Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21 1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán ung thư phổi

Luận văn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ ĐÌNH CHẮC

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT

CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS LÊ QUANG HUẤN

2 GS.TSKH NGUYỄN TÀI LƯƠNG

THÁI NGUYÊN - 2013

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới PGS.TS Lê Quang Huấn – Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; GS.TSKH Nguyễn Tài Lương, là những người thầy đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Phòng Quản lý Sau đại học và Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên

Tôi cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ quý báu của tất cả các anh, chị em và các bạn phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Cuối cùng, tôi muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả người thân trong gia đình đã luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận án này!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

NCS Lê Đình Chắc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả là đồng tác giả với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần cũng

đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào khác

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

Tác giả

Lê Đình Chắc

MỤC LỤC Mục Tên chương, phần, mục và tiểu mục Trang

Lời cảm ơn iLời cam đoan ii

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nguồn gốc và đặc điểm ung thư 4

1.2 Kháng nguyên CYFRA21-1 12

1.3.1 Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu và

thực tiễn hiện nay

21

1.3.2 Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 29

1.4 Công nghệ phage display 30

1.4.2 Ứng dụng của kháng thể phage-scFv trong chẩn đoán và

điều trị

31

2.2.3 Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp 45

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 553.1 Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng

nguyên CYFRA21-1

55

3.1.1 Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi 55 3.1.2 Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-1 57 3.1.3 Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 58 3.1.4 Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 62

3.2 Biểu hiện và thu kháng nguyên CYFRA21-1 64 3.2.1 Nhân bản vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 64 3.2.2 Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên

CYFRA21-1

66

3.2.3 Thiết kế vector biểu hiện pET-21a(+)/Cyfra21-1 67

3.2.4 Biểu hiện protein CYFRA21-1 tái tổ hợp 72

3.2.6 Kết quả phân tích khối phổ protein tái tổ hợp 75

3.3 Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-1 77

3.4 Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 81 3.4.1 Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương và lách của gà đã

được gây miễn dịch

81

3.4.2 Nhân bản đoạn gen mã hóa vùng biến đổi của kháng thể gà

đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1

3.5 Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu

được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1

91

3.6 Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh

phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

97

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 101

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

102

CDR Complement Determining Region

CLL Chronic lymphocytic leukemia

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FcR Frament cristallisable Recetor

FDA Food and Drug Administration

HCDM Human Cell Differentiation Molecules

HLDA Human Leukocyte Differentiation Antigens

HRP horseradish peroxidase

HT Huyết thanh

IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside

NES Neuron specific enolase

NRE Negative Regulatory Element

NSCLC Non small cell lung carcinoma

PASI Psoriasis Area and Severity Index

PBS Phosphate buffered saline

RT-PCR Revert Transcriptase - Polymerase Chain Reaction

scFv Single chain variable fragment

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SCLC Small cell lung carcinoma

TPS Tissue polypeptide specific antigen

VH immunoglobulin heavy chain variable region

VL immunoglobulin light chain variable region

X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- β - D-galactopyranoside

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.3 Cấu trúc gen mã hóa Cytokeratin 19 17Hình 1.4 Vị trí CYFRA21-1 trên Cytokeratin 19 18Hình 1.5 Cấu trúc cơ bản của một phân tử Ig và các mảnh

Hình 3.4 Trình tự nucleotide của cDNA và amino acid suy diễn

của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1

62

Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của đoạn

gen mã hóa CYFRA21-1 thu được với trình tự amino acid của kháng nguyên CYFRA21-1 đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu quốc tế mang mã số K1C19-HUMAN P08727

63

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 65Hình 3.7 Trình tự nucleotide của cDNA và amino acid suy diễn 66

Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector pET-21a(+) với

enzym Nde I và Xho I

69

Hình 3.10 Sơ đồ quá trình gắn kết và chọn dòng vector

pET-21a(+)/Cyfra21-1

70

Hình 3.11 Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của

gen Cyfra 21-1 sau khi gắn vào vector biểu hiện

Hình 3.14 Kết quả phân tích khối phổ của sản phẩm gen biểu hiện

trong E.coli sau khi cảm ứng với IPTG

75

Hình 3.15 Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA

sau khi gây miễn dịch lần thứ 3

78

Hình 3.16 Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA

trước khi lấy tuỷ xương và lách

80

Hình 3.17 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR 82

Hình 3.19 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nối ghép VH-VL

tạo scFv

84

Hình 3.20 Kết quả chọn các dòng mang kháng thể đặc hiệu epitope

kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật ELISA

88

Hình 3.21 Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của

kháng thể scFv đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1

89

Hình 3.22 Biểu đồ đánh giá liên kết của dòng phage 10 với huyết

thanh UTP và huyết thanh bình thường

90

Hình 3.23 Sơ đồ mồi, mẫu dò và đoạn DNA được khuếch đại trong

phản ứng định lượng kháng nguyên CYFRA21-1

Hình 3.26 Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết

thanh do Bệnh Viện Quân Y 108 cung cấp

96

Hình 3.27 Kết quả định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong các

mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

97

Bảng 3.1 Kết quả thực tế nhận được sau khi phân tích khối phổ 76

Bảng 3.2 Kết quả đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau khi

gây miễn dịch lần thứ 3

78

Bảng 3.3 Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA

trước khi lấy tuỷ xương và lách

79

Bảng 3.4 Kết quả sàng lọc, lựa chọn các dòng biểu lộ kháng thể đặc

hiệu quyết định kháng nguyên CYFRA21-1

88

Bảng 3.5 Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết

thanh, kháng nguyên

95

Bảng 3.6 Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm

do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

98

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ung thư phổi (UTP) là một trong những căn bệnh hiểm nghèo do sự tăng sinh không bình thường của tế bào, thường gặp ở nam giới, chủ yếu là lứa tuổi 50-70, đặc biệt liên quan đến những người đã hoặc đang hút thuốc lá Đồng thời, UTP cũng là căn bệnh có tỉ lệ tử vong lớn thường gặp ở người Vì vậy, việc phát hiện sớm UTP có ý nghĩa sống còn với bệnh nhân

Thực tế, trong y học đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để chẩn đoán UTP (sinh thiết phổi, nội soi phổi, thử đờm, chọc nước màng phổi, chụp quang tuyến cắt lớp …) và một số phương pháp điều trị UTP (hoá trị liệu, phẫu thuật, xạ trị …) [2] Tuy nhiên, khi phát hiện UTP thì thường đã muộn hoặc quá muộn, vì một số căn bệnh khác (viêm phế quản, viêm phổi, lao, …) cũng có những triệu chứng tương tự UTP Do vậy, việc tìm kiếm các phương pháp hữu hiệu có độ chính xác cao để chẩn đoán sớm UTP đang là vấn đề cần thiết và cấp bách của các nhà khoa học, y học trong và ngoài nước

Nghiên cứu tế bào ung thư cũng như nguồn gốc và sự phát triển của tế bào ung thư, người ta nhận thấy ung thư có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện hàm lượng các kháng nguyên đặc trưng ung thư trong máu, nước mô, huyết thanh [12], [21], [22], [85], [86], [95] Điều này đã mở ra hướng nghiên cứu mới trong chẩn đoán và điều trị ung thư trên thế giới và trong nước

