối tượng 1).

Tóm lại, cỡ mẫu đối tượng 2 (các bệnh nhân FET): n nhóm chứng = 66,

2.2.3.1 Phân nhóm đối tượng nghiên cứu

Các đối tượng nghiên cứu được chọn lọc theo 2 bước:

- Bước 1: Mỗi nhóm đối tượng 1 (bệnh nhân > 38 tuổi thực hiện qui trình TTON) và đối tượng 2 (các bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh đã thực hiện qui trình đông phôi – rã đông) phù hợp các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ nêu trên (trừ tiêu chuẩn chuyển phôi dễ vì ở bước này chưa tiến hành chuyển phôi) sẽ được rút thăm ngẫu nhiên đơn để chia vào ba nhóm nhỏ: nhóm chứng, nhóm đục lỗ, nhóm làm mỏng

- Bước 2: Các bệnh nhân đã được chọn vào ba nhóm nhỏ kể trên qua bước lọc thứ 2 là đạt tiêu chuẩn chuyển phôi dễ và đủ thông tin nghiên cứu sẽ được chọn vào nghiên cứu

Sơ đồ phân bố đối tượng nghiên cứu

2.2.3.2 Tiến hành qui trình thụ tinh trong ống nghiệm

* Phác đồ kích thích buồng trứng và theo dõi siêu âm nang noãn

Các bệnh nhân đều được kích thích nang noãn, siêu âm nang noãn theo phác đồ chuẩn của Trung tâm Phác đồ dài dùng GnRH đồng vận khoảng 13-

14 ngày Sau đó thử lại nội tiết (FSH, LH, E2), khi thấy FSH ≈ 2 IU/l, LH ≈2 IU/l, E2 < 50 (pmol/l) và siêu âm không thấy nang cơ năng > 20 mm thì chuyển sang dùng thuốc kích thích nang noãn (FSH tinh chế) Phác đồ ngắn dùng GnRH phối hợp với FSH từ ngày thứ 2 của chu kỳ Có thể dùng thêm GnRH đối vận ở cả hai phác đồ từ ngày thứ 5-6 của chu kỳ để tránh quá kích buồng trứng Thuốc kích thích nang noãn tiêm trong khoảng 8-13 ngày, khi

siêu âm có > 3 nang noãn kích thước > 16 mm thì cho thuốc rụng trứng hCG (Pregnyl 5000 hoặc 10 000 đơn vị) Chọc hút noãn sau tiêm hCG 34-36 giờ.

* Chọc hút noãn và nuôi cấy phôi

Noãn sau chọc hút được ủ trong tủ cấy 3-6h trước khi cho thụ tinh với tinh trùng đã được chuẩn bị bằng cách cấy với mật độ 150-200 ngàn tinh trùng/ml, cấy 2-3 noãn/ giếng hoặc thụ tinh bằng cách tiêm tinh trùng vào bào tương noãn.Noãn được đánh giá thụ tinh sau khi cho tiếp xúc với tinh trùng 12-14 giờ đối với ICSI và 16-18 giờ đối với IVF đơn thuần Dùng môi trường nuôi cấy của hãng Vitrolife, Thụy Điển và tủ cấy 370C, 6% CO2 Đánh giá chất lượng phôi trước khi chuyển phôi Có thể chuyển phôi ngày 2 hoặc ngày 3 Các phôi còn dư sau khi chọn phôi tươi để chuyển sẽ được đem đông lạnh

2.2.3.3 Thực hiện qui trình đông phôi và rã đông phôi (riêng đối tượng 2)

Đông phôi và rã đông phôi được thực hiện đúng qui trình độc lập, phân bố ngẫu nhiên ở từng nhóm nghiên cứu

- Đánh giá chất lượng phôi trước đông

- Đông lạnh phôi chậm: Sử dụng môi trường đông phôi của hãng Vitrolife, Thụy Điển, dùng máy Planner chạy chương trình đông lạnh phôi chậm theo Gothenburg, Thụy Điển, 1999

- Đông phôi thủy tinh hóa: Sử dụng môi trường đông phôi thủy tinh hóa của hãng Kitazato, Nhật Cọng trữ phôi của Kitazato, Nhật