Một trong những hướng nghiên cứu đó là phương pháp sử dụng các chỉ thị kháng nguyên để xác định, chẩn đoán bệnh và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên đích để định hướng điều trị ung thư nói chung, UTP nói riêng [51], [58], [88], [102] Phương pháp này bắt đầu được nghiên cứu sâu hơn vào những năm cuối của thế kỷ trước Đến nay, vấn đề này đang được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới và trong nước Phương pháp sử dụng chỉ thị kháng nguyên, tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng

nguyên không chỉ áp dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư mà còn được ứng dụng mạnh mẽ trong chẩn đoán và điều trị nhiều bệnh nan y khác như AIDS, viêm gan B …

Hiện nay, nhiều chỉ thị kháng nguyên ung thư được biết đến và có thể

sử dụng để phát hiện ung thư như: CEA, NES, CA125, CYFRA21-1, 2/neu … [38], [47], [52], [66], [73] trong đó, kháng nguyên CYFRA21-1 là một chỉ thị điển hình cho bệnh UTP dạng không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinoma – NSCLC) do sự tăng hàm lượng CYFRA21-1 nhanh chóng trong dịch cơ thể khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh bất thường [14], [16], [24], [25], [39] Vì vậy, nếu phát hiện sớm được sự tăng hàm lượng CYFRA21-1 trong dịch cơ thể sẽ góp phần chẩn đoán sớm được UTP Do đó, kháng nguyên CYFRA21-1 có thể được sử dụng như là một chỉ thị đặc hiệu

HER-để chẩn đoán sớm, từ đó định hướng điều trị hiệu quả UTP dạng NSCLC

Trên thế giới, hiện nay một số công trình nghiên cứu của Suzuki và cộng sự (2007) [89]; Tomita và cộng sự (2010) [94]; Yang và cộng sự (2012) [107]… đã cho thấy, hàm lượng CYFRA21-1 trong cơ thể luôn được duy trì vào khoảng 3,3 ng/ml, tuy nhiên hàm lượng này tăng đột biến khi có sự tăng sinh không bình thường của tế bào biểu mô phế quản

Mặt khác, lượng kháng thể kháng CYFRA21-1 được sản xuất ra chưa

nhiều và chưa đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán, điều trị bệnh Do đó, kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 được một số công ty thương mại hóa trên thị trường với giá thành tương đối cao, điều này đã gây ra không ít khó khăn cho người sử dụng

Tại Việt Nam, đây là vấn đề còn chưa được nghiên cứu nhiều, hiện tại các nhà khoa học Việt Nam vẫn đang tích cực trên đường nghiên cứu về kháng thể tái tổ hợp phục vụ cho nhu cầu chẩn đoán và điều trị bệnh

Do vậy, việc nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 trong UTP là một trong những hướng nghiên cứu mới

nhằm chẩn đoán, theo dõi và định hướng điều trị kịp thời bệnh UTP dạng NSCLC, góp phần vào những thành tựu đáng kể trong y học và sinh học

Từ những lý do trên, chúng tôi chọn thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 nhằm phát triển KIT chuẩn đoán ung thư phổi”

2 Mục tiêu của đề tài

Tạo được kháng thể scFv kháng kháng nguyên CYFRA21-1 biểu lộ trên phage để phát triển KIT chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC

3 Nội dung nghiên cứu

- Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 từ bệnh phẩm UTP

- Thu nhận, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1

- Gây miễn dịch động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên tái tổ hợp thu nhận được

- Tạo dòng phage biểu lộ kháng thể scFv kháng CYFRA21-1

- Sàng lọc kháng thể scFv biểu lộ trên phage kháng CYFRA21-1

- Sử dụng kháng thể tái tổ hợp thu được để bước đầu xây dựng KIT chẩn đoán UTP

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc và đặc điểm ung thư

Ung thư là một thuật ngữ dùng để chỉ hơn 200 loại bệnh khác nhau gây

ra bởi sự tăng sinh quá mức của tế bào một cách không bình thường Sự tăng sinh này không tuân theo mọi cơ chế kiểm soát của cơ thể Đây là kết quả của hàng loạt các biến đổi bất thường trong cơ chế sinh sản của tế bào

Căn cứ vào tính chất giải phẫu bệnh hoặc các cơ quan bị tổn thương, hoặc có thể dựa vào sự khởi phát của tế bào và vị trí của tế bào … người ta phân loại ung thư theo nhiều dạng khác nhau Nếu căn cứ vào loại tế bào phát sinh, ung thư có thể chia thành các dạng như: ung thư biểu mô, có nguồn gốc

từ tế bào biểu mô; ung thư mô liên kết, có nguồn gốc từ các tế bào ở mô liên kết … Tuy nhiên, tất cả các tế bào ung thư trong một khối u (cả tế bào di căn) thường có nguồn gốc chung là xuất phát từ một tế bào ban đầu [2], [3], [8]

Từ đó, việc xác định, nhận biết sớm và chính xác về ung thư là vô cùng cần thiết và quan trọng, bởi khi phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm là một trong những điều kiện thuận lợi để điều trị kịp thời cho những bệnh nhân không may mắc phải căn bệnh nguy hiểm này

1.1.1 Nguồn gốc tế bào ung thư

Sự phân chia tế bào là một quá trình sinh lý xảy ra trong những điều kiện nhất định tại hầu hết các mô trong cơ thể sinh vật đa bào nói chung, cơ thể người nói riêng, giúp cho cơ thể tồn tại, sinh trưởng và phát triển Bình thường, sự cân bằng giữa tốc độ của quá trình tăng sinh tế bào được điều hoà một cách chặt chẽ và chính xác, đảm bảo cho tính toàn vẹn của mô và các cơ quan trong cơ thể Khi cơ chế này bị rối loạn sẽ xảy ra hiện tượng tế bào tránh được sự chết theo chương trình (apoptosis) và phân chia không có sự kiểm soát là nguyên nhân tạo thành các khối u lành tính hoặc ác tính (ung thư) Khối u lành tính sẽ không có hiện tượng lan tràn đến những vị trí khác nhau

trong cơ thể hoặc không có sự xâm lấn đến các mô xung quanh, vì vậy u lành tính hiếm khi ảnh hưởng đến tính mạng bệnh nhân trừ khi chúng chèn ép các cấu trúc sống còn trong cơ thể

Ngược lại, các khối u ác tính thì có thể xâm lấn vào các cơ quan khác nhau trong cơ thể, lan đến những nơi xa hơn trong cơ thể (di căn), do đó sẽ đe dọa trực tiếp đến tính mạng của con người [2], [3], [8] Vì vậy, di căn có thể được hiểu là yếu tố quan trọng nhất về tính chất ác tính của ung thư

Hai yếu tố quan trọng nhất trong hệ gen dẫn đến ung thư là tích luỹ các đột biến soma và tăng cường tính bất ổn di truyền Các đột biến này rất nhạy với sự tăng sinh tế bào, nhất là khi chúng kết hợp với nhau thì tế bào có khả năng tăng sinh một cách không thể kiểm soát được [2]

Tính bất ổn di truyền phản ánh số lượng gen trong tế bào ung thư, đó có thể là kết quả của sự nhân lên hay mất đi hoặc sự di chuyển vị trí của DNA trên nhiễm sắc thể Khi tính bất ổn ở mức độ nhiễm sắc thể có thể tác động đến hệ thống điều khiển sự phân chia tế bào

Như vậy, sinh ung thư là quá trình rối loạn tốc độ phân chia tế bào do tổn thương của DNA, do đó ung thư là một bệnh lý về gen Thông thường một tế bào bình thường để chuyển sang tế bào ung thư phải qua ít nhất một vài đột biến tại một số gen nhất định Quá trình này liên quan đến cả hệ thống gen tiền ung thư và gen át chế ung thư [2], [3], [8]

Gen tiền ung thư mã hoá cho nhóm protein tham gia vào quá trình hình thành những chất truyền tin (messenger) trong quá trình dẫn truyền tín hiệu tế bào Các chất truyền tin này sẽ truyền tín hiệu "tiến hành phân bào" tới chính

tế bào đó hay những thế bào khác Do vậy, khi bị đột biến, các gen tiền ung thư sẽ biểu hiện quá mức (overexpression) làm các tế bào tăng sinh thừa thãi, lúc này trở thành những gen ung thư (cancer genes) Tuy nhiên, các gen ung thư thực chất là dạng đột biến về trình tự hoặc mức độ biểu hiện của các gen cần thiết đối với quá trình phát triển, sửa chữa và ổn định nội môi của cơ thể,

do đó không thể loại bỏ các gen này khỏi hệ gen nhằm làm giảm khả năng ung thư [2], [3]

Ngược lại với gen ung thư, các gen át chế ung thư (epistasis cencer g ens) mã hóa cho các chất truyền tin hóa học nhằm giảm hoặc ngừng quá trình phân chia của tế bào khi phát hiện thấy có sai hỏng về DNA Đó là các enzym đặc biệt có thể phát hiện các đột biến hay tổn thương DNA và đồng thời kích hoạt quá trình phiên mã của hệ thống enzym sửa chữa DNA Điều này nhằm hạn chế tối đa khả năng các sai hỏng về DNA được truyền cho thế hệ tế bào

kế tiếp Thông thường, các gen áp chế ung thư sẽ được kích hoạt khi có tổn thương DNA xảy ra, nhưng một số đột biến có thể bất hoạt protein áp chế ung thư hoặc làm mất khả năng truyền thông tin của nó Điều này làm gián đoạn hoặc dừng cơ chế sửa chữa DNA, khi đó những tổn thương DNA được tích luỹ lại dần dần hình thành ung thư [2], [3]

1.1.2 Đặc điểm tế bào ung thư

Tất cả các tế bào ung thư ác tính đều không có tính biệt hoá, điều này được thể hiện qua sự khác nhau giữa chúng với tế bào nguồn gốc ban đầu sinh

ra chúng, thậm chí giữa các tế bào ác tính cũng có hình ảnh khác biệt nhau [2], [3], [8]; lúc này, các tế bào ác tính biểu hiện một số đặc điểm sau:

Nhân của tế bào ác tính thường khác nhau về hình dạng và kích thước Hạch nhân ở tế bào u ác tính thường nổi rõ và có nhiều hạch nhân

Tế bào u ác tính có nhiều dạng phân chia bất thường, lượng tế bào chất rất biến đổi

Nhiễm sắc thể thường bị đột biến cả về số lượng và cấu trúc [2], [3]

Từ đó cho thấy các tính chất đặc trưng của tế bào ác tính là:

Tránh được sự chết theo chương trình (apoptosis)

Khả năng phát triển vô hạn (bất tử)

Tự cung cấp các yếu tố phát triển

Không nhạy cảm với các yếu tố chống tăng sinh

Tốc độ phân bào gia tăng

Thay đổi khả năng biệt hoá tế bào

Không có khả năng ức chế, tiếp xúc

Khả năng di căn đến các mô khác nhau trong cơ thể

Khả năng tăng sinh mạch máu [2], [3]

Tuy nhiên lúc mới hình thành, các tế bào khối u thường không có tất cả các đặc điểm trên cùng một lúc, nhưng thế hệ sau của nó sẽ được chọn lọc để

có đặc tính nói trên Đó chính là quá trình chọn lọc theo dòng của tế bào ung thư, đây cũng là một trong những nguyên nhân gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị ung thư

1.1.3 Ung thư phổi

UTP là một trong những căn bệnh hiểm nghèo gây chết người trong hơn 200 căn bệnh về sự tăng sinh không bình thường của tế bào Theo nghiên cứu của tổ chức ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer - IARC), đa số UTP xuất phát từ lớp biểu mô phế quản, do đó UTP còn được gọi là ung thư biểu mô phế quản - phổi nguyên phát, rất hiếm khi phát triển từ biểu mô phế nang [2], [7], [8]

UTP thường là một khối u rắn chắc, khi phát hiện được thì khối u đã có kích thước từ 2-10 cm hoặc có thể lớn hơn Mặt ngoài của khối u thường gồ

gề, nhiều múi, nhăn nhúm; mặt cắt của khối u thường đồng nhất và có màu trắng giống như tổ chức não [2], [3], [7], [8]

Một trong những nguyên nhân để phát hiện UTP muộn là do giai đoạn tiền bệnh, UTP hầu như không có bất cứ dấu hiệu, triệu chứng nào biểu hiện, đây cũng chính là đặc điểm phổ biến của tất cả các loại ung thư và cũng chính

là nguyên nhân để ung thư trở nên khó chẩn đoán được sớm

Nếu sử dụng các phương pháp chẩn đoán thông thường thì việc phát hiện UTP ở giai đoạn sớm là rất khó khăn, làm hạn chế hiệu quả điều trị Chính vì vậy, các nhà khoa học hiện nay đang nỗ lực tìm kiếm và tạo ra các phương pháp chẩn đoán phân tử nhằm đem lại kết quả vừa nhanh vừa chính xác cho căn bệnh nguy hiểm này

Những người mắc UTP thường xuất hiện các triệu chứng sau:

Ho không khỏi và ngày càng nặng hơn

Thường xuyên thấy đau ngực

Ho ra máu

Khó thở, ngạt mũi, khàn giọng

Viêm phổi và viêm phế quản tái đi tái lại

Phù nề vùng mặt và cổ

Mất cảm giác ngon miệng hoặc giảm cân, mệt mỏi…

Tuy nhiên, các triệu chứng này cũng có thể xuất hiện ở các bệnh khác

về phổi, vì vậy muốn khẳng định chắc chắn bệnh nhân có mắc UTP hay không, cần phải thực hiện các chẩn đoán y học đáng tin cậy [2], [3], [7], [8]

1.1.3.1 Nguyên nhân ung thư phổi

Hiện nay, người ta chưa biết rõ nguyên nhân chính xác gây ra UTP Tuy nhiên, nhiều công trình nghiên cứu đã xác định những yếu tố thuận lợi gắn liền với quá trình phát sinh UTP là: khói thuốc lá, thuốc lào; các tác nhân vật lý, hóa học; yếu tố liên quan đến di truyền; ô nhiễm môi trường và một số các yếu tố khác

Khói thuốc lá, thuốc lào

Trong khói thuốc lá có chứa các chất hydrocacbua thơm nhiều vòng, trong số đó độc nhất là chất 3 - 4 benzopyrene với hàm lượng 0,5 microgam trong một điếu thuốc và một số chất khác như nitrosamine, benzanthracene… Đây là những chất có liên quan đến sự phát sinh UTP Mặt khác, các chuyên

viên về UTP cũng đã kết luận: 80-90% căn nguyên UTP bắt đầu từ nghiện hút thuốc lá [2], [7], [97]