- Chuẩn bị niêm mạc tử cung cho bệnh nhân trước FET

Sử dụng Estrogen (Progynova 2mg), Progesteron (Utrogestan 100mg) Ngày 2 (N2) của chu kỳ kinh cho bệnh nhân uống proginova 4mg/ngày

N10: Siêu âm đo độ dày niêm mạc tử cung, điều chỉnh liều proginova cho thích hợp

N12 hoặc N14: Siêu âm kiểm tra nếu niêm mạc tử cung trên 8 mm, bổ sung Utrogestan 400mg/ngày (đặt âm đạo)

N16 – N18: Chuyển phôi rã đông

- Rã đông phôi:

+ Cọng trữ phôi đông lạnh chậm rã đông trong nước ấm 370C, sau đó phôi được chuyển vào môi trường rã đông của của hãng Vitrolife, Thụy Điển Rã đông xong phôi được nuôi cấy tiếp qua đêm trong môi trường GI hãng Vitrolife, Thụy Điển, trong tủ cấy 370C, 6%CO2

+ Phôi đông lạnh nhanh (theo phương pháp thủy tinh hóa): Cọng trữ phôi lấy ra từ nitơ lỏng, sau đó phôi được đẩy ngay vào môi trường rã đông nhanh của Kitazato, Nhật

- Đánh giá chất lượng phôi sau rã đông

- Đánh giá chất lượng phôi trước chuyển phôi đông lạnh.

2.2.3.4 Qui trình làm hỗ trợ phôi thoát màng

- Chuẩn bị đĩa làm AH: Nhỏ 4 giọt Gamete (Vitrolife- Thụy Điển) lên đĩa

Petri nhỏ 35mm (Vitrolife- Thụy Điển), thể tích mỗi giọt = 20 µl Trước khi

nhỏ giọt Gamete đánh số thứ tự các giọt và ghi rõ tên bệnh nhân ở mặt sau đĩa Petri Phủ kín dầu Ovoil (Vitrolife- Thụy Điển) lên đĩa, để vào tủ cấy (370C, 6% CO2) ít nhất 30 phút trước khi sử dụng (hình 2.1)

Hình 2.1 Đĩa Petri phủ dầu chuẩn bị làm AH.

- Chuẩn bị hệ thống laser: Sử dụng hệ thống laser Hamilton Thorn có gắn máy ảnh kỹ thuật số, chương trình Zilos để điều khiển hệ thống laser [70]

Hình 2.2 Vật kính chuyên dụng Zilos-tk loại I

+ Cắm đầu dây cáp nối của hệ thống điều khiển laser vào vật kính chuyên dụng.+ Khởi động máy tính, vào chương trình Zilos

+ Kiểm tra các thông số và chuẩn hóa tiêu điểm:

Chuẩn bị lamelle chuyên dụng đã được quét mực đen chuyên dụng Bắn thử tia laser bằng cách đạp vào cần điều khiển màu vàng hoặc bấm chuột trái vào nút “fire” trên thanh điều khiển, khi đó mực đen sẽ bị tia laser bắn thủng một lỗ màu trắng Nếu lỗ thủng đó trùng với vòng tròn tiêu điểm nhỏ nhất, việc chuẩn hóa tiêu điểm đã xong Nếu lỗ thủng không trùng, bấm vào “Main Menu”, chọn “Align target” rồi di chuyển con trỏ chuột vào vòng tròn tiêu điểm Click giữ chuột trái di vòng tròn tiêu điểm trùng với lỗ sáng Bấm vào nút “Align OK”

ở góc bên phải của khung hình quan sát để cố định tiêu điểm

1234Tên bệnh nhân

Giọt Gamete

Vòng tròn tiêu điểm (target) gồm có 5 vòng: Từ ngoài vào trong: (1) Vòng ngoài cùng màu tím tương ứng với 500C, (2) vòng xanh dương tương ứng 600C, (3) vòng xanh lá cây tương ứng 800C, (4) vòng vàng tương ứng