Tác nhân vật lý, hóa học

Những người làm việc tiếp xúc thường xuyên với các chất phóng xạ, nicken, cromat, amian, hoặc một số các hóa chất như: asbestos, radon, các chất sinh ra do chưng cất hắc ín … là những chất thường dễ gây nên ung thư Ngoài ra, người ta đã xác định, những người công nhân làm việc trong công nghiệp nicken có tỷ lệ chết do ung thư phế quản là 26%, nhiều hơn 9 lần so với các công nhân làm việc trong các khu vực khác [7], [97]

Liệu pháp xạ trị trong việc điều trị các bệnh ác tính khác (bệnh Hodgkin hoặc ung thư vú …) có nguy cơ làm tăng tỉ lệ mắc bệnh UTP

Yếu tố liên quan đến di truyền

Hệ thống enzym chuyển hóa sinh ung thư như arylhydrocardon hydroxylase, 4-dedrisoquine hydroxylase, và glutathiones-transferase (được xác định là có tính di truyền), có thể có liên quan đến tính nhạy cảm với UTP trong các gia đình và các cá thể khác nhau [2], [3], [8], [97]

Ô nhiễm môi trường

Việc tiếp xúc với các chất trong không khí bị ô nhiễm từ môi trường cũng là một trong những thủ phạm gây nên UTP Nhiều thống kê cho thấy, UTP có tỉ lệ cao ở các thành phố công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp hóa chất so với nông thôn Nhiều nghiên cứu cho thấy benzopyren là chất có tác dụng gây ung thư lớn nhất thường có nhiều trong không khí ở những nơi có các nhà máy công nghiệp phát triển Các chất trên kích thích và gây

ra những phản ứng của niêm mạc đường hô hấp Đầu tiên, quá trình tiết chất nhầy bị chậm lại, sau đó lớp biểu mô bị bong ra và lại được tái sinh

Những chu kỳ liên tiếp như vậy kích thích sự tăng sản của các tế bào đáy

và dị sản của các tế bào biểu mô, dẫn đến sự hình thành và phát triển của các tế bào ung thư [2], [8]

Các yếu tố khác

Một phát hiện mới đây trên UTP của khỉ là do một loại virus gây ra Do

đó, một câu hỏi đặt ra là liệu UTP ở người có do loại virus này gây ra hay không? Điều này các nhà khoa học vẫn đang tìm câu trả lời Ngoài ra UTP còn có liên quan đến quá trình tổn thương xơ, sẹo của phổi và phế quản [2], [8], [97]

1.1.3.2 Thực trạng ung thư phổi

Trong thực tế, tỉ lệ người mắc UTP trên thế giới là khá cao, đặc biệt là các nước đông nam Á trong đó có Việt Nam Đa số UTP xuất hiện ở những người đã hoặc đang hút thuốc lá (80%) và khoảng 5% là do hậu quả của sự tiếp xúc thụ động với khói thuốc lá Liều lượng sinh ung thư tùy thuộc vào mức độ tiếp xúc với thuốc lá nặng hay nhẹ, vào số năm hút thuốc, số điếu hút trong ngày và phần nhựa có trong điếu thuốc [2], [3], [7], [8]

Hiện nay, trên thế giới, tỷ lệ mắc UTP trong tổng số các bệnh ung thư khoảng 13%, nhưng đây lại là căn bệnh gây tử vong cao nhất trong số các bệnh ung thư, chiếm đến 31% số người chết hàng năm do căn bệnh nan y này [2], [8]

Ở nước ta, UTP là một căn bệnh khá phổ biến Những thống kê gần đây của 4 bệnh viện khu vực Hà Nội (bệnh viện Lao và bệnh Phổi, bệnh viện Trung ương Quân đội 108, bệnh viện Quân đội 103, bệnh viện Việt - Đức) đã phẫu thuật 879 ca UTP Từ đó có thể thấy, tỷ lệ người mắc UTP ở nước ta là rất cao, điều này có thể liên quan đến không ít người có thói quen sử dụng

thuốc lá hoặc sử dụng các chất hóa học không đúng cách, đặc biệt là sự ô nhiễm môi trường đã tạo điều kiện cho UTP ngày càng phát triển Do vậy, việc tìm ra phương pháp chẩn đoán sớm UTP là rất cần thiết và cấp bách nhằm đem lại hiệu quả cao trong điều trị bệnh

1.1.3.3 Phân loại ung thư phổi

Tuỳ thuộc vào hình dạng tế bào dưới kính hiển vi, UTP được chia làm

hai loại chính: UTP tế bào nhỏ (small cell lung carcinoma - SCLC) và UTP không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinoma - NSCLC) Mỗi loại

ung thư phát triển và lan theo những cách khác nhau

UTP tế bào nhỏ (SCLC) chiếm khoảng 20% trong số các bệnh UTP, loại này thường phát triển ở phế quản - phổi (không ở ngoại vi phổi) Mặc dù

tế bào ung thư là những tế bào nhỏ, nhưng chúng phát triển rất nhanh tạo thành những khối u lớn, lan rất xa trước khi có triệu chứng lâm sàng, nhiều trường hợp khi phát hiện được thì đã không còn khả năng phẫu thuật, tử vong nhanh Đây là loại ung thư có quan hệ mật thiết nhất đối với thuốc lá và cũng

là loại ung thư ác tính nhất

UTP dạng không phải tế bào nhỏ (NSCLC) chiếm khoảng 80%, thường phát triển, lây lan chậm và được chia làm ba loại chủ yếu sau:

Ung thư tế bào tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến

nhầy trong thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 35-40% các loại UTP Đây là dạng UTP phổ biến nhất ở phụ nữ và những người ít hút thuốc

Ung thư tế bào sừng (squamous-cell carcinoma; SCC): hay xuất hiện ở

phế quản lớn và làm chít hẹp lòng phế quản Đây là dạng UTP phổ biến nhất

ở nam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% các loại UTP

Ung thư tế bào lớn (large cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt

phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% các loại UTP [2], [3], [7], [8], [97]

1.2 Kháng nguyên CYFRA21-1

Kháng nguyên là những phân tử kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể, trong đó có việc sản xuất kháng thể Thông thường kháng nguyên là một protein hay một polysaccharide, nhưng cũng có thể là một loại phân tử nào đó mang các hapten nhỏ và gắn với một protein chuyên chở

Kháng nguyên liên hệ khối u là các kháng nguyên được trình diện bởi các tế bào khối u và ít có ở tế bào thường, chủ yếu là kết quả của đột biến đặc

hiệu cho khối u

1.2.1 Cytokeratin

Cytokeratin, thuộc họ sợi trung gian trong bộ xương tế bào và có quan

hệ gần gũi với quá trình phát sinh tế bào ung thư, do đó thường được sử dụng như những công cụ hữu ích đặc biệt trong chẩn đoán ung thư [21], [22] Chính vì tầm quan trọng đó, các nhà ung thư học hiện nay đang tích cực nghiên cứu kỹ hơn về cấu trúc và vai trò của các Cytokeratin trong việc chống lại sự hoành hành của căn bệnh nguy hiểm này

Trong tế bào nhân thực, bộ xương tế bào cơ bản được tạo thành từ 3 loại cấu trúc sợi khác nhau, phân biệt nhau về hình thái, các vi sợi (microfilaments), sợi trung gian (intermidiate filaments) và các vi ống (microtubules), là các yếu tố then chốt trong một vài quá trình của tế bào, như phân bào, vận động và gắn kết tế bào với tế bào … [22], [98]

Từ kết quả nghiên cứu của một số nhà khoa học trên thế giới cho thấy, trong tế bào người có khoảng 54 gen mã hóa cho các keratin, trong đó có tới

26 gen mã hóa cho các keratin tham gia vào sự dẫn truyền các tín hiệu nội bào nhằm đem lại trạng thái cân bằng trong các hoạt động sống của tế bào và chu

kỳ tế bào [12], [49], [80]

Một số kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy, các keratin có liên quan đến ung thư biểu mô chủ yếu là keratin 8 (K8), keratin 18 (K18), keratin 19

(K19), keratin 20 (K20), … trong đó K8 và K18 có liên quan hầu hết tới các ung thư nội tạng trong cơ thể người, ngoại trừ một số ung thư biểu mô tế bào vảy [49], [80]

K19 có liên quan trực tiếp đến sự tăng sinh của tế bào biểu mô, đặc biệt

là ung thư biểu mô tế bào vảy, K20 có liên quan đến ung thư các nội quan và chưa được nghiên cứu nhiều Điều đặc biệt là các keratin này hiếm khi độc lập biểu hiện đặc thù cho từng loại tế bào ung thư nó liên quan, thông thường khi xuất hiện một loại tế bào ung thư nào đó thì nồng độ, hàm lượng của một số keratin tăng lên [80], [91] Chẳng hạn, khi xuất hiện bất thường của K8, K18, K19 … sẽ liên quan tới các tế bào biểu mô của cơ quan hô hấp; hoặc sự xuất hiện đột biến của keratin 1 (K1) và keratin 9 (K9) sẽ liên quan tới rối loạn của tế bào da lòng bàn tay; những biến đổi bất thường của keratin 3 (K3) và keratin 12 (K12) sẽ liên quan tới tế bào màng giác mạc, … [21], [42], [49], [80] Điều này chứng tỏ sự hoạt động của các tổ chức tế bào rất chặt chẽ và có tính thống nhất cao Do đó, sự can thiệp các tác nhân từ bên ngoài như hóa chất, thuốc kháng sinh, … vào tế bào một cách hiệu nghiệm trong điều trị ung thư là thực sự khó khăn Tuy nhiên, hàm lượng của các keratin biểu hiện không giống nhau khi xuất hiện các loại tế bào ung thư khác nhau, đây chính là căn cứ tốt để phân loại, xác định ung thư thông qua sự biểu hiện của các chỉ thị keratin

Trong cấu trúc của các họ sợi protein nói trên thì họ protein sợi trung gian (Hình 1.1) là phức tạp nhất, bao gồm vài trăm thành viên khác nhau Dựa trên những đặc điểm về sự tương đồng trình tự các amino acid và cách biểu hiện, người ta phân chia chúng thành một số nhóm khác nhau

Sợi trung gian nhóm I và II tạo thành Cytokeratin (theo thứ tự là các protein mang tính acid và tính base) Sợi trung gian nhóm III gồm các protein acid dạng sợi desmin, vimentin và glial Sợi trung gian nhóm IV bao gồm các sợi

Hình 1.1 Mô hình bộ khung xương tế bào [2]

protein thần kinh (NF-L, NF-M và NF-H) và internexin Sợi trung gian nhóm V được gọi là các lamin nhân, chỉ có ở nhân tế bào Các protein keratin còn lại đôi khi được xếp vào nhóm VI, gồm có felensin và phakinin [21], [34], [98] Các Cytokeratin biểu mô (sợi trung gian nhóm I và II) có quan hệ họ hàng gần gũi

về mặt sinh hoá và miễn dịch của tế bào

Ngày nay, có hơn 20 loại Cytokeratin biểu mô khác nhau đã được biết đến và được chia thành các nhóm I và II dựa vào các trình tự tương đồng của các amino acid Các Cytokeratin từ 1-8 tạo thành nhóm II (53-68 kDa gồm các protein trung tính đến base) Các Cytokeratin 9-20 tạo thành nhóm I (40-

56 kDa gồm các protein acid), trong đó các Cytokeratin 8, 18, 19 có nhiều nhất ở các tế bào biểu mô đơn giản và có vai trò quan trọng đối với sự ổn định

và tính toàn vẹn của tế bào biểu mô [21], [42], [76], [98]

Khi giải phóng khỏi các tế bào đang tăng sinh hoặc chết theo chương trình, nồng độ, hàm lượng các Cytokeratin xuất hiện có sự khác biệt nhau, điều này là căn cứ để xác định Cytokeratin được xem như là các chỉ thị hữu ích cho khối u biểu mô ác tính, phản ánh rõ nét hoạt động của tế bào Các chị thị này xuất hiện đặc trưng cho các Cytokeratin nhất định và sự giải

phóng tiểu đơn vị của chúng diễn ra tùy theo dạng ung thư mà nó liên quan [21], [34], [76]

1.2.2 Cấu trúc của Cytokeratin

Các protein Cytokeratin có cấu trúc đặc trưng chứa 3 vùng quan trọng (vùng đầu N, đầu C không cuộn gập và vùng trung tâm cuộn gập) [21], [42], [98] Phần cuộn gập ở vùng trung tâm (chủ yếu là cấu trúc xoắn alpha) tạo thành các trình tự bảo thủ gồm 300-320 amino acid và được phân chia thành 4 vùng khác nhau đó là 1A, 1B, 2A và 2B (Hình 1.2) Thành phần amino acid của các đoạn gập cuộn dường như ít thay đổi về kích thước và chứa các trình tự amino acid lặp lại ở phần dư Đồng thời các đoạn này tách biệt nhau nhờ các vùng liên kết ngắn hơn cũng ít thay đổi là L1, L1-2 và L2 [76], [98]

Hình 1.2 Mô tả cấu trúc của Cytokeratin [76]

1.2.3 Biểu hiện của Cytokeratin

Cytokeratin được biểu hiện với các mức độ khác nhau ở các dạng tế bào biểu mô tùy theo sự phát triển và biệt hóa của các mô Trong suốt quá trình biến đổi của các tế bào từ bình thường thành các tế bào ác tính (tế bào ung thư) hình thái Cytokeratin thường không thay đổi Đặc tính này là cơ

sở để các Cytokeratin được ứng dụng như các chỉ thị khối u Trong cấu trúc của các Cytokeratin, những biến đổi sau dịch mã của các vùng ở trung tâm rất hiếm thấy, thường chỉ xuất hiện những biến đổi xảy ra tại các vùng chứa đầu -NH2 và -COOH, bao gồm sự phosphoryl hoá, glycosyl hoá và sự

chuyển glutamin hóa Những biến đổi này chi phối các hoạt động hoá sinh của các sợi, dẫn đến tính tan tăng lên và gây ra sự sắp xếp lại các sợi [42], [105], [108]

Trong lúc giải phóng từ các tế bào khối u, có thể nhận ra Cytokeratin với một số lượng lớn trong dịch cơ thể gồm máu, nước tiểu, dịch tế bào và dịch màng phổi Thông thường, trong các cơ thể khỏe mạnh, nồng độ Cytokeratin lưu thông là rất thấp Nồng độ tăng một cách bất thường trong những người có bệnh ung thư biểu mô [13], [21], [22], [98] Biểu mô dạng vảy xếp tầng biểu hiện chủ yếu Cytokeratin 1-6 và 9-17, trong khi Cytokeratin 7, 8

và 18-20 được xác định ở biểu mô đơn giản [21], [98]