1000C, (5) vòng da cam tương ứng 1400C Kích thước vòng da cam tương ứng với kích thước lỗ thủng sau một lần bắn Trong nghiên cứu này, chúng tôi cài đặt tiêu điểm ở dạng nhìn thấy ba vòng: Vòng tròn tiêu điểm ở giữa màu vàng

- tương ứng 1000C, vòng ngoài tiếp theo màu xanh lá - tương ứng với 600C, vòng ngoài cùng màu tím- tương ứng với 500C Cài đặt vòng này sao cho mỗi lần bắn xong sau 1 giây vòng mới xuất hiện trở lại để nhìn rõ điểm bị bắn thủng trên màng trong suốt

Hình 2.3 Màn hình điều khiển AH bằng phần mềm Zilos.

Hình 2.4 Vòng tròn tiêu điểm

Vòng tròn đích

Kích thước lỗ

Hình 2.5 Vòng tròn tiêu điểm ngắm trên màng trong suốt.

+ Chọn thời gian xung và công suất cần thiết cho việc thao tác bắn laser Thời gian xung tối đa là 3000µs, công suất tối đa là 300mW Thông thường chọn thời gian xung là 300 µs và công suất là 300 mW (100%) để tác kích với các trường hợp màng trong suốt có độ dày trong khoảng 13-25µm Trong trường hợp màng trong suốt của phôi quá dày (> 25µm) hoặc khoang quanh phôi rộng hay phôi nhiều mảnh vỡ sát màng, để an toàn cho phôi, có thể tăng liều lượng xung lên tối đa là 500µs để bắn thủng nhanh hơn Trong trường hợp màng trong suốt mỏng (<13 µm) hoặc khoang quanh phôi hẹp, có thể giảm liều lượng xung xuống đến 200 µs để hạn chế tác động của nhiệt độ mà vẫn bắn thủng mục tiêu

- Thực hiện hỗ trợ phôi thoát màng: Trước chuyển phôi 30 phút, nhặt phôi chuẩn bị cho chuyển phôi vào đĩa AH, 01 phôi/ 1 giọt Chụp ảnh phôi bằng phần mềm Zilos trước khi AH Định vị phôi Điều chỉnh ốc vi cấp sao cho thấy rõ phôi Chỉnh đúng tiêu điểm cần bắn trên màng trong suốt của phôi Chú ý chọn lựa vị trí bắn tia laser ở nơi có khoang PVS (khoang quang noãn hay khoang quanh phôi bào- perivitelline space) rộng nhất hoặc vị trí

có nhiều mảnh vỡ (fragment) Bắn thủng màng trong suốt rộng 30 µm (đo bằng phần mềm Zilos) hoặc làm mỏng màng trong suốt 50% độ dày trên 1/4 chu vi màng (Hình 2.6, 2.7, 2.8, 2.9) Luôn đặt vòng tròn đích sao cho vòng tròn ngoài cùng không chạm vào phôi bào để khống chế tác động tỏa nhiệt có thể làm tổn thương phôi bào

Hình 2.6 Phôi ngày 2, bắn thủng lỗ 30µm.

Hình 2.7 Phôi ngày 2, làm mỏng màng 50% độ dày trên ¼ chu vi màng

Hình 2.8 Phôi ngày 3 (8 tế bào), bắn thủng lỗ 30µm.

Hình 2.9 Phôi ngày 3 (8 tế bào), làm mỏng 50% trên ¼ chu vi màng trong suốt.

- Đo độ dày màng trong suốt bằng phần mềm Zilos: Trước khi đục lỗ hoặc làm mỏng màng trong suốt, nhấn vào biểu tượng “image” trên màn hình để lưu giữ hình ảnh của từng phôi Sau khi AH, đo độ dày màng trong suốt trên ảnh lưu

Đoạn làm mỏng

Lỗ thủng

lại ở 4 điểm cách đều nhau trên màng (đơn vị đo: µm) (Hình 2.10) Lưu trữ trung bình cộng độ dày màng trong suốt của từng bệnh nhân mỗi nhóm.

Hình 2.10 Đo độ dày màng trong suốt phôi ngày 3 ở 4 vị trí cách đều nhau trên màng.