Giá trị của việc nhận biết sự thay đổi về hàm lượng của các mảnh Cytokeratin trong dịch cơ thể chính là cơ sở cho việc phát hiện sớm và đánh giá nhanh hiệu quả điều trị đối với các khối u biểu mô ác tính [32], [87], [96], [99], [100]

Ba chỉ thị Cytokeratin được ứng dụng nhiều nhất trong y học là các kháng nguyên polypeptide mô (tissue polypeptide antigen-TPA), kháng nguyên polypeptide đặc trưng mô (tissue polypeptide specific antigen-TPS)

và CYFRA21-1 Trong đó, TPA có phổ kiểm tra rộng, được dùng để đánh giá Cytokeratin 8, 18 và 19 TPS và CYFRA21-1 đặc hiệu hơn nên được dùng đánh giá Cytokeratin 18 và Cytokeratin 19 theo thứ tự [56], [77], [92], [101], [106]

Vậy nên, Cytokeratin được sử dụng như là một chỉ thị khối u hiệu quả bởi những lý do sau:

Các tế bào khối u không thay đổi cấu trúc sợi trung gian

Sợi trung gian có tính chất đặc trưng mô, trong đó lớp I và II cấu tạo bởi các Cytokeratin đặc trưng cho các tế bào biểu mô

Nồng độ Cytokeratin rất thấp ở các tế bào bình thường, nhưng sẽ tăng nhanh khi xuất hiện các tế bào ung thư

1.2.4 Kháng nguyên CYFRA21-1

1.2.4.1 Gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1

Nhiễm sắc thể số 17 của người có khoảng 81 triệu cặp base và có khoảng 1200 - 1500 gen, trong số đó, có một số gen liên quan đến các chỉ thị của khối u mà đặc biệt là gen mã hóa Cytokeratin có liên quan mật thiết với các khối u biểu mô đơn giản Đáng chú ý hơn cả là Cytokeratin 19, một trong các cấu trúc sợi trung gian của bộ khung tế bào có liên quan đến sự duy trì cân bằng trong sự tăng sinh của tế bào biểu mô phổi [42], [76]

Kháng nguyên CYFRA21-1 là một phân đoạn của Cytokeratin 19, được tiết ra khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh một cách bất thường trong ung thư, nên nó được đặt tên theo chữ viết tắt của từ Cytokeratin fragment (mảnh Cytokeratin) [43], [70], [91]

Cũng như các phân tử Cytokeratin khác, Cytokeratin 19 có cấu trúc vùng trung tâm với 4 vùng xoắn là 1A, 1B, 2A và 2B, kích thước khoảng 40 kDa, gồm 400 axit amin Gen mã hóa cho Cytokeratin 19 nằm trên nhiễm sắc thể số 17 (Hình 1.3), có kích thước 4667 bp chứa 6 exon mã hóa cho phân tử mRNA kích thước 1382 bp (hình 1.3) [36], [41], [42]

Hình 1.3 Cấu trúc gen mã hóa Cytokeratin 19 [36]

Fujita (2004) [36] và cộng sự cho rằng Cytokeratin 19 bị cắt mất một phần đầu C trở thành CYFRA21-1 (37 kDa) có liên quan đến vị trí Met-Asp (367-368) nhạy cảm với một số protease (Hình 1.4)

Vì vậy, khi nghiên cứu CYFRA21-1 với vai trò là kháng nguyên đặc hiệu UTP, chúng tôi quan tâm chủ yếu đến phần epitope kháng nguyên CYFRA21-1 Theo một số kết quả nghiên cứu, khi sử dụng các phân tử kháng thể để nhận ra vùng epitope kháng nguyên của Cytokeratin, người ta nhận thấy, vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 nằm trong khoảng axit amin từ 311 đến 368 trên phân tử Cytokeratin 19 [35], [41], [42]

1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu về CYFRA21-1 trong tế bào ung thư phổi

Trên thế giới

Các chất chỉ thị khối u là những đại phân tử khi xuất hiện ở những bệnh nhân ung thư có nồng độ thay đổi theo chiều hướng tăng lên liên quan đến sự phát sinh, tăng trưởng của những khối u ác tính Các chỉ thị này có thể chia làm các dạng sau:

- Chỉ thị tế bào: bao gồm các kháng nguyên trên bề mặt tế bào, các thụ thể hormone và thụ thể yếu tố tăng trưởng, những biến đổi gen của tế bào

- Chỉ thị thể dịch: bao gồm các chất thể dịch xuất hiện với nồng độ quá mức bình thường trong huyết thanh, nước tiểu hoặc các dịch khác của cơ thể Các chất này được tổng hợp trực tiếp từ khối u hoặc được tạo thành như là một phản ứng của cơ thể đối với khối u [4], [53]

Hình 1.4 Vị trí CYFRA21-1 trên Cytokeratin 19 [36]

Thực tế cho thấy, các chỉ thị thể dịch có nhiều ưu điểm hơn chỉ thị tế bào trong việc chẩn đoán, đặc biệt là việc thu mẫu bệnh phẩm và tiến hành xét nghiệm Do đó, người ta chủ yếu sử dụng các chỉ thị thể dịch trong chẩn đoán ung thư

Trên thế giới, việc nghiên cứu và xác định vai trò của kháng nguyên ung thư nói chung, UTP nói riêng đã được nghiên cứu vào những năm nửa sau của thế kỷ XX Tuy nhiên, hướng nghiên cứu này thực sự được phát triển mạnh mẽ, có giá trị y học, giá trị thực tiễn lớn và rõ trong những năm gần đây

Hatzakis và cộng sự (2002), đã tiến hành nghiên cứu trên mẫu bệnh phẩm của 102 bệnh nhân mắc ung thư phổi có độ tuổi từ 54-71 Kết quả nghiên cứu cho thấy, 84 bệnh nhân (82%) mắc ung thư không phải tế bào nhỏ (NSCLC), trong đó có 34 bệnh nhân (33%) mắc ung thư tế bào sừng (SQCLC), 23 bệnh nhân (22,5%) mắc ung thư tế bào tuyến, 24 bệnh nhân (23,5%) mắc ung thư tế bào lớn (LCC), còn lại 18 bệnh nhân (18%) mắc ung thư tế bào nhỏ (SCLC) [41], [42]

Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy, UTP dạng NSCLC chiếm

tỉ lệ lớn trong các dạng UTP Quan trọng hơn là trong các nghiên cứu này, đã cho thấy rõ sự khác biệt về hàm lượng của CYFRA21-1 trong dịch cơ thể của bệnh nhân UTP dạng NSCLC so với hàm lượng CYFRA21-1 trong dịch cơ thể của người bình thường và những bệnh nhân ung thư khác

Thông thường, trong dịch cơ thể của người bình thường hoặc những bệnh nhân UTP dạng SCLC và một số bệnh khác thì hàm lượng

CYFRA21-1 duy trì ở mức thấp và có giá trị vào khoảng 3,3 ng/ml Tuy

nhiên, những bệnh nhân UTP dạng NSCLC thì hàm lượng CYFRA21-1 trong dịch cơ thể là rất cao, vượt xa mức ngưỡng 3,3 ng/ml [27], [33], [40], đây là cơ sở tốt để CYFRA21-1 được sử dụng như là một chỉ thị xác định, chẩn đoán UTP dạng NSCLC

Một số nghiên cứu khác về chỉ thị UTP đã cho thấy, mối quan hệ hóa sinh của các sợi protein trung gian trong cấu trúc bộ xương tế bào với UTP cũng như giá trị tiên lượng của kháng nguyên UTP [12], [30], [53] Ngoài ra, các nghiên cứu của Chen và cộng sự (2009) [26]; Holdenrieder và cộng sự (2009) [44]; Pavićević và cộng sự (2008) [74] cho thấy, mối quan hệ tuyến tính của hàm lượng CYFRA21-1 đối với sự phát triển của UTP dạng NSCLC Mặt khác, vai trò, tầm quan trọng của CYFRA21-1 trong quá trình theo dõi tiến triển của UTP dạng NSCLC đã được nghiên cứu và khẳng định [61], [67], [109], đây là cơ sở khoa học trong việc sử dụng phương pháp định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 để chẩn đoán UTP

Các chỉ thị CYFRA21-1; enolase đặc hiệu tế bào thần kinh NSE; kháng nguyên polypeptide TPA; kháng nguyên ung thư thai CEA; CA125 và kháng nguyên ung thư tế bào sừng SCCA đang được sự quan tâm tích cực của các nhà khoa học trên thế giới với mục đích chẩn đoán sớm và định hướng điều trị ung thư cũng như theo dõi tiến triển của tế bào ung thư [18], [29], [68]

Giá trị tiên lượng của CYFRA21-1 trong chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC đã được khẳng định bởi một số các nghiên cứu trong những năm gần đây [60], [63], [71], [72], [93] Trong một số các nghiên cứu khác, người ta nhận thấy, nồng độ của CYFRA21-1 liên hệ rất chặt chẽ đến tỷ lệ sống sót, đến giai đoạn phát triển của bệnh (hàm lượng CYFRA21-1 càng cao thì di căn đã lan rộng và khả năng tử vong càng lớn) [15], [17], [54], [64], [69]

Như vậy, CYFRA21-1 là một trong những kháng nguyên đã và đang được quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới

Tại Việt Nam

Ở nước ta, kỹ thuật di truyền đóng vai trò then chốt trong sinh học hiện đại; với sự phát triển không ngừng của kỹ thuật gen, chúng ta đã có thể tiến hành các nghiên cứu về sự sống ở mức độ phân tử Đặc biệt trong lĩnh vực y

học, công nghệ gen đã giúp cho việc nghiên cứu sâu về các bệnh di truyền, về

ung thư, về miễn dịch và liệu pháp gen trong điều trị các bệnh di truyền…

Hướng nghiên cứu tạo các kháng thể đơn dòng, đơn chuỗi có khả năng nhận

biết và liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên đích bằng kỹ thuật tế bào và kỹ

thuật gen là vấn đề trọng tâm nghiên cứu của Phòng Công nghệ Tế bào Động

vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam hiện nay

Các công trình nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy, vai trò y

học của các kháng nguyên HER-2/neu trong ung thư vú, kháng nguyên

CYFRA21-1 trong UTP, kháng nguyên CD20, CD25, CD33 trong ung thư

máu, kháng nguyên EPCA trong ung thư tuyến tiền liệt [4], [5], [6], [9] Đây

là cơ sở để tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư ứng dụng trong chẩn

đoán và điều trị Vấn đề này, hiện đang được tiến hành nghiên cứu với quy

mô hiện đại, bước đầu đã có những kết quả khả quan Từ những kết quả trên

cho thấy, việc nghiên cứu kháng nguyên ung thư và tạo kháng thể đặc hiệu

kháng nguyên ung thư là một trong những vấn đề cần thiết và cấp bách, đáp

ứng được nhu cầu trong chẩn đoán và điều trị

1.3 Kháng thể

Kháng thể (antibody) là các phân tử Ig (có bản chất glycoprotein), do

các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra

giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ Mỗi kháng thể chỉ

có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất 1.3.1 Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu và thực tiễn

hiện nay

Năm 1975, công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng hybridoma ra đời,

đã mở đầu cho thời kỳ sản xuất kháng thể với lượng lớn và thuần khiết phục

vụ cho y, sinh học Đồng thời cũng là tiền đề đặt nền móng cho các công nghệ

và liệu pháp kháng thể đơn dòng tái tổ hợp ra đời với mục tiêu là tạo ra một kháng thể có tác dụng điều trị cao nhất [4] Đến nay đã có nhiều loại kháng thể được tạo ra theo nhiều phương pháp khác nhau, nhằm phục cho nghiên cứu và ứng dụng

1.3.1.1 Kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ chuột

Là kháng thể có nguồn gốc hoàn toàn từ chuột, được tạo ra bằng kỹ thuật hybridoma Cho đến nay, có rất nhiều loại kháng thể đơn dòng được tạo

ra bằng con đường này và đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu Tuy nhiên, kháng thể đơn dòng chuột khi sử dụng trong điều trị y học vẫn còn nhiều hạn chế Sở dĩ như vậy là do phân tử kháng thể có nguồn gốc từ chuột mang cấu trúc không tương hợp với hệ miễn dịch của người (đặc biệt phần Fc) khiến

cơ thể xảy ra hiện tượng HAMA (sinh ra kháng thể kháng kháng thể đơn dòng chuột) Điều này làm giảm hiệu quả tác dụng của thuốc có bản chất kháng thể chuột Mặt khác, thời gian tồn tại của kháng thể chuột trong người bệnh ngắn, chu kỳ bán hủy chỉ khoảng 30 - 40 giờ Vì vậy, các nhà khoa học đã và đang nỗ lực tạo ra những kháng thể phù hợp với hệ miễn dịch của người mà vẫn giữ được tính gắn đặc hiệu với epitope kháng nguyên [1], [4], [10]

1.3.1.2 Kháng thể lai và kháng thể nhân hóa

Cấu trúc Ig được bảo toàn ở các loài khác nhau, điều này cho phép thao tác trên các kháng thể đơn dòng bằng con đường nhân tính hóa hoặc ghép các CDR từ kháng thể nọ sang kháng thể kia Sự nhân tính hóa có thể đạt được bắt đầu với các kháng thể lai, ở đó các vùng ổn định của kháng thể người được nối với các vùng biến đổi của kháng thể chuột (kháng thể lai), hoặc các kháng thể đơn dòng người - kháng thể này chỉ có vùng CDR là của chuột, còn lại toàn bộ phân tử kháng thể là của người (kháng thể nhân tính hóa) [4]

1.3.1.3 Kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ người

Vào những năm 90 của thế kỷ 20, các nhà khoa học trên thế giới đã đem lại nhiều thành công trong việc tạo ra các kháng thể được sử dụng trong điều trị

một số các căn bệnh ở người Nổi bật nhất là tạo được kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ người bằng kỹ thuật phage display và kỹ thuật chuyển gen

Các kháng thể người có thể được chọn lọc thẳng từ các gen của người trong hệ gen Các gen mã hóa kháng thể của người đã được nghiên cứu và đưa vào thử nghiệm trên chuột, kết quả là các kháng thể này đã gây bất hoạt các gen tương ứng Dựa vào quá trình sinh miễn dịch, các con chuột này tạo

ra các kháng thể người trong đáp ứng với kháng nguyên, sau đó chúng được tạo ra theo công nghệ hybridoma quen thuộc [20] Phương pháp này cung cấp