- Phôi sau khi thực hiện hỗ trợ phôi thoát màng được rửa qua môi trường IVF (Vitrolife- Thụy Điển) rồi nhặt các phôi từ đĩa AH sang đĩa chuẩn bị chuyển phôi, nuôi cấy tiếp trong tủ cấy Chuyển phôi sau khi thực hiện hỗ trợ phôi thoát màng ít nhất là 30 phút

2.2.3.5 Hỗ trợ hoàng thể sau chuyển phôi

Utrogestan đặt âm đạo 400mg/ngày x 14 ngày sau chuyển phôi Nếu có thai tiếp tục đặt đến hết 12 tuần sau chuyển phôi Các trường hợp có thai ra máu dưới 14 tuần tuổi thai tiêm thêm progesteron

2.2.3.6 Theo dõi bệnh nhân sau chuyển phôi

Xác định các trường hợp có thai sinh hóa, thai lâm sàng (Ghi lại số túi ối

và số túi ối có tim thai), thai tiến triển Ghi lại các trường hợp sảy, lưu, chửa ngoài tử cung, giảm thiểu, đẻ non, số trẻ sinh sống, trẻ chết chu sinh, cân nặng của trẻ lúc sinh

2.2.4 Các chỉ số, biến số nghiên cứu:

2.2.4.1 Các chỉ số về đặc điểm mẫu nghiên cứu: Các kỹ thuật chỉ định, tuổi,

thời gian vô sinh, nguyên nhân vô sinh, loại vô sinh (thứ phát, nguyên phát),

số chu kỳ IVF thất bại, đặc điểm kích thích buồng trứng, tuổi phôi tươi, số noãn sau chọc hút, số noãn thụ tinh, số phôi chuyển, số phôi rất tốt, độ dày màng trong suốt…

2.2.4.2 Các chỉ số về kết quả có thai: Tỷ lệ thai sinh hóa, tỷ lệ có thai lâm

sàng , tỷ lệ làm tổ, tỷ lệ thai tiến triển, tỷ lệ sinh sống, tỷ lệ thai hỏng, tỷ lệ đa thai, tỷ lệ thai đôi cùng trứng, cân nặng trẻ sơ sinh

2.2.5 Các tiêu chuẩn đánh giá trong nghiên cứu

- Đánh giá phôi tươi trước chuyển (Tiêu chuẩn đánh giá tại Trung tâm HTSS, Bệnh viện Phụ sản Trung Ương xem chi tiết ở phần Phụ lục): Dựa vào các chỉ tiêu chính là tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương (fragments), tốc độ phân chia của phôi và độ đồng đều của các tế bào, ngoài ra còn dựa vào một số chỉ

tiêu phụ như mật độ hạt trong bào tương phôi bào, sự phân chia đồng bộ của các phôi bào, tỷ lệ phôi bào đa nhân, sự có mặt của không bào, lưới nội bào : + Phôi ngày 2:

Độ 4 (phôi rất tốt): Có 4 tế bào, các tế bào đồng đều, không có mảnh

vỡ (fragments) hoặc tỷ lệ mảnh vỡ (fragments) < 10%, phân chia đồng bộ

Độ 3: Có 3- 5 tế bào, các tế bào không đồng đều hoặc tỷ lệ mảnh vỡ (fragments) > 10% và < 25%

Độ 2: Có tỷ lệ mảnh vỡ trên 25% hoặc bào tương của phôi có dạng hạt (chiết quang tối) hoặc phôi bào đa nhân hoặc có nhiều không bào Độ 1: Tỷ lệ mảnh vỡ > 50% hoặc 2 tế bào

Độ 2 : Có < 5 tế bào hoặc tỷ lệ mảnh vỡ trên 25%

Độ 1: Có < 4 tế bào hoặc tỷ lệ mảnh vỡ trên 50%

- Đánh giá phôi rã đông trước chuyển:

Rã đông phôi ngày 2, nuôi qua đêm thành phôi ngày 3:

Độ 4 (phôi rất tốt): Ngày 2 khi rã đông có 3-4 tế bào, ngày 3 có 7-8 tế bào, các tế bào đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ < 10%, còn nguyên vẹn, khi nuôi qua đêm phôi bào phân chia tiếp