đa số các kháng thể có bản chất từ người được sử dụng trong điều trị và đã được kiểm định lâm sàng ngay tại thời điểm đó

Một trong những đổi mới trong những năm gần đây của nguyên lý cơ bản này là các con thỏ chuyển gen sản xuất các kháng thể người bằng phương pháp biến đổi gen [23] Hiện nay, công nghệ chuyển gen đang phát triển một cách mạnh mẽ nhằm thu được những kháng thể có tính toàn vẹn phục vụ cho nhu cầu phát triển của con người và khoa học Khái niệm kháng thể được định nghĩa rộng hơn, kèm theo đó là một số các kháng thể và các khái niệm mới về kháng thể ra đời như: kháng thể đơn chuỗi, kháng thể tái tổ hợp, kháng thể phage-scFv, … Trong đó, kháng thể tái tổ hợp vẫn là nhóm có nhiều triển vọng nhất và phát triển nhanh nhất cả về số lượng lẫn chất lượng cũng như khả năng thương mại hóa

1.3.1.4 Kháng thể đơn chuỗi

Để khắc phục những hạn chế có liên quan đến việc sử dụng các phân tử IgG trong điều trị bệnh, như các hiệu ứng phụ thông qua Fc và trung hòa các phản ứng miễn dịch, các mảnh kháng thể tái tổ hợp nhỏ hơn (chỉ mang chức năng liên kết với kháng nguyên) đã được tạo ra gọi là các mảnh scFv, Fv, Fab hoặc F(ab)2 (Hình 1.5)

Các vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) có thể được tách dòng và liên kết với nhau thông qua đoạn peptide ngắn tạo thành một phân tử đơn chuỗi (scFv) [50] Một Fab gồm có các vùng biến đổi với một vùng hằng định liên kết với nhau bởi liên kết disulfide (-S-S), và các mảnh F(ab)2 được tạo thành bởi hai phân tử Fab Các mảnh kháng thể cũng dễ dàng thao tác để tăng ái lực, tăng vị trí liên kết với kháng nguyên đích so với các phân tử kháng thể nguyên vẹn; scFv có thể tạo thành diabody, triabody và tetrabody

Kích cỡ lớn của phân tử kháng thể nguyên vẹn đã làm hạn chế khả năng khuếch tán của chúng qua thành mạch và tồn tại lâu trong hệ tuần hoàn, điều này dẫn tới các phản ứng phụ không mong muốn, đây cũng là nguyên nhân để gây độc cho cơ thể Ngược lại, các phân tử scFv có kích thước nhỏ nên thâm nhập nhanh qua thành mạch và mô cũng như vào khối u Hơn nữa, lại nhanh

chóng được đào thải khỏi hệ tuần hoàn [11] Chu kỳ bán hủy in vitro của các

scFv có thể được kéo dài tùy ý nếu cần thiết và tùy theo mục đích chữa trị bệnh bằng cách cộng hợp với PEG [59] Các mảnh kháng thể lại không có sự tương tác với các thụ thể của Fc trên bề mặt tế bào trong các mô thường nên không

Hình 1.5 Cấu trúc cơ bản của một phân tử Ig

và các mảnh kháng thể [10]

gây ra các tác dụng phụ không mong muốn Để thay cho việc sử dụng các phân

tử Mab truyền thống, các mảnh kháng thể cần đảm bảo 4 đặc điểm sau:

(1) Có ái lực cao và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích

(2) Đảm bảo độ bền với thời gian cần thiết ở nhiệt độ cơ thể cũng như trong quá trình bảo quản

(3) Phù hợp sản xuất ở quy mô lớn để đảm bảo số lượng cần thiết cho điều trị

(4) Không kích thích sinh miễn dịch ở người sử dụng

Hiện nay, scFv là kháng thể phổ biến nhất của kháng thể tái tổ hợp, so với kháng thể Mab thì các scFv đã có nhiều ưu điểm đáng quan tâm như:

(1) Được tạo ra khá dễ dàng với một lượng lớn và chi phí thấp

(2) Kích thước nhỏ đã cho phép chúng thâm nhập nhanh và dễ dàng hơn vào các mô và khối u, do đó làm tăng tác động lên tế bào đích [46]

(3) Kháng thể scFv có thể dễ dàng dung hợp với protein đánh dấu khác như enzym hoặc protein gắn huỳnh quang tạo thành các chất sẵn sàng cho các phân tích miễn dịch [65], [79] Tuy nhiên, các phân tử scFv thể hiện ái lực thấp hơn các phân tử kháng thể đơn dòng gốc [62], điều này đã làm hạn chế tới việc ứng dụng các scFv trong các phép thử miễn dịch

1.3.1.5 Kháng thể phage-scFv

Kháng thể phage-scFv là một thực khuẩn thể hình sợi mang các mảnh kháng thể ở một đầu của nó, hiện nay thực khuẩn thể được dùng nhiều nhất để biểu lộ kháng thể là M13 Kháng thể phage-scFv được tạo ra nhờ công nghệ phage display

- Cấu trúc của kháng thể phage-scFv

Cấu trúc của thực khuẩn thể M13

Hệ gen của phage có hình sợi, nhỏ, chứa khoảng hơn 10 gen phân bố sát nhau và một vùng không mã hóa, chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bản và

đóng gói của phage Khác với các virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi được tổng hợp và bài tiết khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ Các phage f1, M13, fd đã được sử dụng để biểu hiện các chuỗi polypeptide Hệ gen của các phage hình sợi có sự tương đồng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chúng có thể thay thế cho nhau, vì vậy mà các phage này được gọi chung là phage Fd M13 kiểu dại có đường kính khoảng 65A0, dài 9300A0 Trong cấu trúc virion của M13 chứa bộ gen DNA mạch đơn

có độ lớn 6407 bp [55] bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính, pVIII Mỗi đầu của phage được bao phủ bởi hai protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và PVI Ngoài các protein

vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài của bộ gen: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại Điều đặc biệt là bộ gen có thể gắn thêm đoạn DNA lớn, kích thước bộ gen có thể lên đến gần 12.000 bp mà vẫn không phá vỡ quá trình bao gói của thể hoang dại [104]

Cấu trúc của kháng thể phage-scFv

Các gen mã hoá cho các mảnh kháng thể liên kết scFv có thể được dung hợp với hệ gen của M13 hoặc với gen mã hóa pIII kiểu dại Tuy nhiên, việc gắn các gen kháng thể vào hệ gen của phage gặp một số bất lợi như:

Thứ nhất là hệ quả biến nạp của hệ gen phage thấp hơn nhiều so với phagemid, do đó làm cản trở việc xây dựng các thư viện kháng thể phức tạp

Thứ hai, việc nhân bản và biểu hiện kháng thể gắn với việc nhân bản và biểu hiện của hệ gen, điều này dẫn tới việc chọn lọc rất khó khăn Khi sử dụng

hệ gen phage để chèn đoạn gen kháng thể thì tất cả các bản sao của pIII đều dung hợp với các mảnh kháng thể Điều này là một lợi thế cho việc chọn lọc kháng thể có khả năng liên kết với kháng nguyên Tuy nhiên, tốc độ nhiễm có

thể bị giảm bởi pIII cần thiết cho việc xâm nhiễm vào E coli thông qua lông