Độ 3: Ngày 3 có 4-8 tế bào, tỷ lệ mảnh vỡ từ 10-25%, có thoái hoá < 25%, sau khi nuôi qua đêm có ít nhất một phôi bào phân chia, hoặc các phôi bào tương đối không đồng đều

Độ 2: Có phôi bào phân chia tiếp, thoái hoá > 25-50%

Độ 1: Không có phôi bào phân chia tiếp

- Ðánh giá độ dày niêm mạc tử cung: Đo bằng siêu âm đầu dò âm đạo trước chuyển phôi (đo vào ngày tiêm hCG), niêm mạc tử cung của các bệnh nhân trong nghiên cứu có độ dày trong khoảng 8-14mm

- Kỹ thuật chuyển phôi : Chuyển phôi bằng catheter Stylet (Pháp) dưới siêu âm đường bụng: kỹ thuật chuyển phôi đạt tiêu chuẩn khi chuyển phôi dễ: Cathéter sau chuyển phôi sạch, không nhầy máu, không sót phôi, không kẹp

cổ tử cung, không nong cổ tử cung

- Dấu hiệu để nhận biết AH thành công:

+ Đục lỗ thủng: Nhìn thấy dịch đi qua lỗ thủng từ ngoài vào và từ trong ra

Lớp màng trong của màng trong suốt đứt rời hoàn toàn.

+ Làm mỏng: Phần bị cắt rời khỏi màng trong suốt tan ra hoặc xẹp xuống

- Tỷ lệ thai sinh hóa*: số bệnh nhân có βhCG > 50IU/l/ số bệnh nhân có phôi chuyển nhưng không có túi ối

- Tỷ lệ có thai lâm sàng*: số bệnh nhân có túi ối có tim thai/ số bệnh nhân có phôi chuyển

- Tỷ lệ làm tổ*: số túi ối/ số phôi chuyển

- Tỷ lệ thai tiến triển* (delivery rate, ongoing pregnancy rate): số bệnh nhân mang thai từ 20 tuần trở lên/ số bệnh nhân có phôi chuyển

- Tỷ lệ sinh sống*: số bà mẹ đẻ con sống/ số có phôi chuyển

- Tỷ lệ thai hỏng*: số có thai lâm sàng < 20 tuần (sảy thai, thai lưu, chửa ngoài tử cung) và đẻ non (thai > 20 tuần đến < 37 tuần, đẻ ra con sống hoặc chết chu sinh)/số có thai lâm sàng hoặc số có phôi chuyển

(*) Các tỷ lệ được tính dựa trên các định nghĩa của Ủy ban Quốc tế giám sát Kỹ thuật Hỗ trợ sinh sản (ICMART) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) sửa đổi danh mục các thuật ngữ ART, 2009 [171]

2.2.6 Kỹ thuật thu thập số liệu

Các số liệu về mẫu nghiên cứu được nhập trực tiếp và liên tục vào chương trình SPSS và phiếu thu thập số liệu, nhật ký lab thụ tinh ống nghiệm,

sổ theo dõi bệnh nhân

2.2.7 Xử lý và phân tích số liệu

- Các số liệu được thu thập và xử lý trên chương trình SPSS 16.0 và Epi Info 7.0 Để so sánh hai biến không liên tục, Chi-square test và Fisher’s exact test được sử dụng Để so sánh các giá trị trung bình từng đôi một giữa ba nhóm nghiên cứu của mỗi đối tượng, chúng tôi dùng kết quả của kiểm định Anova Các số liệu về kết quả thai nghén được trình bày thêm kết quả về mối tương quan (tỷ suất chênh – OR, 95% CI)

2.2.8 Các biện pháp khống chế sai số

- Giám sát các quá trình thu thập thông tin chặt chẽ

- Các sai số do nạp số liệu được khống chế bằng cách kiểm tra chéo khi kết hợp số liệu Các kiểm định các sai số của số liệu của mỗi biến số được kiểm tra và hiệu chỉnh ngay sau khi nạp số liệu cuối mỗi ngày và trong quá trình phân tích số liệu

2.3 Đạo đức nghiên cứu